Name: Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę cewnikowania przezcewkowego u myszy w celu badania zakażeń dróg moczowych i odpowiedzi immunologicznej. Ta technika umożliwia porównanie między płciami oraz badanie patologii pęcherza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Matthieu Rousseau za krytyczną lekturę manuskryptu oraz Laboratorium Immunobiologii Dendrytycznej za ich pomocne spostrzeżenia podczas opracowywania tego protokołu i projektu. Prace te były częściowo finansowane ze środków Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej w ramach działania "Marie Curie" (PCIG11-GA-2012-3221170) oraz Laboratorium Immunoonkologicznego (MAI).

Eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzeniem protokołu nr 2012-0024 przez Comité d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (komisja etyki ds. doświadczeń na zwierzętach), zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63 UE.
1. Przygotowanie cewników
<ol>
	<li>Przygotuj jedną pediatryczną kaniulę o dostępie dożylnym dla każdej grupy myszy, która ma zostać zakażona. Korzystając z wbudowanego mechanizmu sprężynowego, odłącz każdą kaniulę od igły, zgodnie z instrukcją producenta. Wyrzuć igły, zachowując tylko plastikową kaniulę dożylną.</li>
	<li>Sterylizuj cewniki w kapturze z przepływem laminarnym przez jeden cykl ultrafioletowy (UV), zwykle 25 - 30 min. 
	Uwaga: Cewniki mogą być używane dla więcej niż jednej myszy, jednak nowy cewnik powinien być używany między grupami eksperymentalnymi, płciami lub szczepami bakterii.</li>
</ol>
2. Przygotowanie uropatogennej E. coli do infekcji
<ol>
	<li>Co najmniej dwa dni przed zakażeniem, używając sterylnej pętli do zaszczepiania, rozprowadź UPEC z zamrożonego wywaru bakteryjnego na płytce agarowej Luria Bulion (LB), zawierającej antybiotyki, jeśli to konieczne. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
	<li>W sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml zaszczepić 10 ml LB, zawierającej antybiotyki, jeśli to właściwe, pojedynczą kolonią z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (około 16-18 godzin). 
	Uwaga: Stałe kultury pozwalają na ekspresję pilusów typu 1, które są niezbędne do infekcji23. Kultury wyhodowane w potrząśnięciu będą miały mniej wydajną ekspresję pilusów, a tym samym niespójne wskaźniki infekcji.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną (OD)600 w nocnej hodowli i obliczyć liczbę bakterii na ml, korzystając z wcześniej ustalonej krzywej wzrostu. Na przykład dla szczepu UPEC UTI89, OD600 = 0,35 odpowiada 2 x 108 CFU na ml, a zatem hodowla przez noc z OD600 = 2,4 byłaby równoważna 13,7 x 108 CFU na ml. Empirycznie określ związek między OD600 a żywymi bakteriami z każdym nowym szczepem wykorzystywanym do infekcji.</li>
	<li>Określ potrzebną ilość bakterii, biorąc pod uwagę liczbę zwierząt, które mają zostać zakażone i że każda mysz powinna otrzymać około 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) w 50 μl PBS. Uwzględnij w obliczeniach ~130 μl martwej objętości cewnika i wypustki strzykawki oraz 100 μl potrzebnych do określenia inokulum.
	<ol>
		<li>Wirować zawiesinę bakteryjną w mikrowirówce stołowej o sile 17 000 x g przez 1 minutę i ponownie zawiesić powstałą osadkę bakteryjną w ilości 2 x 108 jtk/ml w PBS. Seryjnie rozcieńczyć porcję tej zawiesiny i płytki na agarze LB, w razie potrzeby antybiotykami, w celu określenia dokładnego inokulum dla każdego zakażenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narysuj inokulum bakteryjne do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj cewnik do końca strzykawki. Postukać w strzykawkę, aby usunąć powietrze i wcisnąć tłok, aby wypełnić martwą przestrzeń powietrzną w cewniku przed rozpoczęciem wkraplania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Można zapewnić dodatkowe ciepło. </li>
	<li>Upewnij się, że każda mysz jest w pełni uspokojona, ściskając podnóżek ze średnim naciskiem. Myszy są w pełni uspokojone, gdy nie reagują i potrzebują 3 - 5 minut, aby osiągnąć ten stan.</li>
	<li>Ułóż myszy na wznak i wywieraj średni nacisk na dolną część brzucha, aby opróżnić pęcherz z moczu. Pełne pęcherze są jak ziarnko grochu pod skórą między grzbietami jelita krętego. 
	Uwaga: Wziewny izofluran był używany do cewnikowania samic myszy 15,22, jednak nie przetestowano, czy samce myszy są wystarczająco znieczulone przez wziewny izofluran do tej procedury.</li>
</ol>
4. Przezcewkowe wkraplanie samicom myszy
<ol>
	<li>Używając ręki niedominującej, połóż kciuk na ogonie, a palec tej samej ręki na brzuchu myszy i delikatnie uciskaj w przeciwnych kierunkach, aby mocno utrzymać mysz w miejscu.</li>
	<li>Umieść końcówkę cewnika prostopadle do myszy przy ujściu cewki moczowej. Delikatnie uciskając wsuń cewnik do cewki moczowej, aż piasta zetknie się z ujściem cewki moczowej, jednocześnie opuszczając strzykawkę tak, aby była równoległa do powierzchni roboczej. Cewnik nie wymaga smarowania. Nie należy wciskać ani wciskać cewnika na siłę do cewki moczowej. Cewnik powinien płynnie i łatwo wsuwać się do cewki moczowej, z niewielkim lub zerowym oporem.
	<ol>
		<li>Przed wkropleniem inokulum (krok 4.3), gdy cewnik jest już na miejscu, bardzo delikatnie pociągnij skórę brzucha w kierunku głowy myszy palcem z ręki niedominującej, która znajduje się już na brzuchu myszy (krok 4.1). Jeśli cewnik znajduje się w cewce moczowej, tkanka tworząca ujście cewki moczowej nie będzie się poruszać, natomiast jeśli cewnik zostanie nieprawidłowo umieszczony w pochwie, tkanka przesunie się w górę i odsunie się od cewnika. Ten szybki test należy wykonać na każdej myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy piasta cewnika zetknie się z ujściem cewki moczowej, powoli dozuj 50 μl inokulum bakteryjnego. Powolne tempo wkraplania minimalizuje odpływ pęcherzowo-moczowodowy do nerki. Powoli wyjmij cewnik, aby zapobiec wyciekowi, powyżej 5 razy. Umieść myszy w klatkach w pozycji leżącej.</li>
</ol>
5. Wkraplanie przezcewkowe samcom myszy
<ol>
	<li>Przyłóż dwa kleszcze do kciuków czaszkowo i doogonowo do zewnętrznych narządów płciowych myszy. Cofnij napletek, aby w pełni odsłonić żołądź prącia. Gdy penis znajdzie się na zewnątrz, zwolnij kleszcze kciuka.</li>
	<li>Zmień położenie kleszczy, aby ustabilizować wystającego penisa prostopadle do zwierzęcia, przytrzymując narząd delikatnie, ale mocno. Uwidocznij ujście cewki moczowej i ostrożnie wprowadź cewnik do małego otworu na końcu narządu. Delikatnie wprowadź cewnik do penisa, w kierunku ciała myszy, utrzymując delikatne napięcie kleszczami. Cewnik nie wymaga smarowania. Nie wciskaj cewnika na siłę do penisa; Cewnik powinien płynnie wsunąć się do cewki moczowej, wskazując prawidłowe umieszczenie.</li>
