Name: Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Naucz się przygotowywać jednorodne próbki MALDI MS poprzez kontrolowane suszenie z regulacją temperatury. Ta metoda redukuje przestrzenną heterogeniczność sygnałów jonowych i poprawia niezawodność wyników spektrometrii masowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Centrum Badań Genomicznych, Academia Sinica oraz Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu, Republiki Chińskiej (Kontrakt nr 104-2119-M-001-014).

UWAGA: Protokół ten został opracowany w celu zmniejszenia niejednorodności przestrzennej fragmentu maltotriozy i bradykininy (1-7) przygotowanego metodą suszonych kropel. Protokół składa się z trzech głównych etapów, w tym przygotowania i kondycjonowania wstępnego, osadzania i suszenia próbki oraz analizy danych ze spektrometrii mas. Procedury są przedstawione i opisane bardziej szczegółowo poniżej:
1. Przygotowanie i przygotowanie
<ol>
	<li>Czyszczenie płytki próbki
	<ol>
		<li>Nosić rękawice nitrylowe i delikatnie umyć płytkę sample detergentem i destylowaną wodą dejonizowaną (DDW).</li>
		<li>Przepłukać płytkę z próbką metanolem (MeOH) i DDW.</li>
		<li>Umieścić płytkę z próbką w zlewce o pojemności 600 ml i napełnić DDW.</li>
		<li>Sonikować płytkę próbki w DDW przez 15 minut w łaźni ultradźwiękowej (200 W, 40 kHz).</li>
		<li>Usunąć DDW ze zlewki i napełnić zlewkę MeOH.</li>
		<li>Sonikować płytkę próbki w MeOH przez 15 minut w łaźni ultradźwiękowej (200 W, 40 kHz).</li>
		<li>Zdmuchnąć krople rozpuszczalnika na płytce za pomocą azotu gazowego i utrzymać płytkę próbki w stanie suchym przed osadzeniem próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja temperatury komory suszenia 
	UWAGA: Komora suszenia to komora akrylowa o wymiarach 35 x 20 x 45 cm3 (szer. x gł. x wys.). Rysunek 1 przedstawia obraz tego systemu suszenia. Komora jest przedmuchiwana gazowym azotem o temperaturze pokojowej przez przepływomierz gazowy ze stałym natężeniem przepływu w celu utrzymania niskiej wilgotności względnej monitorowanej przez skalibrowany higrometr zainstalowany wewnątrz komory suszącej. Miedziany blok podstawowy w komorze suszącej wyposażony w zaprogramowany cyrkulator wody o stałej temperaturze służy do umieszczania płytek do pobierania próbek ze stali nierdzewnej. Miedziany blok podstawy jest w stanie regulować temperaturę płytki próbki w zakresie od 5 do 25 °C. Temperatury powietrza, miedzianego bloku podstawy i płytki próbki są monitorowane przez termopary typu K.
	<ol>
		<li>Otwórz drzwi i szybko umieść płytkę próbki na miedzianym bloku podstawy, a następnie zamknij drzwi.</li>
		<li>Ręcznie wyreguluj przepływomierz gazu, aby ustawić natężenie przepływu azotu na 10 standardowych stóp sześciennych na godzinę (SCFH).</li>
		<li>Monitoruj wilgotność względną w komorze suszenia za pomocą higrometru i dostosuj przepływomierz gazu, aby upewnić się, że wilgotność względna jest zawsze poniżej 25%.</li>
		<li>Monitorować temperaturę płytki próbki za pomocą termopar typu K i ręcznie regulować temperaturę cyrkulatora wody, aż płytka próbki osiągnie 5 °C w przypadku eksperymentu lub temperatury pokojowej (25 °C) w celu kontroli. 
