Name: Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj niedrogi, zautomatyzowany morbidostat do badania ewolucji oporności bakterii na antybiotyki. Urządzenie dynamicznie dostosowuje stężenia leków i umożliwia skalowalne eksperymenty mikrobiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Sze-Bi Hsu i Pani Zhenzhen za użyteczne dyskusje i pomoc w analizie teoretycznej i symulacjach numerycznych. Y. T. Y. pragnie podziękować za wsparcie finansowe z Ministerstwa Nauki i Technologii w ramach grantów o numerach MOST 103-2220-E-007-026 i MOST 104-2220-E-007-011, oraz z Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua pod numerami grantów 103N2042E1, 104N2042E1 oraz 105N518CE1.

1. Montaż i wstępne testowanie urządzenia Morbidostat
<ol>
	<li>Montaż Morbidostatu
	<ol>
		<li>Przebić 3 otwory w wieczku fiolki z kulturą za pomocą igły ze strzykawką 18 G. Wytnij trzy kawałki rurki polietylenowej o długości ~7 cm. Włóż te trzy kawałki rurki polietylenowej na nasadkę.</li>
		<li>Użyj taśmy, aby owinąć krawędź nasadki, która posłuży jako odlew mieszaniny polidimetylosiloksanu (PDMS). Wymieszać 5 g składnika A i 0,5 g składnika B PDMS w plastikowym pojemniku o pojemności 150 ml, mieszając ręcznie wykałaczką. Załadować mieszaninę do strzykawki o pojemności 10 ml.
		<ol>
			<li>Wylać mieszaninę PDMS na nakrętkę za pomocą strzykawki. Piecz całą nakrętkę, aby utwardzić PDMS przez 8 godzin w piekarniku w temperaturze 70 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>anodę LED za pomocą drutu o średnicy 24 i katodę LED z rezystorem węglowym za pomocą lutownicy. rezystor węglowy 680 Ω z przewodem 24 G. Zaizoluj połączenie przewodów za pomocą taśmy izolacyjnej.</li>
		<li>kolektor fotodetektora przewodem 24 G, a emiter fotodetektora rezystorem węglowym 100 kΩ. Zaizoluj połączenie przewodów za pomocą taśmy izolacyjnej.</li>
		<li>Umieść diodę elektroluminescencyjną w uchwycie na fiolkę z kulturą. Postępując zgodnie ze schematem obwodu na rysunku uzupełniającym 2, podłącz diodę elektroluminescencyjną i zasil ją zasilaczem 5 V. Upewnij się, że dioda LED działa, używając kamery cyfrowej, która może wykrywać podczerwień (np. kamery w telefonie komórkowym).</li>
		<li>Umieścić fotodetektor w uchwycie na fiolkę z kulturą. Postępując zgodnie ze schematem obwodu na rysunku uzupełniającym 2, podłącz fotodetektor i zasil go zasilaczem 5 V. Podłącz przewód po obu stronach rezystorów fotodetektora, aby zmierzyć napięcie na elektronicznej tablicy sterowniczej.</li>
		<li>Przyklej magnes na wale wentylatora chłodzącego, który służy jako mieszadło magnetyczne. Należy pamiętać, że wyrównanie wału wentylatora z fiolką hodowlaną oraz odstęp między fiolką do hodowli a magnesem jest bardzo ważny dla prawidłowego działania mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Połącz każdy kawałek rurki polietylenowej fiolki hodowlanej z odpowiednim kawałkiem silikonowej rurki do mikropomp, pożywki i butelki na odpady. Włączyć pompę na 1 godzinę i zmierzyć całkowitą objętość pompowaną z pożywki do fiolki z kulturą, aby określić szybkość pompowania. Należy pamiętać, że typowa szybkość pompowania powinna wynosić ~ 4 ml / h, co odpowiada szybkości rozcieńczania D = 0,33 hr-1 dla 12 ml objętości roboczej fiolki z kulturą.</li>
		<li>Umieść cały zestaw na średniej wielkości inkubatorze z wytrząsarką (34 cm x 34 cm x 43,5 cm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne testowanie Morbidostat
	<ol>
		<li>Ustaw napięcie zasilania chłodnego wentylatora na 5 V, aby uruchomić jego silnik w celu przetestowania mieszadła magnetycznego. Należy pamiętać, że mieszanie można sprawdzić wizualnie. Napięcie, które napędza silnik wentylatora chłodzącego, jest precyzyjnie kontrolowane przez modulację szerokości impulsu (PWM).</li>
		<li>Do kalibracji należy przygotować serię próbek E. coli typu dzikiego o gęstości optycznej przy długości fali 600 nm, zwykle w zakresie od 0,07 do 0,3. Umieścić próbkę testową E. coli w fiolce hodowlanej i zapisać napięcie fotodetektora.
		<ol>
			<li>Umieścić ~100 μl tej samej próbki w czytniku płytek i zapisać gęstość optyczną. Użyj danych dotyczących napięcia fotodetektora w funkcji gęstości optycznej, aby wykreślić krzywą kalibracyjną. Należy zauważyć, że zazwyczaj jedna jednostka zmiany gęstości optycznej odpowiada zmianie ~7,6 V w fotodetektorze przy zastosowanym tutaj schemacie polaryzacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uruchamianie Morbidostat
<ol>
	<li>Przygotowanie przed rozpoczęciem codziennego eksperymentu
	<ol>
		<li>Przygotować fiolkę hodowlaną z trzema ultraodpornymi chemicznie rurkami Tygon o średnicy wewnętrznej 1/32 cala i średnicy zewnętrznej 3/32 cala dla wlotów do utworzenia urządzenia, jak w sekcji 1.1 i na rysunku uzupełniającym 1.</li>
		<li>Przygotować pożywkę zawierającą minimalny (0,2% glukozy) M9 i trimetoprim (TMP). Wysterylizować pożywkę, butelkę z pożywką, butelkę z pożywką z lekiem, butelkę na odpady i fiolkę z kulturą w autoklawie w temperaturze 121 °C. 
		UWAGA: TMP jest roztworem podstawowym, który jest używany do późniejszego osiągnięcia stężeń w tabeli 1, a pożywka zawierająca lek TMP nie jest sterylizowana w autoklawie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie Morbidostat
	<ol>
		<li>W pierwszym dniu eksperymentu rozmrozić 1 ml zamrożonych komórek MG1655 typu dzikiego E. coli przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść 120 μl komórek do fiolki hodowlanej zawierającej ~12 ml pożywki wzrostowej M9. Po pierwszym dniu rozmrozić 1 ml zamrożonych komórek E. coli z poprzedniego dnia przez 5 minut i przenieść 120 μl komórek do nowej fiolki hodowlanej zawierającej ~12 ml pożywki wzrostowej M9.</li>
		<li>Włączyć inkubator z wytrząsarką i ustawić temperaturę na 30 °C bez potrząsania.</li>
