Kontrolowana synteza i śledzenie fluorescencji wysoce jednorodnych mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych)

Ogólnym celem niniejszej pracy jest zbadanie dynamicznego zachowania i oddziaływania miękkich cząstek koloidalnych w dyspersjach o różnej gęstości cząstek w pobliżu zeszklenia. Mikrożele to miękkie przedmioty, które mogą dostosowywać swój rozmiar, kształt i ruchliwość do środowiska, w którym żyją. W przeciwieństwie do sztywnych cząstek koloidalnych, istnieje wiele otwartych pytań dotyczących zachowania miękkich mikrożeli.

Główną zaletą szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej jest możliwość lokalizacji pojedynczych mikrożeli z dużą dokładnością, bezpośredniego śledzenia ich ruchu w C2 oraz analizy ilości dyfuzji. Aby zbadać dynamikę pojedynczych mikrożeli w gęstych układach, tylko niewielka liczba mikrożeli musi być znakowana fluorescencyjnie. Polimeryzacja wytrącająca bez mieszania pozwala na równoległą syntezę mikrożelu o zmiennych warunkach reakcji, aby wygodnie dopasować wielkość znakowanych i nieznakowanych mikrożeli.

Dynamiczne rozpraszanie światła zapewnia średnie promienie hydrodynamiczne mikrożeli z dokładnością do kilku nanometrów. Rozpuść 1,8 grama NIPAM i 24 miligramy BIS w 245 mililitrach przefiltrowanej podwójnie destylowanej wody w 500-mililitrowej kolbie okrągłodennej z trzema szyjkami wyposażonej w chłodnicę zwrotną, mieszadło i gumową przegrodę. Włóż termometr i 120-milimetrową igłę do wprowadzania azotu przez przegrodę.

Podgrzej roztwór do 60 stopni Celsjusza, mieszając. Następnie odtlenić roztwór, przepłukując go azotem przez 40 minut. Jednocześnie przygotuj roztwór inicjujący składający się ze 155 miligramów nadsiarczanu potasu lub KPS w pięciu mililitrach przefiltrowanej podwójnie destylowanej wody i bąbelkuj roztwór azotem w celu usunięcia tlenu.

Następnie umyj strzykawkę azotem i przenieś cały pięciomililitrowy roztwór KPS do strzykawki przemytej azotem wyposażonej w igłę o średnicy 120 milimetrów. Podnieś igłę azotu powyżej poziomu roztworu w kolbie z trzema szyjkami i szybko dodaj roztwór KPS przez gumową przegrodę do reaktora. Pozwól polimeryzacji postępować przez godzinę pod przepływem azotu i powoli mieszaj w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Użyj lejka Buchnera i bibuły filtracyjnej, aby przefiltrować gorący roztwór reakcyjny i odrzucić wszelkie duże agregaty. Po pozostawieniu dyspersji do ostygnięcia, odwirować i ponownie rozproszyć dyspersję trzy razy przez 40 minut w temperaturze 257 000 razy G. Na koniec ponownie rozproszyć osad w minimalnej możliwej do życia ilości podwójnie destylowanej wody przed liofilizacją dyspersji do przechowywania. Odważ 257,7 miligrama NIPAM, 3,5 miligrama BIS i 1,5 miligrama barwnika metakrylo-tiokarbamoilo rodaminy B w szklanym naczyniu i dodaj 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody z filtrem.

Przygotuj ten sam roztwór bez barwnika w osobnym szklanym naczyniu. Roztwór barwnika należy stosować ultradźwiękami przez 15 minut, aby rozpuścić barwnik w wodzie. Przygotować różne rozcieńczenia roztworu monomeru z barwnikiem, aby uzyskać serię stężeń.

Tutaj stosuje się barwnik w zakresie stężeń od 02 do 0,1 milimola na litr. Następnie rozpuść 8,4 miligrama KPS w 10 mililitrach przefiltrowanej podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać roztwór inicjatora. Przenieś 0,5 mililitra serii stężeń i 05 mililitrów roztworu KPS do probówek o średnicy 10 milimetrów, aby uzyskać końcowe roztwory reakcyjne.

