Name: Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Odkryj analizę metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron Corvina w kontekście terroir. Metody PCA i auto BLSDA ujawniają chemiczne sygnatury makroregionów i wpływ rocznika na jakość owoców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca skorzystała z działań sieciowych koordynowanych w ramach finansowanego przez UE COST ACTION FA1106 "Zintegrowane podejście systemowe do określenia mechanizmów rozwojowych kontrolujących jakość mięsistych owoców w pomidorach i winoroślach". Prace te były wspierane przez projekt "Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale" finansowany przez Fundację Banku CARIVERONA oraz przez projekt "Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)" finansowany przez włoskie Ministerstwo Polityki Rolnej i Leśnej. SDS został sfinansowany przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych FIRB RBFR13GHC5 projekt "The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions".

<ol><li>Jessome, L. L., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+suppression%3A+A+major+concern+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lc+Gc+N+Am%22%5BJournal%5D)">Ion suppression: A major concern in mass spectrometry.</a> Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+plant+metabolomics%3A+where+do+we+stand%2C+where+do+we+go%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotech%22%5BJournal%5D)">NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?</a> Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolomics%3A+large-scale+phytochemistry+in+the+functional+genomics+era%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem%22%5BJournal%5D)">Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era.</a> Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).</li>
<li>Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+matrix+effects+in+metabolite+profiling+based+on+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).</li>
<li>Toffali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+aspects+of+grape+berry+ripening+and+post-harvest+withering+revealed+by+untargeted+LC-ESI-MS+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis.</a> Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).</li>
<li>Martin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+trust+untargeted+metabolomics%3F+Results+of+the+metabo-ring+initiative%2C+a+large-scale%2C+multi-instrument+inter-laboratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study.</a> Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).</li>
<li>Jaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+grapevine+genome+sequence+suggests+ancestral+hexaploidization+in+major+angiosperm+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla.</a> Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).</li>
<li>Velasco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+draft+consensus+sequence+of+the+genome+of+a+heterozygous+grapevine+variety%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety.</a> Plos One. 2 (12), (2007).</li>
<li>Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTornielli%2C+GB+%22The+Biochemestry+of+the+Grape+Berry%22">The Biochemestry of the Grape Berry</a>. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).</li>
<li>Anesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+scientific+interpretation+of+the+terroir+concept%3A+plasticity+of+the+grape+berry+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome.</a> BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).</li>
<li>Berdeja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+limitation+and+rootstock+genotype+interact+to+alter+grape+berry+metabolism+through+transcriptome+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Hort+Res%22%5BJournal%5D)">Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming.</a> Hort Res. 2, 1-13 (2015).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solar+ultraviolet+radiation+is+necessary+to+enhance+grapevine+fruit+ripening+transcriptional+and+phenolic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sampling+bias+in+molecular+studies+of+grapevine+fruit+ripening%3A+transcriptomic+assessment+of+the+density+sorting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Exp+Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method.</a> Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillatory+transcriptional+programs+in+grapevine+ripening+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).</li>
<li>Cavallini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+grapevine+MYB5a+and+MYB5b+in+the+control+of+flavonoid+biosynthesis+in+a+petunia+anthocyanin+regulatory+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant.</a> Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).</li>
<li>Cramer, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+the+late+stages+of+grapevine+%28Vitis+vinifera+cv.+Cabernet+Sauvignon%29+berry+ripening+reveals+significant+induction+of+ethylene+signaling+and+flavor+pathways+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+the+grapevine+berry+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The plasticity of the grapevine berry transcriptome.</a> Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).</li>
<li>Fasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li>
<li>Gambino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+between+Grapevine+rupestris+stem+pitting-associated+virus+and+Vitis+vinifera+L.+leads+to+decreased+defence+responses+and+increased+transcription+of+genes+related+to+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis.</a> J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).</li>
<li>Ghan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+omic+technologies+are+concordant+in+differentiating+the+biochemical+characteristics+of+the+berries+of+five+grapevine+%28Vitis+vinifera+L.%29+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+defoliation+affects+plant+growth%2C+fruit+transcriptional+ripening+program+and+flavonoid+metabolism+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine.</a> BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).</li>
<li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+source%2Fsink+ratio+in+Vitis+vinifera+%28cv+Sangiovese%29+induces+extensive+transcriptome+reprogramming+and+modifies+berry+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening.</a> BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).</li>
<li>Rinaldo, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Grapevine+Anthocyanin+Acyltransferase%2C+Transcriptionally+Regulated+by+VvMYBA%2C+Can+Produce+Most+Acylated+Anthocyanins+Present+in+Grape+Skins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins.</a> Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).</li>
<li>Royo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental%2C+transcriptome%2C+and+genetic+alterations+associated+with+parthenocarpy+in+the+grapevine+seedless+somatic+variant+Corinto+bianco%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco.</a> J Exp Bot. , 259-273 (2015).</li>
<li>Venturini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+transcriptome+characterization+of+Vitis+vinifera+cv.+Corvina+unveils+varietal+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity.</a> BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).</li>
<li>Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+metabolomics%3A+an+emerging+approach+to+determine+the+composition+of+herbal+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products.</a> Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+Modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano metabolomikę, transkryptomikę i protokoły analizy statystycznej stosowane do interpretacji koncepcji terroir z jagód winogron. Analiza metabolomiczna za pomocą HPLC-ESI-MS jest wystarczająco czuła, aby wykryć dużą liczbę metabolitów jednocześnie, ale na względną ocenę ilościową wpływa efekt matrycy i tłumienie/wzmacnianie jonów. Podobne podejście zastosowano już jednak do opisania dojrzewania i więdnięcia jagód Corvina po zbiorach, a korekta efektów matrycy miała ograniczony wpływ na wyniki5</...

