Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków
27 września 2016
Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest charakterystyka ścieżki ewolucyjnej oporności na antybiotyki przy użyciu urządzenia Morbidostat, które stale monitoruje wzrost bakterii i dynamicznie dostosowuje stężenie antybiotyku w miarę nabywania przez bakterie oporności na lek. Główną zaletą tej techniki jest to, że zestaw składa się z tanich i łatwo dostępnych komponentów elektronicznych oraz może być łatwo rekonfigurowany do określonych celów. Procedury zaprezentują Po Cheng Liu oraz Yi Tai Lee, oboje doktoranci w moim laboratorium.
Aby złożyć Morbidostat, należy rozpocząć od wykonania trzech otworów w zakrętce fiolki z kulturą za pomocą igły o rozmiarze 18 G. Odciąć trzy kawałki rurki polietylenowej o długości około siedmiu centymetrów i włożyć je w otwory w zakrętce. Za pomocą taśmy okleić krawędź zakrętki, aby służyła ona jako forma dla mieszaniny polidimetylosiloksanu (PDMS).
Następnie dodaj pięć gramów komponentu A i 0,5 grama komponentu B PDMS do plastikowego pojemnika o pojemności 150 ml i wymieszaj zawartość ręcznie za pomocą wykałaczki. Przenieś mieszaninę do strzykawki o pojemności 10 ml. Następnie, za pomocą strzykawki, nanieś mieszaninę PDMS na nakrętkę.
Wypiekaj całą nasadkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez osiem godzin, aby utwardzić PDMS. Następnie, używając lutownicy, przylutuj anodę diody LED za pomocą drutu 24 gauge oraz katodę diody LED za pomocą rezystora węglowego. Następnie przylutuj rezystor węglowy 680 Ohm za pomocą drutu 24 gauge.
Użyj taśmy izolacyjnej, aby odizolować połączenie przewodów. Przylutuj kolektor fotodetektora do przewodu o przekroju 24 gauge, a emiter fotodetektora do rezystora węglowego o oporności 100 Ohm. Następnie użyj taśmy izolacyjnej, aby odizolować połączenie przewodów.
Umieść diodę emitującą światło w uchwycie na fiolki hodowlane. Zgodnie ze schematem obwodu przedstawionym tutaj, podłącz diodę emitującą światło i użyj zasilacza o napięciu pięciu wolt do jej zasilenia. Upewnij się, że dioda LED działa, używając kamery cyfrowej zdolnej do detekcji IR. Następnie umieść detektor światła w uchwycie na fiolki hodowlane.
Następnie, zgodnie ze schematem, podłącz detektor światła i zasil go za pomocą zasilacza o napięciu 5 V. Podłącz przewód do obu stron rezystorów detektora światła, aby zmierzyć napięcie na elektronicznej płycie sterującej. Przyklej magnes do wału wentylatora chłodzącego, który pełni funkcję jednostki mieszadła magnetycznego.
Ponieważ jednostka mieszania magnetycznego składa się z magnesu i wentylatora chłodzącego, kluczowe jest odpowiednie ustawienie półki wentylatora względem fiolki z hodowlą. Równie krytyczna dla zapewnienia stabilnej pracy jest odległość między fiolką z hodowlą a magnesem. Podłącz każdy odcinek rurki polietylenowej fiolki z hodowlą do odpowiadającego mu odcinka rurki silikonowej pomp mikropomp, butelek z pożywką oraz butelki na odpady.
Włącz pompę na jedną godzinę i zmierz całkowitą objętość cieczy przepompowanej z butelki z medium do fiolki z hodowlą, aby określić szybkość pompowania. Typowa szybkość pompowania powinna wynosić około 4 ml/h, co odpowiada szybkości rozcieńczenia D = 0,33 h⁻¹ dla objętości roboczej fiolki z hodowlą wynoszącej 12 ml. Po zakończeniu przygotowania całego układu umieść go w inkubatorze wytrząsowym średniej wielkości.
Aby przeprowadzić wstępny test urządzenia Morbidostat, ustaw napięcie zasilania wentylatora chłodzącego na pięć woltów, aby uruchomić jego silnik i przetestować magnetyczny mieszadło. Po przygotowaniu serii próbek E. coli i wykreśleniu krzywej kalibracyjnej zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj fiolkę z hodowlą, używając trzech odcinków o długości siedmiu centymetrów ultra-chemicznie odpornej rurki Tygon o średnicy wewnętrznej 1/32 cala i średnicy zewnętrznej 3/32 cala, które posłużą jako wloty do urządzenia. Przygotuj minimalne medium M9 z 0,2% glukozy oraz medium M9 zawierające lek Trimethoprim (TMP).
Następnie wysterylizuj pożywkę, butelkę z pożywką, butelkę z pożywką z lekiem, butelkę na odpady oraz fiolkę hodowlaną w autoklawie w temperaturze 121 °C. Pierwszego dnia eksperymentu rozmroź jeden mililitr zamrożonych komórek szczepu dzikiego E-coli MG1655 w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie przenieś 120 µL komórek do fiolki hodowlanej zawierającej około 12 mL pożywki wzrostowej M9. Włącz inkubator wytrząsowy i ustaw temperaturę na 30 °C bez wytrząsania.
