Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych
28 października 2016
Pokazano protokół redukcji przestrzennych niejednorodności sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI poprzez regulację temperatury substratu podczas procesów suszenia próbki.
Ogólnym celem tej metody przygotowania próbki z MALDI MS jest zmniejszenie przestrzennej niejednorodności sygnałów jonowych podczas MALDI MS. Stworzono dobrze kontrolowane środowisko suszenia w celu optymalizacji konwencjonalnej metody suszenia kropel poprzez manipulowanie przepływami hydrodynamicznymi wewnątrz kropli próbki podczas procesu suszenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że można skutecznie zredukować przestrzenną niejednorodność sygnałów jonowych dla próbki przygotowanej zoptymalizowaną metodą suszonych kropel. Chociaż ta metoda może zapewnić jednorodne próbki dla systemu metrycznego TANAP.
Może być również stosowany do innych systemów metrycznych, takich jak kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, miały trudności, ponieważ kontrolowanie warunków suszenia nie jest łatwe. Aby rozpocząć tę procedurę, należy otworzyć drzwi komory suszącej i natychmiast umieścić wcześniej oczyszczoną płytkę z próbką na bloku na bazie miedzi.
Następnie zamknij drzwi. Ręcznie wyreguluj przepływomierz gazu, aby ustawić natężenie przepływu azotu na 10 standardowych stóp sześciennych na godzinę. Następnie należy dokładnie dostroić przepływomierz gazu, aby upewnić się, że wilgotność względna w komorze suszenia jest zawsze poniżej 25%, mierzona za pomocą higrometru.
Używając termopar typu K do monitorowania temperatury, ręcznie wyreguluj temperaturę cyrkulatora wody, aż płytka próbki osiągnie 5 stopni Celsjusza do eksperymentu. Upewnij się, że wymagane temperatury i wilgotność względna zostały osiągnięte przed osadzaniem próbki. Wymieszaj 0,25 mikrolitra 0,1 molowego roztworu THAP i 0,25 mikrolitra żądanego analitu w probówce do mikrowirówki.
Wirować próbkę przez trzy sekundy. Następnie odwiruj próbkę przez dwie sekundy, aby zebrać roztwór na dnie probówki mikrowirówkowej. Po odwirowaniu otworzyć drzwiczki komory suszącej i ostrożnie nanieść 0,1 mikrolitra roztworu na płytkę z próbką za pomocą pipety.
Natychmiast zamknij drzwiczki i poczekaj, aż kropla próbki wyschnie. Przy utrzymywaniu temperatury płytki próbki niższej niż jej otoczenie, średnia prędkość przepływów recyrkulacyjnych w kropli jest znacznie zwiększona w celu redystrybucji cząsteczek. Osadzanie próbki jest najbardziej krytycznym krokiem, który decyduje o jakości i odtwarzalności danych.
Wstępnie zmieszany roztwór próbki należy natychmiast nanieść na płytkę z próbką, aby zapewnić krystalizację próbki w kontrolowanych warunkach. Po wyschnięciu otwórz drzwi. komory suszenia.
Następnie ustaw temperaturę cyrkulatora wody na 25 stopni Celsjusza. Gdy temperatura płytki próbki powróci do 25 stopni Celsjusza, wyjmij płytkę z próbką z komory suszenia. Zbadaj morfologię próbki pod mikroskopem stereoskopowym powiększonym pięciokrotnie i zrób zdjęcie w jasnym polu.
W tym momencie włóż płytkę próbki do spektrometru masowego MALDI. Następnie wykonaj obrazową analizę spektrometrii mas. Wybierz charakterystyczny pik masy z listy mas wyświetlanej w oknie wyników i kliknij 2D, aby wykreślić dwuwymiarowy obraz jonów.
Następnie kliknij przyciski regulacji w wyskakującym okienku, aby określić górną i dolną granicę intensywności sygnału, aby zwiększyć rozdzielczość obrazu, a następnie kliknij przycisk Zapisz obraz. Obserwuj i porównuj obraz jonów z poprzednio uzyskanym obrazem jasnego pola, aby uzyskać niezbędny obszar próbki. Teraz kliknij puste miejsca i pęknięte obszary na obrazie jonowym pokazanym w oknie wyników, aby precyzyjnie dostosować region do analizy.
Kliknij przycisk znajdź krawędź, aby znaleźć najbardziej zewnętrzną warstwę obrazu jonów. Następnie kliknij przycisk odejmuj, aby zapisać informacje o obfitości jonów w najbardziej zewnętrznej warstwie w bazie danych i jednocześnie usunąć tę warstwę z obrazu jonów. Po powtórzeniu poprzednich kroków, aż środek obrazu jonowego zostanie zdefiniowany, kliknij i zaznacz wszystkie pola wyboru na liście danych wyjściowych, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby wyeksportować dane.
Na koniec otwórz wyeksportowane dane za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią obfitość jonów w każdej warstwie, aby uzyskać informacje o rozkładzie przestrzennym jonów. Na obrazach maltotriozy w jasnym polu i MALDI sygnał jonowy postaci sodowanej zaludnia się głównie na obrzeżach obszaru próbki, gdy jest przygotowywany z płytką próbki o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Obniżając temperaturę do pięciu stopni Celsjusza, sygnał wypełnia się jednorodnie na całym obszarze próbki, co sugeruje, że przygotowanie próbek w niższej temperaturze płytki próbki może znacznie redystrybuować cząsteczki i zmniejszać niejednorodność.