Analiza danych na dużą skalę oparta na genomach, transkryptomach, proteomach i metabolomach roślin dostarcza bezprecedensowego wglądu w zachowanie złożonych systemów, takich jak cechy terroir wina, które odzwierciedlają interakcje między roślinami winorośli a ich środowiskiem. Ponieważ terroir wina może być odrębny nawet wtedy, gdy identyczne klony winorośli są uprawiane w różnych winnicach, analiza genomiczna jest mało przydatna, ponieważ genomy klonów są identyczne. Zamiast tego konieczne jest przyjrzenie się korelacjom między ekspresją genów a właściwościami metabolicznymi jagód, które decydują o cechach jakościowych wina. Analiza ekspresji genów na poziomie transkryptomu korzysta z podobnych właściwości chemicznych wszystkich transkryptów, co ułatwia analizę ilościową poprzez wykorzystanie uniwersalnych cech, takich jak hybrydyzacja do unieruchomionych sond na mikromacierzach. Natomiast uniwersalne metody analityczne w proteomice i metabolomice są trudniejsze ze względu na ogromną różnorodność fizyczną i chemiczną poszczególnych białek i metabolitów. W przypadku metabolomiki ta różnorodność jest jeszcze bardziej ekstremalna, ponieważ poszczególne metabolity różnią się znacznie pod względem wielkości, polarności, obfitości i lotności, więc żaden pojedynczy proces ekstrakcji ani metoda analityczna nie oferuje holistycznego podejścia.
Wśród platform analitycznych odpowiednich dla metabolitów nielotnych, te oparte na wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (HPLC-MS) są znacznie bardziej czułe niż alternatywy, takie jak HPLC z detektorami ultrafioletowymi lub diodowymi (HPLC-UV, HPLC-DAD) lub spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), ale na analizę ilościową za pomocą HPLC-MS mogą wpływać takie zjawiska jak efekt matrycy i tłumienie/wzmacnianie jonów1-3. Badanie takich skutków podczas analizy jagód winogron Corvina za pomocą HPLC-MS przy użyciu źródła jonizacji elektrorozpylania (HPLC-ESI-MS) wykazało, że cukry i inne cząsteczki o najniższych czasach retencji były silnie zaniżone, co prawdopodobnie odzwierciedlało również dużą liczbę cząsteczek w tej strefie, oraz że obfitość innych cząsteczek może być niedoszacowana, przeszacowana lub niezależna od efektu matrycy, Jednak normalizacja danych dla efektu macierzy wydawała się mieć ograniczony wpływ na ogólne wyniki4,5. Opisana w niniejszym dokumencie metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy metabolitów o średniej polarności, które gromadzą się w dużych stężeniach w jagodach winogron podczas dojrzewania i na które terroir ma znaczący wpływ. Należą do nich antocyjany, flawonole, flawan-3-ole, procyjanidyny, inne flawonoidy, resweratrol, stylbeny, kwasy