		<li>Rozpocznij operację morbidost, włączając mikropompę, mieszadło magnetyczne i pomiar gęstości optycznej. 
		UWAGA: Podczas operacji używany jest algorytm progu sprzężenia zwrotnego do kontrolowania wstrzyknięcia leku. Gdy zmierzona gęstość optyczna przekroczy ustawiony próg, pompa do wstrzykiwania leku zostanie włączona, a pompa medium zostanie wyłączona. W przeciwnym razie pompa do wstrzykiwań leku pozostaje wyłączona, a pompa medium jest włączona.</li>
		<li>Od czasu do czasu monitoruj napięcie, aby upewnić się, że następuje rozwój drobnoustrojów. 
		Uwaga: Ze względu na cykl zamrażania i rozmrażania, komórki E. coli wykazują opóźnienie ~ 4 godziny podczas wzrostu każdego dnia.</li>
		<li>Po ~23 godzinach zatrzymać mikropompę, wyłączając jej napięcie zasilania i wyjąć fiolkę z hodowlą. Dodać 15% glicerolu do fiolki hodowlanej i zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C do przechowywania.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.2.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar wrażliwości na antybiotyki w formacie 96 dołków
UWAGA: Wykonaj pomiar szybkości wzrostu w czytniku płytek z formatem 96 dołków, aby określić poziom oporności na antybiotyki.
<ol>
	<li>Rozmrażać codziennie zamrożoną próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i przenieść 15 μl komórki do fiolki hodowlanej zawierającej ~15 ml pożywki M9. Pozwól im rosnąć, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie ~0,1. Podzielić 15 ml na butelki o pojemności 1 ml i dodać lek TMP na tym etapie, aby uzyskać pożądane stężenia leku, jak pokazano w Tabeli 1.</li>
	<li>Pobrać 200 μl próbki z kroku 3.1 i umieścić w każdym dołku w czytniku płytek i pozostawić do wzrostu przez 12 godzin5. Gęstość optyczna przy długości fali 600 nm jest rejestrowana automatycznie podczas pomiaru. 
	UWAGA: Dla każdego punktu danych rejestrowane są trzy pomiary i uśredniane w celu zapewnienia spójności danych. Dane dotyczące gęstości optycznej w funkcji czasu można wykorzystać do uzyskania szybkości wzrostu.</li>
	<li>Wykreśl dane dotyczące szybkości wzrostu w funkcji stężenia leku, aby uzyskać IC50. Należy zauważyć, że IC50 definiuje się jako stężenie leku, przy którym szybkość wzrostu wynosi pięćdziesiąt procent maksymalnej szybkości wzrostu5.</li>
</ol>
4. Morfologia pojedynczych komórek i pomiar wrażliwości na antybiotyki w urządzeniach mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Wykonanie urządzeń mikroprzepływowych za pomocą wielowarstwowej miękkiej litografii z PDMS, jak opisano w innym miejscu15.
	<ol>
		<li>Użyj fotolitografii, aby wykonać formę fotorezystu dla warstw kontrolnych i przepływowych. Należy pamiętać, że w warstwie kontrolnej użyj ujemnego fotorezystu (wysokość ~15 μm) i dodatniego fotorezystu (wysokość ~8 μm), aby wytworzyć formę na gołej płytce krzemowej.</li>
		<li>Przygotować mieszaniny PDMS o współczynnikach usieciowania 5:1 i 20:1 odpowiednio dla warstwy kontrolnej i warstwy przepływowej. Umieścić mieszaniny w eksykatorze pod próżnią w celu usunięcia pęcherzyków na 1 godzinę.</li>
		<li>Wystawić warstwy kontrolnej formy fotorezystu na płytce krzemowej na działanie pary trimetylochlorosilanu (TMCS). Wykonać warstwę kontrolną o grubości ~6 mm poprzez odlewanie mieszaniny PDMS (o stosunku usieciowania 5:1) na płytkę krzemową na formie fotorezystu warstwy kontrolnej. Piecz warstwę kontrolną przez 40 minut w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w piekarniku.</li>
		<li>Wykonaj warstwę płynięcia poprzez wirowanie powłoki mieszaniny PDMS (ze stosunkiem usieciowania 20:1, prędkością wirowania 3,000 obr./min przez 60 sekund) na formie fotorezystu warstwy przepływowej. Piecz warstwę przepływową przez 30 minut w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w piekarniku.</li>
		<li>Za pomocą żyletki przyciąć warstwę kontrolną do żądanego rozmiaru wióra (zwykle 3 cm x 2 cm) i ręcznie oderwać warstwę kontrolną. Umieść warstwę kontrolną na warstwie przepływu i wyrównaj je pod mikroskopem stereoskopowym. Utwardź wyrównany zespół w temperaturze 80 °C w piekarniku przez noc. Następnie namocz zestaw w 250 ml dejonizowanej wody w plastikowym pojemniku na 5 godzin, aby rozpuścić resztki TMCS.</li>
		<li>Następnie przebić otwory wlotowe igłami 20 G i przymocować cały elastomer do szkiełka pokrytego ślepą warstwą PDMS (współczynnik sieciowania PDMS 5:1, prędkość wirowania 2 000 obr./min przez 30 sekund) poprzez obróbkę plazmą powietrzną przez 40 sekund przy ciśnieniu powietrza 1,2 Torra.</li>
		<li>Przeprowadzaj intensywne pieczenie przez 36 godzin w temperaturze 80 °C, aby zmniejszyć cytotoksyczne działanie PDMS. Należy pamiętać, że ten etap pieczenia ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania toksyczności dla komórek bakteryjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment z rozwojem chipów
	<ol>
		<li>Przed załadowaniem do urządzenia mikroprzepływowego należy je przepłukać wodą dejonizowaną przez 1 godzinę i pożywką M9 przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozmrażaj codziennie zamrożoną próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zaszczep nową probówkę świeżą pożywką M9. Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C na noc.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbkę drobnoustrojów 10-krotnie pożywką M9 i załadować ją do urządzenia mikroprzepływowego, wywierając ciśnienie w pojemniku na próbkę drobnoustrojów pod ciśnieniem 5 psi. Następnie załaduj pożywkę z lekiem TMP do chipa, naciskając pojemnik na pożywkę lekiem pod ciśnieniem 5 psi. Wykonaj mieszanie drobnoustroju i leku, uruchamiając zawór mikromechaniczny między dwiema komorami na chipie mikroprzepływowym na 15 minut.</li>
