Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

Ogólnym celem tej procedury jest połączenie prostej metody wizualnego wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych z pneumatyczną platformą do manipulacji kropelkami. Platforma do wykrywania DNA znajduje się na otwartej powierzchni i jest łatwa w użyciu dla badaczy biochemicznych. Zbadaliśmy proste narzędzie do wielokrotnego wykrywania mutacji genetycznych i chorób genetycznych.

Ma większy potencjał, który pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób zmienność genetyczna prowadzi do chorób. Połączyliśmy dwie nowatorskie i proste metody. Polimorfizm wielonukleotydowy można wykryć na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami gołym okiem i bez żadnego dodatkowego przyrządu.

Metodę wykrywania polimorfizmu wielonukleotydowego zademonstruje Tzu-Ming Wang, doktor habilitowany w naszej grupie. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 100-mikromolowy roztwór DNA sondy, jak wskazano w protokole tekstowym. Następnie dodaj DNA sondy do roztworu nanocząstek złota o średnicy jednego OD na mililitr.

Doprowadzić końcowe stężenie SDS do 0,01%, a PBS do 0,01 mola. Pozostaw roztwór do inkubacji przez 20 minut. Następnie zwiększ stężenie chlorku sodu do 0,05 mola, dodając roztwór dwóch molowych chlorków sodu i 0,01 molowego PBS.

Utrzymuj stężenie SDS na poziomie 0,01% i pozwól roztworowi inkubować przez kolejne 20 minut. Zwiększać stężenie chlorku sodu w krokach co 0,1 mola w odstępach 20-minutowych, aż do osiągnięcia końcowego stężenia jednego molowca. Inkubować roztwór w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez noc na rotatorze.

Po sprzężeniu próbek DNA i nanocząstek złota należy odwirować roztwór o sile 7 000 razy g przez 30 sekund. Usunąć supernatant. Następnie przygotuj 25-nanomolowy roztwór sondy nanocząstek złota, ponownie zawieszając granulat w wodzie dejonizowanej.

Przygotuj docelowe próbki DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj sześć mikrolitrów roztworu sondy nanocząstek złota do każdej próbki DNA z chlorkiem sodu. Za pomocą mieszalnika wirowego wstrząsaj każdym roztworem próbki przez pięć minut w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj sześć mikrolitrów 400-milimolowej hydroksylaminy i sześć mikrolitrów 25,4-milimolowego kwasu chloroaurowego do każdego roztworu próbki DNA. Odłóż te próbki na bok, ponieważ w ciągu następnej godziny nastąpi stała zmiana zabarwienia. wielkość, właściwości optyczne nanocząstki zależne od kształtu, liczba typowych niezgodności we fragmencie DNA próbki może być rozpoznana gołym okiem.

Aby rozpocząć wytwarzanie platformy do manipulacji kroplami, należy wykorzystać komputerową maszynę sterowaną numerycznie wyposażoną w wiertło o średnicy 0,5 milimetra do produkcji wzorców na bazie PMMA z mikrostrukturami. Do wiertarki należy użyć prędkości posuwu siedmiu milimetrów na sekundę i prędkości obrotowej 26 000 obr./min, a po wierceniu sprawdź formy. Użyj dmuchawy powietrza i wody dejonizowanej, aby oczyścić powierzchnię form głównych i usunąć wszelkie złomy PMMA.

Następnie przygotuj mieszaninę 10 do jednego bazy PDMS i utwardzacza. Odgazować mieszaninę w eksykatorze do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza. Następnie wlej mieszaninę PDMS do formy głównej.

Piecz przez trzy godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby uzyskać odwrotne mikrostruktury w komorach powietrznych i kanałach powietrznych. Po zakończeniu pieczenia usuń warstwę PDMS z formy głównej i wybij w niej otwory na wloty ssące powietrze. Użyj systemu obróbki plazmą tlenową do oczyszczenia membrany PDMS i warstwy PDMS.

Po zabiegu zwiąż membranę PDMS i warstwę PDMS, a następnie wybij w tej sprzężonej strukturze. Następnie połącz PDMS i szklane podłoże za pomocą płyty grzejnej w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po połączeniu warstw ze sobą umieść płytę kompozytową w maszynie do cięcia laserowego PDMS membraną do góry.

