Name: Uraz ścięgna zginacza myszy i chirurgia naprawcza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj model urazu i naprawy ścięgna zginacza u myszy, który pozwala badać procesy gojenia i tworzenia blizn. Technika umożliwia identyfikację komórek odpowiedzialnych za regenerację tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez American Society for Surgery of the Hand Pilot Award oraz NIH/NIAMS 1K01AR068386-01 (do AEL) i NIAMS/NIH P30AR061307.

Uniwersytecki Komitet ds. Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Rochester zatwierdził wszystkie eksperymenty na zwierzętach. Użyto 10-12-tygodniowych samic myszy C57BL/6J.
1. Przygotowanie zwierząt do operacji ścięgna zginacza (~15 min)
<ol>
	<li>Autoklaw narzędzi chirurgicznych do sterylizacji, noś sterylne rękawiczki przez cały czas i utrzymuj sterylne pole operacyjne.</li>
	<li>Znieczulić mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) z objętością ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) odpowiadającą masie ciała. Potwierdź głębokość sedacji poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp.</li>
	<li>Analgezję zapobiegawczą należy podawać (buprenorfina, 0,05-0,1 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Przygotuj miejsce operacji, przycinając futro na całej tylnej kończynie. Wysterylizuj skórę, szorując sekwencyjnie jodem powidonu, a następnie 70% etanolem i ponownie jodem powidonu.</li>
</ol>
2. Uraz ścięgna zginacza myszy i operacja naprawcza (~10 min)
<ol>
	<li>Znajdź ścięgno zginacza długiego palca (FDL), widoczne powierzchownie w przyśrodkowej części łydki. Za pomocą skalpela wykonaj małe 0,5-1 cm nacięcie w skórze za pomocą mikronożyczek, aby odsłonić ścięgno.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby oddzielić ścięgno FDL od otaczającej tkanki i prześledzić je aż do połączenia mięśniowo-ścięgnistego. Przetnij ścięgno na tym skrzyżowaniu nożyczkami sprężynowymi, aby je uwolnić, uważając, aby ominąć tylną tętnicę piszczelową.</li>
	<li>Zamknij skórę nylonowymi szwami 5-0. 
	Uwaga: Przecięcie i naprawa FDL (kroki 2.4) powinny być wykonane przy użyciu mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Wykonaj 3 mm nacięcie nad tylno-boczną częścią tylnej łapy za pomocą mikronożyczek sprężynowych. Delikatnie cofnij otaczające tkanki miękkie i mięśnie za pomocą kleszczy, upewniając się, że zminimalizujesz uszkodzenie tkanek i zidentyfikuj ścięgno FDL.
	<ol>
		<li>Delikatnie unieś ścięgno FDL i całkowicie je przetransektuj za pomocą mikronożyczek. Zszyj końce ścięgna FDL razem w zmodyfikowany wzór Kesslera z 8-0 szwy, unikając wysuszenia ścięgna poprzez okresowe zwilżanie go solą fizjologiczną.</li>
		<li>Wymień tkankę miękką i mięśnie nad ścięgnem, a następnie zamknij nacięcie nylonowymi szwami 5-0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść myszy na podgrzewaczu do szkiełek ustawionych na 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj myszy po operacji pod kątem oznak upośledzenia lub infekcji, w tym zwiększonej wokalizacji i potarganej sierści. Wstrzykuj buprenorfinę (50 μl / mysz) jako środek przeciwbólowy co 12 godzin, aż myszy przestaną wykazywać oznaki bólu lub niepokoju.</li>
	<li>Pozwól myszom zagoić się przez okres 10 dni po operacji, zanim przejdziesz do kolejnych kroków. 
	Uwaga: Komórki można pobrać w dowolnym momencie po operacji. W tym przypadku na te reprezentatywne eksperymenty wybiera się 10 dni, biorąc pod uwagę stosunkowo wysoką komórkowość tkanki w tym czasie.</li>
</ol>
3. Etykietowanie komórek cyklicznych (~10 min)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór EdU (5-etynylo-2'deoksyurydyna) (10 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] + 1% dimetylosulfotlenku [DMSO] w celu zwiększenia rozpuszczalności).</li>
	<li>Wstrzyknąć myszom 100 μl EdU (50 mg / kg) przez wstrzyknięcie dożylne 24 godziny przed uśmierceniem.</li>
</ol>