Obraz jonów protonowanych fragmentów bradykininy wykazuje podobny trend jak w przypadku maltotriozy sodowanej. Analizy statystyczne pokazują, że niejednorodność sygnałów jonowych uzyskanych w temperaturze płytki próbki wynoszącej 5 stopni Celsjusza zmniejsza się o 60 do 80 procent, w porównaniu do tej poniżej 25 stopni Celsjusza. W przypadku maltotriozy sodowanej, o temperaturze płytki próbki wynoszącej 25 stopni Celsjusza, natężenia sygnału w centrach są znacznie niższe niż w tych o temperaturze 5 stopni Celsjusza.
Protonowany fragment bradykininy wykazuje mniejszą zmienność przy obniżaniu temperatury płytki próbki z 25 do 5 stopni Celsjusza. Podczas próby tej metody suszenia temperatury i wilgotność względna w komorze suszenia muszą być dokładnie kontrolowane i monitorowane. Po opanowaniu próbka przygotowana tą techniką może być wykonana w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się MALDI MS do zbadania analizy ilościowej próbek z wysuszonych kropel. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować jednorodne próbki z wysuszonych kropel do analizy MALDI MS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół mający na celu redukcję niejednorodności przestrzennej sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI. Poprzez regulację temperatury podłoża podczas procesu suszenia próbki, metoda ta zwiększa jednorodność sygnałów jonowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria mas
- Techniki przygotowania próbek
- Chemia analityczna
Wstęp
- Spektrometria mas MALDI jest wrażliwa na heterogeniczność przestrzenną sygnałów jonowych.
- Konwencjonalne metody suszenia kropli mogą prowadzić do niespójnych wyników.
- Optymalizacja warunków suszenia może poprawić homogeniczność próbki.
- Przepływy hydrodynamiczne wewnątrz kropli mogą być modyfikowane w celu uzyskania lepszych wyników.
Cel badania
- Opracowanie metody minimalizującej niejednorodność przestrzenną sygnałów jonowych.
- Poprawa wiarygodności wyników MALDI MS.
- Ułatwienie stosowania tej metody w różnych systemach miar.
Zastosowane metody
- Kontrolowane środowisko suszenia do przygotowania próbek.
- Manipulacja przepływami hydrodynamicznymi podczas suszenia.
- Zastosowanie zoptymalizowanej metody suszonych kropli.
- Wykorzystanie różnych systemów metrycznych do walidacji.
Główne wyniki
- Zoptymalizowana metoda skutecznie redukuje heterogeniczność przestrzenną.
- Uzyskano homogeniczne próbki dla systemu miar THAP.
- Technika ta jest możliwa do zaadaptowania w innych systemach miar.
- Nowi użytkownicy mogą uznać kontrolę warunków suszenia za wymagającą.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa powtarzalność wyników MALDI MS.
- Udoskonalone techniki przygotowania próbek mogą przynieść korzyści w różnorodnych zastosowaniach.
- Nowi użytkownicy mogą wymagać dodatkowego przeszkolenia w celu opanowania tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Heterogeniczność przestrzenna w przygotowaniu próbek do analizy MALDI historycznie ograniczała powtarzalność i wiarygodność ilościową danych z spektrometrii mas w badaniach i rozwoju farmaceutycznym. Niniejszy protokół wprowadza suszenie z kontrolą temperatury w celu zminimalizowania zmienności sygnału jonów, co bezpośrednio zwiększa pewność prognostyczną testów opartych na metodzie MALDI. Poprawiona homogeniczność próbek wspiera generowanie solidnych danych w krytycznych punktach przełomowych procesu odkrywania i przesiewania, umożliwiając bardziej niezawodną ocenę związków oraz triage portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Zmniejsza zmienność biologiczną i analityczną w procesach walidacji celów w oparciu o technikę MALDI.
- Umożliwia dokładniejszą analizę rozkładów molekularnych i komponentów szlaków.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zwiększenie pewności ilościowej wyników spektrometrii mas.
Przesiew i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie homogenicznych próbek dla wysokoprzepustowych platform przesiewowych MALDI.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analizy poprzez minimalizację przestrzennej heterogeniczności sygnału jonowego.
- Umożliwia wiarygodne pomiary ilościowe w badaniach przesiewowych związków oraz identyfikacji wiodących struktur chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zwiększa ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wspieranie rzetelnej ilościowej analizy biomarkerów.
- Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie ujemnych lub dodatnich wynikających z artefaktów przygotowania próbek w badaniach translacyjnych.
- Zwiększa pewność danych dotyczących rozkładu przestrzennego w układach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda przygotowania próbek do analizy MALDI z kontrolą temperatury integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne testowanie hipotez, jak i późniejszą analitykę ilościową.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotezy zerowej poprzez redukcję zmienności indukowanej przez próbkę.
- Screening: Zapewnia standaryzowane i powtarzalne przygotowanie próbek dla platform analitycznych opartych na MALDI.
- Analityka: Dostarcza ilościowych danych dotyczących rozkładu przestrzennego, co pozwala na rzetelne porównania statystyczne między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i zapewnia ciągłość wyników od modeli in vitro do modeli przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Możliwość adaptacji do różnych kombinacji próbek i matryc, co wspiera szerokie zastosowanie w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w analizach MALDI.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w obrębie zespołów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wiarygodnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów badawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu próbek do analizy MALDI oraz w kontroli warunków środowiskowych.
- Wymaga dostępu do komór suszących z regulacją temperatury oraz aparatury do monitorowania wilgotności.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do wielu rodzajów próbek i matryc po odpowiedniej optymalizacji.
- Staranna kontrola temperatury i wilgotności jest kluczowa dla uzyskania optymalnych wyników.