	<li>Gdy piasta cewnika zetknie się z czubkiem prącia, bardzo powoli dozuj 50 μl inokulum, zachowując pozycję prącia. Jakość wkraplania można w tym czasie odnotować zgodnie z wcześniej ustaloną oceną jakości wkraplania, taką jak pokazana na rysunku 2.</li>
	<li>Wycofaj cewnik powoli, powyżej liczby 5, aby zapobiec wyciekowi inokulum. Umieść myszy w klatkach w pozycji leżącej. Zwierzęta powinny zacząć wracać do zdrowia po 30 - 45 minutach od podania środka znieczulającego.</li>
</ol>
6. Oznaczanie CFU w zakażonych narządach
<ol>
	<li>W określonych punktach czasowych należy złożyć ofiary myszy przy użyciu zatwierdzonych standardowych procedur operacyjnych (np. zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie dwutlenku węgla). Dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w poprzek dolnej jednej trzeciej brzucha myszy o długości co najmniej 2 cm za pomocą nożyczek i aseptycznie usuń pęcherz moczowy i wszelkie inne pożądane narządy, w tym między innymi nerki, jądra, pęcherzyki nasienne lub gruczoły napletkowe, w 5 ml polipropylenowych probówkach zatrzaskowych zawierających 1 ml sterylnego PBS. Wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Homogenizuj narządy za pomocą ręcznego homogenizatora, aż prawie nie pozostanie tkanka stała, około 15 - 60 sekund, w zależności od narządu. Tłuszcz nie homogenizuje się dobrze i jest łatwo rozpoznawalny jako błyszcząca, beżowo-biała tkanka. Wyrzucić tłuszcz przed lub po homogenizacji. Przemyć homogenizator w etanolu, a następnie PBS między każdą grupą doświadczalną lub grupą narządów. 
	Uwaga: Zazwyczaj należy używać homogenizatorów ręcznych lub homogenizatorów z młynkiem perełkowym. Chociaż wszystkie te systemy dały podobne wyniki, określone przez bezpośrednie porównanie bakteryjnej CFU po 24 godzinach od infekcji, optymalne warunki do homogenizacji tkanki gospodarza przy jednoczesnym zachowaniu żywotności bakterii powinny zostać określone empirycznie przed rutynowym wykonaniem tego protokołu.</li>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia homogenizowanych zawiesin narządów. Rozcieńczenia na płytkach agarowych LB, zawierające antybiotyki, jeśli to właściwe, i inkubować przez noc (~15 godzin) w temperaturze 37 °C. Szczepy UPEC mają bardzo krótki czas podwajania i w związku z tym należy uważać, aby nie inkubować płytek agarowych zbyt długo, ponieważ utrudni to liczenie pojedynczych kolonii.</li>
</ol>
7. Analiza cytometryczna przepływu tkanki pęcherza moczowego
<ol>
	<li>Przygotować bufor do wytrawiania zawierający kolagenazę w stężeniu 34 jednostek/ml i DNazę w stężeniu 100 μg/ml w PBS. Trzymaj na lodzie. Przygotować jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml na zwierzę do analizy i podamy 1 ml buforu do wytrawiania na probówkę.</li>
	<li>W określonych punktach czasowych należy poświęcić myszy przy użyciu zatwierdzonych standardowych procedur operacyjnych (np. zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie dwutlenku węgla). Dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w poprzek dolnej jednej trzeciej brzucha myszy o długości co najmniej 2 cm za pomocą nożyczek i usuń cały pęcherz. Dobrze zmiel nożyczkami, krojąc pęcherz na 2 - 3 mm kawałki wielkości2, zwykle około 8 sztuk.
	<ol>
		<li>Dodać jeden zmielony pęcherz do probówki zawierającej bufor wytrawiający. Wstrząśnij, aby przemyć zmieloną tkankę pęcherza moczowego do buforu do wytrawiania. Trzymaj na lodzie, aż wszystkie pęcherze zostaną wycięte i zmielone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować rozdrobnione pęcherze przez 60 - 75 minut w temperaturze 37 °C, energicznie potrząsając ręką przez 5 s co 15 minut. Kiedy tkanka ma szklisty, przezroczysty wygląd, przypominający mokrą bibułkę, trawienie jest zakończone. Przedłużone trawienie usunie białka powierzchniowe z komórek potrzebnych do identyfikacji i należy tego unikać.</li>
	<li>Dezaktywować enzymy trawiące przez dodanie 2 - 3 ml lodowatego buforu cytometrii przepływowej (PBS zawierający 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,2 mM EDTA) i delikatnie wymieszać. Umieść probówki na lodzie.</li>
	<li>Aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki i usunąć tkankę łączną, przepuścić zawartość probówki przez filtr 100 μm umieszczony w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie przecisnąć pozostałą tkankę przez filtr końcem tłoka strzykawki. Przemyć filtr dodatkowym buforem do cytometrii przepływowej o pojemności 2 ml. Próbki należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przemywać próbki przez odwirowywanie przez 7 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C. Zawiesić osady w 100 μl buforze cytometrii przepływowej zawierającym blok Fc, rozcieńczonym do 5 μg/ml i przenieść na 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Po 10 - 15 minutach dodaj 100 μl pożądanego koktajlu przeciwciał do każdej próbki. Próbki inkubować przez 30 - 45 minut, na lodzie, chronić przed światłem. 
	Uwaga: Blok Fc jest odczynnikiem stosowanym w celu zapobiegania wiązaniu się części Fc przeciwciał z komórkami eksprymującymi receptory Fc. Jego celem jest zminimalizowanie nieswoistego wiązania przeciwciał. Określenie przeciwciał do użycia będzie zależało od hipotezy testowanej w eksperymencie i powinno być wybrane na podstawie danych z literatury. Na rycinie 3, aby zmierzyć ogólny naciekanie komórek odpornościowych, zastosowano przeciwciało anty-CD45, które jest białkiem komórek panimmunologicznych.</li>
	<li>Przemywać próbki przez odwirowywanie przez 7 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C. Ponownie zawiesić granulki komórek w buforze do cytometrii przepływowej o pojemności 200 μl i przepuścić próbki przez sitko o wielkości 40 μm na probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml tuż przed pobraniem na cytometr przepływowy.</li>
	<li>Pobrać całą próbkę na cytometr przepływowy. Dobre trawienie da 200 000 - 400 000 komórek, z 8 000 - 10 000 komórek odpornościowych CD45 + z naiwnych pęcherzy myszy, podczas gdy zakażone narządy będą zawierały więcej komórek16 (ryc. 3). 
	Uwaga: Próbki przygotowane do analizy metodą cytometrii przepływowej nie mogą być używane do oceny jtk. Nie zaleca się dzielenia pęcherza moczowego na dwie części, ponieważ nie ma dowodów na to, że kolonizacja UPEC lub infiltracja komórek odpornościowych jest jednolita w całej tkance.</li>
</ol>

