Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Ogólnym celem opisanych procedur eksperymentalnych jest obserwacja różnych sygnatur terroir w metabolomie i transkryptomie jagód winorośli odmiany Corvina. Opisane studium przypadku obejmowało pobieranie i analizę próbek w trzech etapach dojrzewania z siedmiu winnic w trzech makrostrefach w ciągu trzech sezonów wegetacyjnych. Opisane techniki ujawniają dominujący wpływ rocznika (dojrzewania w danym roku) na metabolom jagód.

W dojrzałych owocach zidentyfikowano również wyraźne sygnatury chemiczne reprezentujące trzy makrostrefy. Sygnaturę terroir na poziomie makrostrefy ujawniono przy użyciu odpowiednich technik statystycznych, takich jak PCA (analiza głównych składowych) oraz auto BLSDA (dwukierunkowa ortogonalna projekcja do struktur prowadzących, analiza dyskryminacyjna), aby przeanalizować macierze danych z transcriptomics oraz metabalomics. Z drugiej strony, różnice między poszczególnymi winnicami są bardziej subtelne i wymagają bardziej zaawansowanych oraz czułych podejść statystycznych.

Eksperyment należy rozpocząć od opracowania odpowiedniego planu pobierania próbek. Należy upewnić się, że plan ten określa miejsca i terminy poboru, a także precyzyjną procedurę pobierania próbek. Po zebraniu 30 gron z różnych pozycji wzdłuż dwóch rzędów winorośli, z każdego grona należy losowo wybrać trzy jagody, unikając tych z widocznymi uszkodzeniami lub oznakami infekcji.

Powtórz ten proces, aby uzyskać trzy niezależne pule dla każdego etapu dojrzewania. Usuń nasiona z owoców i natychmiast zamroź okwapi w ciekłym azocie. Zmiel wszystkie zamrożone owoce z każdej puli za pomocą automatycznego młyna rozcierającego.

Podziel każdą sproszkowaną próbkę na dwie równe części: jedną do analizy transkryptomicznej, a drugą do analizy metabolomicznej. Następnie zamknij i zdejmij moździerz, a proszki przechowuj w temperaturze -80 °C. Przygotuj ekstrakty metaboliczne z próbek owoców jagód w temperaturze pokojowej, stosując trzy objętości metanolu zakwaszonego 0,1% kwasem mrówkowym, w kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz przez 15 minut.

Odwiruj ekstrakty przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozcieńcz supernatant w dwóch objętościach wody dejonizowanej i przepuść przez filtr 0,2 mikrona. Przygotuj układ wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z wykorzystaniem źródła jonizacji rozpylnej (system HPLC-ESI-MS), zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przeprowadź rozdział HPLC z liniowym gradientem rozpuszczalników A i B przy stałej prędkości przepływu 0,2 milliliters per minute, stosując objętość wstrzykiwanej próbki wynoszącą 30 microliters. Rejestruj widma mas w naprzemiennych trybach jonizacji ujemnej i dodatniej, zgodnie z parametrami wymienionymi w protokole tekstowym. W celu przetworzenia danych LCMS wykonaj procedury detekcji pików, wyrównywania, uzupełniania luk oraz filtrowania pików przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak oprogramowanie open source M Zeta Mine w wersji 2.14.

Zaimportuj wynikowe pliki tekstowe do arkusza kalkulacyjnego. Pozwala to na utworzenie macierzy danych, w której wszystkie wykryte metabolity zidentyfikowane za pomocą numeru identyfikacyjnego, wartości stosunku masy do ładunku oraz czasu retencji są ilościowane we wszystkich próbkach na podstawie wartości powierzchni ich pików. Przygotuj zestaw do hybrydyzacji zgodnie ze specyfikacjami formatu czteropakowego, umieszczając 1,65 µg znakowanego cyjaniną komplementarnego RNA w końcowej objętości 41,8 µL odsolonej wody wolnej od RNazy.

Dodać 11 µL 10X agentu blokującego oraz 2,2 µL 25X buforu do fragmentacji. Inkubować w temperaturze 60 °C przez 30 minut w łaźni termostatycznej w celu fragmentacji RNA. Po 30 minutach natychmiast schłodzić na lodzie przez jedną minutę.