4. Pobieranie komórek do wirowania cytologicznego (2,5 godziny, ~30 minut czasu praktycznego)
<ol>
	<li>Przygotować 3 mg/ml kolagenazy I w PBS.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla przy natężeniu przepływu nie większym niż 3 l/min i wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako środek wtórny.</li>
	<li>Zlokalizuj naprawione ścięgno, wykonując krok 2.4 powyżej, i wyizoluj tkankę ścięgna, przecinając około 2 mm po obu stronach miejsca urazu za pomocą mikronożyczek.
	<ol>
		<li>Tkankę rozdrobnić skalpelem na szalce Petriego z 1 ml kolagenazy o stężeniu 3 mg/ml, a następnie kilkakrotnie przepuścić mieszaninę przez igłę o sile 18 g w celu rozdrobnienia tkanki. Zebrać mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Trawić tkankę ścięgna przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
		<li>Odwirować tkankę w dół (300 x g przez 5 minut), odessać kolagenazę, a następnie ponownie zawiesić komórki/tkanki za pomocą 500 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, pipetując kilkakrotnie w górę iw dół.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń i dużych kawałków ścięgien i odłożyć do inkubatora o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieść tkankę ścięgna w innej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odśwież 1 ml roztworu kolagenazy, pipetując w górę iw dół, aby wymieszać.</li>
		<li>Inkubować tkankę przez kolejną godzinę w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
		<li>Odwirować strawioną tkankę ścięgna (300 x g przez 5 minut), a następnie ponownie zawiesić w 500 μl 3% BSA w PBS, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.</li>
		<li>Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm, połączyć z zawiesiną wyizolowaną w ppkt 4.3.3, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Ponownie przemyć komórki za pomocą 3% BSA w PBS, a następnie ponownie zawiesić do 3-6 x 104/100 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj lejek cytologiczny do dodatnio naładowanego szkiełka i zablokuj go w nośniku. Włożyć cały aparat do wirówki cytologicznej i dodać 100 μl zawiesiny komórek do lejka. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby rozproszyć komórki na szkiełku.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia do wykrywania EdU (2 godziny, ~45 min czasu praktycznego)
Uwaga: Wszystkie etapy inkubacji powinny być wykonywane w ciemności, aby ograniczyć fotowybielanie fluoroforów.
<ol>
	<li>Zakreśl komórki hydrofobowym pisakiem barierowym, aby zminimalizować roztwór potrzebny do wykonania kolejnych kroków, a następnie natychmiast utrwal 150 μl 3% paraformaldehydu w PBS 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
	<ol>
		<li>Umyć dwukrotnie przez 5 minut 150 μl 3% BSA w PBS.</li>
		<li>Permeabilizuj komórki za pomocą 0,5% Triton-X 100 w PBS 20 min w RT.</li>
		<li>Powtórzyć etap prania jak w ppkt 5.1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Koktajl reakcyjny EdU należy przygotować zgodnie z instrukcją zestawu nie później niż 30 minut przed użyciem.
	<ol>
		<li>Dodaj 150 μl koktajlu do każdego szkiełka, inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórzyć etap prania jak w ppkt 5.1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować ze 150 μl jądrowego barwnika przeciwstawnego Hoechst33342 rozcieńczonego 1:2,000 w PBS 30 min w temperaturze suchej.
	<ol>
		<li>Umyć dwukrotnie przez 5 minut 150 μl 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 1-2 krople środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do komórek, a następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
	<ol>
		<li>Pozostawić podłoże montażowe do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obraz jest wyświetlany w 40-krotnym powiększeniu przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry wzbudzenia/emisji zdolne do wykrywania DAPI (Hoeschst33342) i Texas Red (Alexa Fluor 594).</li>
</ol>

