Name: Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj test odroczonego hamowania wzrostu do ilościowej oceny konkurencji między szczepami bakteryjnymi. Ta metoda pozwala badać dynamikę wspólnot mikrobiomowych i mechanizmy wykluczania konkurencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JCM jest finansowany z nagrody BBSRC-IPA przyznanej przez Unilever Plc (BB/L023040/1). HAG jest finansowany przez stypendium doktoranckie Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego Arabii Saudyjskiej.

Poniższa metoda jest dostosowana do 7,8 do testowania konkurencyjnych szczepów ze szczepami produkującymi inhibitory.
UWAGA: Ten protokół obejmuje wytwarzanie aerozoli z kulturami bakteryjnymi. Można to zrobić tylko w zamkniętej przestrzeni z uwzględnieniem lokalnie zatwierdzonych względów bezpieczeństwa. Rozpylanie kultury na płytki agarowe w komorze bezpieczeństwa poziomu 2 zminimalizuje zanieczyszczenie płytek agarowych i otaczającego środowiska. Będzie to również chronić badacza przed wdychaniem aerozoli rozpylonych bakterii, co jest poważnym problemem, jeśli badacz używa organizmów o poziomie hermetyczności 2. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Obszar wokół szalki Petriego najlepiej pokryć jednorazową chusteczką chłonną. Zaleca się odkażanie po rozpyleniu za pomocą światła UV.
1. Przygotowanie płytek agarowych
<ol>
	<li>Przygotuj agar do infuzji serca (BHI) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Autoklawować agar BHI w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 minut lub zgodnie z zaleceniami producenta autoklawu, w celu sterylizacji.</li>
	<li>Wlej 15 ml porcji wysterylizowanego agaru BHI do sterylnych szalek Petriego i pozwól mu zastygnąć. 
	UWAGA: Upewnij się, że każda płytka agarowa, która ma być użyta w teście, pochodzi z tego samego zapasu agaru i że na każdej płytce znajduje się taka sama ilość agaru. Ogranicza to zmienność dostępnych składników odżywczych i dyfuzję inhibitorów między płytkami, umożliwiając porównywanie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sterylnego bulionu
<ol>
	<li>Przygotuj bulion BHI zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dodać 10 ml porcji BHI do 28 ml szklanych butelek uniwersalnych.</li>
	<li>Bulion BHI należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 minut lub zgodnie z zaleceniami producenta autoklawu w celu sterylizacji. 
	UWAGA: Upewnij się, że cały bulion użyty w teście pochodzi z tej samej partii bulionu autoklawowanego w tym samym czasie, aby ograniczyć różnice w składnikach odżywczych, które mogą powodować różnice w wynikach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sterylnej butelki do waporyzatora
<ol>
	<li>Zdemontuj butelkę parownika.</li>
	<li>Rozpyl 5% powierzchniowo czynny środek czyszczący przez parownik, aby wyeliminować zanieczyszczenia wewnętrzne, namocz butelkę parownika, pokrywkę i parownik w 5% powierzchniowo aktywnym środku czyszczącym przez noc. 
	UWAGA: Podczas pracy ze środkiem czyszczącym powierzchniowo czynnym należy używać rękawic i odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	<li>Wysuszyć waporyzator, pokrywkę i butelki pod sterylnym kapturem z przepływem powietrza.</li>
	<li>Napełnij butelkę 70% etanolem, ponownie podłącz parownik i rozpyl trochę etanolu przez parownik.</li>
	<li>Załóż pokrywkę na waporyzator i przechowuj z etanolem w środku do czasu użycia.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy aseptycznie przepłukać butelkę sterylnym bulionem BHI i spryskać bulion przez parownik. 
	UWAGA: Zapobiega to wpływowi etanolu na inokulum dodawane do butelki w sekcji 6.3.</li>
</ol>
4. Przygotowanie hodowli bakteryjnej na noc
<ol>
	<li>Szczepy konkurenta i inhibitora należy umieścić na sterylnej płytce z agarem BHI i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych przez około 18 godzin (przez noc). 
	UWAGA: Ta płytka wytwarza zapas bakterii, który może być użyty do wielu powtórzeń w ciągu tego samego tygodnia, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zaszczepić 10 ml sterylnego bulionu BHI pojedynczą kolonią wymaganego konkurencyjnego szczepu bakteryjnego w uniwersalnej butelce o pojemności 28 ml.</li>
	<li>Inkubować butelkę uniwersalną w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc, wytrząsając z prędkością 250 obr./min w wytrząsarce orbitalnej.</li>
</ol>
5. Posiew punktowy izolatu wytwarzającego inhibitory
<ol>