Na koniec dodaj 55 µL 2X buforu do hybrydyzacji i dokładnie wymieszaj, pipetując. Po wirowaniu przez jedną minutę przy 15 500 ×g w temperaturze pokojowej, bezzwłocznie umieść probówkę do mikrocentryfugi na lodzie. Aby załadować niestandardową mikromacierz, umieść slajd z uszczelką etykietą do góry w podstawie komory hybrydyzacyjnej.

Powoli nanieś 100 µL próbki do hybrydyzacji do każdej studzienki uszczelki, dozując płyn końcówką pipety w sposób zapobiegający powstawaniu pęcherzyków powietrza. Powoli umieść dedykowany mikroarray stroną aktywną do dołu, upewniając się, że numeryczny kod kreskowy znajduje się na górze. Upewnij się, że para warstw jest prawidłowo wyrównana.

Na koniec nałóż pokrywę komory hybrydyzacyjnej na zestaw okładkowych szkiełek i ręcznie dokręć zacisk komory. Obróć zmontowaną komorę, aby ocenić ruch pęcherzyków powietrza. Umieść zmontowaną komorę ze szkiełkami w zbalansowanym rotatorze, w piecu do hybrydyzacji ustawionym na 65 °C.

Ustaw rotator na prędkość 10 RPM. Pozostaw próbki do hybrydyzacji na 17 godzin. Aby przejść do etapu przemywania szkiełek z mikroarrayem, przygotuj trzy kuwety do barwienia szkiełek i napełnij je odpowiednimi buforami do przemywania.

Napełnij dwie płytki buforem do płukania jeden w temperaturze pokojowej, a jedną płytkę podgrzanym wcześniej buforem do płukania dwa. Rozmontuj komorę hybrydyzacyjną i wyjmij kanapkę. Zanurz kanapkę kodem kreskowym na szkiełku mikroarray skierowanym do góry w pierwszej płytce do barwienia szkiełek wypełnionej buforem do płukania jeden w temperaturze pokojowej, a następnie za pomocą czystej pęsety oddziel uszczelkę od szkiełka mikroarray.

Szybko przenieś szkiełko z mikroarray do statywu na szkiełka i umieść je w drugiej kuwecie do barwienia szkiełek wypełnionej buforem do mycia 1 w temperaturze pokojowej. Postaw kuwetę do barwienia na mieszalniku magnetycznym i myj przez jedną minutę przy umiarkowanym mieszaniu. Szybko przenieś statyw na szkiełka do trzeciej kuwety do barwienia, wypełnionej uprzednio podgrzanym buforem do mycia 2, i myj przez jedną minutę przy umiarkowanym mieszaniu.

Powoli wyjmij statyw z naczynia do barwienia preparatów, a następnie ostrożnie wyjmij slajd ze statywu, unikając powstawania kropel. Umieść slajd z mikroarray w odpowiednim skanerze i zeskanuj każdą macierz, stosując ustawienia parametrów zalecane w instrukcji obsługi producenta mikroarray. Aby przygotować oprogramowanie do analizy statystycznej, najpierw zaimportuj dane metabolomiczne i transkryptomiczne.

Przejdź do File, New Regular Project, New Regular Project, aby zaimportować otrzymaną macierz danych. Następnie kliknij Edit. Wykonaj transpozycję całej macierzy, home, i przypisz odpowiednie identyfikatory primary oraz secondary. Na koniec zatwierdź zmiany.

Aby przeprowadzić wielowymiarową analizę statystyczną, przejdź do okna Workset, wybierz PCAX jako typ modelu i kliknij AutoFit. Wybierz Scores, a następnie Scatter, aby wyświetlić wykres przedstawiający możliwe grupowanie próbek. Przeanalizuj wykres wyników PCA.

Jeśli uzyskano odpowiedni model, należy wykorzystać te same klasy próbek do zbudowania modelu analizy dyskryminacyjnej O2PLS. Aby zbudować dwa modele analizy dyskryminacyjnej O2PLS przy użyciu próbek zaklasyfikowanych przez MacroZone, przypisz klasy, przechodząc w oknie Home do New As, M1, a następnie Observations. Ustaw odpowiednie klasy.