		<li>Umieść chip mikroprzepływowy w inkubatorze mikroskopowym zamontowanym na mikroskopie odwróconym. Uzyskuj obraz komórki w komorze wzrostowej co godzinę przez 8 godzin za pomocą kamery CCD zamontowanej na odwróconym mikroskopie.</li>
		<li>Użyj niestandardowego skryptu programu, aby obliczyć numery komórek za pomocą algorytmu progowego na danych obrazu komórki18. Należy zauważyć, że dane dotyczące liczby komórek są zwykle uśredniane w trzech komorach mikroprzepływowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+worldwide%3A+causes%2C+challenges%2C+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses.</a> Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).</li>
<li>Wang, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+in+vivo+evolution+of+multidrug+resistance+in+Staphylococus+aureus+by+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing.</a> Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).</li>
<li>Dragosits, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+laboratory+evolution+-+principles+and+applications+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factory%22%5BJournal%5D)">Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology.</a> Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment.</a> Science. 333, 1764-1767 (2011).</li>
<li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).</li>
<li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+morbidostast%3A+an+automated+continuous+culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).</li>
<li>Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+evolution+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time.</a> Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).</li>
<li>Young, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+resistance+selection+and+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial resistance selection and quantitation.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2006).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li>
<li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li>
<li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li>
<li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).</li>
<li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost%2C+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. , (2015).</li>
<li>Mohan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+microfluidic+platform+for+rapid+antibiotic+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectrons%22%5BJournal%5D)">A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing.</a> Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKellogg%2C+RA+%22Nat.+Protocols%22">Nat. Protocols</a>. 9, 1713(2014).</li>
<li>Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoliter+microfluidic+serial+dilution+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+using+Matlab+processing%22">Digital image using Matlab processing</a>. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).</li>
<li>Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethoprim+resistance+in+Escherichia+coli+isolates+from+a+geriatric+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).</li>
<li>Flensburg, J., Skold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+overproduction+of+dihydrofolate+reductase+in+bacteria+as+a+response+to+the+use+of+trimethoprim%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim.</a> Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).</li>
<li>Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+five-tryptophan+mutations+on+structure%2C+stability+and+function+of+Escherichia+coli+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase.</a> J. Biochem. 130, 439-447 (2001).</li>
<li>Smith, D. R., Calvo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+dihydrofolate+reductase+genes+from+trimethoprim-resistant+mutants+of+Escherichia+coli.+Evidence+that+dihydrofolate+reductase+interacts+with+another+essential+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product.</a> Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).</li>
<li>Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidic+and+microfluidic+tools+for+quantitative+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology.</a> Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+based+on+single-cell+morphological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.</a> Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).</li>
<li>Hsu, S. B., Waltman, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+of+two+competitors+in+a+chemostat+with+an+external+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+J.+Applied+Math%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor.</a> SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+biomass+productivity+and+cell+density+of+Chlorella+vulgaris+by+using+light-emitting+diode-based+photobioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor.</a> J. Biotech. 161, 242-249 (2012).</li>
<li>Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+developing+tolerance+to+toxic+chemicals+in+microbial+systems+and+perspectives+on+moving+the+field+forward+and+into+the+industrial+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+in+Chem+Eng%22%5BJournal%5D)">Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting.</a> Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zademonstrowano urządzenie morbidostat o niewielkich rozmiarach wykonane z tanich komponentów. Wzrost poziomu oporności na leki zarejestrowany przez urządzenie jest zgodny z wcześniejszymi raportami5. Zaprojektowane z myślą o ewolucyjnych badaniach nad opornością na leki, urządzenie może mieć potencjalne zastosowanie w wielu innych eksperymentach. Po pierwsze, można stworzyć obszerną bazę danych mutacji wywołanych lekami dla dużego zestawu antybiotyków o znaczeniu klinicznym. Na przykład szlak ewolucyjny oporn...

