Name: Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj wizualną detekcję polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Ta metoda umożliwia badaczom biochemicznym wykrywanie mutacji genetycznych bez zaawansowanych instrumentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu zapewniło wsparcie finansowe dla tych badań w ramach kontraktów MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

1. Metoda wykrywania MNP
Uwaga: W tej sekcji opisano procedurę wykrywania MNP w oparciu o wzrost nanocząstek złota za pośrednictwem hybrydyzacji.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór DNA sondy (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGAGGCAAG-3') o stężeniu 100 μM.</li>
	<li>Przygotuj sondę Cząstki AuNP (sonda AuNP) zmodyfikowane DNA. 21 
	Uwaga: Objętość użyta w tym miejscu zależy od zapotrzebowania na cząstki AuNP (sonda AuNP) modyfikowane DNA. Jest to zatem zależne od liczby eksperymentów, które mają zostać przeprowadzone. Zazwyczaj przygotowujemy nadmiar cząstek sondy AuNP jako części zamienne. Głośność używana na tych etapach jest regulowana i elastyczna.
	<ol>
		<li>Dodać DNA sondy (100 μM, przygotowane w kroku 1.1) do roztworu nanocząstek złota (13 nm, 17 nM) o stężeniu 1 OD/ml.</li>
		<li>Doprowadzić końcowe stężenia dodecylosiarczanu sodu (NaC12H25SO4, SDS) i buforu fosforanowego (PBS) odpowiednio do 0,01% i 0,01 M.</li>
		<li>Po 20 minutach doprowadzić stężenie chlorku sodu (NaCl) do 0,05 M roztworem NaCl (2 M) i PBS (0,01 M), utrzymując SDS na poziomie 0,01% i inkubować przez 20 min.</li>
		<li>Zwiększać stężenie NaCl w krokach co 0,1 M do końcowego stężenia 1 M w odstępach 20 minut.</li>
		<li>Inkubować przez noc, wytrząsając na mieszadle wirowym w temperaturze 23 °C. Prędkość wytrząsania nie ma wpływu na eksperyment, o ile próbki DNA i sondy AuNP ulegną hybrydyzacji.</li>
		<li>Odwirować nanocząstki złota o masie 7 000 x g przez 30 sekund i usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cząstki sondy AuNP dodać do wody dejonizowanej (wody DI) o stężeniu 25 nM (roztwór sondy AuNP).</li>
	<li>Przygotować docelowe próbki DNA (w pełni komplementarne: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3'; trzy niedopasowane pary zasad: 5'-CTTGCCTACTTTACCAGCTC-3'; sześć niedopasowanych par zasad: 5'-CTTGCCTTTTTTTCCAGCTC-3') w stężeniach odpowiednio 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 μM.</li>
	<li>Dodać roztwór sondy AuNP (6 μl, 25 nM) do próbek DNA (350 μl) za pomocą NaCl (14 μM).</li>
	<li>Wstrząsnąć mieszaniną próbek DNA i sond AuNP za pomocą mieszalnika wirowego w temperaturze 23 °C przez 5 minut w celu hybrydyzacji DNA.</li>
	<li>W celu wzrostu AuNP dodać NH2OH (6 μl, 400 mM) i HAuCl4 (6 μl, 25,4 mM) do roztworu (mieszaniny próbek DNA i sond AuNP). Wzrost AuNP trwa około 30 sekund. Stała zmiana zabarwienia utrzymuje się przez ponad 1 godz. < / >
	UWAGA: Kontakt skóry z HAuCl4 może powodować poważne skutki toksyczne. Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS). Podczas korzystania z HAuCl4 należy nosić rękawice i używać dygestorium.</li>
</ol>
2. Produkcja pneumatycznej platformy do manipulacji kroplami
Uwaga: Platforma do manipulacji kropelkami oparta na PDMS składa się z dwóch elementów: membrany PDMS (100 μm) z superhydrofobową powierzchnią i warstwy kanału powietrznego (5 mm). Bez procesu MEMS, do wytworzenia tego urządzenia wykorzystano powszechne procesy obróbki, które obejmują mikroobróbkę sterowaną komputerowo (CNC) w celu wykonania formy, odlewanie i replikację PDMS w celu szybkiego prototypowania komponentów mikroprzepływowych oraz mikroobróbkę laserową w celu wytworzenia powierzchni superhydrofobowej (patrz rysunek 3).