<ol><li>Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+tendon+inury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of tendon inury and repair.</a> J Biomech. 37, 865-877 (2004).</li>
<li>Strickland, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+flexor+tendon+surgery%3A+twenty-five+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+%5BAm%5D%22%5BJournal%5D)">Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress.</a> J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).</li>
<li>Bunnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+tendons+in+the+fingers+and+description+of+two+new+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments.</a> Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).</li>
<li>Aydin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stage+flexor+tendoplasty+in+the+treatment+of+flexor+tendon+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop+Traumatol+Turc%22%5BJournal%5D)">Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries.</a> Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).</li>
<li>Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+chemotaxis+after+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Fibroblast chemotaxis after tendon repair.</a> J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).</li>
<li>Lundborg, G., Rank, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+intrinsic+healing+of+flexor+tendons+based+upon+synovial+fluid+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition.</a> J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).</li>
<li>Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+histologic+characteristics+of+canine+flexor+tendon+repair+using+early+postoperative+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization.</a> J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+and+biological+modifications+for+enhanced+flexor+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hand+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair.</a> J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).</li>
<li>Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+of+flexion+after+flexor+tendon+repair+according+to+the+placement+of+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures.</a> Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Award+for+Outstanding+Orthopaedic+Research%3A+Engineering+flexor+tendon+repair+with+lubricant%2C+cells%2C+and+cytokines+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model.</a> Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).</li>
<li>Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+and+histological+examination+of+the+mouse+hindpaw+digit+and+flexor+tendon+arrangement+with+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction.</a> J Anat. 209, 533-545 (2006).</li>
<li>Katzel, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Smad3+loss+of+function+on+scarring+and+adhesion+formation+during+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing.</a> J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).</li>
<li>Loiselle, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+matrix+metalloproteinase-9+is+associated+with+fibrous+adhesion+formation+after+murine+flexor+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury.</a> PloS one. 7, e40602(2012).</li>
<li>Lee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parathyroid+hormone+1-34+enhances+extracellular+matrix+deposition+and+organization+during+flexor+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair.</a> J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).</li>
<li>Geary, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+EP4+Inhibition+Increases+Adhesion+Formation+in+a+Murine+Model+of+Flexor+Tendon+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair.</a> PloS one. 10, e0136351(2015).</li>
<li>Loiselle, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+antisense+oligonucleotide+%28ASO%29+technology+against+Tgf-beta+signaling+to+prevent+scarring+during+flexor+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair.</a> J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).</li>
<li>Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrner%2C+CA+%22Plast+Reconstr+Surg%22">Plast Reconstr Surg</a>. , (2016).</li>
<li>Loiselle, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+murine+intrasynovial+tendon+adhesions+following+injury%3A+MMP+and+neotendon+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression.</a> J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).</li>
<li>Tsubone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+TGF-beta+inducible+early+gene+deficiency+on+flexor+tendon+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing.</a> J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).</li>
<li>Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+multiple+tendon+injury+models+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse.</a> J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).</li>
<li>David, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+repair+is+compromised+in+a+high+fat+diet-induced+mouse+model+of+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes.</a> PloS one. 9, e91234(2014).</li>
<li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+biology+of+flexor+tendon+adhesion+formation%3A+an+old+problem+in+a+new+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm.</a> Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