<ol><li>Hooton, T. M., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+uncomplicated+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection.</a> Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).</li>
<li>Harper, M., Fowlis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+urinary+tract+infections+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Urology%2C+Gynaecology+%26+Sexual+Health%22%5BJournal%5D)">Management of urinary tract infections in men.</a> Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).</li>
<li>Lipsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infections+in+men.+Epidemiology%2C+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment.</a> Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).</li>
<li>Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+Factors+for+Nosocomial+Bacteremia+Secondary+to+Urinary+Catheter-Associated+Bacteriuria%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review.</a> Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).</li>
<li>Markle, J. G., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeXX+matters+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">SeXX matters in immunity.</a> Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).</li>
<li>Yu, C. Y., Whitacre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+MHC+and+complement+C4+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases.</a> Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).</li>
<li>Castelao, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-+and+smoking-related+bladder+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Gender- and smoking-related bladder cancer risk.</a> J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).</li>
<li>Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+incidence+and+mortality+of+bladder+and+kidney+cancers%3A+national+estimates+from+49+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries.</a> Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).</li>
<li>Garg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Disparities+in+Hematuria+Evaluation+and+Bladder+Cancer+Diagnosis%3A+A+Population-Based+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis.</a> J Urol. , (2014).</li>
<li>Dobruch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+Bladder+Cancer%3A+A+Collaborative+Review+of+Etiology%2C+Biology%2C+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes.</a> Eur Urol. , (2015).</li>
<li>Hsu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+tumorigenesis+and+mortality+from+bladder+cancer+in+mice+lacking+urothelial+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor.</a> Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).</li>
<li>El Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+decorin+in+bladder+cancer+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness.</a> EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+urinary+tract+infections%3A+incidence%2C+morbidity%2C+and+economic+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs.</a> Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).</li>
<li>Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF+induction+early+in+uropathogenic+Escherichia+coli+infection+of+the+urinary+tract+modulates+host+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity.</a> Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).</li>
<li>Mora-Bau, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Subvert+Adaptive+Immunity+to+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005044(2015).</li>
<li>Oliveira, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Report%3A+Technique+of+Bladder+Catheterization+in+Female+Mice+and+Rats+for+Intravesical+Instillation+in+Models+of+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%28Conference+Title%2939th+Scand-LAS+and+ICLAS+Joint+Meeting%22%5BJournal%5D)">Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer.</a> (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).</li>
<li>Seager, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+delivery+of+rapamycin+suppresses+tumorigenesis+in+a+mouse+model+of+progressive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prev+Res+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer.</a> Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).</li>
<li>Hagberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin).</a> Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).</li>
<li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> J Am Soc Nephrol. , (2015).</li>
<li>Knipper, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+Receptor+alpha+Signaling+in+Myeloid+Cells+Controls+Collagen+Fibril+Assembly+in+Skin+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair.</a> Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).</li>
<li>Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intracellular+bacterial+communities+of+uropathogenic+Escherichia+coli+depends+on+type+1+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili.</a> Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wkraplanie przezcewkowe samcom myszy oferuje wiele nowych możliwości badawczych nad wpływem płci na choroby błony śluzowej pęcherza moczowego, ale wiąże się również z kilkoma wyzwaniami. Przede wszystkim jednym z ograniczeń jest to, że wkroplenie może początkowo okazać się trudne technicznie, co skutkuje nadmiernym stanem zapalnym podczas wprowadzania cewnika. Poprawę techniki można osiągnąć poprzez wkroplenie martwych myszy kolorowym roztworem, takim jak niebieski barwnik Evans. Aby potwierdzić, że zakroplenie się powio...

