Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Ogólnym celem tych procedur eksperymentalnych jest obserwacja różnych sygnatur terroir w metabolomie i transkryptomie jagód odmiany winorośli Corvina. Opisane tutaj studium przypadku polegało na pobraniu i analizie próbek na trzech etapach dojrzewania z siedmiu winnic w trzech makrostrefach w ciągu trzech sezonów wegetacyjnych. Opisane techniki ujawniają powszechny wpływ dojrzewania w okresie vintage na metabolom jagód.

W dojrzałych jagodach zidentyfikowano również wyraźne specyficzne sygnatury chemiczne reprezentujące trzy makrostrefy. Sygnatura terroir na poziomie makrostrefy została ujawniona przy użyciu odpowiednich technik statystycznych, takich jak PCA, która jest analizą głównych składowych, oraz auto BLSDA, która jest dwukierunkowym rzutem ortogonalnym na struktury ołowiane, analizą dyskretną, do analizy zarówno transkryptomiki, jak i macierzy danych metabalomicznej. Z drugiej strony, różnice między poszczególnymi winnicami są bardziej subtelne, a także wymagają bardziej wyrafinowanego i czułego podejścia statystycznego.

Rozpocznij eksperyment od opracowania odpowiedniego planu pobierania próbek. Należy zapewnić, aby plan pobierania próbek określał miejsca, czas pobierania próbek i dokładną procedurę pobierania próbek. Po zebraniu 30 kiści z różnych miejsc wzdłuż dwóch rzędów winorośli, wybierz losowo trzy jagody z każdej kiści, unikając tych z widocznymi uszkodzeniami i/lub oznakami infekcji.

Powtórz ten proces, aby uzyskać trzy niezależne pule na każdy etap dojrzewania. Usuń pestki z jagód i natychmiast zamroź owocnię w ciekłym azocie. Zmiażdż wszystkie zamrożone jagody z każdej puli za pomocą automatycznego młynka.

Podziel każdą sproszkowaną próbkę na dwie równe części, jedną do analizy transkryptomicznej, a drugą do analizy metabolomicznej. Następnie zamknij i wyjmij duer, a proszki przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotować ekstrakty metaboliczne z próbek jagód w temperaturze pokojowej w trzech objętościach metanolu, zakwaszonych 0,1% kwasem mrówkowym, w łaźni ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kiloherców przez 15 minut.

Odwirować ekstrakty w temperaturze 16 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozcieńczyć supernatent w dwóch objętościach wody dejonizowanej i przepuścić przez filtr 0,2 mikrona. Zainstalować wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu źródła jonizacji elektrorozpylania lub systemu HPLC-ESI-MS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przeprowadzić separację HPLC z liniowym gradientem rozpuszczalników A i B przy stałym natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę, używając objętości wtrysku próbki wynoszącej 30 mikrolitrów. Uzyskaj widma masowe w naprzemiennych trybach jonizacji ujemnej i dodatniej, z parametrami wymienionymi w protokole tekstowym. Aby przetworzyć dane LCMS, należy zaimplementować procedury wyrównywania wykrywania pików, wypełniania luk i filtrowania pików za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak oprogramowanie open source M Zeta Mine w wersji 2.14.

Zaimportuj wynikowe pliki tekstowe do arkusza kalkulacyjnego. W ten sposób powstaje matryca danych, w której wszystkie wykryte metabolity rozpoznane na podstawie numeru identyfikacyjnego, wartości stosunku masy do ładunku i czasu retencji są określane ilościowo we wszystkich próbkach pod względem wartości ich powierzchni pików. Przygotuj zestaw hybrydyzacyjny w oparciu o specyfikacje formatu czterech opakowań, umieszczając 1,65 mikrograma komplementarnego RNA znakowanego cyjaniną w końcowej objętości 41,8 mikrolitra wody wolnej od dejonizowanej RNAzy.

Dodaj 11 mikrolitrów 10-krotnego środka blokującego i 2,2 mikrolitra 25-krotnego buforu do fragmentacji. Inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut w kąpieli termostatycznej, aby rozdrobnić RNA. Po 30 minutach natychmiast schłodzić na lodzie przez jedną minutę.