W pracy przedstawiono procedurę chirurgiczną mysiego modelu całkowitego przecięcia i naprawy ścięgna zginacza długiego palca palca. Ponadto zademonstrowano nowatorskie zastosowanie koncentracji populacji małych komórek za pomocą wirówki cytologicznej, co pozwala na ilościową analizę immunocytochemiczną środowiska komórkowego podczas gojenia ścięgna zginaczy. Ten model naprawy ścięgna zginacza wykazuje powtarzalną odpowiedź gojenia, którą można wykorzystać do oceny zmian w procesie gojenia za pomocą modeli nokautujących l...

Ścięgna zginaczy w dłoni współpracują z mięśniami zginaczy przedramienia i osłonkami cyfrowymi, umożliwiając zginanie palców i funkcję chwytania ręki. Ścięgna zginaczy biegną wzdłuż dłoniowej części dłoni; Ta stosunkowo powierzchowna lokalizacja często powoduje urazy ścięgien zginaczy podczas urazu ręki. Ścięgna goją się poprzez reakcję tkanki bliznowatej, a nie regenerację normalnej tkanki ścięgna 1. Podczas gdy ta tkanka bliznowata zapewnia ciągłość ścięgna, funkcja jest dramatycznie zmniejszona w stosunku do zdrowego ścięgna. Kompozyty tkanki ścięgnistej i bliznowatej charakteryzują się upośledzonymi właściwościami mechanicznymi1, co zwiększa prawdopodobieństwo zerwania naprawionych ścięgien. Ponadto tkance bliznowatej brakuje organizacji natywnej struktury włókien kolagenowych ścięgien, co powoduje wzrost rozmiaru i objętości ścięgien. Biorąc pod uwagę ograniczenia anatomiczne jednostki ścięgno-pochewka, nawet niewielki wzrost rozmiaru ścięgna może drastycznie zmniejszyć funkcję ślizgania ścięgna, a tym samym zakres ruchu palców i funkcję dłoni.
Przed 1960 rokiem urazy ścięgien zginaczy, szczególnie te w strefie II ręki, nie były rutynowo naprawiane z powodu poważnych komplikacji w gojeniu, które powstały podczas tych napraw 2. Ten obszar dłoni był określany jako "ziemia niczyja" 3. Jednak ulepszenia w technikach chirurgicznych, wzorach szwów i protokołach rehabilitacji fizjoterapeutycznej znacznie poprawiły wyniki naprawy ścięgien zginaczy 2. Pomimo tych postępów, do 40% napraw powoduje powstanie przyczepności na tyle dużo, aby utrudnić funkcjonowanie ręki 4. Dlatego wymagane jest podejście biologiczne, aby poprawić gojenie. Niestety, bardzo niewiele wiadomo na temat procesu gojenia się ścięgien na poziomie komórkowym i molekularnym. W związku z tym celem było opracowanie mysiego modelu, który mógłby zostać wykorzystany do lepszego zrozumienia podstawowych składników komórkowych i molekularnych gojenia ścięgien zginaczy oraz reakcji na tworzenie się blizn, jako sposób na zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych w celu poprawy gojenia.
Większe modele zwierzęce odegrały kluczową rolę w lepszym zrozumieniu procesu gojenia ścięgien zginaczy. Badania na psach i królikach wykazały zarówno wewnętrzną, jak i zewnętrzną zdolność gojenia ścięgien zginaczy 5,6, znaczenie wczesnego kontrolowanego ruchu biernego w minimalizowaniu powstawania zrostów w stosunku do unieruchomienia 7, a także wpływ różnych wzorów szwów na proces gojenia 8,9. Ponadto model psa okazał się przydatny w testowaniu translacyjnych metod inżynierii tkankowej w celu poprawy gojenia 10. Istnieje jednak kilka ważnych zalet korzystania z modelu mysiego w porównaniu z dużym modelem zwierzęcym, w tym względny koszt, dostępność odczynników specyficznych dla myszy oraz łatwość generowania globalnych nokautów lub specyficznych dla tkanki konstrukcji delecji/nadekspresji. Co więcej, podobieństwa funkcjonalne między człowiekiem a myszami w odniesieniu do ścięgien zginaczy 11 wskazują na potencjalną użyteczność w opracowaniu modelu mysiego.
Opracowanie mysiego modelu przecięcia i naprawy ścięgna zginacza naśladuje wiele aspektów klinicznego gojenia, w tym tworzenie obfitych blizn i pogorszenie właściwości mechanicznych. Opisany tutaj model nie jest prawdziwym podsumowaniem praktyki klinicznej ze względu na przecięcie FDL w połączeniu mięśniowo-ścięgnistym w celu ochrony miejsca naprawy. Co więcej, model ten nie uwzględnia udziału komórek osłonki maziowej w odpowiedzi gojenia, ponieważ nie ma osłonki maziowej pokrywającej środkową część ścięgna, w której zachodzi naprawa. Pomimo tych ograniczeń, model ten ma tę zaletę, że generuje zrosty ograniczające ruch, co nie zostało jeszcze wykazane w modelach mysich, które są bardziej zbliżone do scenariusza klinicznego. Model ten został wykorzystany do oceny mysich modeli nokautujących 12,13 oraz do testowania różnych podejść farmakologicznych w celu poprawy gojenia 14-17. Analizy histologiczne tego modelu, wykorzystujące immunohistochemię i hybrydyzację in situ, mogą dostarczyć ważnych informacji na temat lokalizacji kluczowych genów i białek podczas gojenia. Jednak histologia zapewnia jedynie przekrojową analizę przestrzenną i nie pozwala na kwantyfikację w całej tkance. Cytometria przepływowa reprezentuje bardziej ilościowe podejście, ale tylko bardzo ograniczona liczba komórek może zostać wyizolowana z gojącej się tkanki ścięgna w modelu mysim, a liczba ta jest dodatkowo zmniejszana podczas etapów fiksacji, przepuszczalności i mycia. Biorąc to pod uwagę, cytometria przepływowa staje się niewykonalnym podejściem ze względu na liczbę zwierząt, które byłyby wymagane. Alternatywna metoda jest niezbędna do zachowania większości tej populacji małych komórek w celu dalszego scharakteryzowania środowiska leczniczego. Metoda zastosowana w tym celu, pokazana tutaj, polega na koncentracji wyizolowanych komórek poprzez wirowanie cytologiczne na szkiełku szkiełkowym, a następnie immunocytochemię. W niniejszym badaniu zastosowano inkorporację EdU (5-etynylo-2'deoksyurydyna, analog tymidyny), a następnie znakowanie w celu określenia względnego stanu proliferacyjnego komórek w miejscu gojenia. Podejście to można zastosować do badania skuteczności leczenia farmakologicznego w zakresie proliferacji komórek, nokautu lub nadekspresji genów lub do identyfikacji i ilościowego określenia różnych populacji komórek.