hydroksycynamonowe i kwasy hydroksybenzoesowe, które razem decydują o barwie, smaku i właściwościach zdrowotnych win. Inne metabolity, takie jak cukry i alifatyczne kwasy organiczne, są ignorowane, ponieważ oznaczanie ilościowe za pomocą HPLC-MS jest niewiarygodne ze względu na efekt matrycy i zjawiska supresji jonów5. W zakresie polaryzacji wybranym tą metodą podejście to jest nieukierunkowane, ponieważ ma na celu wykrycie jak największej liczby różnych metabolitów6.
Metody transkryptomiczne, które pozwalają na jednoczesne monitorowanie tysięcy transkryptów winorośli, są ułatwione dzięki dostępności kompletnej sekwencjigenomu winorośli 7,8. Wczesne metody transkryptomiczne oparte na wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu cDNA ewoluowały wraz z nadejściem sekwencjonowania nowej generacji w zbiór procedur określanych zbiorczo jako technologia sekwencjonowania RNA. Podejście to szybko staje się metodą z wyboru w badaniach transkryptomicznych. Jednak duża literatura oparta na mikromacierzach, która pozwala na równoległe ilościowe oznaczanie tysięcy transkryptów przez hybrydyzację, zgromadziła się dla winorośli. Rzeczywiście, zanim sekwencjonowanie RNA stało się główną technologią, opracowano wiele dedykowanych komercyjnych platform mikromacierzy, które umożliwiały bardzo szczegółowe badanie transkryptomu winorośli. Spośród ogromnej różnorodności platform, tylko dwie umożliwiały analizę transkryptomu całego genomu9. Najbardziej rozwinięta matryca pozwoliła na hybrydyzację do 12 niezależnych próbek na jednym urządzeniu, zmniejszając w ten sposób koszty każdego eksperymentu. Każdy z 12 podukładów składał się z 135 000 60-merowych sond reprezentujących 29 549 transkryptów winorośli. To urządzenie było używane w wielu badaniach10-24. Te dwie platformy zostały obecnie wycofane z produkcji, ale niedawno zaprojektowano nową, niestandardową mikromacierz, która stanowi nowsze osiągnięcie, ponieważ zawiera jeszcze większą liczbę sond reprezentujących dodatkowe nowo odkryte geny winorośli25.
Duże zbiory danych uzyskane przez transkryptomikę i analizę metabolomiczną wymagają odpowiednich metod statystycznych do analizy danych, w tym technik wielowymiarowych do określania korelacji między różnymi formami danych. Najpowszechniej stosowanymi technikami wielowymiarowymi są techniki oparte na projekcji, które mogą być nienadzorowane, takie jak analiza głównych składowych (PCA), lub nadzorowane, takie jak dwukierunkowa analiza dyskryminacyjna z rzutowania ortogonalnego na struktury utajone (O2PLS-DA)26. Protokół przedstawiony w tym artykule wykorzystuje PCA do eksploracyjnej analizy danych oraz O2PLS-DA do identyfikacji różnic między grupami próbek.

