Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie konkurencji między jednym izolatem bakteryjnym a drugim, zarówno w sposób ilościowy, jak i jakościowy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące badań nad wykluczeniem konkurencyjnym w społecznościach bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że odzwierciedla to, co dzieje się w społeczności bakteryjnej.

Inwazyjne izolaty muszą być w stanie przetrwać hamujące działanie ustalonych izolatów, aby inwazja zakończyła się sukcesem. Procedurę zademonstruje Emma Crank, doktorantka biologii w szpitalu. Na początek przygotuj napar z mózgu, serce lub agar BHI zgodnie z instrukcjami producenta.

Autoklaw agaru w temperaturze 121 stopni Celsjusza w 15 psi przez 20 minut w celu sterylizacji. Wlej 15 mililitrów podwielokrotności wysterylizowanego agaru BHI do sterylnych szalek Petriego i pozwól agarowi stężeć. Przygotuj bulion BHI zgodnie z instrukcjami producenta i przenieś 10 mililitrowych porcji do 28-mililitrowych szklanych butelek uniwersalnych.

Następnie autoklaw bulionu BHI przez 20 minut. Aby przygotować butelki do waporyzatora, zacznij od demontażu butelek. Rozpyl 5% aktywny środek czyszczący przez waporyzator, aby wyeliminować zanieczyszczenia wewnętrzne.

Następnie namocz butelkę waporyzatora, pokrywkę i waporyzator w środku czyszczącym na noc. Następnego dnia wysusz waporyzator, pokrywkę i butelki pod sterylnym kapturem nawiewu. Następnie użyj 70% etanolu do napełnienia butelek.

Następnie ponownie podłącz waporyzator i rozpyl trochę etanolu przez parownik. Umieść pokrywkę na waporyzatorze i przechowuj go w środku z etanolem do czasu użycia. Przed użyciem użyj sterylnego bulionu BHI, aby aseptycznie przepłukać butelkę i spryskaj bulion przez parownik.

Aby przygotować kultury bakteryjne na noc, należy rozprowadzić szczepy konkurencyjne i inhibitorowe na sterylnej płytce agarowej BHI i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w aerobie przez około 18 godzin. W uniwersalnej butelce o pojemności 28 mililitrów zaszczepij 10 mililitrów sterylnego bulionu BHI pojedynczą kolonią wymaganego konkurencyjnego szczepu bakteryjnego. Inkubuj kulturę w uniwersalnej wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez noc.

Następnego dnia upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche i nie ma kondensacji na pokrywce, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się inokulacji na płytce. Odpipetować 25 mikrolitrów nocnej kultury na środek płytek agarowych, unikając całkowitego wciśnięcia tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które rozpylają kulturę na agare. Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się kultury.

Następnie inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez noc. Po wyhodowaniu kultury przez noc, pracując pod szafką bezpieczeństwa drugiego poziomu wyłożoną papierem chłonnym, użyj bulionu BHI, aby rozcieńczyć kulturę dziesięciokrotnie, aby uzyskać około cztery razy dziesięć do szóstego CFU na mililitr. Następnie wlej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej butelki na waporyzator perfum.

Aby przeprowadzić test odroczonego zahamowania wzrostu, należy spryskać kulturę przez każdą z butelek parownika, aby upewnić się, że kultura została załadowana do mechanizmu rozpylania przed rozpyleniem na agar. Z odległości około 15 centymetrów nad agarem spryskaj około 250 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na całej powierzchni agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez noc.

Aby zinterpretować odroczone zahamowanie wzrostu, zmierz strefę zahamowania wzrostu rozpylanego szczepu konkurencyjnego w milimetrach, odejmując średnicę centralnego miejsca inhibitora-producenta. Na koniec zapisz wynik klarowności dla stref inhibicji zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tym rysunku, wyniki testu powinny być obserwowalne jako różnica w nałożonym na siebie szczepie konkurencyjnym w pobliżu centralnie wykrytego szczepu wytwarzającego inhibitor.

Różnice mogą polegać na całkowitym zahamowaniu, częściowym zahamowaniu, braku zahamowania lub pozytywnym skojarzeniu. Na tym wykresie porównano strefy inhibicji między izolatami wytwarzającymi inhibitory, które mogą być wynikiem ilości wyprodukowanego środka przeciwdrobnoustrojowego, zdolności inhibitora do dyfuzji przez pożywkę, rodzaju wytwarzanego inhibitora lub poziomu odporności konkurencyjnego szczepu na inhibitory. Ten przykład pokazuje, że jeśli kultura konkurenta testowego jest zbyt rozcieńczona, strefa hamowania będzie wydawać się większa i z mniej wyraźnie zdefiniowaną krawędzią niż zwykle obserwuje.

Jeśli plamka szczepu wytwarzającego inhibitor nie została całkowicie wysuszona przed inkubacją przez noc, szczep inhibitora rozprzestrzeni się i nie utworzy całkowicie zdefiniowanego miejsca. Alternatywnie, jeśli konkurencyjny szczep nie zostanie rozpylony równomiernie, może to prowadzić do nierównomiernego rozprzestrzeniania się bakterii. Wreszcie, jeśli szczep konkurenta jest zbyt skoncentrowany, może rosnąć na szczycie szczepu inhibitora i może w skrajnych przypadkach prowadzić do odwrócenia ról szczepu inhibitora konkurenta.

Po opanowaniu tej techniki zajmie to jedną godzinę podzieloną na cztery dni na testowaną parę izolatów. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o równomiernym rozpylaniu z dobrą replikacją między testami. Zgodnie z tą procedurą, dane dotyczące inhibicji można nałożyć na dane taksonomiczne dotyczące obecności lub braku gatunku bakterii w społeczności.

Możliwe jest zatem określenie, czy efekty hamujące wpływają na zdolność gatunku do kolonizacji w środowisku. Po opracowaniu technika ta pozwala naukowcom zajmującym się mikrobiomami społecznościowymi badać wpływ wariancji cech, takich jak przewidywanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych, w strukturze społeczności w wykluczeniu konkurencyjnym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak porównać zdolność jednego izolatu bakteryjnego do konkurencyjnego hamowania wzrostu innego zarówno w sposób jakościowy, jak i ilościowy.

Nie zapominaj, że praca z bakteriami w aerozolu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w komorze bezpieczeństwa poziomu drugiego i noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.