<table><tbody><tr><td>Preparat chirurgiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>myszy C57BL/6J&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>NDC# 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NDC# 61311-482-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Par Pharmaceutical Inc.</td><td>NDC# 42023-179-10</td><td></td></tr><tr><td>0,9% chlorek sodu do nawadniania</td><td>Hospira</td><td>NDC# 0409-6138-03</td><td>Do przygotowania roztworów ketaminy/ksylazyny i buprenorfiny</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G igła</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór powidonu i jodu</td><td>Aplicare</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna weterynaryjna Puralube</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NDC# 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga przenośna 200 g</td><td>Ohaus</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do igieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki z mikro sprężynami</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do mikroigieł</td><td>Fine Science Tools</td><td>12061-02</td><td></td></tr><tr><td>5-0 nici nylonowe</td><td>Ethicon</td><td>668G</td><td></td></tr><tr><td>8-0 nici nylonowe do mikrochirurgii</td><td>Ethicon</td><td>2808G</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line histologiczne podgrzewacz do szkiełek</td><td>Barnstead International</td><td>26025</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Cytospin method</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenaza typu I, liofilizowana</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>1700-017</td><td></td></tr><tr><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>albuminy w surowicy bydlęcej</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>1x</td><td>PBS Thermo Fisher</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Lejki cytologiczne</td><td>Fisher HealthCare</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe HistoBond+</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>SH-CYTO2</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Immunocytochemia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tacka do barwienia szkiełek z czarną pokrywką</td><td>IHC World</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Imaging Kit</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>C10639</td><td>Zawiera EdU i&nbsp; Hoeschst 33342</td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis barierowy Immedge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamentowe medium montażowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 50 mm #1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier</td><td></td><td></td><td></td> do paznokci</tr></tbody></table>

uraz ścięgna zginacza myszy i chirurgia naprawcza

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Ścięgno łączy mięśnie szkieletowe i kości, ułatwiając poruszanie prawie całego ciała. W dłoni ścięgna zginaczy (FT) umożliwiają zgięcie palców i ogólne funkcjonowanie dłoni. Urazy FT są powszechne, a zadowalające gojenie jest często utrudnione z powodu nadmiaru tkanki bliznowatej i zrostów między ścięgnem a otaczającą tkanką. Jednak niewiele wiadomo na temat molekularnych i komórkowych składników naprawy FT. W tym celu opracowano i opisano wcześniej mysi model naprawy FT, który podsumowuje wiele aspektów gojenia u ludzi, w tym upośledzony zakres ruchu i zmniejszone właściwości mechaniczne. W tym miejscu przedstawiono dogłębną demonstrację tej procedury chirurgicznej, obejmującej przecięcie, a następnie naprawę ścięgna zginacza długiego palca (FDL) w tylnej łapie myszy. Technika ta może być wykorzystana do przeprowadzenia analizy linii różnych typów komórek, oceny skutków przyrostu lub utraty funkcji genów oraz do testowania skuteczności interwencji farmakologicznych w procesie gojenia. Istnieją jednak dwa podstawowe ograniczenia tego modelu: i) ścięgno FDL w środkowej części mysiej tylnej łapy, gdzie następuje przecięcie i naprawa, nie jest otoczone osłonką maziową. W związku z tym model ten nie uwzględnia potencjalnego udziału osłonki w procesie powstawania blizny. ii) Aby chronić integralność miejsca naprawy, FT jest uwalniany w połączeniu mięśniowo-ścięgnistym, zmniejszając siły mechaniczne ścięgna, co prawdopodobnie przyczynia się do zwiększonego tworzenia blizn. Wyizolowanie wystarczającej ilości komórek z tkanki ziarninowej FT podczas procesu gojenia do analizy metodą cytometrii przepływowej okazało się wyzwaniem; Wirowanie cytologiczne w celu zagęszczenia tych komórek jest alternatywną metodą stosowaną i pozwala na wytworzenie preparatów komórkowych, na których można przeprowadzić znakowanie immunofluorescencyjne. Dzięki tej metodzie możliwa staje się kwantyfikacja komórek lub białek będących przedmiotem zainteresowania podczas gojenia FT.