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są jednymi z najczęstszych infekcji w krajach rozwiniętych1. Wskaźniki zakażeń są podobne wśród kobiet i mężczyzn wśród noworodków i osób starszych2. Dorosłe kobiety przed menopauzą mają jednak znacznie zwiększoną częstość występowania ZUM nabytego przez społeczność w porównaniu z mężczyznami2,3. Biorąc pod uwagę, że choroba ta dotyka przede wszystkim kobiety, badania podstawowe i kliniczne w przeważającej mierze koncentrują się na ZUM u kobiet. Jednak ZUM u mężczyzn jest poważnym i niedostatecznie zbadanym wyzwaniem w zakresie opieki zdrowotnej4. Rzeczywiście, ponieważ ZUM u mężczyzn wiąże się z większą zachorowalnością, infekcje te są rutynowo definiowane jako skomplikowane4,5.
W miarę rozwoju naszego zrozumienia kluczowej roli uprzedzeń płciowych w fizjologii i patologii, potrzebne są nowe metody do zbadania tego wcześniej zaniedbywanego aspektu choroby. Różnice płci odgrywają zasadniczą rolę w odporności i infekcjach; Kobiety częściej zapadają na choroby autoimmunologiczne, podczas gdy mężczyźni są bardziej podatni na niektóre infekcje, takie jak gruźlica, malaria i HIV6,7. Rak pęcherza moczowego, inna patologia urologiczna, występuje znacznie częściej u mężczyzn niż u kobiet, a kilka badań wykazało rolę androgenów w rozwoju nowotworu złośliwego8,9,10,11,12. Warto jednak zauważyć, że badania nad dopęcherzowymi terapiami raka pęcherza moczowego są prowadzone wyłącznie na samicach zwierząt, ze względu na niemożność wielokrotnego cewnikowania samców myszy13.
Badanie patogenezy infekcji dróg moczowych opiera się głównie na modelach infekcji u gryzoni (np. myszy i szczurów). Mysie modele ZUM mogą wykorzystywać uropatogeny pierwotnie wyizolowane z ludzkich infekcji, takie jak uropatogenne E. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcus lub Proteus14. Zazwyczaj bakterie są wprowadzane do pęcherza moczowego poprzez cewnikowanie cewki moczowej. Po zakażeniu pęcherze moczowe i nerki mogą zostać usunięte w celu oceny określonych parametrów infekcji, takich jak kolonizacja bakteryjna, uszkodzenie tkanek lub odpowiedź immunologiczna gospodarza15,16. Powszechnie jednak do badań nad ZUM wykorzystuje się tylko samice zwierząt. Rzeczywiście, wiele badań wykazało, że z przyczyn anatomicznych cewnikowanie samców myszy nie jest możliwe13,17,18,19. Niedawno opisano chirurgiczne podejście do wkraplania męskiego, w którym brzuch jest otwierany, pęcherz jest przemieszczany zewnętrznie poprzez delikatny nacisk na otwór w jamie brzusznej, a bakterie są wstrzykiwane do pęcherza20. Takie podejście umożliwia zakażenie u mężczyzn, kosztem interwencji chirurgicznej. Tak więc głównym zastrzeżeniem tego podejścia jest wpływ stanu zapalnego na wynik infekcji, taki jak możliwość wywołania przeciwzapalnej odpowiedzi gojenia się ran po nacięciu21. Ponieważ nasze zainteresowania obejmują zrozumienie uprzedzeń płciowych w odpowiedzi na chorobę, opracowaliśmy metodę bakteryjnego wkraplania dopęcherzowego u samców myszy, która bardziej odpowiada długotrwałemu niechirurgicznemu podejściu przezcewkowemu stosowanemu u samic gryzoni22.
Nasz model opiera się na ustalonej metodologii i umożliwia bezpośrednie porównanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza na ZUM u samic i samców. Metoda ta pozwoli na analizę różnic w zakażeniu ze względu na płeć i potencjalnie dostarczy molekularnych i komórkowych wskazówek dotyczących wyraźnych różnic w podatności i odpowiedzi na infekcję między płciami. Ponadto model ten ma wartość wykraczającą poza badania ZUM, umożliwiając ustanowienie modeli do badania innych chorób związanych z pęcherzem moczowym, takich jak rak pęcherza moczowego, zapalenie gruczołu krokowego, zespół niedoczynności lub nadczynności pęcherza moczowego oraz śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego.