Od czasu wprowadzenia pierwszego antybiotyku penicyliny, oporność mikroorganizmów na antybiotyki stała się globalnym problemem zdrowotnym1. Chociaż nabycie oporności na antybiotyki może być retrospektywnie badane in vivo, warunki tych eksperymentów często nie są kontrolowane przez cały okres ewolucji2. Alternatywnie, adaptacyjna ewolucja laboratoryjna może ujawnić ewolucję molekularną gatunku drobnoustrojów pod wpływem stresów środowiskowych lub presji selekcyjnej ze strony antybiotyku3. Ostatnio wiele dobrze kontrolowanych eksperymentów ewolucyjnych dotyczących oporności na antybiotyki wyjaśniło pojawienie się oporności na antybiotyki. Na przykład, grupa Austina wykazała szybkie pojawienie się w odpowiednio zaprojektowanym środowisku mikroprzepływowym z przedziałami4. Niedawno opracowany morbidostat indukuje systematyczne mutacje pod presją selekcji leków5,6. Morbidostat, urządzenie do selekcji drobnoustrojów, które w sposób ciągły dostosowuje stężenie antybiotyku w celu utrzymania prawie stałej populacji, stanowi duży postęp w stosunku do testu fluktuacji stosowanego w mikrobiologii7,8. W teście fluktuacji antybiotyk jest wstrzykiwany w wysokim stężeniu, a mutanty, które przeżyły, są badane i liczone. Zamiast tego drobnoustroje w morbidostat są stale prowokowane i nabywają wiele mutacji.
Morbidostat działa podobnie do chemostatu, urządzenia hodowlanego wynalezionego przez Novicka i Szliarda w 1950 roku, które utrzymuje stałą populację poprzez ciągłe dostarczanie składników odżywczych, jednocześnie rozcieńczając populację mikroorganizmów9. Od czasu wprowadzenia chemostatu został on zaawansowany i ulepszony. Obecne chemostaty mikroprzepływowe osiągnęły pojemność nanolitrów i pojedynczych komórek. Jednak urządzenia te nie nadają się do eksperymentów ewolucji adaptacyjnej, które wymagają dużej populacji komórek z wieloma mutacjami10,11. Ostatnio opracowano również mini-chemostaty o objętości roboczej ~10 ml, aby wypełnić lukę między bioreaktorami w skali litrowej a chemostatem mikroprzepływowym12,13.
Tutaj prezentujemy projekt i zastosowanie taniego, zautomatyzowanego morbidostu do badania oporności na antybiotyki. Proponowany moduł może być stosowany w inkubatorze z wytrząsarką w laboratorium mikrobiologicznym przy minimalnym zapotrzebowaniu na sprzęt. Oprogramowanie układowe typu open source można również łatwo dostosować do konkretnych zastosowań ewolucji adaptacyjnej, takich jak inżynieria metaboliczna3. Na koniec morbidostat jest integrowany z multipleksowaną platformą mikroprzepływową do badania wrażliwości na antybiotyki14.