	<li>Przygotować kulturę (kultury) na noc zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
	<li>Upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche, bez kondensacji na pokrywce, przed inokulacją (np. przez inkubację płytki przez 60 minut w temperaturze 37 °C); zapobiega to rozprzestrzenianiu się inokulum po płytce z miejsca inokulacji.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 25 μl nocnej kultury na środek płytek agarowych. Unikaj całkowitego wciskania tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które rozpylają kulturę na agarze .</li>
	<li>Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się kultury. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc.</li>
</ol>
6. Przygotowanie inokulum w sprayu szczepu (szczepów) uczestnika testu
<ol>
	<li>Przygotować posiew przez noc zgodnie z opisem w punkcie 4. Rozcieńczyć kulturę przez noc 10 razy w bulionie BHI, aby uzyskać około 4 x 106 CFU ml-1 i zawiesinę OD600 0,3 ±0,05, 
	UWAGA: 10-krotne rozcieńczenie nie da 4 x 106 CFU ml-1 dla wszystkich gatunków bakterii, oblicz niezbędny współczynnik rozcieńczenia, rozprowadzając seryjne rozcieńczenia posiewu między 1 x 10-1-1 x 10-6.</li>
	<li>Wlej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej butelki na waporyzator perfum. 
	UWAGA: Całkowita objętość musi być większa niż jest to konieczne dla liczby opryskiwanych płytek agarowych. Około 250 μl na płytkę wystarcza na szalkę Petriego o średnicy 9 cm.</li>
</ol>
7. Test odroczonego hamowania wzrostu
<ol>
	<li>Rozpyl kulturę przez każdą z butelek parownika, aby upewnić się, że kultura została załadowana do mechanizmu rozpylającego przed rozpyleniem na agar</li>.
	<li>Z odległości około 15 cm nad agarem rozpylić około 250 μl rozcieńczonej kultury (3 rozpylenia typowego parownika o pojemności 50 ml) na całą powierzchnię agaru. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc. Powtórz dla innych płytek z taką samą liczbą rozpyleń.</li>
</ol>
8. Interpretacja wyników testu hamowania odroczonego wzrostu
<ol>
	<li>Zmierz strefę zahamowania wzrostu rozpylonego szczepu konkurencyjnego (Rysunek 1A-C, "X" do "X") w milimetrach, odejmując średnicę centralnego miejsca inhibitora-producenta (Rysunek 1A-C, "Y" do "Y"). 
	UWAGA: Rysunek 1E pokazuje, w jaki sposób można przedstawić te dane</li>
	<li>Zapisz wynik klarowności dla stref inhibicji. 
	UWAGA: Wskazuje to zaobserwowany stopień zahamowania. Przykłady przedstawiono na rysunku 1A-D, szczepy, które można wykorzystać do standaryzacji, sugerowano w sekcji reprezentatywnych wyników. Do oceny klarowności można użyć następującej skali: wynik klarowności równy 0 w celu opisania strefy całkowitego zahamowania wzrostu konkurencyjnego szczepu. Wynik 1 opisujący strefę prawie całkowitego zahamowania wzrostu, w której znajdują się tylko pojedyncze kolonie. Wynik 2 opisujący widoczną strefę zmniejszonego wzrostu, wzrost w tej strefie jest zlewający się lub prawie zlewający, ale gęstość zmniejszona o >50%. Wynik 3 opisujący tylko minimalne zmniejszenie wzrostu, wzrost jest zlewający się i zmniejszony o mniej niż 50%, strefa jest nadal widoczna i mierzalna. Wynik 4 oznacza brak widocznego zahamowania wzrostu. Wynik 5 opisujący, że wzrost konkurencyjnego szczepu był zwiększony w pobliżu szczepu wytwarzającego inhibitor testowy. Przykłady przedstawiono na rysunku 1. Wyniki te są subiektywne dla eksperymentatora.</li>
</ol>
9. Replikuje
<ol>
	<li>Powtórzyć próby co najmniej w trzech biologicznych powtórzeniach w celu określenia odtwarzalności otrzymanych wyników. 
	UWAGA: Jeżeli kontrpróby są przeprowadzane w różnych dniach, należy wykonać pomiary i naciąć płytki natychmiast po wyjęciu z inkubacji, a następnie przechowywać płytki w temperaturze 4 °C lub wykonać wysokiej jakości zdjęcia płytek przed ich wyrzuceniem. Przechowywanie lub fotografowanie płytek umożliwia łatwe porównywanie wyników między różnymi dniami, co jest szczególnie ważne dla potwierdzenia powtarzalnej punktacji w różnych dniach/eksperymentach. Należy pamiętać, że przechowywanie płytek może zmienić wyniki. 
	UWAGA: Aby uzyskać wyraźne zdjęcia, umieść płyty pionowo bez pokrywy na matowym czarnym tle w obszarze rozproszonego światła, użyj aparatu o wysokiej rozdzielczości (≥8 MP), który może ustawić ostrość na obiektach znajdujących się blisko obiektywu (tryb makro). Alternatywnie, niektóre kamery żelowe z trans-iluminatorem ustawionym na światło białe mogą wytwarzać obrazy o wysokiej jakości, wysoce powtarzalne.</li>
</ol>