		UWAGA: Aby ustabilizować płytkę próbki w zaprojektowanej temperaturze, temperatura cyrkulatora wody jest zwykle ustawiona o 0 do 5 °C niższa niż zaprojektowana próbka. Na przykład, aby utrzymać temperaturę 5 °C na płytce do pobierania próbek, ustawienie temperatury cyrkulatora wody mieści się w zakresie od 0 do 2 °C; aby utrzymać płytkę próbki w temperaturze 25 °C, ustawienie temperatury cyrkulatora wody mieści się w zakresie od 23 do 25 °C.</li>
		<li>Upewnij się, że osiągnięto wymaganą temperaturę i wilgotność względną (Tabela 1) przed osadzaniem próbki. 
		UWAGA: Wszystkie parametry, jak również ich wartości ustawień dla procesów suszenia przy różnych temperaturach płytki próbki są pokazane w tabeli 1. 
		UWAGA: Przy niskiej temperaturze płytki próbki może dojść do kondensacji wody na płytce próbki, jeśli drzwi komory są otwarte przez długi czas. Jeśli dojdzie do kondensacji wody, zamknij drzwi i NIE umieszczaj na nich żadnej próbki dopóki kondensacja wody nie wyschnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów matryc i analitów
	<ol>
		<li>Przygotowanie roztworów matrycowych
		<ol>
			<li>Przygotować 0,1 M roztwór THAP z 50% acetonitrylem (ACN): 50% wodny roztwór DDW.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie analitów
		<ol>
			<li>Przygotować 10-4 M roztwór maltotriozy z DDW.</li>
			<li>Przygotować 10-5 M roztwór fragmentu bradykininy (1-7) w 50% roztworze wodnym acetonitrylu (ACN) : 50% DDW.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie i suszenie próbki
<ol>
	<li>Premiksować 0,25 μl 0,1 M roztworu THAP i 0,25 μl 10-4 M roztworów maltotriozy lub 10-5 M fragmentu bradykininy (1-7) w probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Mieszaj roztwór przez 3 sekundy.</li>
	<li>Odwirować zmieszany roztwór przez 2 sekundy (2 000 x g), aby zebrać roztwór na dnie probówki wirówkowej.</li>
	<li>Otworzyć drzwiczki komory suszącej, ostrożnie nanieść 0,1 μl roztworu na płytkę z próbką za pomocą pipety i natychmiast zamknąć drzwiczki.</li>
	<li>Poczekaj, aż kropla próbki wyschnie. 
	UWAGA: Zazwyczaj obserwowane czasy schnięcia przy różnych temperaturach płytki próbki są wymienione w tabeli 1. W przypadku temperatury płytki próbki wynoszącej 5 °C średni czas schnięcia wynosi od 800 do 1 000 sekund; dla temperatury płytki próbki 25 °C średni czas schnięcia wynosi od 100 do 150 sekund.</li>
	<li>Po wysuszeniu otwórz drzwi komory suszenia.</li>
	<li>Ustaw temperaturę cyrkulatora wody na temperaturę pokojową (25 °C). 
	UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli płytka sample jest stale utrzymywana w temperaturze pokojowej (25 °C) podczas procesu suszenia.</li>
	<li>Gdy temperatura płytki próbki powróci do temperatury pokojowej (25 °C), wyjmij płytkę z suszarką.</li>
	<li>Zbadaj morfologię próbki pod 5-krotnym mikroskopem stereoskopowym i zrób migawkę obrazu w jasnym polu. 
	UWAGA: Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami, konieczne jest przygotowanie nowej próbki przy użyciu tej samej procedury. Typowe morfologie kryształów pokazano na górnych panelach rysunku 2. 