Rozpocznij pracę urządzenia Morbidostat, włączając mikropompę, mieszadło magnetyczne oraz pomiar gęstości optycznej. Po około 23 godzinach zatrzymaj mikropompę, wyłączając jej napięcie zasilania, i wyjmij fiolkę z hodowlą. Do fiolki z hodowlą dodaj 15% glicerolu, a następnie zamroź próbki w temperaturze -80 °C w celu ich przechowywania.
Wymiana fiolki z hodowlą na początku każdego z tych eksperymentów jest również istotna, aby uniknąć tworzenia się biotyny. W przeciwnym razie do powstania biotyny może dojść w ciągu dwóch lub trzech dni. Po rozmrożeniu codziennej zamrożonej próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, zaszczep nową probówkę zawierającą świeżą pożywkę M9.
Umieść próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia użyj pożywki M9 do dziesięciokrotnego rozcieńczenia próbki mikrobiologicznej, a następnie wprowadź ją do urządzenia mikroprzepływowego, przykładając ciśnienie 5 PSI do pojemnika z próbką. Następnie wprowadź do chipa pożywkę zawierającą TMP, przykładając ciśnienie 5 PSI do pojemnika z pożywką M9 z TMP.
Przeprowadź mieszanie mikroorganizmów z lekiem poprzez uruchomienie mikromechanicznego zaworu znajdującego się pomiędzy dwiema komorami na chipie mikroprzepływowym przez 15 minut. Następnie umieść chip mikroprzepływowy w inkubatorze mikroskopowym zamontowanym na mikroskopie odwróconym. Za pomocą kamery CCD wykonuj obrazy komórek w komorze wzrostu co godzinę przez osiem godzin.
Oblicz dane dotyczące liczby komórek zgodnie z protokołem tekstowym. Typowe operacje w systemie Morbidostat, w tym ewolucja eksperymentalna, testy podatności na antybiotyki oraz analiza morfologii komórek, zostały przeprowadzone z wykorzystaniem kultury E-coli MG1655 narażonej na antybiotyk TMP, który indukuje charakterystyczny skokowy wzrost oporności na lek dzięki mutacjom skupionym wokół genu reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Przewiduje się, że każdego dnia mikroorganizmy będą rosły powyżej zaprogramowanego progu gęstości optycznej, co wywoła wtrysk leku, jak pokazano tutaj.
Oczekuje się, że wstrzyknięcie leku zahamuje wzrost, a w konsekwencji zmniejszy gęstość optyczną. Wykres ten przedstawia wzrost w czasie oporności na lek antybiotyczny w eksperymencie mającym na celu wyznaczenie IC50. Oporność na lek wzrosła około 1500-krotnie, osiągając wartość 1 000 µg/mL w ciągu około 12 dni.
Zgodnie z poprzednimi ustaleniami. Punktowe mutacje DHFR w mutancie z ostatniego dnia zostały zmierzone za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera i są wymienione w tej tabeli. Nabycie oporności na lek przy wielu mutacjach potwierdza użyteczność urządzenia Morbidostat.
Ponieważ selekcja na płytkach agarowych zawierających lek ma tendencję do nadawania jedynie pojedynczej mutacji. Rysunek ten przedstawia krzywe wzrostu na chipie przy różnych stężeniach TMP. Próbki mutantów wykazują znaczący wzrost odporności na lek antybiotykowy.
Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom do analizy poziomu oporności na antybiotyki w rzeczywistym środowisku laboratoryjnym. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne pomiary, takie jak mikrofluidyczne pomiary pojedynczych komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy morfologia nadal ulega zmianie pod wpływem ekspozycji na leki antybiotykowe. Po opanowaniu obsługi, urządzenie to można łatwo rekonfigurować dla wszystkich eksperymentów z kulturami bakterii, takich jak hodowla konkretnego szczepu bakterii lub zwiększanie poziomu tolerancji na dany lek u szczepu bakteryjnego.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak badać nabywanie oporności na antybiotyki w rzeczywistym, kontrolowanym eksperymencie laboratoryjnej ewolucji adaptacyjnej. Prosimy pamiętać o postępowaniu z bakteriami opornymi na leki zgodnie z zasadami bezpieczeństwa biologicznego w praktyce mikrobiologicznej. W przypadku eksperymentów obejmujących podstawowe szkolenie bakterii może być wymagane specjalne zezwolenie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia tani, konfigurowalny morbidostat zaprojektowany do badania oporności na antybiotyki poprzez dynamiczną regulację stężeń leków. Urządzenie może zostać zintegrowane z multipleksową platformą mikroprzepływową, co umożliwia skalowalne badania laboratoryjne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Oporność na antybiotyki
- Inżynieria urządzeń
Wprowadzenie
- Oporność na antybiotyki stanowi istotne wyzwanie dla zdrowia publicznego.