<ol>
	<li>Za pomocą maszyny CNC wyposażonej w wiertło (0.5 mm) można wyprodukować formy wzorcowe na bazie PMMA (patrz rysunek 3) z mikrostrukturą. Stosować prędkość posuwu wiertła 7 mm/s i prędkość obrotową 26 000 obr./min. Użyj dmuchawy powietrza i wody DI, aby usunąć złom PMMA i oczyścić powierzchnię form głównych.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę bazy PDMS i utwardzacza w stosunku 10:1. Odgazowywać mieszaninę wewnątrz eksykatora przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wlej PDMS do formy głównej i piecz PDMS przez 3 godziny w temperaturze 60 °C w piekarniku, aby uzyskać odwrotną mikrostrukturę komór powietrznych (membrana PDMS) i kanałów powietrznych (warstwa PDMS).</li>
	<li>Usuń warstwę PDMS z formy głównej (ręcznie). Przebić otwory w warstwie PDMS na wloty zasysające powietrze.</li>
	<li>Umieścić membranę PDMS, warstwę PDMS i podłoże szklane w komorze systemu obróbki tlenowo-plazmowej. Po obróbce plazmą tlenową należy połączyć membranę PDMS, warstwę PDMS i szklane podłoże na płycie grzejnej (90 °C) na 10 minut.</li>
	<li>Umieść wiór kompozytowy w maszynie do cięcia laserowego (membraną PDMS do góry). Zaimportuj plik .dwg, aby zdefiniować obszar superhydrofobowy (15 mm × 12 mm). Zobacz rysunek 3. Bezpośrednio graweruj membranę PDMS za pomocą lasera CO2, aby utworzyć obszar superhydrofobowy na membranie PDMS (moc 12 W, prędkość skanowania 106,68 mm/s).</li>
	<li>Oczyść powierzchnię superhydrofobową wodą DI, aby zmyć zwęglone pozostałości na powierzchni.</li>
	<li>Podłączyć wlot powietrza i pompę próżniową przez zawór elektromagnetyczny (patrz rysunek 4). Podłącz zawór elektromagnetyczny do komputera i steruj za pomocą cyfrowego modułu I/O USB.</li>
</ol>
3. Operacja wykrywania MNP na platformie pneumatycznej
Uwaga: W tej sekcji opisano operację mającą na celu kolorymetryczną i szybką identyfikację MNP na pneumatycznej platformie do manipulacji kroplami (patrz rysunek 5). Wszystkie etapy odbywają się w temperaturze 23 °C (temperatura otoczenia) i wilgotności względnej 85%.
<ol>
	<li>Umieścić kropelkę docelowej próbki DNA (10 μl, 0,5 μM) na obszarze superhydrofobowym pneumatycznej platformy do manipulowania kropelkami.</li>
	<li>Umieścić kropelkę sondy AuNP (10 μl, 25 nM) w obszarze superhydrofobowym pneumatycznej platformy do manipulowania kroplami.</li>
	<li>Kontroluj zasysanie powietrza, aby spowodować ugięcie membrany PDMS za pomocą zaworu elektromagnetycznego i prostego programu (np. Labview). Zapewnić zasysanie powietrza w każdej komorze powietrznej wzdłuż ścieżki migracji kropelek (zawierających odpowiednio docelowe sondy DNA i AuNP) na membranie PDMS tak, aby kropelki zderzały się ze sobą i łączyły się. Stosować ciśnienie robocze pompy próżniowej -80 kPa (ciśnienie manometryczne).
