Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych
28 października 2016
Pokazano protokół redukcji przestrzennych niejednorodności sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI poprzez regulację temperatury substratu podczas procesów suszenia próbki.
Ogólnym celem tej metody przygotowania próbek do analizy MALDI MS jest zmniejszenie heterogeniczności przestrzennej sygnałów jonowych podczas MALDI MS. W celu optymalizacji konwencjonalnej metody wysuszonej kropli zbudowano środowisko suszenia o wysokiej kontroli, manipulując przepływami hydrodynamicznymi wewnątrz kropli próbki podczas procesu suszenia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego zredukowania heterogeniczności przestrzennej sygnałów jonowych dla próbek przygotowanych za pomocą zoptymalizowanej metody wysuszonej kropli. Metoda ta pozwala na uzyskanie homogenicznych próbek dla systemu metrycznego THAP.
Można go również zastosować do innych systemów matryc, takich jak kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ kontrolowanie warunków suszenia nie jest łatwe. Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz drzwi komory suszącej i niezwłocznie umieść wcześniej oczyszczoną płytkę z próbką na bloku miedzianym.
Następnie zamknij drzwiczki. Ręcznie ustaw przepływomierz gazu, aby ustalić szybkość przepływu azotu na 10 standard cubic feet per hour. Po tym dostrój przepływomierz gazu, aby upewnić się, że wilgotność względna w komorze suszenia, mierzona higrometrem, zawsze wynosi poniżej 25%.
Używając termopar typu K do monitorowania temperatury, ręcznie dostosuj temperaturę cyrkulatora wody, aż płytka z próbką osiągnie 5 °C na potrzeby eksperymentu. Przed naniesieniem próbki upewnij się, że osiągnięto wymagane temperatury oraz wilgotność względną. W probówce do mikrocentryfugi zmieszaj 0,25 µL 0,1 M roztworu THAP i 0,25 µL wybranego anality.
Mieszaj próbkę w wirówce wortex przez trzy sekundy. Następnie wiruj próbkę przez dwie sekundy, aby zebrać roztwór na dnie probówki do mikrocentryfugi. Po wirowaniu otwórz drzwi komory suszącej i ostrożnie nanieś 0.1 µL roztworu na płytkę z próbką za pomocą pipety.
Natychmiast zamknij drzwi i poczekaj, aż kropelka próbki wyschnie. W przypadku utrzymywania temperatury płytki z próbką niższej niż temperatura otoczenia, średnia prędkość przepływów recyrkulacyjnych wewnątrz kropelki znacznie wzrasta, co prowadzi do redystrybucji cząsteczek. Naniesienie próbki jest najbardziej krytycznym etapem, który determinuje jakość danych i powtarzalność wyników.
Wymieszany roztwór próbki należy natychmiast nanieść na płytkę z próbkami, aby zapewnić krystalizację próbki w kontrolowanych warunkach. Po wysuszeniu należy otworzyć drzwiczki komory suszącej.
Następnie ustaw temperaturę cyrkulatora wody na 25 °C. Po powrocie temperatury płytki z próbkami do 25 °C wyjmij płytkę z komory suszącej. Zbadaj morfologię próbek pod stereomikroskopem z pięciokrotnym powiększeniem i wykonaj zdjęcie w jasnym polu.
W tym momencie należy włożyć płytkę z próbkami do spektrometru mas MALDI. Następnie przeprowadź analizę obrazowania spektrometrycznego. Wybierz charakterystyczny pik masowy z listy mas wyświetlanej w oknie wyników i kliknij 2D, aby wygenerować dwuwymiarowy obraz jonowy.
Następnie kliknij przyciski regulacji w oknie wyskakującym, aby określić górną i dolną granicę intensywności sygnału, zwiększyć rozdzielczość obrazu, a następnie kliknij zapisz obraz. Zaobserwuj i porównaj obraz jonowy z wcześniej uzyskanym obrazem w jasnym polu, aby wyznaczyć kluczowy obszar próbki. Teraz kliknij puste miejsca oraz regiony pęknięte na obrazie jonowym wyświetlanym w oknie wyników, aby precyzyjnie dostosować obszar do analizy.
Kliknij przycisk find edge, aby zlokalizować zewnętrzną warstwę obrazu jonów. Następnie kliknij deduct, aby zapisać informacje o obfitości jonów z zewnętrznej warstwy w bazie danych i jednocześnie usunąć tę warstwę z obrazu jonów. Po powtórzeniu poprzednich kroków do momentu zdefiniowania centrum obrazu jonów, zaznacz wszystkie pola wyboru na liście danych wyjściowych (output data) i kliknij export, aby wyeksportować dane.
Na koniec otwórz wyeksportowane dane w programie arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią liczebność jonów dla każdej warstwy i uzyskać informacje o rozmieszczeniu przestrzennym jonów. Na obrazach w polu jasnym oraz obrazach MALDI maltotriozy sygnał jonowy formy sodowanej występuje głównie na obrzeżach obszaru próbki, gdy jest ona przygotowana w temperaturze płytki do próbek wynoszącej 25 °C. Po obniżeniu temperatury do 5 °C sygnał rozmieszcza się jednorodnie na całym obszarze próbki, co sugeruje, że przygotowywanie próbek w niższej temperaturze płytki może znacząco zmienić rozkład cząsteczek i zmniejszyć heterogeniczność.