<table><tbody><tr><td>Inkubator wytrząsarki środowiskowej</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Płyta Arduino Leonardo</td> Rezystor węglowy <td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm</td> Rezystor <td>Digikey</td><td></td><td>Bias do</td></tr><tr><td>LED Rezystor węglowy 100k Ohm</td> Rezystor <td>Digikey</td><td></td><td>Bias do fototranzystora</td></tr><tr><td>Dioda elektroluminescencyjna 940 nm</td><td>Bright LED Electronic</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Pomiar gęstości optycznej</td></tr><tr><td>fototranzystor 940 nm</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Pomiar gęstości optycznej</td></tr><tr><td>Para Darlington IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>ten układ scalony napędza mikropompy i mieszadło magnetyczne</td></tr><tr><td>Wentylator bezszczotkowy 5 V DC</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>specyfikacja: napięcie zasilania 5 V i 80&nbsp; mA; dostępne www.jameco.com</td></tr><tr><td>Mikropompa piezoelektryczna</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Ciśnienie > 3&nbsp; kPa; Przepływ >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L: 50'&nbsp;</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>COWIE</td><td></td><td>stożkowy kształt przyciemnienie: 10&nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Szklana fiolka scyntylacyjna 20 ml</td><td>DGS</td><td></td><td>Szkło Pyrex 28 mm (średnica) x 61 mm (wysokość)</td></tr><tr><td>Uchwyt</td><td></td><td></td> na fiolkę do <td>hodowli Wykonane na zamówienie z poliformaldehydu&nbsp;</td></tr><tr><td>Silikon</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>służy do uszczelniania szklanej fiolki</td></tr><tr><td>Średnia butelka</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimalna sól 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>Kadaminy BD</td><td></td><td></td><td>Średnia</td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bateriological</td><td>Oxoid</td><td></td><td>na płytkę</td></tr> <tr><td>agarowąLuria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>używany do pomiarów mikroprzepływowych Użyj obiektywu 40X NA = 0,55</td></tr><tr><td>Inkubator mikroskopowy</td><td>Instrument do żywych komórek</td><td>CU-109</td><td>używany do pomiarów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Zawory elektromagnetyczne</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalnie otwarty 1,3 W 12 Vdc</td></tr><tr><td>Karta interfejsu USB</td> Cyfrowy moduł I/O <td>firmy Hobby Engineering</td><td>USBIO24-R&nbsp;</td><td>do pomiarów mikrofluidycznych</td></tr><tr><td>Sprężarka powietrza</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Źródło ciśnienia do mikrofluidów; Max. Ciśnienie 80 psi</td></tr><tr><td>Męskie złączki luer-lock do 1/8" zadzior</td><td></td><td>ValuePlastics.com MTLL230-1</td><td>używany do sterowania mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Króciec 1/8" do portu gwintowanego 10-32</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>używany do sterowania mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Złączki żeńskie typu luer-lock do portu</td> <td>gwintowanego 10-32ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>używany do sterowania mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>NPN tranzystor Darlingtona 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>stosowany do sterowania mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>10 kOhm, rezystor węglowy, 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>stosowany do sterowania mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Kondensator tantalowy, 10&nbsp; &mu; F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>używany do sterowania mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>używany do obrazowania mikroprzepływowego na chipie</td></tr><tr><td>czytnik</td><td></td><td></td><td></td>płytek ELISA</tr><tr><td>dwuskładnikowy silikon&nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>używany do produkcji chipów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Fotorezystor SU-8</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>używany do produkcji chipów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Fotorezystor AZ4620</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>używany do produkcji chipów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>używany do produkcji chipów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa o rozmiarze 20 BD</td><td></td><td></td><td>używany do produkcji chipów mikroprzepływowych</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR amplifikacja</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate czytnik</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp;</td><td>Pomiar oporności na antybiotyki</td></tr></tbody></table>

opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat do scharakteryzowania ewolucyjnej ścieżki oporności na antybiotyki. Morbidostat to urządzenie do hodowli bakteryjnej, które w sposób ciągły monitoruje wzrost bakterii i dynamicznie dostosowuje stężenie leku, aby stale stanowić wyzwanie dla bakterii w miarę ich ewolucji w kierunku uzyskania oporności na leki. Urządzenie charakteryzuje się pojemnością roboczą ~10 ml i jest w pełni zautomatyzowane oraz wyposażone w optyczny pomiar gęstości oraz mikropompy do podawania pożywki i leków. Aby zweryfikować platformę, zmierzyliśmy stopniowe nabywanie oporności na trimetoprim u Escherichia coli MG 1655 i zintegrowaliśmy urządzenie z multipleksowaną platformą mikroprzepływową w celu zbadania morfologii komórek i wrażliwości na antybiotyki. Podejście to można rozszerzyć do badań laboratoryjnych nad opornością na antybiotyki i można je rozszerzyć o ewolucję adaptacyjną w celu ulepszenia szczepu w inżynierii metabolicznej i innych eksperymentach z kulturami bakteryjnymi.

Opisany powyżej morbidostat przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. Typowe operacje morbidostatu, w tym ewolucja eksperymentalna, test podatności na antybiotyki oraz kontrola morfologii komórek, zostały zwalidowane w kulturze E. coli MG1655 poddanej działaniu trimetoprymu (TMP), powszechnie stosowanego leku antybiotykowego5,6. TMP indukuje bardzo charakterystyczne, stopniowe wzrosty oporności na lek, a mutacje grupują się wokół genu reduktazy dihydro...