Na koniec dodaj 55 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego 2X i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Po wirowaniu przez jedną minutę w temperaturze 15 500 razy g w temperaturze pokojowej, natychmiast umieść probówkę mikrowirówki na lodzie. Aby załadować niestandardową mikromatrycę, załaduj suwak uszczelki z etykietą skierowaną do góry do podstawy komory hybrydyzacyjnej.

Powoli załaduj 100 mikrolitrów próbki hybrydyzacji na każdą uszczelkę, dozując płyn końcówką pipety, unikając pęcherzyków. Powoli umieść niestandardową mikromacierz skierowaną w dół, upewniając się, że numeryczny kod kreskowy jest skierowany do góry. Upewnij się, że para kanapek jest prawidłowo wyrównana.

Na koniec umieść pokrywę komory hybrydyzacji na szkiełkach warstwowych i ręcznie dokręć zacisk do komory. Obróć zmontowaną komorę, aby ocenić ruchliwość pęcherzyków. Umieść zmontowaną komorę szkiełkową w zrównoważonym rożnie, w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 65 stopni Celsjusza.

Ustaw rotator tak, aby obracał się z prędkością 10 obr./min. Pozwól hybrydyzacji postępować przez 17 godzin. Aby przystąpić do mycia szkiełek z mikromatrycą, przygotuj trzy naczynia do barwienia szkiełek i napełnij je odpowiednimi do mycia.

Napełnij dwa naczynia pierwszym buforem do mycia o temperaturze pokojowej, a jedno naczynie wstępnie podgrzanym buforem do mycia dwa. Zdemontuj komorę hybrydyzacji i wyjmij kanapkę. Z numerycznym kodem kreskowym na szkiełku z mikromatrycą skierowanym do góry, zanurz kanapkę w pierwszym naczyniu do barwienia szkiełek wypełnionym buforem do mycia w temperaturze pokojowej i za pomocą czystych kleszczy oddziel uszczelkę od szkiełka mikromatrycy.

Szybko przenieś szkiełko do szkiełka do stojaka na szkiełka i umieść je w drugim naczyniu do barwienia szkiełek wypełnionym pierwszym buforem do mycia w temperaturze pokojowej. Umieść naczynie do barwienia szkiełka na mieszadle magnetycznym i myj przez minutę, mieszając. Szybko przenieś ruszt do szkiełek do trzeciego naczynia do barwienia szkiełek, wypełnionego wstępnie podgrzanym buforem do mycia nr dwa i myj przez minutę z umiarkowanym mieszaniem.

Powoli wyjmij ruszt z naczynia do barwienia szkiełek i ostrożnie wyjmij szkiełko z rusztu, unikając kropel. Umieść szkiełko mikromacierzy w odpowiednim skanerze i zeskanuj każdą matrycę, korzystając z ustawień parametrów zalecanych w instrukcji obsługi producenta mikromacierzy. Aby przygotować oprogramowanie do analizy statystycznej, najpierw zaimportuj dane metabolomiczne i transkryptomiczne.

Przejdź do Plik, Nowy zwykły projekt, Nowy regularny projekt, aby zaimportować uzyskaną macierz danych. Następnie kliknij Edytuj. Transponuj całą matrycę, dom i przypisz odpowiednie podstawowe i drugorzędne ID.

Aby przeprowadzić wielowymiarową analizę statystyczną, przejdź do okna Zadanie, wybierz PCAX jako typ modelu i kliknij Autodopasowanie. Wybierz pozycję Wyniki, a następnie pozycję Punktowe, aby wyświetlić wykres przedstawiający możliwe grupowanie próbek. Sprawdź wykres punktacji PCA.

Jeśli uzyskany zostanie dobry model, użyj tych samych klas próbek, aby zbudować model analizy dyskryminacyjnej O2PLS. Aby utworzyć dwa modele analizy dyskryminacyjnej O2PLS przy użyciu próbek sklasyfikowanych przez MacroZone, przypisz klasy, przechodząc do Okno główne, Nowe jako, M1 i Obserwacje. Ustaw żądane klasy.