	UWAGA: W przypadku niskich temperatur płytki próbki, takich jak 5 °C, ważne jest, aby podgrzać płytkę próbki do temperatury pokojowej przed wyjęciem jej z komory suszenia. Podczas wrzucania próbek NIE WOLNO przechowywać wstępnie wymieszanego roztworu na końcówce pipety przez ponad 10 sekund. NIE WOLNO ponownie używać wstępnie zmieszanego roztworu po zdeponowaniu próbek. Górne panele rysunku 2 pokazują obrazy w jasnym polu próbek przygotowanych z różnymi temperaturami płytki próbki.</li>
</ol>
3. Analiza danych spektrometrii mas
<ol>
	<li>Akwizycja danych spektrometrii mas 
	UWAGA: Po przygotowaniu próbkę można analizować za pomocą obrazowej spektrometrii mas. W obecnym badaniu eksperymenty z obrazowaniem stwardnienia rozsianego są przeprowadzane przy użyciu laboratoryjnie zbudowanego spektrometru mas do obrazowania z dwubiegunowością TOF (DP-TOF). Do takich eksperymentów nadaje się również 15 komercyjnych spektrometrów masowych MALDI-TOF z możliwością obrazowania. Spektrometr mas pracuje w trybie ekstrakcji liniowej i jonów dodatnich ze zoptymalizowanymi opóźnieniami ekstrakcji. Energia kinetyczna jonów wynosi 20 kV. Rozmiar wiązki laserowej ma średnicę 35 μm na powierzchni próbki, a widmo każdej plamki to średnia z 5 strzałów laserowych.
	<ol>
		<li>Włożyć płytkę z próbką do spektrometru mas MALDI.</li>
		<li>Przeprowadzić obrazową analizę spektrometrii mas na próbce przygotowanej w krokach 2.1-2.9.</li>
		<li>Wybierz charakterystyczny pik masy z listy mas wyświetlanej w oknie wyników i kliknij "2D", aby wykreślić dwuwymiarowy obraz jonów. 
		UWAGA: W przypadku maltotriozy zmieszanej z THAP, charakterystycznymi pikami są maltotrioza sodowana, protonowana THAT i sodowana THAP. W przypadku fragmentu bradykininy (1-7) zmieszanego z THAP, charakterystyczne piki obejmują protonowany fragment bradykininy (1-7), protonowany THAT i sodowany THAP.</li>
		<li>Kliknij przyciski regulacji w wyskakującym okienku, aby określić górną i dolną granicę intensywności sygnału i kliknij "zapisz zdjęcie". To ustawienie określa kontrast obrazów jonów. 
		UWAGA: W każdym pojedynczym zestawie danych eliminowane są pęknięte obszary i puste plamy o niskiej jasności.</li>
		<li>Obserwuj i porównuj obraz jonów z obrazem w jasnym polu, który został wykonany w kroku 2.9. 
		UWAGA: Obrazowanie spektrometrii mas i konstruowanie obrazów poszczególnych jonów można osiągnąć za pomocą komercyjnych instrumentów. Ze względu na różnorodność oprogramowania do akwizycji i analizy danych, użytkownicy powinni postępować zgodnie z instrukcjami oprogramowania dostarczonymi przez dostawcę urządzenia, aby uzyskać obrazy wysokiej jakości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych 
	UWAGA: Niejednorodność próbek jest analizowana ilościowo. W tej demonstracji każda próbka jest dzielona na wiele koncentrycznych obszarów za pomocą oprogramowania opracowanego we własnym zakresie do analizy przestrzennego rozkładu jonów. Analizę można również przeprowadzić za pomocą samodzielnego oprogramowania do analizy danych.
	<ol>
		<li>Kliknij puste miejsca i pęknięte obszary na obrazie jonów pokazanym w oknie wyników, aby usunąć nieistotne obszary. 