Następnie zmień typ modelu z PCAX na analizę dyskryminacyjną O2PLS. Naciśnij Autofit. W oknie projektu wybierz M2, kliknij Scores, a następnie Scatter, aby wyświetlić wykres i położenie klas próbek.

Przejdź do sekcji Select Data Type i wybierz Observations and Loadings. Następnie kliknij Add Series i wybierz pozycje PQ correlation one oraz PQ correlation two lub kolejne komponenty, jeśli są dostępne. Klikając prawym przyciskiem myszy na wykresie, przejdź do opcji Property, wybierz Color, a następnie zaznacz By Terms, aby odróżnić symbole na wykresie w zależności od cząsteczek i klas.

Przejdź do sekcji Układ (Layout), Formatuj wykres (Format Plot), Dostęp (Access) i lub Style (Styles), aby zmodyfikować wykres zgodnie z pożądanymi charakterystykami. Aby sprawdzić, jakie metabolity charakteryzują jedną lub więcej konkretnych klas, przejdź do Listy wykresów (Plot List), a następnie do wykresu rozrzutu (Scatter). Analiza eksploracyjna całej macierzy danych za pomocą PCA wykazała, że próbki grupują się zgodnie ze stadium dojrzewania, w tym veraison, średnim etapem dojrzewania oraz pełną dojrzałością, wzdłuż pierwszej i drugiej głównej składowej.

Próbki pogrupowały się zgodnie z sezonem wegetacyjnym wzdłuż trzeciej głównej składowej. Analiza dyskryminacyjna O2PLS dojrzałych jagód pozwala na identyfikację specyficznych sygnatur terroir, reprezentujących trzy makrostrefy: Valpolicella, jezioro Garda i Soave. Wykresy ładunków tych modeli są przedstawione jako korelacja PQ, czyli korelacja między P, klasą próbek, a Q, metabolitami.

Na wykresach ładunków czerwone kwadraty reprezentują klasę próbek lub makrostref, a kolorowe trójkąty reprezentują poszczególne metabolity. Metabolity są zakodowane kolorami zgodnie z ich klasą chemiczną, a odległość między metabolitami a próbkami odzwierciedla ich zależności. Makrostrefa Jeziora Garda charakteryzowała się obecnością stilbenów, natomiast Soave i Valpolicella wyróżniały się flawonoidami.

Wśród antocyjanów peonidyna i jej pochodne były bardziej rozpowszechnione w makrostrefie jeziora Garda, podczas gdy pozostałe antocyjany przeważały w makrostrefie Valpolicella. Ponadto glukozydy 3-O-antocyjanów były częściej spotykane w makrostrefie Valpolicella, natomiast pochodne acylowane i kumerowane dominowały w makrostrefie Soave. Metody transkryptomiki, RA oraz RNA sig pozwalają na jednoczesne monitorowanie tysięcy transkryptów winorośli.

Niedawno zaprojektowano nową, niestandardową macierz mikroarray, która zawiera jeszcze większą liczbę sond reprezentujących dodatkowe, nowo odkryte rodzaje winorośli. Biorąc pod uwagę szybką dezaktualizację platform transkryptomicznych, opisaliśmy alternatywną procedurę z wykorzystaniem nowej platformy, która zawiera więcej sond niż poprzednia, w tym 249 dodatkowych przewidywanych transkryptów peno dla 1392 nowo zidentyfikowanych loci peno oraz 179 genów corvina prava. Analiza metabolomiczna metodą HPLC-ESI-MS jest wystarczająco czuła, aby jednocześnie wykrywać duże liczby metabolitów.

Kluczowe jest zapewnienie możliwości stworzenia jednolitego planu próbkowania. Wybór jednego klona w celu zminimalizowania różnic genetycznych oraz wieloletni okres próbkowania pozwoliły na zidentyfikowanie rzeczywistych różnic pomiędzy poszczególnymi terroir. Interesujące byłoby porównanie tej samej odmiany uprawianej w strefach mniej optymalnych, jednak niestety takie winnice nie były dostępne.