Mięsień zginacz długi palców (FDL), znajdujący się w łydce, odpowiada za zginanie palców tylnej łapy myszy poprzez ścięgno zginacza (obrysowane na niebiesko na Rysunku 1A i przedstawione histologicznie na Rysunku 2A), które biegnie proksymalnie od połączenia mięśniowo-ścięgnistego i kończy się w paliczkach dystalnych. W tym modelu gojenia ścięgna zginacza, ścięgno FDL jest przecinane i naprawiane w połowie stopy, proksymalnie względem rozwidlenia do palcó...

Ścięgna zginaczy w dłoni są często uszkadzane, co prowadzi do upośledzenia funkcji ręki. Jednak reakcja gojenia się tkanki bliznowatej nie jest dobrze scharakteryzowana. Przedstawiono tutaj mysi model gojenia ścięgien zginaczy. Model ten może przyczynić się do lepszego zrozumienia procesu gojenia i oceny podejść terapeutycznych w celu poprawy gojenia.

Uraz ścięgna zginacza myszy i chirurgia naprawcza

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Ogólnym celem tego zabiegu chirurgicznego jest pogłębienie zrozumienia procesów komórkowych i molekularnych prowadzących do powstawania blizn i zrostów podczas gojenia ścięgna zginacza. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące procesu gojenia ścięgna zginacza, takie jak to, które typy komórek przyczyniają się do tworzenia blizn i naprawy tkanki. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania myszy transgenicznych oraz knock-out do lepszego zrozumienia procesu gojenia.Technika ta może pomóc w identyfikacji potencjalnych celów biologicznych w celu poprawy wyników gojenia ścięgien zginaczy, ponieważ ułatwia badanie tych słabo zdefiniowanych populacji komórek, które przyczyniają się do powstawania blizn. Po potwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca, należy nałożyć maść oftalmiczną na oczy zwierząt i przystrzyc futro z całej kończyny tylnej. Miejsce operacyjne należy wysterylizować poprzez sekwencyjne przemywanie jodopowidonem i 70% etanolem, a następnie zlokalizować ścięgno mięśnia zginacza długiego palców, czyli ścięgno FDL, w przyśrodkowej części łydki.Następnie wykonaj nacięcie skóry o długości od 0,5 do 1 cm, aby odsłonić ścięgno. Używając pęsety, oddziel ścięgno m. flexor digitorum longus od otaczających tkanek i prowadź je w górę aż do połączenia mięśniowo-ścięgnistego. Za pomocą nożyczek sprężynowych uwolnij ścięgno w miejscu połączenia, uważając, aby nie uszkodzić tętnicy piszczelowej tylnej.Następnie zamknąć skórę szwami z nylonu 5-0. Teraz przenieść mysz pod stereomikroskop i za pomocą mikro-nożyczek sprężynowych wykonać nacięcie o długości trzech milimetrów nad tylno-boczną stroną tylnej łapy. Użyć pęsety, aby delikatnie odsunąć otaczające tkanki miękkie i mięśnie, dbając o zminimalizowanie uszkodzeń tkanek, i zlokalizować ścięgno FDL.Następnie ostrożnie unieś ścięgno i za pomocą mikronozyci całkowicie przetnij tkankę. Używając szwów 8.0 w zmodyfikowanym wzorze Kesslera, podwiąż końce ścięgna FDL. W razie potrzeby okresowo nawilżaj ścięgno solą fizjologiczną w trakcie całej procedury.Po zszyciu końców, naciągnij tkankę miękką i mięsień nad ścięgno i użyj nici nylonowych 5.0 do zamknięcia nacięcia. Następnie umieść mysz na podgrzewaczu do szkiełek w temperaturze 37°C i monitoruj ją do pełnego ocknięcia. Na 24 godziny przed końcowym punktem czasowym eksperymentu, wstrzyknij myszom 100 µL EDU.Następnego dnia zlokalizuj naprawione ścięgno w sposób przedstawiony powyżej i pobierz przeciętą tkankę. Izolacja tkanki ziarninowej otaczającej gojące się ścięgno jest krytycznym krokiem umożliwiającym późniejszą analizę aminocytochemiczną. Należy zachować szczególną ostrożność, aby zminimalizować włączenie tkanek obwodowych.Umieść ścięgno