		UWAGA: Ta procedura określa zasadniczy obszar obrazu jonowego.</li>
		<li>Kliknij przycisk "znajdź krawędź", aby znaleźć najbardziej zewnętrzną warstwę obrazu jonowego.</li>
		<li>Kliknij "odejmij", aby zapisać informacje o obfitości jonów najbardziej zewnętrznej warstwy w bazie danych i jednocześnie usunąć tę warstwę z obrazu jonów. Pole wyboru reprezentujące tę najbardziej zewnętrzną warstwę pojawi się na liście "dane wyjściowe" w oknie wyników.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 3.2.2 i 3.2.3, aż środek obrazu jonów zostanie zdefiniowany.</li>
		<li>Kliknij i zaznacz wszystkie pola wyboru na liście "dane wyjściowe" i kliknij "eksportuj", aby wyeksportować dane.</li>
		<li>Otwórz wyeksportowane dane za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią obfitość jonów w każdej warstwie, aby uzyskać informacje o przestrzennym rozkładzie jonów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-Assisted Laser Desorption Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Ehring, H., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Photoionization+and+Photochemistry+in+Ionization+Processes+of+Organic-Molecules+and+Relevance+for+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Role of Photoionization and Photochemistry in Ionization Processes of Organic-Molecules and Relevance for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Org. Mass Spectrom. 27, 472-480 (1992).</li>
<li>Strupat, K., Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C5-Dihydroxybenzoic+Acid+-+a+New+Matrix+for+Laser+Desorption+Ionization+Mass-Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom.+Ion+Process%22%5BJournal%5D)">2,5-Dihydroxybenzoic Acid - a New Matrix for Laser Desorption Ionization Mass-Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 111, 89-102 (1991).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+of+a+Sessile+Droplet+on+a+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Evaporation of a Sessile Droplet on a Substrate.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 1334-1344 (2002).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Flow+as+the+Cause+of+Ring+Stains+from+Dried+Liquid+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Flow as the Cause of Ring Stains from Dried Liquid Drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Hu, J. -B., Chen, Y. -C., Urban, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee-Ring+Effects+in+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Coffee-Ring Effects in Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chim. Acta. 766, 77-82 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
<li>Hu, H., Larson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marangoni+Effect+Reverses+Coffee-Ring+Depositions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Marangoni Effect Reverses Coffee-Ring Depositions.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 7090-7094 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Opierając się na wcześniejszych przewidywaniach teoretycznych, przepływy hydrodynamiczne w kropelkach wywołane temperaturą mogą pokonać zewnętrzne przepływy kapilarne wywołane parowaniem rozpuszczalnika. Wydajność takiej wewnętrznej recyrkulacji cząsteczek zwiększa się, gdy wzrastają gradienty temperatury w kropli. Zgodnie z przewidywanymi wynikami, przy utrzymywaniu temperatury płytki próbki poniżej 5 °C przy jednoczesnym utrzymywaniu jej otoczenia w temperaturze otoczenia, średnia prędkość przepływów recyrkulacyjnych w...

Spektrometria mas (MS) jest jedną z najważniejszych technik analitycznych do analizy składu molekularnego złożonych próbek. Spośród wszystkich metod jonizacji stosowanych w stwardnieniu rozsianym, desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) jest najbardziej czułą i szeroko stosowaną metodą w zastosowaniach bioanalitycznych. 1 W porównaniu z innymi technikami jonizacji, MALDI ma najwyższą czułość i wysoką tolerancję na zanieczyszczenia solne. Takie właściwości analityczne sprawiają, że MALDI jest pierwszym wyborem do analizy węglowodanów i wielu zastosowań proteomicznych. Jednak przygotowanie próbki jest kluczowym krokiem w celu uzyskania wysokiej jakości danych w MALDI-MS.
Najczęściej stosowaną metodą przygotowania próbki dla MALDI-MS jest metoda suszonych kropel, w której kropelki próbki są osadzane na powierzchni i suszone w warunkach otoczenia. Ta metoda suszenia jest prosta i ogólnie skuteczna. 2-5 Jednak częstym problemem w metodzie suszonych kropel jest to, że powstałe kryształy analitu/matrycy zwykle rozmieszczają się nieregularnie. W wielu przypadkach kryształy gromadzą się na obrzeżach obszarów próbki, co powoduje tak zwane powstawanie plam pierścieniowych. 6-8 Niejednorodne morfologie kryształów wpływają na przestrzenne rozmieszczenie cząsteczek analitu, co powoduje silne wahania sygnału jonowego na obszarach próbki. Tak poważne wahania sygnału i słaba odtwarzalność danych są znane jako problem "sweet spot" w MALDI-MS. 9 W związku z tym istnieje ogromna potrzeba zmniejszenia niejednorodności przestrzennych w zastosowaniach z suszonymi kroplami MALDI-MS.