<ol><li>Bolnick, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+intraspecific+trait+variation+matters+in+community+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Why intraspecific trait variation matters in community ecology.</a> Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).</li>
<li>Christensen, G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Staphylococcus+epidermidis+and+Propionibacterium+acnes+and+its+genomic+basis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis.</a> BMC Genomics. 17 (152), (2016).</li>
<li>Faust, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+co-occurrence+relationships+in+the+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome.</a> PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).</li>
<li>Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+nasal+microbiota+and+Staphylococcus+aureus+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage.</a> PLoS One. 5 (5), e10598(2010).</li>
<li>Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonisation+and+interaction+between+S.+epidermidis+and+S.+aureus+in+the+nose+and+throat+of+healthy+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li>
<li>Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+intraspecific+trait+variation+among+nasal+bacteria+shapes+the+distribution+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus.</a> Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).</li>
<li>Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+spatial+structure%2C+frequency+dependence+and+resistance+evolution+on+the+dynamics+of+toxin-mediated+microbial+invasions%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+appl%22%5BJournal%5D)">The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions.</a> Evol appl. 8, 738-750 (2015).</li>
<li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+and+the+ecology+of+the+nasal+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome.</a> Sci Adv. 1, e1400216(2015).</li>
<li>Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+are+alternative+agents+for+control+of+multiresistant+staphylococcal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).</li>
<li>Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+application+of+S.+epidermidis+prevents+colonization+by+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice.</a> PLoS One. 6 (10), e25880(2011).</li>
<li>Uehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+interference+among+nasal+inhabitants%3A+eradication+of+Staphylococcus+aureus+from+nasal+cavities+by+artificial+implantation+of+Corynebacterium+sp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp.</a> J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).</li>
<li>Wos-Oxley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+poke+into+the+diversity+and+associations+within+human+anterior+nare+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities.</a> ISME J. 4, 839-851 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytycznym etapem tego protokołu konkurencji gatunków bakterii, który odróżnia go od innych, jest nocna inkubacja izolatu inhibitora przed dodaniem izolatu konkurencyjnego. Szczep inhibitora wymaga tego okresu wzrostu do produkcji związków hamujących. Ponieważ szczep konkurenta jest nakładany na to samo podłoże, metoda ta pozwala badaczowi zaobserwować pełny potencjał szczepu inhibitora do zakłócania wzrostu szczepu konkurencyjnego. W rezultacie test ten odzwierciedla to, co dzieje się z naturą; Jeden izolat jest w pełni zakorzeniony w niszy, a drugi musi być w stanie przeciwdziałać wszelkim zmiennym hamującym, aby móc skutecznie zaatakować niszę.
Istnieją dwie części tego protokołu, które najprawdopodobniej spowodują błędne wyniki, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo. Po pierwsze, niepełna sterylizacja butelek parownika może wprowadzić do testu bakterie zanieczyszczające. Inkubacja bulionu użytego do przepłukania butelki parownika w kroku 3.6 w sterylnym naczyniu może być wykorzystana do potwierdzenia, że butelki zostały całkowicie wysterylizowane. Jeśli wymagana jest dodatkowa sterylizacja, można zastosować dodatkowe płukanie roztworami dezynfekującymi, takimi jak Virkon, przed myciem w powierzchniowo czynnym środku czyszczącym, opisanym w kroku 3.2.
Drugim krokiem, który może spowodować błędne wyniki, jest rozcieńczenie konkurencyjnego szczepu (krok 6.1). Jeżeli rozcieńczenie nie jest optymalne, jednoznaczne pomiary inhibicji mogą nie być łatwe do określenia. Test ten został zoptymalizowany przy użyciu różnych izolatów donosowych jako szczepów wytwarzających inhibitory w szerokim zakresie gatunków Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w porównaniu z S. aureus SH1000 jako konkurencyjnym szczepem 7,8. Następnie został przetestowany przy użyciu różnych gronkowców koagulazo-ujemnych i koagulazo-dodatnich jako szczepów konkurencyjnych i wytwarzających inhibitory. Podczas badania rodzajów innych niż te opisane powyżej jako szczep konkurencyjny, może być konieczna pewna optymalizacja rozcieńczenia dla inokulum.
Jeśli wyniki klarowności różnią się znacznie między powtórzeniami, może być konieczna standaryzacja inokulum konkurencyjnego szczepu poprzez ustawienie go na określoną gęstość optyczną. Wydłuży to jednak czas potrzebny na przygotowanie testu i prawdopodobnie zmniejszy liczbę szczepów, które można przetworzyć w jednym doświadczeniu. Wizualne dostosowanie kultury do odpowiedniego OD przy użyciu standardu McFarland może stanowić szybką alternatywę.
Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że można ją stosować tylko do bakterii zdolnych do hodowli. Dlatego w wielu badaniach wykorzystuje się sekwencjonowanie 16S rRNA do przewidywania interakcji wykluczających konkurencję 3,4,13. Jednak techniki genetyczne i metagenomiczne mogą rozróżniać członków społeczności tylko na poziomie gatunku i/lub nie uwzględniają szczególnej zmienności cech wewnątrzgatunkowych. Możliwe jest przeprowadzenie badań przesiewowych pod kątem związku konkretnego genu kodującego cechę z obecnością lub brakiem gatunku bakterii 5, jednak wymaga to wstępnej wiedzy na temat genu, który może być związany z wykluczeniem gatunku.
Ze względu na bezpieczeństwo tej techniki polega na tym, że ze względu na wytwarzanie bakterii w aerozolu, może być ona stosowana tylko w laboratoriach z komorą bezpieczeństwa poziomu 2 lub z podobnymi środkami ostrożności. Istnieją alternatywne techniki testowania konkurencji między izolatami, które uwzględniają zmienność cech wewnątrzgatunkowych i nie generują aerozoli bakterii. Jedną z takich metod jest jednoczesny test antagonizmu 2. W tej metodzie inokulum jednego izolatu rozprowadza się na płytce agarowej, a drugi inokulum izolatu jest nakrapiany lub dźgany na wierzchu po wyschnięciu pierwszego. W ten sposób powstałoby środowisko, w którym szczepy bezpośrednio konkurują ze sobą (jednoczesny antagonizm), konkurując zarówno o produkcję związków hamujących, jak i o wymiatanie składników odżywczych w pierwszej kolejności. Przewaga testu odroczonego hamowania wzrostu w porównaniu z równoczesnym testem antagonizmu polega na tym, że izolat inhibitora powinien zawsze mieć przewagę konkurencyjną polegającą na tym, że jest w pełni ugruntowany przed inwazją konkurencyjnego izolatu. Jest to bardziej odzwierciedleniem tego, co stałoby się w środowisku, ponieważ w większości nisz jeden izolat zostanie ustanowiony przed dodaniem innego szczepu, a nie dwa izolaty zostaną dodane w tym samym czasie 8.
Inną alternatywą, aby uniknąć wytwarzania bakterii w aerozolu, byłoby dodanie konkurencyjnego izolatu do górnego agaru, który można wylać, a nie rozpylać na izolat inhibitora. Jednak objętość dodanego górnego agaru musiałaby wynosić około 3 ml, aby zapewnić równomierne pokrycie płytki. W tej objętości konkurencyjny izolat nie byłby hodowany na tym samym podłożu co izolat inhibitora, więc nie cierpiałby z powodu zmniejszonej ilości składników odżywczych. Konkurent nie miałby również bezpośredniego kontaktu z żadnymi związkami hamującymi, dopóki nie dyfundowałyby one do górnego agaru. Takiego testu nie można określić jako odroczonego hamowania lub jednoczesnego antagonizmu.
Podobną metodę stosowano wcześniej do oceny poziomu oporności na bacytracynę wśród klinicznych izolatów S. aureus 10. Główna różnica między protokołem opisanym tutaj a tym opisanym przez 10 polega na tym, że ten drugi klasyfikuje tylko konkurencyjne szczepy jako wrażliwe (całkowita inhibicja - wynik klarowności 0) lub oporne (częściowe lub brak hamowania - wynik klarowności 1-5). Test odroczonego hamowania wzrostu może być zatem również wykorzystywany do badań przesiewowych pod kątem poziomów oporności producentów określonych środków przeciwdrobnoustrojowych, a nawet do poszukiwania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych aktywnych przeciwko patogenom wielolekoopornym.
Sugeruje się, że mikroflorą gospodarza można manipulować w celu wyeliminowania niepożądanych członków społeczności bakteryjnej 9. Wykazano już, że stosowanie corynebacteria lub Staphylococcus epidermidis eliminuje kolonizację S. aureus w nozdrzach u znacznej części populacji 11,12. Badania nad konkretnymi szczepami, które mogą konkurencyjnie wykluczać niepożądanych członków flory gospodarza, za pomocą technik takich jak ta opisana tutaj, mogą zatem prowadzić do przyszłych terapii.