<table><tbody><tr><td>Osłonięte cewniki dożylne BD Insyte Autoguard 24 G, średnica zewnętrzna 0,7 mm, długość 14 mM</td> Numer katalogowy <td>BD Medical</td><td>381811 lub 381411*</td><td>* to zależna od kraju</td></tr><tr><td>pętla inokulacyjna</td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do kciuków (Adson)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 5 ml, polipropylen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Jednorazowe sondy Ruptor</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki z klapką</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>należy podkwotować i przechowywać w temperaturze -20 °; C, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>100 &mikro; Inteligentne filtry siatkowe M MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td><td>kompatybilny z tubkami 15 ml, preferowane</td></tr><tr><td>100 i mikro; M Sitka komórkowe&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>kompatybilny z probówkami 50 ml, jeśli MACS Smart Sitka nie są dostępne</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc blok</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>anty-CD16/CD32</td></tr><tr><td>anty-mysie przeciwciało CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>wiele różnych opcji koniugacji fluorescencyjnej Probówki</td></tr><tr><td>5 ml polistyren z nasadką filtrującą</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>strzykawka insulinowa</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>ręczny homogenizator</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueCytometr przepływowy Ruptor</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do cytometrii przepływowej</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A Diva</td><td></td></tr></tbody></table>

zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infekcje dróg moczowych (UTI) są niezwykle powszechne na całym świecie, powodując znaczną zachorowalność i wydatki związane z opieką zdrowotną. Małe modele zwierzęce, które dokładnie odzwierciedlają powstawanie i postęp choroby, pozwalają na analizę interakcji gospodarz-patogen i generowanie odporności na infekcje. U myszy dopęcherzowe wkroplenie uropatogennej E. coli, czynnika wywołującego u ponad 85% zakażeń układu moczowego nabytych w społeczności, podsumowuje wiele etapów infekcji obserwowanych u ludzi. Do niedawna jednak ZUM można było modelować tylko u samic. To ograniczenie utrudniło badanie różnic związanych z płcią w ZUM, a także innych patologii pęcherza moczowego, takich jak rak. W tym miejscu opisujemy metodę wpajania samcom myszy, która umożliwia bezpośrednie porównanie samic i samców zwierząt oraz zapewnia szczegółowy protokół oceny tkanki pęcherza moczowego za pomocą cytometrii przepływowej jako sposób na lepsze zrozumienie reakcji gospodarza na infekcję. Łącznie podejścia te pomogą w identyfikacji czynników gospodarza, które przyczyniają się do uprzedzeń płciowych obserwowanych w ZUM i innych chorobach związanych z pęcherzem moczowym.