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest charakterystyka ścieżki ewolucyjnej oporności na antybiotyki przy użyciu urządzenia Morbidostat, które stale monitoruje wzrost bakterii i dynamicznie dostosowuje stężenie antybiotyku w miarę nabywania przez bakterie oporności na lek. Główną zaletą tej techniki jest to, że zestaw składa się z tanich i łatwo dostępnych komponentów elektronicznych oraz może być łatwo rekonfigurowany do określonych celów. Procedury zaprezentują Po Cheng Liu oraz Yi Tai Lee, oboje doktoranci w moim laboratorium.Aby złożyć Morbidostat, należy rozpocząć od wykonania trzech otworów w zakrętce fiolki z kulturą za pomocą igły o rozmiarze 18 G. Odciąć trzy kawałki rurki polietylenowej o długości około siedmiu centymetrów i włożyć je w otwory w zakrętce. Za pomocą taśmy okleić krawędź zakrętki, aby służyła ona jako forma dla mieszaniny polidimetylosiloksanu (PDMS).Następnie dodaj pięć gramów komponentu A i 0,5 grama komponentu B PDMS do plastikowego pojemnika o pojemności 150 ml i wymieszaj zawartość ręcznie za pomocą wykałaczki. Przenieś mieszaninę do strzykawki o pojemności 10 ml. Następnie, za pomocą strzykawki, nanieś mieszaninę PDMS na nakrętkę.Wypiekaj całą nasadkę w

design-use-low-cost-automated-morbidostat-for-adaptive-evolution

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Źródło: Liu, P. C., et al. Zaprojektowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostatu do adaptacyjnej ewolucji bakterii przy doborze antybiotyków. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje zastosowanie chipa mikroprzepływowego do wizualizacji i porównania wzrostu i morfologii szczepów E. coli typu dzikiego i opornych na trimetoprim w warunkach stresu związanego z antybiotykiem trimetoprimu.

Wzrost bakterii na chipie mikroprzepływowym w celu zbadania antybiotykooporności

Źródło: Jian, X. i in., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Ten film demonstruje zastosowanie systemu hodowli mikrobiologicznych mikrokropel do kierowania adaptacyjną ewolucją bakterii w kierunku tolerancji metanolu. Mieszając zmodyfikowane kultury bakteryjne z podłożem stresowym o wysokiej zawartości metanolu i dzieląc je na mikrokropelki, system wybiera mutanty, które wykazują lepszy wzrost pod...

Adaptacyjna ewolucja bakterii przy użyciu mikrobiologicznego systemu hodowli mikrokropelek

Tempo wzrostu komórek jest procesem regulowanym i głównym wyznacznikiem fizjologii komórki. Ciągła hodowla przy użyciu chemostatów umożliwia zewnętrzną kontrolę tempa wzrostu komórek poprzez ograniczenie składników odżywczych, co ułatwia badanie sieci molekularnych, które kontrolują wzrost komórek i jak te sieci ewoluują w celu optymalizacji wzrostu komórek.

Zastosowanie chemostatów w biologii systemów mikrobiologicznych

Opracowaliśmy i sprawdziliśmy zestaw miniaturowych chemostatów o niewielkich rozmiarach, zbudowanych z łatwo dostępnych części za niskie koszty. Wyniki ewolucji fizjologicznej i eksperymentalnej były podobne do chemostatów o większej objętości. Macierz ministat zapewnia kompaktową, niedrogą i dostępną platformę do tradycyjnych eksperymentów z chemostatem, genomiki funkcjonalnej i badań przesiewowych substancji chemicznych.

Projektowanie i wykorzystanie multipleksowanych macierzy chemostatów

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający uzyskanie adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów w warunkach wykorzystujących hodowlę chemostatu. Omówiono również analizę genomiczną wyewoluowanego szczepu.

Procedura adaptacyjnej laboratoryjnej ewolucji mikroorganizmów przy użyciu chemostatu

Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.

Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Poznaj niedrogi, zautomatyzowany morbidostat do badania ewolucji oporności bakterii na antybiotyki. Urządzenie dynamicznie dostosowuje stężenia leków i umożliwia skalowalne eksperymenty mikrobiologiczne.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Przeglądaj więcej filmów