Przepływy hydrodynamiczne w kropli próbki odgrywają ważną rolę w określaniu rozkładu przestrzennego próbek przygotowanych metodą suszonych kropel. 10-12 Stwierdzono, że parowanie rozpuszczalnika indukuje zewnętrzne przepływy kapilarne w kropelkach, które są odpowiedzialne za tworzenie się plam pierścieniowych. 7,10 Natomiast przepływy recyrkulacyjne indukowane przez styczne gradienty napięcia powierzchniowego mogą równoważyć przepływy kapilarne na zewnątrz. 13 Jeśli prędkości przepływu recyrkulacyjnego są wyższe niż prędkości przepływu kapilarnego na zewnątrz, próbki mogą być skutecznie redystrybuowane w celu zmniejszenia problemu niejednorodności. 14
W tej pracy demonstrujemy szczegółowy protokół przygotowania próbek za pomocą prostej komory suszącej, aby wywołać efektywne przepływy recyrkulacyjne podczas procesów suszenia kropel. Warunki suszenia kropel są precyzyjnie kontrolowane, w tym temperatura płytki próbki i jej otoczenia oraz wilgotność względna w komorze. Modelowymi analitami są maltotrioza i łańcuch bradykininy (1-7). Matrycą użytą do demonstracji jest 2,4,6-trihydroksyacetofenon (THAP). Próbki są badane za pomocą MS czasu przelotu (TOF), a dane są analizowane ilościowo w celu wykazania zmniejszenia niejednorodności.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergent w proszku</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-trihydroksyacetofenon (THAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fragment bradykininy (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotrioza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Probówka do mikrowirówek Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q oczyszczanie wody system</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe bezpudrowe</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>600 ml zlewka</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Higrometr</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz azotu</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K-type termopary</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Komora susząca z kontrolowaną temperaturą</td><td>to laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zsynchronizowany spektrometr masowy do obrazowania czasu przelotu o podwójnej polaryzacji (DP-TOF IMS</td><td>) ten laboratoryjny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Próbka ze stali nierdzewnej MALDI-TOF jest przeznaczona</td><td>dla tego laboratorium</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie jednorodnych próbek maldi do zastosowań ilościowych

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Ten protokół demonstruje proste przygotowanie próbki w celu zmniejszenia przestrzennej niejednorodności sygnałów jonowych podczas spektrometrii mas wspomaganej matrycowo desorpcji/jonizacji laserowej (MALDI). Niejednorodność sygnałów jonowych jest poważnym problemem w MALDI, co skutkuje słabą odtwarzalnością danych i sprawia, że MALDI nie nadaje się do analizy ilościowej. Regulując temperaturę płytki próbki podczas przygotowywania próbki, indukowane termicznie przepływy hydrodynamiczne wewnątrz kropelek roztworu próbki są w stanie zmniejszyć problem niejednorodności. Komora do przygotowywania próbek o temperaturze pokojowej wyposażona w miedziany blok podstawy o regulowanej temperaturze, w którym znajdują się płytki próbek MALDI, ułatwia precyzyjną kontrolę warunków suszenia próbki. Po wysuszeniu kropelek próbki, temperatura płytek próbek jest przywracana do temperatury pokojowej i usuwana z komory w celu późniejszej analizy spektrometrii mas. Obszary próbek są badane za pomocą spektrometrii mas obrazowania MALDI w celu uzyskania rozkładu przestrzennego wszystkich składników w próbce. W porównaniu z konwencjonalną metodą suszonych kropel, która przygotowuje próbki w warunkach otoczenia bez kontroli temperatury, próbki przygotowane za pomocą przedstawionej tutaj metody wykazują znacznie lepszy rozkład przestrzenny i intensywność sygnału. Zgodnie z obserwacjami z wykorzystaniem próbek węglowodanów i peptydów, obniżenie temperatury substratu przy jednoczesnym utrzymaniu otoczenia w temperaturze otoczenia podczas procesu suszenia może skutecznie zmniejszyć niejednorodność sygnałów jonowych. Metoda ta jest ogólnie stosowana do różnych kombinacji próbek i matryc.