	<ol>
		<li>Alternatywnie można ręcznie kontrolować zasysanie powietrza, o ile kropla jest całkowicie wymieszana. Ręcznie podłącz lub odłącz pompę próżniową i wloty komory powietrznej za pomocą rurek we wczesnych etapach testowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontroluj zasysanie powietrza, aby toczyć koalescencyjną kroplę do przodu i do tyłu, aby zwiększyć wydajność mieszania przez 3 minuty za pomocą układu sterującego zaworu elektromagnetycznego. Docelowe sondy DNA i AuNP dobrze się mieszają i hybrydyzują w ciągu 3 minut. Stosować częstotliwość sterowania i ciśnienie robocze odpowiednio 5 Hz i -80 kPa (ciśnienie manometryczne).</li>
	<li>Umieścić kroplę zawierającą NH2OH (2 μl, 400 mM) i HAuCl4 (2 μl, 25,4 mM) na obszarze superhydrofobowym pneumatycznej platformy do manipulowania kropelkami.</li>
	<li>Kontroluj zasysanie powietrza (ciśnienie manometryczne -80 kPa), aby kropelki zderzały się ze sobą i łączyły się. Następnie kontroluj zasysanie powietrza (5 Hz i ciśnienie manometryczne -80 kPa), aby umożliwić koalescencyjnej kropli toczenie się do przodu i do tyłu, aby zwiększyć wydajność mieszania przez 1 minutę.</li>
	<li>Zmierz i zapisz kolor połączonej kropli gołym okiem.</li>
</ol>

<ol><li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions%3A+current+and+developing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li>
<li>Hinds, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+patterns+of+common+DNA+variation+in+three+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations.</a> Science. 307 (5712), 1072-1079 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multi-nucleotide+polymorphisms+in+the+human+genome+characterized+by+whole+genome+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing.</a> Nucleic Acids Res. , 408(2010).</li>
<li>Whelan, S., Goldman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+frequency+of+events+that+cause+multiple-nucleotide+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Estimating the frequency of events that cause multiple-nucleotide changes.</a> Genetics. 167 (4), 2027-2043 (2004).</li>
<li>Saiki, R. K., Walsh, P. S., Levenson, C. H., Erlich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+amplified+DNA+with+immobilized+sequence-specific+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (16), 6230-6234 (1989).</li>
<li>Kim, S., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+technologies+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: technologies and biomedical applications.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 9, 289-320 (2007).</li>
<li>Kwok, P. Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 43-60 (2003).</li>
<li>Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+colorimetric+detection+of+polynucleotides+based+on+the+distance-dependent+optical+properties+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles.</a> Science. 277 (5329), 1078-1081 (1997).</li>
<li>Lee, J. S., Han, M. S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+Detection+of+Mercuric+Ion+%28Hg2%2B%29+in+Aqueous+Media+using+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-Functionalized Gold Nanoparticles.</a> Angew. Chem. 119 (22), 4171-4174 (2007).</li>
<li>Storhoff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+detection+of+genomic+DNA+targets+on+microarrays+using+a+novel+optical+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based detection of genomic DNA targets on microarrays using a novel optical detection system.</a> Biosens. Bioelectron. 19 (8), 875-883 (2004).</li>
<li>Bao, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+identification+in+unamplified+human+genomic+DNA+with+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SNP identification in unamplified human genomic DNA with gold nanoparticle probes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (2), 15-15 (2005).</li>
<li>Chen, Y. T., Hsu, C. L., Hou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single-nucleotide+polymorphisms+using+gold+nanoparticles+and+single-strand-specific+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases.</a> Anal. Biochem. 375 (2), 299-305 (2008).</li>
<li>Li, H., Rothberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+DNA+sequences+based+on+electrostatic+interactions+with+unmodified+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14036-14039 (2004).</li>