<table><tbody><tr><td>Młynek Młyn</td><td>IKA</td><td>IKA A11 podstawowy</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Autosampler</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp;-</td><td>System Gold 508 Autosampler</td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp;-</td><td>System Gold 127 Moduł rozpuszczalnika HPLC</td></tr><tr><td>C18 Kolumna ochronna</td><td>Grace</td><td>&nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 &mu; m) Kolumna ochronna</td></tr><tr><td>C18 Kolumna</td><td>Grace</td><td>&nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 &mu; m) Kolumnowy</td></tr><tr><td>spektrometr masowy</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&nbsp;-</td><td>Bruker Esquire 6000; Spektrometr masowy był wyposażony w źródło ESI, a analizator był pułapką jonową.</td></tr><tr><td>Rozpuszczalniki ekstrakcyjne i HPLC</td><td>Sigma</td><td>34966</td><td>Metanol LC-MS klasa</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>94318</td><td>Kwas mrówkowy LC-MS gatunek</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>34967</td><td>Acetonitryl LC-MS gatunek</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>39253</td><td>Woda&nbsp; Filtry</td> strzykawkowe LC-MS Minisart <td></td></tr><tr><td>RC 4 (0,2 &mu; m)</td> <td>Sartorius</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do zbierania i przetwarzania danych (a) i przetwarzania (b)</td> <td>Bruker Daltonics-Bruker</td><td></td> <td>Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Oprogramowanie Esquire 3.2 do analizy danych i MzMine 2.2 (b)</td></tr><tr><td>Zestaw Spectrum Plant Total RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN250-1KT</td><td>Do ekstrakcji całkowitego RNA z owocni winogron</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Odczynniki</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Chipy RNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania ekspresji genów Agilent 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania ekspresji genów Agilent 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do etykietowania QuickAmp o niskim wkładzie jednokolorowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2305</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNA Spike In - jednokolorowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5282</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genów</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5242</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>do oczyszczania cRNA</td></tr><tr><td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-merowa mikromacierz</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F-048771&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>eArray</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td><a href="https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/</a>Prowadnice</td></tr> <tr><td>uszczelkowe</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60012</td><td>Włącz Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybrydyzacja</td></tr><tr><td>Wanna termostatyczna</td><td>Julabo-Komora</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hybrydyzacji</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60001</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji mikromacierzy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji Rotator</td><td>Rack Agilent Technologies</td><td>G2530-60029</td><td></td></tr><tr><td>Pręt do konwersji rotatora</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2530-60030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia</td><td>Bio-Optica</td><td>10-2000</td><td>Naczynie do barwienia szkiełkowego i stojak na slajdy</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>AREX Ogrzewanie Mieszadło magnetyczne</td><td>F20540163&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik termostatyczny</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus - 6030</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikromatrycowy Agilent</td><td>Technologies</td><td>G2565CA</td><td></td></tr><tr><td>Karuzela skanera, 48-pozycyjna</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60502</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do prowadnic</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do ekstrakcji cech v11.5</td><td>Agilent Technologie</td> <td>w</td> <td>skanerze mikromacierzowym Agilent G2565CA</td></tr><tr><td>oprogramowanie SIMCA + V13</td><td>Umetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir odnosi się do kombinacji czynników środowiskowych, które wpływają na cechy upraw, takich jak winorośl (Vitis vinifera) zgodnie z określonymi siedliskami i praktykami zarządzania. W tym artykule pokazano, w jaki sposób można wykryć pewne sygnatury terroir w metabolomie i transkryptomie jagód odmiany winorośli Corvina za pomocą wielowymiarowej analizy statystycznej. Metoda wymaga najpierw odpowiedniego planu pobierania próbek. W tym studium przypadku wybrano konkretny klon odmiany Corvina w celu zminimalizowania różnic genetycznych, a próbki pobrano z siedmiu winnic reprezentujących trzy różne makrostrefy podczas trzech różnych sezonów wegetacyjnych. Ze względu na wysoką czułość, zalecane jest podejście metabolomiczne oparte na nieukierunkowanym LC-MS, któremu towarzyszy wydajne przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania MZmine oraz strategia identyfikacji metabolitów oparta na analizie drzewa fragmentacji. Kompleksową analizę transkryptomu można uzyskać za pomocą mikromacierzy zawierających sondy pokrywające ~99% wszystkich przewidywanych genów winorośli, co pozwala na jednoczesną analizę wszystkich genów o zróżnicowanej ekspresji w kontekście różnych terroir. Wreszcie, wielowymiarowa analiza danych oparta na metodach projekcji może być wykorzystana do przezwyciężenia silnego efektu specyficznego dla rocznika, umożliwiając integrację i szczegółową analizę danych metabolomicznych i transkryptomicznych w celu zidentyfikowania korelacji informacyjnych.