Obraz jonu fragmentacyjnego protonowanej bradykininy wykazuje podobną tendencję jak w przypadku sodowanego maltotriozy. Analizy statystyczne wskazują, że heterogeniczność sygnałów jonowych otrzymanych przy temperaturze płytki z próbkami wynoszącej 5 °C zmniejsza się o 60 do 80 procent w stosunku do wyników przy 25 °C. W przypadku sodowanego maltotriozy, przy temperaturze płytki z próbkami 25 °C, intensywności sygnałów w centrach są znacznie niższe niż przy temperaturze 5 °C.
Protonowany fragment bradykininy wykazuje mniejszą zmienność przy obniżeniu temperatury płytki z próbkami z 25 do 5 stopni Celsiusza. Podczas stosowania tej metody suszenia temperatury i wilgotność względna w komorze suszącej muszą być starannie kontrolowane i monitorowane. Po opanowaniu tej techniki przygotowanie próbki może zająć 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.
Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie MALDI MS do eksploracji analiz ilościowych próbek w formie wysuszonych kropli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania homogenicznych próbek w formie wysuszonych kropli do analizy MALDI MS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół mający na celu redukcję niejednorodności przestrzennej sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI. Poprzez regulację temperatury podłoża podczas procesu suszenia próbki, metoda ta zwiększa jednorodność sygnałów jonowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria mas
- Techniki przygotowania próbek
- Chemia analityczna
Wstęp
- Spektrometria mas MALDI jest wrażliwa na heterogeniczność przestrzenną sygnałów jonowych.
- Konwencjonalne metody suszenia kropli mogą prowadzić do niespójnych wyników.
- Optymalizacja warunków suszenia może poprawić homogeniczność próbki.
- Przepływy hydrodynamiczne wewnątrz kropli mogą być modyfikowane w celu uzyskania lepszych wyników.
Cel badania
- Opracowanie metody minimalizującej niejednorodność przestrzenną sygnałów jonowych.
- Poprawa wiarygodności wyników MALDI MS.
- Ułatwienie stosowania tej metody w różnych systemach miar.
Zastosowane metody
- Kontrolowane środowisko suszenia do przygotowania próbek.
- Manipulacja przepływami hydrodynamicznymi podczas suszenia.
- Zastosowanie zoptymalizowanej metody suszonych kropli.
- Wykorzystanie różnych systemów metrycznych do walidacji.
Główne wyniki
- Zoptymalizowana metoda skutecznie redukuje heterogeniczność przestrzenną.
- Uzyskano homogeniczne próbki dla systemu miar THAP.
- Technika ta jest możliwa do zaadaptowania w innych systemach miar.
- Nowi użytkownicy mogą uznać kontrolę warunków suszenia za wymagającą.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa powtarzalność wyników MALDI MS.
- Udoskonalone techniki przygotowania próbek mogą przynieść korzyści w różnorodnych zastosowaniach.
- Nowi użytkownicy mogą wymagać dodatkowego przeszkolenia w celu opanowania tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Heterogeniczność przestrzenna w przygotowaniu próbek do analizy MALDI historycznie ograniczała powtarzalność i wiarygodność ilościową danych z spektrometrii mas w badaniach i rozwoju farmaceutycznym. Niniejszy protokół wprowadza suszenie z kontrolą temperatury w celu zminimalizowania zmienności sygnału jonów, co bezpośrednio zwiększa pewność prognostyczną testów opartych na metodzie MALDI. Poprawiona homogeniczność próbek wspiera generowanie solidnych danych w krytycznych punktach przełomowych procesu odkrywania i przesiewania, umożliwiając bardziej niezawodną ocenę związków oraz triage portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Zmniejsza zmienność biologiczną i analityczną w procesach walidacji celów w oparciu o technikę MALDI.
- Umożliwia dokładniejszą analizę rozkładów molekularnych i komponentów szlaków.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zwiększenie pewności ilościowej wyników spektrometrii mas.
Przesiew i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie homogenicznych próbek dla wysokoprzepustowych platform przesiewowych MALDI.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analizy poprzez minimalizację przestrzennej heterogeniczności sygnału jonowego.
- Umożliwia wiarygodne pomiary ilościowe w badaniach przesiewowych związków oraz identyfikacji wiodących struktur chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zwiększa ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wspieranie rzetelnej ilościowej analizy biomarkerów.
- Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie ujemnych lub dodatnich wynikających z artefaktów przygotowania próbek w badaniach translacyjnych.
- Zwiększa pewność danych dotyczących rozkładu przestrzennego w układach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda przygotowania próbek do analizy MALDI z kontrolą temperatury integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne testowanie hipotez, jak i późniejszą analitykę ilościową.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotezy zerowej poprzez redukcję zmienności indukowanej przez próbkę.
- Screening: Zapewnia standaryzowane i powtarzalne przygotowanie próbek dla platform analitycznych opartych na MALDI.
- Analityka: Dostarcza ilościowych danych dotyczących rozkładu przestrzennego, co pozwala na rzetelne porównania statystyczne między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i zapewnia ciągłość wyników od modeli in vitro do modeli przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Możliwość adaptacji do różnych kombinacji próbek i matryc, co wspiera szerokie zastosowanie w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w analizach MALDI.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w obrębie zespołów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wiarygodnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów badawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu próbek do analizy MALDI oraz w kontroli warunków środowiskowych.
- Wymaga dostępu do komór suszących z regulacją temperatury oraz aparatury do monitorowania wilgotności.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do wielu rodzajów próbek i matryc po odpowiedniej optymalizacji.
- Staranna kontrola temperatury i wilgotności jest kluczowa dla uzyskania optymalnych wyników.