<li>Fang, W. F., Chen, W. J., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+DNA+concentration+and+mismatches+using+hybridization-mediated+growth+of+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of DNA concentration and mismatches using hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes.</a> Sensor. Actuat. B Chem. 192, 77-82 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, J., Ekman, J. M., Kenis, P. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+control+of+metal+nanoparticle+shape%3A+one-pot+synthesis+and+cellular+uptake+of+highly+stable+and+functional+gold+nanoflowers%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated control of metal nanoparticle shape: one-pot synthesis and cellular uptake of highly stable and functional gold nanoflowers.</a> Nano Lett. 10 (5), 1886-1891 (2010).</li>
<li>Chen, L., Manz, A., Day, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+nucleic+acid+analysis+integrated+on+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Total nucleic acid analysis integrated on microfluidic devices.</a> Lab Chip. 7 (11), 1413-1423 (2007).</li>
<li>Lien, K. Y., Liu, C. J., Lin, Y. C., Kuo, P. L., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+and+detection+of+single+nucleotide+polymorphism+genotyping+utilizing+an+integrated+magnetic+bead-based+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA and detection of single nucleotide polymorphism genotyping utilizing an integrated magnetic bead-based microfluidic platform.</a> Microfluid. Nanofluid. 6 (4), 539-555 (2009).</li>
<li>Ng, J. K. K., Feng, H. H., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+single-nucleotide+mismatches+using+a+microfluidic+device+with+monolayered+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of single-nucleotide mismatches using a microfluidic device with monolayered beads.</a> Anal. Chim. Acta. 582 (2), 295-303 (2007).</li>
<li>Xing, S., Harake, R. S., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-driven+transports+on+superhydrophobic-patterned+surface+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet-driven transports on superhydrophobic-patterned surface microfluidics.</a> Lab Chip. 11 (21), 3642-3648 (2011).</li>
<li>Huang, C. J., Fang, W. F., Ke, M. S., Chou, H. Y. E., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biocompatible+open-surface+droplet+manipulation+platform+for+detection+of+multi-nucleotide+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A biocompatible open-surface droplet manipulation platform for detection of multi-nucleotide polymorphism.</a> Lab Chip. 14 (12), 2057-2062 (2014).</li>
<li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li>
<li>Ichimura, K., Oh, S. K., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+motion+of+liquids+on+a+photo-responsive+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light-driven motion of liquids on a photo-responsive surface.</a> Science. 288 (5471), 1624-1626 (2000).</li>
<li>Jones, T. B., Gunji, M., Washizu, M., Feldman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+liquid+actuation+and+nanodroplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic liquid actuation and nanodroplet formation.</a> J. Appl. Phys. 89 (2), 1441-1448 (2001).</li>
<li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+S%22%5BJournal%5D)">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li>
<li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li>
<li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole można zastosować prostą metodę kolorymetryczną do wykrywania MNP w stężeniach w zakresie 0,11-0,50 μM w probówkach mikrowirówek. Co więcej, proponowana metoda wykrywania MNP jest przeprowadzana na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami, która ma duży potencjał w zakresie badań przesiewowych DNA i innych zastosowań biomedycznych. W praktyce wykrywalny zakres stężenia DNA próbki zależy od skuteczności mieszania platform operacyjnych. Aby zapewnić, że koalescencyjna kropla jest w pełni wymieszana...

Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP), który jest pojedynczą różnicą par zasad w sekwencji DNA, jest jedną z najczęstszych odmian genetycznych. Aktualne badania donoszą, że SNP są związane z ryzykiem choroby, skutecznością leków i skutkami ubocznymi poszczególnych osób poprzez wpływ na funkcję genów. 1,2 Ostatnie badania wykazały również, że mutacje dwu- lub wielopunktowe (polimorfizm wielonukleotydowy) powodują określone choroby i indywidualne różnice w skutkach choroby. 3,4 Wykrycie polimorfizmu nukleotydów jest zatem niezbędne w badaniach przesiewowych w kierunku choroby. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowano proste i skuteczne metody szybkiego wykrywania oligonukleotydów specyficznych dla sekwencji. 1,5 Obecne podejścia do identyfikacji mutacji DNA zazwyczaj obejmują procedury takie jak unieruchomienie sondy, znakowanie fluorescencyjne, elektroforeza żelowa itp.,6,7 ale metody te na ogół wymagają długiego procesu analitycznego, drogiego sprzętu, dobrze wyszkolonych techników i znacznego zużycia próbek i odczynników.