Studium przypadku opisane w niniejszym artykule dostarczyło końcową macierz danych obejmującą 552 sygnały (cechy m/z), w tym jony molekularne wraz z ich izotopami, adduktami i niektórymi fragmentami, poddane względnej kwantyfikacji w 189 próbkach (7 winnic x 3 stadia dojrzewania x 3 sezony wegetacyjne x 3 powtórzenia biologiczne). Całkowita liczba punktów danych wyniosła zatem 104 328. Analiza drzew fragmentacji pozwoliła na adnotację 282 cech m/z, odpowiadających metabo...

Ten artykuł opisuje zastosowanie nieukierunkowanej metabolomiki, transkryptomiki i wielowymiarowej analizy statystycznej do transkryptów i metabolitów z jagód winogron w celu uzyskania wglądu w koncepcję terroir, tj. wpływ środowiska na cechy jakości jagód.

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Ogólnym celem opisanych procedur eksperymentalnych jest obserwacja różnych sygnatur terroir w metabolomie i transkryptomie jagód winorośli odmiany Corvina. Opisane studium przypadku obejmowało pobieranie i analizę próbek w trzech etapach dojrzewania z siedmiu winnic w trzech makrostrefach w ciągu trzech sezonów wegetacyjnych. Opisane techniki ujawniają dominujący wpływ rocznika (dojrzewania w danym roku) na metabolom jagód.W dojrzałych owocach zidentyfikowano również wyraźne sygnatury chemiczne reprezentujące trzy makrostrefy. Sygnaturę terroir na poziomie makrostrefy ujawniono przy użyciu odpowiednich technik statystycznych, takich jak PCA (analiza głównych składowych) oraz auto BLSDA (dwukierunkowa ortogonalna projekcja do struktur prowadzących, analiza dyskryminacyjna), aby przeanalizować macierze danych z transcriptomics oraz metabalomics. Z drugiej strony, różnice między poszczególnymi winnicami są bardziej subtelne i wymagają bardziej zaawansowanych oraz czułych podejść statystycznych.Eksperyment należy rozpocząć od opracowania odpowiedniego planu pobierania próbek. Należy upewnić się, że plan ten określa miejsca i terminy poboru, a także precyzyjną procedurę pobierania próbek. Po zebraniu 30 gron z różnych pozycji wzdłuż dwóch rzędów winorośli, z każdego grona należy losowo wybrać trzy jagody, unikając tych z widocznymi uszkodzeniami lub oznakami infekcji.Powtórz ten proces, aby uzyskać trzy niezależne pule dla każdego etapu dojrzewania. Usuń nasiona z owoców i natychmiast zamroź okwapi w ciekłym azocie. Zmiel wszystkie zamrożone owoce z każdej puli za pomocą automatycznego młyna rozcierającego.Podziel każdą sproszkowaną próbkę na dwie równe części: jedną do analizy transkryptomicznej, a drugą do analizy metabolomicznej. Następnie zamknij i zdejmij moździerz, a proszki przechowuj w temperaturze -80 °C. Przygotuj ekstrakty metaboliczne z próbek owoców jagód w temperaturze pokojowej, stosując trzy objętości metanolu zakwaszonego 0,1% kwasem mrówkowym, w kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz przez 15 minut.Odwiruj ekstrakty przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozcieńcz supernatant w dwóch objętościach wody dejonizowanej i przepuść przez filtr 0,2 mikrona. Przygotuj układ wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z wykorzystaniem źródła jonizacji rozpylnej (system HPLC-ESI-MS), zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przeprowadź rozdział HPLC z liniowym gradientem rozpuszczalników A i B przy stałej prędkości przepływu 0,2 milliliters per minute, stosując objętość wstrzykiwanej próbki wynoszącą 30 microliters. Rejestruj widma mas w naprzemiennych trybach jonizacji ujemnej i dodatniej, zgodnie z parametrami wymienionymi w protokole tekstowym. W celu przetworzenia danych LCMS wykonaj procedury detekcji pików, wyrównywania, uzupełniania luk oraz filtrowania pików przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak oprogramowanie open source M Zeta Mine w wersji 