Podczas opracowywania niniejszego protokołu przeprowadzono instylację u grup samic i samców myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 8 tygodni, a następnie oceniono obciążenie bakteryjne w pęcherzach moczowych w punktach czasowych od 1 h do 30 dni. Wyniki tych badań zostały szczegółowo opisane w innej publikacji (Zychlinsky Scharff et al., w przygotowaniu). Tutaj przedstawiamy reprezentatywne dane z infekcji trwających 24 h. Co istotne, obciążenie bakteryjne było zbliżone u samców i samic m...

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Ogólnym celem tego eksperymentalnego podejścia jest zbadanie odpowiedzi immunologicznej na zakażenie dróg moczowych i zapobieganie bezpośredniemu porównaniu między samcami i samicami. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania immunologiczne błony śluzowej związane z tym, jak mężczyźni i kobiety reagują na infekcję dróg moczowych. Główną zaletą jest to, że infekcja odbywa się za pośrednictwem naturalnego korzenia.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po zauważeniu, jak często stwierdza się, że instalacja pęcherza moczowego samcom myszy jest niemożliwa. Chociaż metoda ta zapewni wgląd w infekcje dróg moczowych, może być również zastosowana do innych badań nad chorobami, takimi jak rak pęcherza moczowego. Na początek przygotuj jedną pediatryczną kaniulę z dostępem dożylnym dla każdej grupy myszy, która ma zostać zainfekowana.Korzystając z wbudowanego mechanizmu sprężynowego, usuń każdą kaniulę z igły zgodnie z instrukcją producenta. Wyrzuć igły, zachowując tylko plastikową kaniulę dożylną. Sterylizuj cewniki w kapturze z przepływem laminarnym przez jeden cykl UV trwający około 25 do 30 minut.Po przejściu do nocnej hodowli uropatogennej grupy E coli lub UPEC, zgodn

urinary-tract-infection-small-animal-model-transurethral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Źródło: Luyts, N. i inni. Podłużna kontrola infekcji dróg moczowych i ich leczenia u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje indukcję i śledzenie infekcji dróg moczowych w modelu mysim z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli wstrzykniętego do pęcherza, gdzie zachodzi adhezja, inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa bakterii. Światło emitowane z bioluminescencyjnego operonu służy jako wskaźnik w czasie rzeczywistym obciążenia bakteryjnego podczas...

Wizualizacja infekcji dróg moczowych w modelu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji

Źródło: Conover, M. S. i in., J. Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszym. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę montażu i wszczepienia cewnika transurethralnego u samicy myszy, po czym następuje szczepienie bakteryjne w celu wywołania zakażenia dróg moczowych związanych z cewnikami oraz badania interakcji gospodarza z patogenem wygenerowanym przez biofilm.

Zakażenie dróg moczowych związane z cewnikami w modelu mysim

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Ten film demonstruje technikę oceny przeciwnowotworowej aktywności białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP) w modelu raka pęcherza moczowego u myszy. HP-NAP oddziałuje z neutrofilami nowotworowymi w celu wytworzenia cytokin prozapalnych, indukując różnicowanie naiwnych limfocytów T w fenotypy limfocytów T pomocniczych typu 1 (Th1) i cytotoksycznych (Tc1) typu 1. Komórki Th1 i Tc1 wydzielają interferon-gamma, hamując angiogenezę guza i promując niszczenie guza za pośrednictwem...

Ocena skuteczności przeciwnowotworowej bakteryjnego białka immunomodulującego w modelu mysim

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Inkraplanie przezcewkowe jest trudną procedurą i nie zostało dobrze opisane w literaturze. Celem pracy jest opisanie techniki przezcewkowego wprowadzania cewnika do dopęcherzowego podawania płynów z substancjami czynnymi do pęcherza moczowego i/lub prostaty u dorosłych samców myszy.

Procedura wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Poznaj metodę cewnikowania przezcewkowego u myszy w celu badania zakażeń dróg moczowych i odpowiedzi immunologicznej. Ta technika umożliwia porównanie między płciami oraz badanie patologii pęcherza.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Przeglądaj więcej filmów