Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Ogólnym celem tego eksperymentalnego podejścia jest zbadanie odpowiedzi immunologicznej na zakażenie dróg moczowych i zapobieganie bezpośredniemu porównaniu między samcami i samicami. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania immunologiczne błony śluzowej związane z tym, jak mężczyźni i kobiety reagują na infekcję dróg moczowych. Główną zaletą jest to, że infekcja odbywa się za pośrednictwem naturalnego korzenia.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po zauważeniu, jak często stwierdza się, że instalacja pęcherza moczowego samcom myszy jest niemożliwa. Chociaż metoda ta zapewni wgląd w infekcje dróg moczowych, może być również zastosowana do innych badań nad chorobami, takimi jak rak pęcherza moczowego. Na początek przygotuj jedną pediatryczną kaniulę z dostępem dożylnym dla każdej grupy myszy, która ma zostać zainfekowana.

Korzystając z wbudowanego mechanizmu sprężynowego, usuń każdą kaniulę z igły zgodnie z instrukcją producenta. Wyrzuć igły, zachowując tylko plastikową kaniulę dożylną. Sterylizuj cewniki w kapturze z przepływem laminarnym przez jeden cykl UV trwający około 25 do 30 minut.

Po przejściu do nocnej hodowli uropatogennej grupy E coli lub UPEC, zgodnie z protokołem tekstowym, należy odwirować zawiesinę bakteryjną w mikrowirówce stołowej z prędkością 17 000 g przez jedną minutę i ponownie zawiesić powstały osad bakteryjny dwa razy od 10 do ósmego CFU na mililitr w PBS. Seryjnie rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny i płytkę na agarze LB antybiotykami, jeśli to właściwe, w celu określenia dokładnego inokulum dla każdego zakażenia. Pobrać inokulum bakteryjne do jednomililitrowej strzykawki i przymocować cewnik do końca strzykawki.

Postukać w strzykawkę, aby usunąć powietrze, a następnie wcisnąć tłok, aby wypełnić martwą przestrzeń powietrzną w cewniku przed rozpoczęciem wkraplania. Po znieczuleniu samicy myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem, umieść zwierzę na wznak i zastosuj średni nacisk na dolną część brzucha, aby opróżnić pęcherz z moczu. Pełne pęcherze są jak ziarnko grochu pod skórą, między grzebieniami biodrowymi.

Gdy pęcherz jest pusty, używając ręki niedominującej, połóż kciuk na ogonie, a palec tej samej ręki na brzuchu myszy i delikatnie uciskaj w przeciwnych kierunkach, aby mocno utrzymać mysz na miejscu. Następnie umieść końcówkę cewnika prostopadle do myszy przy ujściu cewki moczowej, a następnie delikatnie docisk wsuń cewnik do cewki moczowej, aż piasta zetknie się z otworem cewki moczowej, jednocześnie opuszczając strzykawkę tak, aby była równoległa do powierzchni roboczej. Po umieszczeniu cewnika użyj palca ręki niedominującej, która spoczywa na brzuchu myszy, aby bardzo delikatnie pociągnąć skórę brzucha w kierunku głowy myszy.

Należy pamiętać, że otwór cewki moczowej nie będzie się poruszał. Jeśli jednak cewniki znajdują się w pochwie, tkanka przesunie się w górę i odsunie się od cewnika. Trzymając piastę cewnika przy ujściu cewki moczowej, powoli dozuj 15 mikrolitrów inokulum bakteryjnego.

Powolna szybkość instalacji minimalizuje refluks pęcherzowo-moczowodowy do nerki. Powoli wyjmij cewnik, aby zapobiec wyciekowi. Następnie umieść zwierzę w klatce w pozycji leżącej.

Aby zaszczepić samce myszy, umieść dwa kleszcze kciuka czaszkowo i doogonowo do zewnętrznych narządów płciowych myszy. Cofnij napletek, aby w pełni odsłonić penisa gruczołu. Następnie, gdy penis znajdzie się na zewnątrz, zwolnij kleszcze do kciuków.

Zmień położenie kleszczy, aby ustabilizować wystającego penisa prostopadle do zwierzęcia, przytrzymując narząd delikatnie, ale mocno. Następnie przez mały otwór w końcówce ujścia cewki moczowej ostrożnie wprowadź cewnik i delikatnie wprowadź go do penisa za pomocą kleszczy, aby delikatnie utrzymać napięcie. Gdy piasta cewników zetknie się z czubkiem prącia, bardzo powoli dozuj 50 mikrolitrów inokulum, zachowując pozycję prącia.

Zwróć uwagę na jakość wkraplania zgodnie z wcześniej ustaloną oceną jakości wkraplania, taką jak ta pokazana tutaj. Powoli cofaj cewnik przez pięć sekund, aby zapobiec wyciekowi inokulum. Umieść mysz w klatce w pozycji leżącej.