Obrazy w jasnym polu oraz obrazy MS maltotriozy i fragmentu bradykininy (1-7), przygotowane w temperaturze płytki z próbką wynoszącej 5 oraz 25 °C, przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku sodowanej maltotriozy sygnał jonowy występuje głównie na obrzeżach obszaru próbki, gdy jest ona przygotowywana w temperaturze płytki 25 °C. Po obniżeniu temperatury płytki z próbką do 5 °C sygnał rozkłada się jednorodnie na całym obszarze próbki. Jedyną zauważalną wadą przygotowywania pr...

Pokazano protokół redukcji przestrzennych niejednorodności sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI poprzez regulację temperatury substratu podczas procesów suszenia próbki.

Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

Ogólnym celem tej metody przygotowania próbek do analizy MALDI MS jest zmniejszenie heterogeniczności przestrzennej sygnałów jonowych podczas MALDI MS. W celu optymalizacji konwencjonalnej metody wysuszonej kropli zbudowano środowisko suszenia o wysokiej kontroli, manipulując przepływami hydrodynamicznymi wewnątrz kropli próbki podczas procesu suszenia. Główną zaletą tej techniki jest możliwość skutecznego zredukowania heterogeniczności przestrzennej sygnałów jonowych dla próbek przygotowanych za pomocą zoptymalizowanej metody wysuszonej kropli. Metoda ta pozwala na uzyskanie homogenicznych próbek dla systemu metrycznego THAP.Można go również zastosować do innych systemów matryc, takich jak kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ kontrolowanie warunków suszenia nie jest łatwe. Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz drzwi komory suszącej i niezwłocznie umieść wcześniej oczyszczoną płytkę z próbką na bloku miedzianym.Następnie zamknij drzwiczki. Ręcznie ustaw przepływomierz gazu, aby ustalić szybkość przepływu azotu na 10 standard cubic feet per hour. Po tym dostrój przepływomierz gazu, aby upewnić się, że wilgotność względna w komorze suszenia, mierzona higrometrem, zawsze wynosi poniżej 25%.Używając termopar typu K do monitorowania temperatury, ręcznie dostosuj temperaturę cyrkulatora wody, aż płytka z próbką osiągnie 5 °C na potrzeby eksperymentu. Przed naniesieniem próbki upewnij się, że osiągnięto wymagane temperatury oraz wilgotność względną. W probówce do mikrocentryfugi zmieszaj 0,25 µL 0,1 M roztworu THAP i 0,25 µL wybranego anality.Mieszaj próbkę w wirówce wortex przez trzy sekundy. Następnie wiruj próbkę przez dwie sekundy, aby zebrać roztwór na dnie probówki do mikrocentryfugi. Po wirowaniu otwórz drzwi komory suszącej i ostrożnie nanieś 0.1 µL roztworu na płytkę z próbką za pomocą pipety.Natychmiast zamknij drzwi i poczekaj, aż kropelka próbki wyschnie. W przypadku utrzymywania temperatury płytki z próbką niższej niż temperatura otoczenia, średnia prędkość przepływów recyrkulacyjnych wewnątrz kropelki znacznie wzrasta, co prowadzi do redystrybucji cząsteczek. Naniesienie próbki jest najbardziej krytycznym etapem, który determinuje jakość danych i powtarzalność wyników.Wymieszany roztwór próbki należy natychmiast nanieść na płytkę z próbkami, aby zapewnić krystalizację próbki w kontrolowanych warunkach. Po wysuszeniu należy otworzyć drzwiczki komory suszącej.Następnie ustaw temperaturę cyrkulatora wody na 25 °C. Po powrocie temperatury płytki z próbkami do 25 °C wyjmij płytkę z komory suszącej. Zbadaj morfologię próbek pod stereomikroskopem z pięciokrotnym powiększeniem i wykonaj zdjęcie w jasnym polu.W tym momencie należy