Bakterie żyjące w społecznościach konkurują na poziomie międzygatunkowym i wewnątrzgatunkowym o przestrzeń i składniki odżywcze 6. Konkurencja między drobnoustrojami może często prowadzić do wykluczenia określonych gatunków lub szczepów w obrębie społeczności. Wykluczenie może wynikać z konkurencji o określony receptor lub składnik odżywczy lub z produkcji związku przeciwdrobnoustrojowego przez członka społeczności 6.
Badania badające konkurencyjne wykluczenie często badają obecność i brak gatunków za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA 3,4,13. Jednak zmienność cech wewnątrzgatunkowych, na przykład obecność lub brak produkcji peptydów przeciwdrobnoustrojowych, może mieć ogromny wpływ na zdolność jednego gatunku do hamowania innego 1. Ponieważ sekwencjonowanie 16S rRNA nie może rozróżnić szczepów tego samego gatunku, nie można ocenić zmienności cech wewnątrzgatunkowych. Opisana tutaj technika może być wykorzystana do oceny potencjału poszczególnych szczepów do wykluczenia innych bakterii. Metoda ta była wcześniej stosowana w celu wykazania dodatniej korelacji między obecnością bakterii hamujących Staphylococcus aureus a brakiem S. aureus w społeczności nosowej 7.
Test odroczonego hamowania wzrostu (konkurencji) może zidentyfikować produkcję związków przeciwdrobnoustrojowych lub konkurencję składników odżywczych przez szczep inhibitora. Może również wykrywać pozytywne interakcje, przy czym obecność szczepu inhibitora faktycznie poprawia wzrost szczepu konkurencyjnego. Test ten może być wykorzystany do stworzenia danych ilościowych (strefa wielkości oczyszczania) i danych jakościowych (stopień zahamowania), z których oba można nałożyć na dane dotyczące obecności lub braku gatunku w społeczności w celu znalezienia korelacji między fenotypem (cechą) a wykluczeniem konkurencyjnym 7.