Zwierzę powinno zacząć wracać do zdrowia po 30 do 45 minutach od podania środka znieczulającego. Po złożeniu w ofierze myszy zgodnie z zatwierdzonym protokołem, użyj 70%Epinal do dokładnego zwilżenia brzucha, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią. Za pomocą nożyczek wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w poprzek dolnej jednej trzeciej brzucha myszy i aseptycznie usuń pęcherz moczowy i inne pożądane narządy.

Przenieść narządy do pięciu mililitrowych polipropylenowych probówek typu snap-cap, zawierających jeden mililitr sterylnego PBS i przechowywać wszystkie próbki na lodzie. Za pomocą ręcznego homogenizatora homogenizuj narządy, aż prawie nie pozostanie żadna tkanka stała. Wyrzuć błyszczącą, beżowo-białą tkankę tłuszczową, która nie homogenizuje się dobrze.

Następnie użyj Epinal, a następnie PBS, aby umyć homogenizator między każdą grupą eksperymentalną lub narządową. Po przygotowaniu seryjnych rozcieńczeń homogenizowanej zawiesiny narządowej, rozcieńczenia płytki na płytkach agarowych LB, w razie potrzeby z antybiotykami, i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Aby przeprowadzić cytometrię przepływową na tkance pęcherza moczowego, po odizolowaniu pęcherza, jak pokazano wcześniej w tym filmie, użyj nożyczek, aby dobrze zmielić tkankę.

Dodać jeden zmielony pęcherz do probówki zawierającej bufor wytrawiający. Następnie potrząśnij probówką, aby umyć zmieloną tkankę w buforze do wytrawiania i trzymaj ją na lodzie, aż wszystkie pęcherze zostaną wycięte i zmielone. Inkubować rozdrobnione pęcherze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 do 75 minut, energicznie potrząsając ręką przez pięć sekund, co 15 minut.

Kiedy tkanka ma szklisty, przezroczysty wygląd przypominający mokrą bibułkę, trawienie jest zakończone. Dezaktywuj enzymy wytrawiania, dodając dwa do trzech mililitrów lodowatego buforu cytometrii przepływowej i delikatnie wymieszaj. Następnie umieść rurki na lodzie.

Aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową i usunąć tkankę łączną, przepuść zawartość probówki przez filtr o średnicy 100 mikrometrów umieszczony w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Następnie, za pomocą końcówki tłoka strzykawki, delikatnie przeciśnij pozostałą tkankę przez filtr. Umyj filtr dodatkowymi dwoma mililitrami buforu cytometrii przepływowej i utrzymuj próbki na lodzie.

Próbki przemywać przez odwirowanie w temperaturze 200 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez siedem minut. Zawiesić osady w 100 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej zawierającego blok Fc, rozcieńczony do pięciu mikrogramów na mililitr i przenieść na 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Po 10 do 15 minutach dodaj 100 mikrolitrów pożądanego koktajlu przeciwciał do każdej próbki.

Następnie próbki należy inkubować na lodzie chronionym przed światłem przez 30 do 45 minut. Próbki przemywać przez odwirowanie w temperaturze 200 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez siedem minut. Na koniec ponownie zawieś granulki komórek w 200 mikrolitrach bufora cytometrii przepływowej i przepuść próbki przez sitko komórkowe o wielkości 40 mikrometrów na pięciomililitrowej probówce z polistyrenu, tuż przed pobraniem na cytometr przepływowy.

Ten rysunek przedstawia reprezentatywne dane od myszy zakażonych przez 24 godziny. Obciążenie bakteryjne było równe między samcami i samicami myszy po 24 godzinach od zakażenia. Aby ustalić, czy utrata inokulum w czasie infekcji wpłynęła na powstanie infekcji, każde wkroplenie oceniano w skali od jednego do pięciu, przy czym jedna z nich była najbardziej optymalna.

Kolonizację bakteryjną stwierdzono 24 godziny po zakażeniu. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między CFU uzyskanymi od zwierząt o różnych wynikach wkraplania, ocenianych za pomocą nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa, porównującego średnią rangę każdej kolumny ze średnią rangą każdej innej kolumny i korygującego wielokrotne porównania za pomocą testu Dunna. Można wnioskować, że nieoptymalne wkroplenia, skutkujące znacznym wyciekiem inokulum bakteryjnego podczas infekcji, nie wpływają znacząco na kolonizację bakteryjną po 24 godzinach.

Co ważne, częstotliwość nieoptymalnego wkraplania będzie się zmniejszać wraz z praktyką. Wreszcie, podczas gdy liczba komórek odpornościowych CD45-dodatnich, obecnych u nieleczonych zwierząt, nie różniła się między samicami i samcami myszy, nastąpił statystycznie istotny wzrost infiltracji do pęcherzy moczowych zakażonych samic myszy. Podczas próby cewnikowania ważne jest, aby wykonywać powolne, delikatne ruchy.

Wraz z rozwojem technika ta pomogła nam zbadać różnice w odporności pęcherza moczowego samców i samic zwierząt ze względu na płeć.