2.14.Zaimportuj wynikowe pliki tekstowe do arkusza kalkulacyjnego. Pozwala to na utworzenie macierzy danych, w której wszystkie wykryte metabolity zidentyfikowane za pomocą numeru identyfikacyjnego, wartości stosunku masy do ładunku oraz czasu retencji są ilościowane we wszystkich próbkach na podstawie wartości powierzchni ich pików. Przygotuj zestaw do hybrydyzacji zgodnie ze specyfikacjami formatu czteropakowego, umieszczając 1,65 µg znakowanego cyjaniną komplementarnego RNA w końcowej objętości 41,8 µL odsolonej wody wolnej od RNazy.Dodać 11 µL 10X agentu blokującego oraz 2,2 µL 25X buforu do fragmentacji. Inkubować w temperaturze 60 °C przez 30 minut w łaźni termostatycznej w celu fragmentacji RNA. Po 30 minutach natychmiast schłodzić na lodzie przez jedną minutę.Na koniec dodaj 55 µL 2X buforu do hybrydyzacji i dokładnie wymieszaj, pipetując. Po wirowaniu przez jedną minutę przy 15 500 ×g w temperaturze pokojowej, bezzwłocznie umieść probówkę do mikrocentryfugi na lodzie. Aby załadować niestandardową mikromacierz, umieść slajd z uszczelką etykietą do góry w podstawie komory hybrydyzacyjnej.Powoli nanieś 100 µL próbki do hybrydyzacji do każdej studzienki uszczelki, dozując płyn końcówką pipety w sposób zapobiegający powstawaniu pęcherzyków powietrza. Powoli umieść dedykowany mikroarray stroną aktywną do dołu, upewniając się, że numeryczny kod kreskowy znajduje się na górze. Upewnij się, że para warstw jest prawidłowo wyrównana.Na koniec nałóż pokrywę komory hybrydyzacyjnej na zestaw okładkowych szkiełek i ręcznie dokręć zacisk komory. Obróć zmontowaną komorę, aby ocenić ruch pęcherzyków powietrza. Umieść zmontowaną komorę ze szkiełkami w zbalansowanym rotatorze, w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 65 °C.Ustaw rotator na prędkość 10 RPM. Pozostaw próbki do hybrydyzacji na 17 godzin. Aby przejść do etapu przemywania szkiełek z mikroarrayem, przygotuj trzy kuwety do barwienia szkiełek i napełnij je odpowiednimi buforami do przemywania.Napełnij dwie płytki buforem do płukania jeden w temperaturze pokojowej, a jedną płytkę podgrzanym wcześniej buforem do płukania dwa. Rozmontuj komorę hybrydyzacyjną i wyjmij kanapkę. Zanurz kanapkę kodem kreskowym na szkiełku mikroarray skierowanym do góry w pierwszej płytce do barwienia szkiełek wypełnionej buforem do płukania jeden w temperaturze pokojowej, a następnie za pomocą czystej pęsety oddziel uszczelkę od szkiełka mikroarray.Szybko przenieś szkiełko z mikroarray do statywu na szkiełka i umieść je w drugiej kuwecie do barwienia szkiełek wypełnionej buforem do mycia 1 w temperaturze pokojowej. Postaw kuwetę do barwienia na mieszalniku magnetycznym i myj przez jedną minutę przy umiarkowanym mieszaniu. Szybko przenieś statyw na szkiełka do trzeciej kuwety do barwienia, wypełnionej uprzednio podgrzanym buforem do mycia 2, i myj przez jedną minutę przy umiarkowanym mieszaniu.Powoli wyjmij statyw z naczynia do barwienia preparatów, a następnie ostrożnie wyjmij slajd ze statywu, unikając powstawania kropel. Umieść slajd z mikroarray w odpowiednim skanerze i zeskanuj każdą macierz, stosując ustawienia parametrów zalecane w instrukcji obsługi producenta mikroarray. Aby przygotować oprogramowanie do analizy statystycznej, najpierw zaimportuj dane metabolomiczne i transkryptomiczne.Przejdź do File, New Regular Project, New Regular Project, aby zaimportować otrzymaną macierz danych. Następnie kliknij Edit. Wykonaj transpozycję całej macierzy, home, i przypisz odpowiednie identyfikatory primary oraz secondary. Na koniec zatwierdź zmiany.Aby przeprowadzić wielowymiarową analizę statystyczną, przejdź do okna Workset, wybierz PCAX jako typ modelu i kliknij AutoFit. Wybierz Scores, a następnie Scatter, aby wyświetlić wykres przedstawiający możliwe grupowanie