<table><tbody><tr><td>Bulion do infuzji serca mózgu</td><td>Lab M</td><td>lab049</td><td>bogate podłoże</td></tr><tr><td>agarowe</td> ogólnego przeznaczenia <td>Merck Milipore</td><td>101614</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy parownik perfum</td><td>nieznany</td> <td>-</td> <td>10 cm wysokości z przezroczystą plastikową butelką z rozpylaczem o średnicy 3,5 cm z pokrywką, zakupioną w dziale podróżnym supermarketu</td></tr><tr><td>Butelki uniwersalne</td><td></td><td>już nieprodukowane, alternatywa SLS BOT5006</td><td>szklana butelka cylindryczna o pojemności 28 ml (średnica ~280 mm, wysokość 850 mm), z płaskim dnem i plastikową nakrętką</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon&nbsp;</td><td></td><td>Powierzchniowo czynny środek czyszczący&nbsp;</td></tr></tbody></table>

test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Konkurencyjne wykluczenie może wystąpić w społecznościach mikroorganizmów, gdy na przykład szczep produkujący inhibitory konkuruje ze swoim konkurentem o niezbędny składnik odżywczy lub wytwarza związki przeciwdrobnoustrojowe, na które jego konkurent nie jest odporny. W tym miejscu opisujemy test odroczonego hamowania wzrostu, metodę oceny zdolności jednej bakterii do hamowania wzrostu innej poprzez produkcję związków przeciwdrobnoustrojowych lub poprzez rywalizację o składniki odżywcze. Technika ta została wykorzystana do zbadania korelacji izolatów donosowych z wykluczeniem poszczególnych gatunków ze zbiorowiska. Technika ta może być również wykorzystywana do badań przesiewowych pod kątem producentów antybiotyków lub potencjalnie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Test przeprowadza się poprzez najpierw hodowlę szczepu wytwarzającego badany inhibitor przez noc na płytce agarowej, a następnie rozpylenie na testowany szczep konkurenta i ponowną inkubację. Po inkubacji zakres inhibicji można zmierzyć ilościowo, poprzez wielkość strefy oczyszczania wokół szczepu wytwarzającego inhibitor, oraz jakościowo, oceniając przejrzystość strefy inhibicji. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu odroczonej inhibicji, opisujemy sposoby minimalizacji różnic między eksperymentami oraz definiujemy skalę przejrzystości, którą można wykorzystać do jakościowej oceny stopnia zahamowania.