Nanocząstka o dużym stosunku powierzchni do objętości i unikalnych właściwościach fizykochemicznych jest idealnym materiałem jako bardzo czuła i tania platforma do wykrywania specyficznych biomarkerów. Nanocząstki złota (AuNP) są szeroko stosowane do wykrywania DNA ze względu na ich dużą zdolność do modyfikacji za pomocą sond oligonukleotydowych. Opracowano również 8-10 technik detekcji SNP przy użyciu AuNP. 11-13 W niniejszej pracy przyjęliśmy nowatorskie podejście kolorymetryczne do wykrywania polimorfizmu wielonukleotydowego (MNP) poprzez wzrost sond AuNP za pośrednictwem hybrydyzacji DNA. 14 Ta prosta i szybka metoda sondowania opiera się na teorii, że różne długości jednoniciowego DNA (ssDNA) lub dwuniciowego DNA (dsDNA) sprzężonego z AuNP wpływają na rozmiar i kształt wzrostu AuNP (patrz rysunek 1). 15 Ta metoda wykrywania DNA charakteryzuje się niewielkim zużyciem odczynników, krótkim czasem trwania testu (kilka minut) i prostą procedurą bez kontroli termicznej, która może być potencjalnie stosowana w diagnostyce klinicznej i domowych badaniach przesiewowych.
Opracowano kilka systemów mikroprzepływowych do wykrywania sekwencji DNA; 16 Te systemy mikroprzepływowe, wywodzące się z tradycyjnych protokołów doświadczalnych, wymagały mniejszej liczby urządzeń na dużą skalę i uprościły protokoły eksperymentalne w celu poprawy czułości, granicy wykrywalności i swoistości biosensora DNA. Metody wykrywania DNA w układach mikroprzepływowych nadal wymagają jednak przyrządów do późniejszego procesu, takich jak maszyna do PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) do wzmacniania sygnału i czytnik fluorescencji do pojedynczego odczytu w celu identyfikacji heterogenicznego SNP. 17,18 Opracowanie prostej platformy bez późniejszego przetwarzania w celu bezpośredniego odczytu wyników polimorfizmu wielonukleotydowego jest wysoce pożądane. W porównaniu z dobrze stosowanymi, konwencjonalnymi, zamkniętymi systemami mikroprzepływowymi, urządzenia mikroprzepływowe o otwartej powierzchni obiecująco oferują kilka zalet, takich jak wyraźna ścieżka optyczna, łatwy dostęp do próbki, bezpośredni dostęp do środowiska oraz brak łatwo tworzącej się kawitacji lub niedrożności międzyfazowej w kanale. 19 W naszych poprzednich pracach wprowadzono prostą platformę pneumatyczną do manipulowania kroplami na otwartej powierzchni (zob. rys. 2). 20 Na tej platformie kropelki mogą być jednocześnie transportowane i manipulowane bez zakłóceń spowodowanych energią napędową za pomocą siły ssącej, która ma ogromny potencjał w zastosowaniach biologicznych i chemicznych. Ta platforma pneumatyczna została zatem wykorzystana do przeprowadzenia manipulacji próbkami DNA w celu wykrycia MNP w połączeniu z podejściem kolorymetrycznym wykorzystującym koncepcję wzrostu sond AuNP za pośrednictwem hybrydyzacji DNA.
Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje proste wizualne wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami na otwartej powierzchni. Praca ta potwierdza, że polimorfizm wielonukleotydowy jest wykrywalny gołym okiem; Proponowana platforma pneumatyczna nadaje się do zastosowań biologicznych i chemicznych.