Zaimportuj plik dwg, aby zdefiniować obszar super hydrofobowy i pamiętaj, że zostanie on bezpośrednio wygrawerowany w membranie PDMS. Oczyść nowo grawerowaną powierzchnię superhydrofobową wodą dejonizowaną. To zmyje wszelkie zwęglone pozostałości.

Po oczyszczeniu powierzchni podłączyć wlot ssący powietrze i pompę próżniową przez zawór elektromagnetyczny. Następnie podłącz zawór elektromagnetyczny do komputera, aby sterować nim za pomocą cyfrowego modułu IO USB. Po ustawieniu pneumatycznej platformy do manipulacji kropelkami dodaj 10 mikrolitrów docelowego DNA o średnicy 0,5 mikromola na obszar superhydrofobowy.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów świeżo zhybrydyzowanego roztworu sondy nanocząstek złota o zawartości 25 nanomolowych złota obok docelowej kropli DNA. Użyj prostego programu, aby sterować zasysaniem powietrza do platformy przez zawór elektromagnetyczny. Ustaw ciśnienie na minus 80 kilopaskalów, a częstotliwość jazdy na pięć herców.

Zapewnij ssanie wzdłuż ścieżek drgań kropli, powodując ich zderzenie i koalescencję. Następnie wymieszaj skoalowaną kroplę, manipulując ssaniem, aby toczyć próbkę przez trzy minuty. Dodaj dwa mikrolitry 400 milimolowej hydroksyloaminy i dwa mikrolitry 25,4 milimolowego kwasu chloroaurowego do superhydrofobowego obszaru pneumatycznej platformy do manipulacji kropelkami.

Manipuluj ssaniem tak, aby kropelki zderzały się i łączyły. Następnie wymieszaj scaloną kroplę, tocząc ją przez minutę. Obserwuj kolor ostatniej kropli gołym okiem.

W tym badaniu polimorfizmy wielonukleotydowe są wykrywane kolorymetrycznie za pomocą wzrostu sond nanocząstek złota za pośrednictwem hybrydyzacji DNA. W tym przypadku próbki DNA mają różne powinowactwo do DNA sondy, co powoduje różnice we wzroście nanocząstek złota, co jest postrzegane jako zmiana koloru. Próbka DNA z trzema niedopasowanymi parami zasad ma mniejszą hybrydyzację niż w pełni komplementarne DNA, co można postrzegać jako zauważalne różnice w kolorze, szczególnie przy wyższych stężeniach.

Sześć niedopasowanych zasad DNA ma słabe powinowactwo do hybrydyzacji do sondy, a zatem rozmiar wzrostu nanocząstek złota był niewielki. Wykazano, że ta analiza kolorymetryczna jest powtarzalna, gdy próbki są manipulowane za pomocą pneumatycznej platformy ssącej, ponieważ wyniki niedopasowania DNA są łatwo widoczne gołym okiem. Po opanowaniu cała procedura trwa mniej niż pięć minut od dodania próbki i odczynnika do ich wyniku, co jest znacznie szybsze niż w przypadku metody tradycyjnej.

Suma w każdej operacji wynosi tylko 10 mikrolitrów, czyli znacznie mniej niż to, co jest wymagane w dużym systemie. Po tej procedurze, gdy potwierdzi się, że zmiana sekwencji przestrzeni fragmentu DNA jest odpowiedzialna za określoną chorobę. Specjalnie zaprojektowany produkt może być wykorzystany do uzyskania szeregu niezgodności próbki DNA.

Pneumatyczna platforma do manipulacji kropelkami jest bardziej biokompatybilna niż inne metody, takie jak ważenie optyczne, elektrofluorescencja barwnika, elektroważenie i aktywacja kapilarna shoomoo. Zaproponowana metoda wykrywania polimorfizmu wielonukleotydowego została przeprowadzona przy użyciu pneumatycznej platformy do manipulacji kropelkami, co oznacza, że próbki i odczynniki mogą być bezpośrednio ładowane i pobierane za pomocą pipety. Po opracowaniu, technika ta ma duży potencjał w zakresie badań przesiewowych DNA oraz innych zastosowań chemicznych i biomatycznych.