Następnie zmień typ modelu z PCAX na analizę dyskryminacyjną O2PLS. Naciśnij przycisk Autodopasowanie. Przejdź do pozycji Wybierz M2 w oknie projektu i kliknij pozycję Wyniki, a następnie pozycję Punktowe, aby wyświetlić wykres i pozycję klas próbki.

Przejdź do pozycji Wybierz typ danych, a następnie wybierz pozycję Obserwacje i obciążenia. Następnie kliknij przycisk Dodaj serię i wybierz elementy Pierwsza korelacja PQ i Korelacja PQ dwa lub dalsze składniki, jeśli są obecne. Po naciśnięciu prawego przycisku myszy na wykresie przejdź do Właściwość, wybierz Kolor, a następnie wybierz Według terminów, aby rozróżnić symbole wykresu wśród cząsteczek i klas.

Przejdź do pozycji Układ, Formatuj wydruk, Access i/lub Style, aby zmodyfikować wydruk o żądane cechy. Aby zaobserwować, jakie metabolity charakteryzują jedną lub więcej określonych klas, przejdź do Lista wykresów, a następnie Rozproszenie. Eksploracyjna analiza całej macierzy danych za pomocą PCA wykazała, że próbki grupowane są zgodnie z etapem dojrzewania, w tym veraison, w połowie dojrzewania i dojrzały, wzdłuż pierwszego i drugiego głównego składnika.

Próbki grupowały się zgodnie z sezonem wegetacyjnym wzdłuż trzeciego głównego składnika. Analiza dyskryminacyjna O2PLS dojrzałych jagód pozwala na identyfikację specyficznych sygnatur terroir, reprezentujących trzy makrostrefy: Valpolicella, Garda Lake i Soave. Wykresy obciążenia tych modeli są wyrażone jako korelacja PQ, korelacja między P, klasą próbek, a Q, metabolitami.

Na wykresach obciążeniowych czerwone kwadraty reprezentują klasę próbek lub makrostref, a kolorowe trójkąty reprezentują poszczególne metabolity. Metabolity są oznaczone kolorami zgodnie z ich klasą chemiczną, a odległość między metabolitami a próbkami odzwierciedla ich relacje. Makrostrefa jeziora Garda charakteryzowała się stylbenami, podczas gdy Soave i Valpolicella charakteryzowały się flawonoidami.

Wśród antocyjanów peonidyna i jej pochodne były bardziej rozpowszechnione w makrostrefie jeziora Garda, podczas gdy inne antocyjany były bardziej rozpowszechnione w makrostrefie Valpolicella. Ponadto antocyjany trój-O-glukozydy były bardziej rozpowszechnione w makrostrefie Valpolicella, podczas gdy acylowane i kumeryzowane pochodne były bardziej rozpowszechnione w makrostrefie Soave. Transkryptomika, RZS i metody sig RNA pozwalają na jednoczesne monitorowanie tysięcy transkryptów winorośli.

Niedawno zaprojektowano nową, niestandardową mikromacierz, która reprezentuje jeszcze większą liczbę sond, reprezentujących dodatkowy, nowo odkryty rodzaj winorośli. Biorąc pod uwagę szybkie starzenie się platform transkryptomicznych, opisaliśmy alternatywną procedurę przy użyciu nowej platformy, która zawiera więcej sond niż stara, w tym 249 więcej przewidywanych transkryptów peno, dla 1392 nowo zidentyfikowanych loci peno i 179 genów corvina prava. Analiza metabolomiczna za pomocą HPLC-ESI-MS jest wystarczająco czuła, aby wykryć dużą liczbę metabolitów jednocześnie.

Możliwość stworzenia równiny próbkowania ma kluczowe znaczenie. Wybór jednego klonu w celu zminimalizowania różnic genetycznych oraz wielokrotny czas trwania pobierania próbek pozwoliły na zidentyfikowanie rzeczywistych różnic między terroir. Interesujące byłoby porównanie tej samej odmiany uprawianej w mniej optymalnych strefach, ale niestety te winnice nie były dostępne.