<table><tbody>Grawerki stołowe <tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td></td> Wycinarka laserowa <td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>System obróbki plazmy tlenowej</td><td>Femto Science Inc. Korea</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr>zawór<td>elektromagnetyczny</td><td></td><td></td><td>domowa</td></tr><tr><td>pompa próżniowa</td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm roztwór AuNP</td><td>TAN Bead Inc., Tajwan</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (z tiolem znakowanym na końcu 5')</td><td>MDBio, Inc., Tajwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>UniRegion&nbsp; Bio-technologia,. Tajwan</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>J. T. baker</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hydroksyloaminy (NH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Kwas chloroaurowy (HAuCl4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4022</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mieszalnik</td> <td>wirowyInstrumenty laboratoryjne Digisystem Inc.</td><td>Wirówka VM-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Prosta i wizualna metoda wykrywania polimorfizmu wielonukleotydowego (MNP) została przeprowadzona na pneumatycznej platformie do manipulacji kroplami na otwartej powierzchni. To podejście do kolorymetrycznego wykrywania DNA opierało się na wzroście sond z nanocząstkami złota za pośrednictwem hybrydyzacji (sondy AuNP). Wielkość wzrostu i konfiguracja AuNP są zdominowane przez liczbę próbek DNA zhybrydyzowanych z sondami. Na podstawie specyficznych właściwości optycznych nanocząstek, zależnych od wielkości i kształtu, można rozróżnić liczbę niedopasowań fragmentu DNA próbki do sond. Testy przeprowadzono za pomocą kropelek zawierających odpowiednio odczynniki i próbki DNA, a następnie przetransportowano i zmieszano na platformie pneumatycznej z kontrolowanym zasysaniem pneumatycznym elastycznej membrany superhydrofobowej na bazie PDMS. Kropelki mogą być dostarczane jednocześnie i precyzyjnie na otwartej powierzchni na proponowanej platformie pneumatycznej, która jest wysoce biokompatybilna, bez skutków ubocznych w postaci próbek DNA wewnątrz kropel. Łącząc dwie zaproponowane metody, polimorfizm wielonukleotydowy można wykryć na pierwszy rzut oka na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami; Nie jest wymagany żaden dodatkowy instrument. Procedura od zainstalowania kropel na platformie do końcowego wyniku zajmuje mniej niż 5 minut, znacznie mniej niż przy istniejących metodach. Co więcej, to połączone podejście do wykrywania MNP wymaga objętości próbki wynoszącej zaledwie 10 μl w każdej operacji, czyli znacznie mniejszej niż w przypadku systemu makro.

W niniejszej pracy przetestowano trzy próbki DNA, wykorzystując prostą i nowatorską metodę detekcji poprzez wzrost sond AuNP zapośredniczony przez hybrydyzację DNA. Sekwencje sondy DNA oraz trzech rodzajów próbek DNA, a mianowicie CDNA (całkowicie komplementarnego do sondy DNA), TMDNA (DNA z niedopasowaniem trzech par zasad) oraz SixMDNA (DNA z niedopasowaniem sześciu par zasad), wymieniono w kroku 1 protokołu. Niedopasowania do sondy w testowanych tutaj próbkach DNA znajdują się w segmen...

Ta praca przedstawia prostą i wizualną metodę wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Dzięki proponowanej metodzie cały eksperyment, w tym manipulacja kropelkami i wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych, może być przeprowadzony w temperaturze około 23 °C bez pomocy zaawansowanych urządzeń.