Uszczelnij rurki gumowymi przegrodami. Rozgrzej kąpiel olejową w szklanym naczyniu o podwójnych ściankach podłączonym do cyrkulatora grzewczego do 63 stopni Celsjusza. Roztwory reakcyjne należy odtleniać, przepłukując je azotem przez 120-milimetrowe igły przez 20 minut.

Następnie włóż rurki do pływającej platformy i zanurz platformę w podgrzanej kąpieli olejowej. Ustaw temperaturę na 60 stopni Celsjusza. W celu precyzyjnego dostrojenia wielkości cząstek, kontrola temperatury podczas początkowej reakcji musi być rygorystyczna, zwykle plus minus 0,1 stopnia Celsjusza.

Pozwól reakcji postępować przez odpowiednią ilość czasu. Zazwyczaj wystarczy jedna godzina. Po reakcji szybko przenieś probówki reakcyjne do pieca o temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Umieść jedną kroplę gorącej dyspersji w 10 mililitrach przefiltrowanej podwójnie destylowanej wody, wstępnie podgrzanej do temperatury objętościowej przemiany fazowej poli-NIPAM w celu zmierzenia promieni hydrodynamicznych cząstek w stanie zapadniętym. Pozostaw resztę dyspersji do ostygnięcia do temperatury pokojowej i przenieś je do probówek wirówkowych. Po odwirowaniu roztworu rozcieńczyć mikrożele w dwóch mililitrach przefiltrowanej podwójnie destylowanej wody, aby użyć jej jako cząstek znacznikowych.

W celu wyznaczenia promienia hydrodynamicznego w stanie zapadniętym przez dynamiczne rozpraszanie światła, należy najpierw umyć kuwety i naczynia szklane parami acetonu. Przenieś około jednego mililitra dyspersji rozcieńczonych cząstek do kuwety pomiarowej. Temperaturę dynamicznego goniometru rozpraszającego światło do 50 stopni Celsjusza i przenieść próbkę do przyrządu, nie dopuszczając do jej ostygnięcia.

Włóż kuwetę na próbkę i przesuń ramię detektora do małego kąta rozpraszania. Po sprawdzeniu profilu wiązki i zakresu zliczania zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przesuń ramię goniometru na najwyższy kąt rozpraszania. Sprawdź, czy szybkość zliczania jest nadal wystarczająco wysoka do pomiaru.

Jeśli intensywność jest zbyt niska, przesuń ramię na niższy kąt rozpraszania. Następnie sprawdź wizualnie wiązkę przez toluenową szklankę do kąpieli pod najmniejszym kątem rozproszenia. Jeśli zaobserwuje się poświatę wokół padającej wiązki, następuje wielokrotne rozpraszanie.

Zdobądź 20 korelogramów między minimalnym a maksymalnym kątem rozproszenia z minimalnym czasem namierzania wynoszącym 60 sekund. W razie potrzeby wydłuż czas akwizycji dla słabych kątów rozproszenia o dużej intensywności. Użyć odpowiedniej soczewki obiektywowej o pożądanym powiększeniu i aperturze do wzbudzenia znaczników i jednoczesnego pobrania fluorescencji z próbki.

W tej pracy zastosowano soczewkę obiektywową 100X, 1,3 z aperturą numeryczną, zanurzoną w olejku. Umieść komorę wilgotności na stole XYZ pi-SO, który pasuje do mikroskopu. Aby zapobiec wyschnięciu próbki, należy umieścić oczyszczoną plazmowo szkiełko nakrywkowe w komorze wilgotnościowej i odpipetować 10 mikrolitrów pożądanego stężenia dyspersji poli-NIPAM.

