Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowa i jakościowa analiza konkurencji między jednym a drugim izolatem bakteryjnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące badań nad wykluczeniem konkurencyjnym w obrębie społeczności bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że odzwierciedla ona zjawiska zachodzące w naturalnej społeczności bakteryjnej.

Izolaty naciekające muszą być zdolne do przetrwania hamującego działania izolatów ugruntowanych, aby inwazja zakończyła się sukcesem. Procedurę zaprezentuje Emma Crank, studentka studiów magisterskich z zakresu biologii szpitalnej. Na początek należy przygotować agar BHI (Brain Heart Infusion) zgodnie z instrukcją producenta.

Autoklawować agar w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut w celu sterylizacji. Nalać 15 ml sterylnego agaru BHI do sterylnych szalek Petriego i poczekać, aż agar zestali się. Przygotować bulion BHI zgodnie z instrukcją producenta i przelać 10 ml do szklanych butelek uniwersalnych o pojemności 28 ml.

Następnie wysterylizuj bulion BHI w autoklawie przez 20 minut. Aby przygotować butelki do waporyzatora, zacznij od ich rozmontowania. Przez waporyzator rozpyl 5% środek czyszczący o właściwościach powierzchniowo czynnych, aby usunąć zanieczyszczenia wewnętrzne.

Następnie namocz butelkę parownika, pokrywkę oraz parownik w środku czyszczącym na noc. Następnego dnia wysusz parownik, pokrywkę i butelki pod sterylnym dygestorium z przepływem laminarnym. Następnie napełnij butelki 70% ethanol.

Następnie ponownie podłącz waporyzator i rozpyl przez niego niewielką ilość etanolu. Nałóż pokrywkę na waporyzator i przechowuj go z etanolem w środku do momentu użycia. Przed użyciem wypłucz butelkę w sposób aseptyczny, używając sterylnego bulionu BHI, a następnie rozpyl bulion przez waporyzator.

Aby przygotować nocne kultury bakteryjne, wysiać szczepy konkurujące i hamujące na sterylną płytkę z agarem BHI, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez około 18 godzin. Do uniwersalnej butelki o pojemności 28 mililitrów wprowadzić pojedynczą kolonię wymaganego szczepu bakterii konkurujących do 10 mililitrów sterylnego bulionu BHI. Inkubować kulturę w uniwersalnym inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 RPM przez noc.

Następnego dnia upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche i nie ma kondensacji na pokrywkach, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się inokulum na płytce. Pipetuj 25 µL kultury nocnej na środek płytek agarowych, unikając całkowitego wciśnięcia tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które mogłyby rozpryskać kulturę na agarze. Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć jej rozprzestrzenianie się.

Następnie inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 °C w warunkach aerobowych przez noc. Po wyhodowaniu nocnej kultury, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej wyłożonej papierem chłonnym, użyj bulionu BHI, aby rozcieńczyć kulturę dziesięciokrotnie, aby uzyskać około 4 × 10⁶ CFU/ml. Następnie przelej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej buteleczki do rozpylania perfum.

Aby przeprowadzić test opóźnionego hamowania wzrostu, rozpyl kulturę za pomocą każdego z flakonów z atomizerem, aby upewnić się, że kultura znajduje się w mechanizmie rozpylającym przed naniesieniem jej na agar. Z odległości około 15 centymetrów nad agarem rozpyl około 250 µL rozcieńczonej kultury na całą powierzchnię agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych przez noc.

Aby zinterpretować odroczone hamowanie wzrostu, należy zmierzyć w milimetrach strefę hamowania wzrostu rozpylonego szczepu konkurencyjnego, odejmując średnicę centralnej plamki producenta inhibitora. Na koniec należy zapisać ocenę przejrzystości stref hamowania zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tej rycinie, wyniki testu powinny być widoczne jako różnica w nakładającym się szczepie konkurencyjnym w pobliżu centralnie naniesionego szczepu produkującego inhibitor.

Różnice mogą obejmować całkowite zahamowanie, częściowe zahamowanie, brak zahamowania lub powiązanie pozytywne. Wykres ten porównuje strefy zahamowania między izolatami produkującymi inhibitor, co może być wynikiem ilości wytworzonego związku przeciwdrobnoustrojowego, zdolności inhibitora do dyfuzji przez podłoże, rodzaju produkowanego inhibitora lub poziomu oporności szczepu konkurującego na inhibitory. Ten przykład pokazuje, że jeśli testowana kultura konkurencyjna jest zbyt rozcieńczona, strefa zahamowania będzie wydawać się większa i z mniej wyraźnie zdefiniowaną krawędzią niż zazwyczaj.

Jeśli plamka szczepu produkującego inhibitor nie została całkowicie wysuszona przed inkubacją przez noc, szczep inhibitora rozprzestrzeni się i nie utworzy całkowicie zdefiniowanej plamki. Alternatywnie, jeśli szczep konkurenta nie zostanie rozpylony równomiernie, może to prowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia się bakterii. Wreszcie, jeśli szczep konkurenta jest zbyt skoncentrowany, może on narosnąć na szczep inhibitora, co w skrajnych przypadkach może doprowadzić do odwrócenia ról szczepu konkurenta i inhibitora.

Po opanowaniu tej techniki, przeprowadzenie badania dla każdej badanej pary izolatów zajmie jedną godzinę w ciągu czterech dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o równomiernym rozpylaniu i zachowaniu dobrej powtarzalności między analizami. Po zastosowaniu tej procedury dane o inhibicji można nałożyć na dane taksonomiczne dotyczące obecności lub braku danego gatunku bakterii w społeczności.

Można następnie określić, czy efekty hamujące wpływają na zdolność danego gatunku do kolonizacji środowiska. Po opracowaniu, technika ta pozwala badaczom zajmującym się mikrobiomami społeczności na analizę wpływu wariancji cech, takich jak przewidywanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych, na strukturę społeczności w kontekście wykluczenia konkurencyjnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak w sposób jakościowy i ilościowy porównać zdolność jednego izolatu bakteryjnego do konkurencyjnego hamowania wzrostu innego.

Należy pamiętać, że praca z bakteriami w formie aerozolu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej oraz stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).