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest połączenie prostej metody wizualnej detekcji polimorfizmów wielonukleotydowych z pneumatyczną platformą do manipulacji kropelkami. Platforma do detekcji DNA znajduje się na otwartej powierzchni i jest łatwa w obsłudze dla badaczy z zakresu biochemii. Zbadaliśmy proste narzędzie do wielokrotnego wykrywania mutacji genetycznych oraz chorób genetycznych.Ma ono większy potencjał w pomaganiu nam w zrozumieniu, w jaki sposób zmienność genetyczna prowadzi do chorób. Połączyliśmy dwie nowe i proste metody. Polimorfizm wielonukleotydowy można wykryć na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami gołym okiem i bez użycia żadnych dodatkowych instrumentów.Metoda wykrywania polimorfizmu wielonukleotydowego zostanie zaprezentowana przez Tzu-Ming Wang, postdoka w naszej grupie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 100 µM roztwór sondy DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy dodać sondę DNA do roztworu nanocząsteczek złota o absorbancji 1 OD/mL.Dopełnij roztwór tak, aby stężenie końcowe SDS wynosiło 0,01%, a PBS 0,01 M. Inkubuj roztwór przez 20 minut. Następnie zwiększ stężenie chlorku sodu do 0,05 M, dodając roztwór 2 M chlorku sodu w 0,01 M PBS.Utrzymaj stężenie SDS na poziomie 0,01% i inkubuj roztwór przez kolejne 20 minut. Zwiększaj stężenie chlorku sodu w przyrostach 0,1 M w odstępach 20-minutowych, aż do osiągnięcia stężenia końcowego 1 M. Inkubuj roztwór w temperaturze 23 °C przez noc na rotatorze.Po sprzężeniu próbek DNA z nanocząsteczkami złota, odwiruj roztwór z prędkością 7 000 ×g przez 30 sekund. Usuń nadsącz. Następnie przygotuj 25 nanomolarny roztwór sondy z nanocząsteczek złota, resuspendując osad w wodzie dejonizowanej.Przygotować próbki docelowego DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do każdej próbki DNA z chlorkiem sodu dodać sześć µL roztworu sondy z nanocząsteczkami złota. Za pomocą mieszadła wortex wstrząsać każdą próbkę przez pięć minut w temperaturze 23 °C.Następnie do każdego roztworu z próbką DNA należy dodać 6 µL 400 mM hydroksyloaminy oraz 6 µL 25,4 mM kwasu chlorozłotowego. Próbki te należy odstawić, ponieważ w ciągu następnej godziny nastąpi stopniowa zmiana barwy. Typowe właściwości optyczne nanocząsteczek, zależne od ich rozmiaru i kształtu, pozwalają na wizualne odróżnienie liczby niedopasowań w fragmencie próbki DNA.Aby rozpocząć budowę platformy do manipulacji kropelkami, należy użyć maszyny sterowanej numerycznie (CNC) wyposażonej w wiertło o średnicy 0,5 mm w celu wykonania form matecznych z PMMA z mikrostrukturami. Podczas wiercenia należy zastosować posuw o prędkości 7 mm/s oraz prędkość obrotową 26 000 rpm, a następnie sprawdzić formy po zakończeniu procesu. Do oczyszczenia powierzchni form matecznych i usunięcia resztek PMMA należy użyć dmuchawy powietrznej oraz wody dejonizowanej.Następnie przygotować mieszaninę bazy PDMS i utwardzacza w stosunku 10:1. Odgazować mieszaninę w eksykatorze aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie wlać mieszaninę PDMS do formy matki.Wygrzewać przez trzy godziny w temperaturze 60 °C, aby uzyskać odwrócone mikrostruktury w komorach i kanałach powietrznych. Po zakończeniu wygrzewania zdjąć warstwę PDMS z formy matki i wykonać w niej otwory na wloty ssania powietrza. Użyć systemu do obróbki plazmą tlenową w celu oczyszczenia membrany PDMS oraz warstwy PDMS.Po zakończeniu obróbki należy połączyć membranę PDMS z warstwą PDMS, a następnie wyciąć otwory w tej sprzężonej strukturze. Następnie należy połączyć PDMS z podłożem szklanym za pomocą płyty grzejnej w temperaturze 90 °C przez 10 minut. Po połączeniu warstw należy umieścić kompozytową płytkę w maszynie do cięcia laserowego stroną membrany PDMS do góry.Zaimportuj plik dwg, aby zdefiniować obszar superhydrofobowy, pamiętając, że zostanie on bezpośrednio wygrawerowany na membranie PDMS. Oczyść nowo wygrawerowaną powierzchnię superhydrofobową wodą dejonizowaną. Pozwoli to na usunięcie wszelkich zwęglonych pozostałości.Po oczyszczeniu powierzchni połącz wlot ssący powietrza z pompą próżniową za pomocą zaworu