Wyniki testu powinny być widoczne jako różnica w obrębie nałożonego szczepu konkurenta w pobliżu centralnie naniesionego szczepu produkującego inhibitor (Rysunek 1). Różnice te można interpretować jako pełną inhibicję (Rysunek 1A), inhibicję częściową (Rysunek 1B oraz 1C), brak inhibicji (Rysunek 1D) lub asocjację dodatnią. W Rysunkach 1B i 1D) odpowiednio wykorzystano powszechnie dostępne szczepy laboratoryjne S. epidermidis Tü3298 i S. epidermidis Rp62A, a także S. epidermidis Rp62A i S. aureus Newman. Sugerujemy, że szczepy te mogą zostać wykorzystane do przetestowania niniejszego protokołu.
W zależności od badanego gatunku, pełna inhibicja i inhibicja częściowa są najprawdopodobniej wynikiem działania peptydów przeciwdrobnoustrojowych, antybiotyków lub innych dyfundujących inhibitorów wzrostu produkowanych przez szczep inhibitorowy. Inhibicję częściową wiązano również ze zmniejszoną dostępnością składników odżywczych dla szczepu konkurencyjnego, wynikającą z poboru lub sekwestracji nutrientów przez szczep inhibitorowy 6.
Porównanie wielkości strefy zahamowania między różnymi izolatami produkującymi inhibitor, przetestowanymi przeciwko temu samemu szczepowi konkurenta, wskazuje na różnice w którymkolwiek z następujących aspektów: ilości substancji przeciwdrobnoustrojowej produkowanej przez szczep produkujący inhibitor; zdolności inhibitora do dyfuzji w pożywce; rodzaju produkowanego inhibitora oraz poziomu oporności szczepu konkurenta na produkowane inhibitory. Porównanie wielkości strefy zahamowania między różnymi szczepami konkurenta, przetestowanymi przeciwko temu samemu szczepowi produkującemu inhibitor, jest wskaźnikiem poziomów oporności szczepów konkurenta na produkowany inhibitor.
Wyniki będą się różnić w zależności od zastosowanego szczepu hamującego i szczepu konkurenta. Powtórzenia z wykorzystaniem tego samego szczepu hamującego i konkurenta powinny idealnie dawać ten sam wynik przejrzystości (opisany w sekcji 8.2), co świadczy o zastosowaniu prawidłowej techniki w całym procesie.
W przypadku niespójnego naniesienia bakterii płytki nie powinny być użyte. Na przykład, jeśli testowana kultura konkurenta jest zbyt rozcieńczona, strefa zahamowania będzie wydawać się większa i będzie miała mniej wyraźnie zdefiniowaną krawędź niż zazwyczaj (Rycina 2A); wpłynęłoby to na wiarygodność wszelkich porównawczych pomiarów strefy. Jeśli plamka szczepu produkującego inhibitor nie wyschła całkowicie przed inkubacją nocną, szczep inhibitora prawdopodobnie rozprzestrzeni się i nie utworzy wyraźnie zdefiniowanej plamki (Rycina 2B), co zazwyczaj wpływa na pomiary strefy, ale może również wpłynąć na ocenę klarowności. Jeśli szczep konkurenta nie zostanie rozpylony równomiernie, może to prowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia się bakterii (Rycina 2C). Jeśli szczep konkurenta jest zbyt skoncentrowany, możliwe jest, że szczep konkurenta urośnie na wierzchu szczepu inhibitora (Rycina 2C); w ekstremalnych przypadkach może to doprowadzić do częściowej inwersji ról szczepu konkurenta i inhibitora.
<img alt="Wyniki testu przeciwdrobnoustrojowego, schematy szalek Petriego A-D, strefy zahamowania, wraz z analizą na wykresie słupkowym E." src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zakres wyników jakościowych i ilościowych, jakie można uzyskać w teście opóźnionego hamowania wzrostu. Wyniki hamowania wzrostu mogą obejmować (A) całkowite hamowanie (wynik 0), (B) częściowe hamowanie (wynik 1), (C) częściowe hamowanie (wynik 2) oraz (D) brak hamowania (wynik 4). Etykiety wskazują krawędzie wzrostu szczepów inhibitorów (Y) oraz zewnętrzną krawędź stref zahamowania (X). Wielkość strefy zahamowania mieści się w zakresie od 0 mm do ponad 10 mm, co pokazano na (E), gdzie przedstawiono pomiary dla szalek sfotografowanych w A, B, C i D. Wyniki przedstawiono dla niedawno wyizolowanych szczepów gronkowców (A, C) lub powszechnych laboratoryjnych izolatów gronkowców S. epidermidis Tü3298 (inhibitor) i S. epidermidis Rp62A (konkurent) (B), a także S. epidermidis Rp62A (inhibitor) i S. aureus Newman (konkurent) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki eksperymentu z hamowaniem wzrostu bakterii na płytkach agarowych, przedstawiające strefy zahamowania." src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykłady niespójnych wyników wynikających z błędnej techniki. Wyniki mogą odbiegać od oczekiwanych, jeśli (A) szczep konkurujący był zbyt rozcieńczony, (B) szczep inhibitora nie wyschł całkowicie przed inkubacją/płytki nie były suche lub (C) szczep konkurujący nie został rozpylony równomiernie i był zbyt skoncentrowany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Test odroczonego hamowania wzrostu może być użyty do oceny wpływu konkurencji jednego izolatu bakteryjnego na drugi. Hamowanie określa się ilościowo, mierząc strefę oczyszczania wokół izolatu wytwarzającego inhibitor, lub ocenia się jakościowo, określając widoczny zakres hamowania.

Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowa i jakościowa analiza konkurencji między jednym a drugim izolatem bakteryjnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące badań nad wykluczeniem konkurencyjnym w obrębie społeczności bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że odzwierciedla ona zjawiska zachodzące w naturalnej społeczności bakteryjnej.Izolaty naciekające muszą być zdolne do przetrwania hamującego działania izolatów ugruntowanych, aby inwazja zakończyła się sukcesem. Procedurę zaprezentuje Emma Crank, studentka studiów magisterskich z zakresu biologii szpitalnej. Na początek należy przygotować agar BHI (Brain Heart Infusion) zgodnie z instrukcją producenta.Autoklawować agar w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut w celu sterylizacji. Nalać 15 ml sterylnego agaru BHI do sterylnych szalek Petriego i poczekać, aż agar zestali się. Przygotować bulion BHI zgodnie z instrukcją producenta i przelać 10 ml do szklanych butelek uniwersalnych o pojemności 28 ml.Następnie wysterylizuj bulion BHI w autoklawie przez 20 minut. Aby przygotować butelki do waporyzatora, zacznij od ich rozmontowania. Przez waporyzator rozpyl 5% środek czyszczący o właściwościach powierzchniowo czynnych, aby usunąć zanieczyszczenia wewnętrzne.Następnie namocz butelkę parownika, pokrywkę oraz parownik w środku czyszczącym na noc. Następnego dnia wysusz parownik, pokrywkę i butelki pod sterylnym dygestorium z przepływem laminarnym. Następnie napełnij butelki 70% ethanol.Następnie ponownie podłącz waporyzator i rozpyl przez niego niewielką ilość etanolu. Nałóż pokrywkę na waporyzator i przechowuj go z etanolem w środku do momentu użycia. Przed użyciem wypłucz butelkę w sposób aseptyczny, używając sterylnego bulionu BHI, a następnie rozpyl bulion przez waporyzator.Aby przygotować nocne kultury bakteryjne, wysiać szczepy konkurujące i hamujące na sterylną płytkę z agarem BHI, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza tlenowo przez około 18 godzin. Do uniwersalnej butelki o pojemności 28 mililitrów wprowadzić pojedynczą kolonię wymaganego szczepu bakterii konkurujących do 10 mililitrów sterylnego bulionu BHI. Inkubować kulturę w uniwersalnym inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 RPM przez noc.Następnego dnia upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche i nie ma kondensacji na pokrywkach, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się inokulum na płytce. Pipetuj 25 µL kultury nocnej na środek płytek agarowych, unikając całkowitego wciśnięcia tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które mogłyby rozpryskać kulturę na agarze. Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć jej rozprzestrzenianie się.Następnie inkubuj płytki agarowe w temperaturze 37 °C w warunkach aerobowych przez noc. Po wyhodowaniu nocnej kultury, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej wyłożonej papierem chłonnym, użyj bulionu BHI, aby rozcieńczyć kulturę dziesięciokrotnie, aby uzyskać około 4 × 10⁶ CFU/ml. Następnie przelej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej buteleczki do rozpylania perfum.Aby przeprowadzić test opóźnionego hamowania wzrostu, rozpyl kulturę za pomocą każdego z flakonów z atomizerem, aby upewnić się, że kultura znajduje się w mechanizmie rozpylającym przed naniesieniem jej na agar. Z odległości około 15 centymetrów nad agarem rozpyl około 250 µL rozcieńczonej kultury na całą powierzchnię agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych przez noc.Aby zinterpretować odroczone hamowanie wzrostu, należy zmierzyć w milimetrach strefę hamowania wzrostu rozpylonego szczepu konkurencyjnego, odejmując średnicę centralnej plamki producenta inhibitora. Na koniec należy zapisać ocenę przejrzystości stref hamowania zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tej rycinie, wyniki testu powinny być widoczne jako różnica w nakładającym się szczepie konkurencyjnym w pobliżu centralnie naniesionego szczepu produkującego inhibitor.Różnice mogą obejmować całkowite zahamowanie, częściowe zahamowanie, brak zahamowania lub powiązanie pozytywne. Wykres ten porównuje strefy zahamowania między izolatami produkującymi inhibitor, co może być wynikiem ilości wytworzonego związku przeciwdrobnoustrojowego, zdolności inhibitora do dyfuzji przez podłoże, rodzaju produkowanego inhibitora lub poziomu oporności szczepu konkurującego na inhibitory. Ten przykład pokazuje, że jeśli testowana kultura konkurencyjna jest zbyt rozcieńczona, strefa zahamowania będzie wydawać się większa i z mniej wyraźnie zdefiniowaną krawędzią niż zazwyczaj.Jeśli plamka szczepu produkującego inhibitor nie została całkowicie wysuszona przed inkubacją przez noc, szczep inhibitora rozprzestrzeni się i nie utworzy całkowicie zdefiniowanej plamki. Alternatywnie, jeśli szczep konkurenta nie zostanie rozpylony równomiernie, może to prowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia się bakterii. Wreszcie, jeśli szczep konkurenta jest zbyt skoncentrowany, może on narosnąć na szczep inhibitora, co w skrajnych przypadkach może doprowadzić do odwrócenia ról szczepu konkurenta i inhibitora.Po opanowaniu tej techniki, przeprowadzenie badania dla każdej badanej pary izolatów zajmie jedną godzinę w ciągu czterech dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o równomiernym rozpylaniu i zachowaniu dobrej powtarzalności między analizami. Po zastosowaniu tej procedury dane o inhibicji można nałożyć na dane taksonomiczne dotyczące obecności lub braku danego gatunku bakterii w społeczności.Można następnie określić, czy efekty hamujące wpływają na zdolność danego gatunku do kolonizacji środowiska. Po opracowaniu, technika ta pozwala badaczom zajmującym się mikrobiomami społeczności na analizę wpływu wariancji cech, takich jak przewidywanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych, na strukturę społeczności w kontekście wykluczenia konkurencyjnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak w sposób jakościowy i ilościowy porównać zdolność jednego izolatu bakteryjnego do konkurencyjnego hamowania wzrostu innego.Należy pamiętać, że praca z bakteriami w formie aerozolu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej oraz stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).