włożyć płytkę z próbkami do spektrometru mas MALDI. Następnie przeprowadź analizę obrazowania spektrometrycznego. Wybierz charakterystyczny pik masowy z listy mas wyświetlanej w oknie wyników i kliknij 2D, aby wygenerować dwuwymiarowy obraz jonowy.Następnie kliknij przyciski regulacji w oknie wyskakującym, aby określić górną i dolną granicę intensywności sygnału, zwiększyć rozdzielczość obrazu, a następnie kliknij zapisz obraz. Zaobserwuj i porównaj obraz jonowy z wcześniej uzyskanym obrazem w jasnym polu, aby wyznaczyć kluczowy obszar próbki. Teraz kliknij puste miejsca oraz regiony pęknięte na obrazie jonowym wyświetlanym w oknie wyników, aby precyzyjnie dostosować obszar do analizy.Kliknij przycisk find edge, aby zlokalizować zewnętrzną warstwę obrazu jonów. Następnie kliknij deduct, aby zapisać informacje o obfitości jonów z zewnętrznej warstwy w bazie danych i jednocześnie usunąć tę warstwę z obrazu jonów. Po powtórzeniu poprzednich kroków do momentu zdefiniowania centrum obrazu jonów, zaznacz wszystkie pola wyboru na liście danych wyjściowych (output data) i kliknij export, aby wyeksportować dane.Na koniec otwórz wyeksportowane dane w programie arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią liczebność jonów dla każdej warstwy i uzyskać informacje o rozmieszczeniu przestrzennym jonów. Na obrazach w polu jasnym oraz obrazach MALDI maltotriozy sygnał jonowy formy sodowanej występuje głównie na obrzeżach obszaru próbki, gdy jest ona przygotowana w temperaturze płytki do próbek wynoszącej 25 °C. Po obniżeniu temperatury do 5 °C sygnał rozmieszcza się jednorodnie na całym obszarze próbki, co sugeruje, że przygotowywanie próbek w niższej temperaturze płytki może znacząco zmienić rozkład cząsteczek i zmniejszyć heterogeniczność.Obraz jonu fragmentacyjnego protonowanej bradykininy wykazuje podobną tendencję jak w przypadku sodowanego maltotriozy. Analizy statystyczne wskazują, że heterogeniczność sygnałów jonowych otrzymanych przy temperaturze płytki z próbkami wynoszącej 5 °C zmniejsza się o 60 do 80 procent w stosunku do wyników przy 25 °C. W przypadku sodowanego maltotriozy, przy temperaturze płytki z próbkami 25 °C, intensywności sygnałów w centrach są znacznie niższe niż przy temperaturze 5 °C.Protonowany fragment bradykininy wykazuje mniejszą zmienność przy obniżeniu temperatury płytki z próbkami z 25 do 5 stopni Celsiusza. Podczas stosowania tej metody suszenia temperatury i wilgotność względna w komorze suszącej muszą być starannie kontrolowane i monitorowane. Po opanowaniu tej techniki przygotowanie próbki może zająć 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie MALDI MS do eksploracji analiz ilościowych próbek w formie wysuszonych kropli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania homogenicznych próbek w formie wysuszonych kropli do analizy MALDI MS.

preparation-of-homogeneous-maldi-samples-for-quantitative-applications

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Ten protokół opisuje użycie spektrometrii mas MALDI-TOF na komórkach eukariotycznych. Tutaj ilustrujemy dokładność tej techniki, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Naucz się przygotowywać jednorodne próbki MALDI MS poprzez kontrolowane suszenie z regulacją temperatury. Ta metoda redukuje przestrzenną heterogeniczność sygnałów jonowych i poprawia niezawodność wyników spektrometrii masowej.

Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych

Przeglądaj więcej filmów