elektromagnetycznego. Następnie podłącz zawór elektromagnetyczny do komputera, aby sterować nim za pomocą modułu cyfrowego wejścia/wyjścia USB. Po przygotowaniu pneumatycznej platformy do manipulacji kropelkami, nanieś 10 µL 0,5 µM docelowego DNA na obszar superhydrofobowy.Następnie, obok kropli docelowego DNA, należy dodać 10 µL świeżo hybrydyzowanego roztworu sondy z nanocząsteczek złota o stężeniu 25 nM. Do sterowania zasysaniem powietrza do platformy za pomocą zaworu elektromagnetycznego należy wykorzystać prosty program. Ustaw ciśnienie na -80 kPa, a częstotliwość wymuszania na 5 Hz.Zastosuj ssanie wzdłuż ścieżek wibracji kropli, aby doprowadzić do ich zderzenia i koalescencji. Następnie wymieszaj złączoną kroplę, manipulując ssaniem tak, aby próbka toczyła się przez trzy minuty. Do obszaru superhydrofobowego pneumatycznej platformy do manipulacji kroplami dodaj 2 µL 400 mM hydroksyloaminy oraz 2 µL 25,4 mM kwasu złocistego.Manipuluj ssaniem w taki sposób, aby kropelki zderzyły się i połączyły. Następnie wymieszaj połączoną kropelkę, tocząc ją przez jedną minutę. Zaobserwuj gołym okiem kolor końcowej kropelki.W niniejszym badaniu polimorfizmy wielonukleotydowe są wykrywane kolorymetrycznie z wykorzystaniem wzrostu sond z nanocząsteczek złota indukowanego hybrydyzacją DNA. W tej metodzie próbki DNA wykazują różną powinowactwo do DNA sondy, co powoduje różnice w wzroście nanocząsteczek złota, objawiające się zmianą barwy. Próbka DNA z niedopasowaniem trzech par zasad wykazuje mniejszy stopień hybrydyzacji niż DNA w pełni komplementarne, co przejawia się wyraźnymi różnicami w kolorze, szczególnie przy wyższych stężeniach.Sześć niedopasowań zasad w DNA skutkuje słabym powinowactwem hybrydyzacyjnym do sondy, przez co wielkość wzrostu nanocząsteczek złota była niewielka. Wykazano, że ta analiza kolorymetryczna jest powtarzalna, gdy próbki są manipulowane za pomocą pneumatycznej platformy ssącej, ponieważ wyniki niedopasowania DNA są łatwo dostrzegalne gołym okiem. Po opanowaniu techniki, cała procedura zajmuje mniej niż pięć minut od momentu dodania próbki i odczynnika do uzyskania wyniku, co jest znacznie szybsze niż w przypadku metody tradycyjnej.Całkowita objętość w każdej operacji wynosi zaledwie 10 µL, co jest wartością znacznie mniejszą niż wymagana w dużych systemach. Po zastosowaniu tej procedury, gdy zostanie potwierdzone, że wariant sekwencji w obszarze fragmentu DNA odpowiada za konkretną chorobę, specjalnie zaprojektowany produkt może zostać wykorzystany do wykrycia liczby niedopasowań w próbce DNA.Platforma pneumatycznej manipulacji kroplami jest bardziej biokompatybilna niż inne metody, takie jak ważenie optyczne, elektrofluorescencja barwników, ważenie elektryczne oraz kapilarne sterowanie typu shoomoo. Zaproponowana metoda wykrywania polimorfizmu wielu nukleotydów została przeprowadzona z wykorzystaniem platformy pneumatycznej manipulacji kroplami, co oznacza, że próbki i odczynniki można bezpośrednio nanosić i pobierać za pomocą pipety. Po opracowaniu technika ta wykazuje wysoki potencjał w badaniach przesiewowych DNA oraz w innych zastosowaniach chemicznych i biomedycznych.

the-visual-colorimetric-detection-multi-nucleotide-polymorphisms-on

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Ten film demonstruje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej multipleksowej do jednoczesnej kwantyfikacji regionów metylowanego DNA w różnych populacjach białych krwinek jako wczesnego biomarkera dla diagnozy klinicznej i prognozowania.

Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Poznaj wizualną detekcję polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Ta metoda umożliwia badaczom biochemicznym wykrywanie mutacji genetycznych bez zaawansowanych instrumentów.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

Przeglądaj więcej filmów