próbek. Przeanalizuj wykres wyników PCA.Jeśli uzyskano odpowiedni model, należy wykorzystać te same klasy próbek do zbudowania modelu analizy dyskryminacyjnej O2PLS. Aby zbudować dwa modele analizy dyskryminacyjnej O2PLS przy użyciu próbek zaklasyfikowanych przez MacroZone, przypisz klasy, przechodząc w oknie Home do New As, M1, a następnie Observations. Ustaw odpowiednie klasy.Następnie zmień typ modelu z PCAX na analizę dyskryminacyjną O2PLS. Naciśnij Autofit. W oknie projektu wybierz M2, kliknij Scores, a następnie Scatter, aby wyświetlić wykres i położenie klas próbek.Przejdź do sekcji Select Data Type i wybierz Observations and Loadings. Następnie kliknij Add Series i wybierz pozycje PQ correlation one oraz PQ correlation two lub kolejne komponenty, jeśli są dostępne. Klikając prawym przyciskiem myszy na wykresie, przejdź do opcji Property, wybierz Color, a następnie zaznacz By Terms, aby odróżnić symbole na wykresie w zależności od cząsteczek i klas.Przejdź do sekcji Układ (Layout), Formatuj wykres (Format Plot), Dostęp (Access) i lub Style (Styles), aby zmodyfikować wykres zgodnie z pożądanymi charakterystykami. Aby sprawdzić, jakie metabolity charakteryzują jedną lub więcej konkretnych klas, przejdź do Listy wykresów (Plot List), a następnie do wykresu rozrzutu (Scatter). Analiza eksploracyjna całej macierzy danych za pomocą PCA wykazała, że próbki grupują się zgodnie ze stadium dojrzewania, w tym veraison, średnim etapem dojrzewania oraz pełną dojrzałością, wzdłuż pierwszej i drugiej głównej składowej.Próbki pogrupowały się zgodnie z sezonem wegetacyjnym wzdłuż trzeciej głównej składowej. Analiza dyskryminacyjna O2PLS dojrzałych jagód pozwala na identyfikację specyficznych sygnatur terroir, reprezentujących trzy makrostrefy: Valpolicella, jezioro Garda i Soave. Wykresy ładunków tych modeli są przedstawione jako korelacja PQ, czyli korelacja między P, klasą próbek, a Q, metabolitami.Na wykresach ładunków czerwone kwadraty reprezentują klasę próbek lub makrostref, a kolorowe trójkąty reprezentują poszczególne metabolity. Metabolity są zakodowane kolorami zgodnie z ich klasą chemiczną, a odległość między metabolitami a próbkami odzwierciedla ich zależności. Makrostrefa Jeziora Garda charakteryzowała się obecnością stilbenów, natomiast Soave i Valpolicella wyróżniały się flawonoidami.Wśród antocyjanów peonidyna i jej pochodne były bardziej rozpowszechnione w makrostrefie jeziora Garda, podczas gdy pozostałe antocyjany przeważały w makrostrefie Valpolicella. Ponadto glukozydy 3-O-antocyjanów były częściej spotykane w makrostrefie Valpolicella, natomiast pochodne acylowane i kumerowane dominowały w makrostrefie Soave. Metody transkryptomiki, RA oraz RNA sig pozwalają na jednoczesne monitorowanie tysięcy transkryptów winorośli.Niedawno zaprojektowano nową, niestandardową macierz mikroarray, która zawiera jeszcze większą liczbę sond reprezentujących dodatkowe, nowo odkryte rodzaje winorośli. Biorąc pod uwagę szybką dezaktualizację platform transkryptomicznych, opisaliśmy alternatywną procedurę z wykorzystaniem nowej platformy, która zawiera więcej sond niż poprzednia, w tym 249 dodatkowych przewidywanych transkryptów peno dla 1392 nowo zidentyfikowanych loci peno oraz 179 genów corvina prava. Analiza metabolomiczna metodą HPLC-ESI-MS jest wystarczająco czuła, aby jednocześnie wykrywać duże liczby metabolitów.Kluczowe jest zapewnienie możliwości stworzenia jednolitego planu próbkowania. Wybór jednego klona w celu zminimalizowania różnic genetycznych oraz wieloletni okres próbkowania pozwoliły na zidentyfikowanie rzeczywistych różnic pomiędzy poszczególnymi terroir. Interesujące byłoby porównanie tej samej odmiany uprawianej w strefach mniej optymalnych, jednak niestety takie winnice nie były dostępne.