W zależności od widm wzbudzenia i emisji barwnika fluorescencyjnego, należy użyć odpowiedniego lasera do wzbudzenia i odpowiednio dostosować moc lasera. Zastosowano tu laser półprzewodnikowy z pompą diodową o długości fali 561 nanometrów o stałej mocy lasera 16 miliwatów. Aby uzyskać jednorodne oświetlenie próbki, połącz laser ze światłowodem wielomodowym, potrząśnij włóknem za pomocą wirownika, aby tymczasowo uśrednić plamki lasera i wyświetl koniec światłowodu w płaszczyźnie próbki.

Skalibruj odległość Z od tylnego odbicia szkiełka nakrywkowego i skup się na kilku mikrometrach w próbce, przesuwając obiektyw lekko w górę, a następnie ustal pozycję Z za pomocą kompensatora Z. Pozwala to uniknąć jakichkolwiek efektów interfejsu ze szkiełkiem nakrywkowym. Dostosuj parametry detektora, takie jak czas ekspozycji, do siły sygnału fluorescencyjnego.

W tym przypadku używana jest kamera EMCCD z czasem naświetlania 0,1 sekundy w trybie zwielokrotniania elektronów i wzmocnieniem 50. Zdobądź kilka filmów z odpowiednią liczbą klatek, aby uzyskać odpowiedni czas opóźnienia do obliczenia średniokwadratowego przemieszczenia mikrożeli w różnych obszarach próbki. Zsyntetyzowano osiem znakowanych partii mikrożeli.

W przypadku sześciu partii tempo rozpadu korelogramu rośnie liniowo w stosunku do kwadratu wielkości wektora rozpraszania, co wskazuje na wąski rozkład wielkości. Dopasowanie przez początek układu współrzędnych wskazuje tylko na dyfuzję translacyjną. W przypadku dwóch partii obserwuje się zachowanie nieliniowe.

Odchylenie jest spowodowane szerokim rozkładem wielkości i minimalnym współczynnikiem kształtu cząstek, który pokrywa się z zakresem wektora rozpraszania. Aby uzyskać lepsze oszacowanie średniego współczynnika dyfuzji cząstek, należy wykluczyć te punkty z pasowania. Wysoki stosunek sygnału do szumu umożliwia śledzenie mikrożeli fluorescencyjnych.

Ich dyfuzja jest ograniczona przez nieznakowaną matrycę mikrożelową. Wyższe stężenia nieznakowanej matrycy mikrożelowej po prawej stronie prowadzą do wyraźnego efektu klatki, w którym fluorescencyjne mikrożele są uwięzione w nieznakowanej matrycy mikrożeli. Przy niskich stężeniach nieznakowanej matrycy mirkożelowej mikrożele znacznikowe wykazują normalną dyfuzję, którą można wywnioskować z liniowego wzrostu przemieszczenia średniokwadratowego z czasem opóźnienia.

Jednak przy wysokich stężeniach zbliżonych do zeszklenia koloidalnego wykazują dyfuzję nieliniową, reprezentowaną przez nieliniową ewolucję czasową przemieszczeń średniokwadratowych. Przy wyższym stężeniu nieznakowanej matrycy mikrożelowej, mikrożele znacznikowe są uwięzione przez nieoznakowanych sąsiadów w przejściowych klatkach, jak pokazano na zgrupowanych ścieżkach dla 12 mikrożeli. Równoległa synteza na małą skalę umożliwia szybkie eksperymentowanie z różnymi parametrami reakcji.

Minimalizuje to również wszelkie niepożądane zmiany eksperymentalne wynikające z różnic temperatur reakcji. W połączeniu ze staranną charakterystyką dynamicznego rozpraszania światła, można szybko znaleźć warunki reakcji dla odpowiedniej wielkości mikrożelu. W tym filmie pokazujemy, w jaki sposób kontrolowana synteza mikrożeli pozwala nam badać dyfuzję pojedynczych mikrożeli w stężonych roztworach mikrożeli za pomocą szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Postępując zgodnie z tą procedurą, możliwe będzie zrozumienie, w jaki sposób struktura mikrożeli kontroluje ich właściwości. Otworzy to drzwi do projektowania nowej miękkiej materii interaktywnej.