deferred-growth-inhibition-assay-to-quantify-effect-bacteria-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Speare, L., et al. Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri.  J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test współinkubacji używany do badania, w jaki sposób szczepy bakteryjne konkurują ze sobą we wspólnym środowisku. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii do identyfikacji mechanizmów, takich jak zabijanie zależne od kontaktu lub niezależne od kontaktu, które napędzają te interakcje.

Test Coincubation do badania konkurencyjnych interakcji między szczepami bakterii

Ten film demonstruje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania konkurencji bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta dostarcza informacji na temat struktury i funkcji społeczności bakteryjnych.

Test koinkubacji bakterii: technika oparta na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji bakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki

Ten film prezentuje test odroczonego hamowania wzrostu, używany do zbadania, jak związki przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez jeden typ bakterii wpływają na inny konkurencyjny szczep bakteryjny.

Test odroczonego hamowania wzrostu w celu oceny wpływu związków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego

Ten film demonstruje metodę opartą na płytkach mikromiareczkowych do określania minimalnego stężenia hamującego (MIC) testowych antybiotyków przeciwko bakteriom. Po dodaniu zawiesiny patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa do płytki mikromiareczkowej zawierającej seryjne rozcieńczenia badanego antybiotyku i inhibitora wytwarzania pyomelaniny przez bakterie, mierzy się gęstość optyczną studzienek w celu obliczenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyku oraz wpływu inhibitora produkcji...

Metoda mikromiareczkowania na płytkach do oceny minimalnego stężenia hamującego antybiotyku

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Opisujemy prostą metodę badania kultur bakteryjnych pod kątem produkcji związków hamujących inne bakterie.

Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Testy interakcji międzykulturowych przedstawione w tym protokole są niedrogie, mają wysoką przepustowość i są proste. Testy te można wykorzystać do obserwacji interakcji mikrobiologicznych w kokulturze, identyfikacji wzorców interakcji i scharakteryzowania potencjału hamującego badanego szczepu drobnoustrojów przeciwko patogenom ludzkim i środowiskowym.

Wysokoprzepustowe testy kokultur do badania interakcji mikrobiologicznych

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Poznaj test odroczonego hamowania wzrostu do ilościowej oceny konkurencji między szczepami bakteryjnymi. Ta metoda pozwala badać dynamikę wspólnot mikrobiomowych i mechanizmy wykluczania konkurencyjnego.

Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję (Wideo) | JoVE Journal

Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Przeglądaj więcej filmów