the-terroir-concept-interpreted-through-grape-berry-metabolomics

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Czas reakcji transferu protonów w locie Spektrometria mas umożliwia bardzo czułą, szybką i nieinwazyjną analizę lotnych związków organicznych. Aby pokazać jej potencjał, podajemy trzy przykłady: fermentację mlekową jogurtu (monitorowanie bioprocesów on-line), różne genotypy jabłek (badania przesiewowe na dużą skalę) oraz przestrzeń zanosową po wypiciu kawy (analiza przestrzeni nosowej).

PTR-ToF-MS w połączeniu ze zautomatyzowanym systemem pobierania próbek i dostosowaną analizą danych do badań żywności: monitorowanie bioprocesów, badania przesiewowe i analiza przestrzeni nosowej

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

Tutaj prezentujemy protokół opisujący metagenomiczny amplikon do określania społeczności bakteryjnej winogron Traminette, winogron fermentujących i końcowego wina.

Profilowanie społeczności bakteryjnej fermentujących winogron traminette podczas produkcji wina przy użyciu sekwencjonowania amplikonów metagenomicznych

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Ten protokół przedstawia porównawczy proces tworzenia transkryptomu i adnotacji de novo dla początkujących bioinformatyków. Przepływ pracy jest dostępny bezpłatnie całkowicie za pośrednictwem CyVerse i połączony przez magazyn danych. Używany jest wiersz poleceń i graficzne interfejsy użytkownika, ale cały potrzebny kod jest dostępny do skopiowania i wklejenia.

Wykorzystanie zasobów CyVerse do transkryptomiki porównawczej de novo organizmów nieobjętych modelem

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Odkryj analizę metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron Corvina w kontekście terroir. Metody PCA i auto BLSDA ujawniają chemiczne sygnatury makroregionów i wpływ rocznika na jakość owoców.

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Przeglądaj więcej filmów