w szalce Petri zawierającej 1 mL kolagenazy. Następnie posiekaj tkanki skalpelem, a następnie poddaj fragmenty tryturacji, przeciskając je kilkukrotnie przez igłę o rozmiarze 18 G. Przenieś zawiesinę do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL i inkubuj fragmenty ścięgna w celu trawienia przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym wstrząsaniu.Po zakończeniu trawienia odwiruj zawiesiny tkankowe, a osady zawieś ponownie w 500 µL 3% BSA w PBS. Następnie przefiltruj komórki przez sito 70 µm, aby usunąć zanieczyszczenia oraz duże fragmenty nietrawionego ścięgna. Komórki umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C.Przenieść nieprzetrawione fragmenty ścięgna do nowych probówek mikroodwirowywacza o pojemności 1,5 mililitra zawierających jeden mililitr świeżej kolagenazy i wymieszać fragmenty za pomocą pipety. Po kolejnej godzinie trawienia z wytrząsaniem ponownie odwirować fragmenty tkanki, a osady zawiesić w 500 mikrolitrach PBS uzupełnionego o BSA. Następnie przefiltrować zawiesinę przez nowe sitko komórkowe o oczkach 70 mikronów do probówki z komórkami zebranymi po pierwszym trawieniu.Należy policzyć komórki, a następnie osadzić je poprzez wirowanie. Następnie osad należy zawiesić w stężeniu od 3 do 6 × 10⁴ komórek na 100 µL PBS uzupełnionego o BSA. Aby wykryć wbudowanie EdU metodą immunocytochemiczną, należy najpierw użyć hydrofobowego pisaka do wyznaczenia obszaru z komórkami na szkiełkach, a następnie niezwłocznie utrwalić próbki 150 µL 3% paraformaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej.Po 15 minutach wypłucz komórki, wykonując dwa pięciominutowe płukania w 150 µL PBS z dodatkiem BSA. Następnie przeprowadź permeabilizację próbek przy użyciu 0,5% Triton X 100 w PBS przez 20 minut. Po wypłukaniu w sposób przedstawiony przed chwilą, dodaj do komórek 150 µL świeżo przygotowanego koktajlu reakcyjnego EDU i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie ponownie przemyć komórki i przeprowadzić barwienie kontrastowe próbek, stosując 150 µL Hoechst. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej dodać do komórek jedną lub dwie krople medium montażowego z inhibitorem blaknięcia, a następnie ostrożnie przykryć każdą próbkę szkiełkiem podstawowym, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Pozostawić medium montażowe do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.Następnie przykrywki należy zabezpieczyć bezbarwnym lakierem do paznokci. Na koniec wykonuje się obrazy preparatów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 40X. W przypadku udanej naprawy tkanka ziarninowa wykazuje znacznie zwiększoną komórkowość w porównaniu do nieuszkodzonego ścięgna.Na tym obrazie przedstawiono przykład histologiczny zerwania naprawionego ścięgna zginacza. Marker EDU uwidacznia jedynie te komórki, które aktywnie proliferują w ciągu 24 godzin po podaniu impulsu EDU u żywych myszy. Umożliwia to ilościową ocenę proliferacji w obrębie tkanki ziarninowej gojącego się ścięgna.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania operacji uszkodzenia i naprawy ścięgna zginacza u myszy, co pozwoli lepiej zrozumieć populacje komórek przyczyniających się do tworzenia blizny w ścięgnie zginacza podczas procesu gojenia.

murine-flexor-tendon-injury-and-repair-surgery

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Dalkin, W., et al. Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny mający na celu wywołanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). Procedura polega na odsłonięciu nerwu strzałkowego, zastosowaniu kontrolowanego nacisku w celu wywołania urazu i upewnieniu się, że epineurium...

Wywoływanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych

Ten protokół opisuje mysi model chirurgii ortopedycznej, który był używany do badania mechanizmów pooperacyjnego zapalenia nerwów i zmian w zachowaniu, a w połączeniu z parabiozą, do badania regeneracji tkanek podczas starzenia.

Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek

W tym artykule prezentujemy protokół in vitro i in situ do naprawy szczeliny ścięgna do 1,5 cm poprzez wypełnienie jej zmodyfikowanym przeszczepem kolagenu. Osiągnięto to poprzez opracowanie zmodyfikowanej techniki szwów, która przejmie obciążenie mechaniczne do momentu, gdy przeszczep dojrzeje do tkanki gospodarza.

Nowatorska technika szwów tenorrhaphy z przeszczepem kolagenu modyfikowanym tkankowo w celu naprawy dużych ubytków ścięgien

Tutaj prezentujemy protokół opisujący minimalnie inwazyjną technikę unieruchomienia stawu kolanowego na modelu szczurzym. Ten powtarzalny protokół, oparty na sposobie separacji mięśni-szczelina i umiejętności mini-nacięcia, jest odpowiedni do badania mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw nabytego przykurczu stawów.

Miniinwazyjna technika stabilizacji wewnętrznej do badania przykurczu zgięciowego kolana wywołanego unieruchomieniem u szczurów

Tutaj prezentujemy technikę szwów "Q", która może być wykonywana w naprawie ścięgien i jej wpływ na tworzenie szczelin i wytrzymałość na rozciąganie naprawianych ścięgien. Wykazano, że szew Q skutecznie zwiększa wytrzymałość na rozciąganie i wytrzymałość naprawy ścięgien.

Stosowanie szwu Q w celu zwiększenia odporności na powstawanie szczelin i wytrzymałości na rozciąganie naprawionych ścięgien zginaczy

Niniejszy protokół ilustruje metodę oceny właściwości biofizycznych napraw ścięgien ex vivo. Materiał szewny z politetrafluoroetylenu (PTFE) oceniono tą metodą i porównano z innymi materiałami w różnych warunkach.

Politetrafluoroetylen (PTFE) jako materiał do szwów w chirurgii ścięgien

Złożony staw skokowo-podskokowy (ASCJ) jest rdzeniem stopy i odgrywa kluczową rolę w kontroli równowagi w codziennych czynnościach. Kontuzje sportowe często prowadzą do niestabilności tego stawu. Tutaj opisujemy mysi model niestabilności ASCJ wywołanej przecięciem więzadła.

Mysi model złożonej niestabilności stawu skokowo-podskokowego

To badanie szczegółowo opisuje procedury ustalania przewlekłego uszkodzenia stożka rotatorów u królika (RC). W szczególności uraz powstaje w jednostce mięśniowo-ścięgnistej / mięśniowo-ścięgnistej podłopatkowej (SSC), aby naśladować ludzką anatomię i patofizjologię RC, w tym ciężkie zwyrodnienie tłuszczowe mięśni (FD). Protokół ten może być stosowany do badania urazów RC i oceny terapii regeneracyjnych.

Opracowanie modelu przewlekłego uszkodzenia stożka rotatorów u królika do badania zwłóknienia i zwyrodnienia mięśniowego

Prezentujemy niestandardową platformę eksperymentalną i protokół hodowli tkankowej, który odtwarza zmiany włóknisto-chrzęstne wywołane uderzeniem przyczepu ścięgna Achillesa w eksplantatach mysich kończyn tylnych o trwałej żywotności komórek, dostarczając model odpowiedni do badania mechanobiologii uderzeń ścięgien.

Mysi model eksplantatu kończyn tylnych do badania mechanobiologii uderzenia ścięgna Achillesa

Opisujemy dwie metody testowania czucia dotykowego w ostrych lub przewlekłych okresach po urazie rdzenia kręgowego u szczurów. Te zwalidowane procedury pozwalają wykryć rozwój i utrzymywanie się doznań typu allodynii.

Ostre i przewlekłe badanie czucia dotykowego po uszkodzeniu rdzenia kręgowego u szczurów

Poznaj model urazu i naprawy ścięgna zginacza u myszy, który pozwala badać procesy gojenia i tworzenia blizn. Technika umożliwia identyfikację komórek odpowiedzialnych za regenerację tkanek.

Uraz ścięgna zginacza myszy i chirurgia naprawcza

Przeglądaj więcej filmów