- Zrozumienie ścieżek ewolucyjnych oporności może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Obecne metody badania oporności mogą być kosztowne i złożone.
- Morbidostat oferuje nowatorskie podejście do ciągłego monitorowania wzrostu bakterii.
Cel badania
- Określenie ścieżki ewolucyjnej oporności na antybiotyki.
- Zaprezentowanie niskokosztowej metody prowadzenia badań nad opornością na antybiotyki.
- Zapewnienie rekonfigurowalnej platformy dostosowanej do różnych potrzeb eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Montaż morbidostatu z wykorzystaniem niedrogich komponentów elektronicznych.
- Ciągłe monitorowanie wzrostu bakterii.
- Dynamiczna regulacja stężeń antybiotyków w zależności od rozwoju oporności.
- Wykorzystanie PDMS do tworzenia elementów urządzenia.
Główne wyniki
- Morbidostat skutecznie monitoruje wzrost bakterii w czasie rzeczywistym.
- Dynamiczna regulacja stężenia antybiotyku jest możliwa i efektywna.
- Urządzenie można łatwo rekonfigurować dla różnych eksperymentów.
- Niskokosztowe komponenty sprawiają, że to podejście jest dostępne dla wielu laboratoriów.
Wnioski
- Morbidostat jest cennym narzędziem do badania oporności na antybiotyki.
- Metoda ta może pogłębić zrozumienie adaptacji bakterii.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę platformę w szerszych zastosowaniach w mikrobiologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowane platformy morbidostatowe umożliwiają ciągłą, w czasie rzeczywistym analizę adaptacji bakterii pod wpływem presji antybiotykowej, co bezpośrednio zwiększa wiarygodność prognostyczną w mapowaniu ścieżek oporności. Możliwość ta jest kluczowa dla zespołów zajmujących się wczesnym odkrywaniem leków, dążących do zminimalizowania ryzyka przy wyborze celów przeciwbakteryjnych oraz do opracowania strategii translacyjnych dla terapeutyków nowej generacji. Tani, rekonfigurowalny projekt ułatwia szerokie zastosowanie w portfelach badawczo-rozwojowych, przyspieszając wyjaśnianie mechanizmów oporności oraz badania nad ewolucją adaptacyjną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia dynamiczną, ilościową ocenę nabywania oporności w warunkach kontrolowanej selekcji lekowej.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez mapowanie trajektorii mutacyjnych w czasie rzeczywistym.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów przeciwbakteryjnych za pomocą eksperymentów z ewolucji adaptacyjnej.
- Dostarcza praktycznych danych do segregacji portfela i priorytetyzacji strategii przełamywania oporności.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne warunki hodowli bakteryjnej do późniejszych testów podatności.
- Umożliwia generowanie ilościowych pomiarów gęstości optycznej oraz wartości IC50 w celu opracowania rzetelnych analiz.
- Wspiera integrację z platformami mikroprzepływowymi do wysokoprzepustowego przesiewu fenotypowego.
- Umożliwia skalowalną, multipleksową ocenę skuteczności związków przeciwko ewoluującym populacjom bakterii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników ewolucji laboratoryjnej z klinicznie istotnymi fenotypami oporności.
- Zapewnia ciągłość procesu – od mapowania oporności na etapie odkryć po przedkliniczną walidację potencjalnych interwencji.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i rzeczywiste dane dotyczące pojawiania się oporności.
- Wspiera identyfikację translacyjnych biomarkerów dzięki sekwencyjnemu pobieraniu i sekwencjonowaniu próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta zautomatyzowana platforma morbidostatowa łączy wczesną fazę odkrywania, badania przesiewowe i badania translacyjne, umożliwiając prowadzenie studiów nad ciągłą ewolucją adaptacyjną oraz ilościowe profilowanie oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów oporności i wyjaśnianie szlaków w oparciu o postawione hipotezy.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w celu standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza danych o gęstości optycznej i IC50 w czasie rzeczywistym do analizy porównawczej dynamiki oporności.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników laboratoryjnych do klinicznych trendów oporności oraz opracowywanie biomarkerów.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje modułową, rekonfigurowalną platformę, którą można dostosować do różnorodnych eksperymentów z hodowlą i ewolucją bakterii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w mapowaniu ścieżek oporności i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów ewolucji adaptacyjnej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz ogranicza ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju portfela leków przeciwbakteryjnych.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację i rozwój kandydatów przełamujących oporność w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli bakterii, montażu urządzeń oraz protokołów ewolucji adaptacyjnej.
- Wymagany jest dostęp do podstawowych komponentów elektronicznych, integracji mikroprzepływowej oraz infrastruktury do pomiaru gęstości optycznej.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia porównywalności danych i integracji przepływu pracy.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych szczepów bakteryjnych i projektów eksperymentalnych przy minimalnej rekonfiguracji.
- Zapewnienie zabezpieczeń przed zagrożeniami biologicznymi i przestrzeganie zasad bezpieczeństwa biologicznego jest niezbędne podczas pracy z organizmami lekoopornymi.
