Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w preparatach tkankowych, takich jak embriony myszy w stadium E8.5 lub dorosłe hodowle neurosfer, z wykorzystaniem komórkowego testu reporterowego. Choć szlak sygnalizacyjny RA jest dobrze scharakteryzowany, bezpośredni pomiar histologiczny RA jest technicznie niewykonalny. Niniejszy test może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mutacje genetyczne mogą wpływać na poziomy RA.

Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka czułość i wszechstronność, umożliwiająca pomiar szerokiego zakresu stężeń RA w różnych próbkach tkanek. Chociaż metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie poziomów RA w różnorodnych próbkach tkanek, może być ona również stosowana w innych badaniach, takich jak ustalanie obecności lub braku enzymów metabolicznych RA poprzez monitorowanie zmian w poziomach RA. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów należy sprawdzić odpowiedź komórek F9 RARE-LacZ na RA. Do komórek F9 RARE-LacZ wysianych na płytce 96-dołkowej dodaj jeden nanomol all-trans RA.

Następnie inkubuj płytkę i hoduj w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia przeprowadź barwienie LacZ i sprawdź, czy w komórkach pojawił się niebieski osad. Jeśli kolor nie jest jednolity we wszystkich komórkach, przystąp do subclonowania komórek.

Przenieść wybrane hodowle do szalek 10 cm w zagęszczeniu 100 000 komórek na 10 ml. Po dwóch dniach hodowli przygotować płytkę 24-dołkową z 500 µl 0,2% żelatyny na dołek i pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usunąć żelatynę i dwukrotnie przepłukać dołki 500 µl wody destylowanej.

Następnie do dołków należy dodać 500 µL pożywki do hodowli komórek F9 RARE-LacZ. W kolejnym kroku, używając sterylnej końcówki do pipety P10, należy pobrać kolonie komórek F9 i przenieść każdą z nich do osobnego dołka. Po trzech lub czterech dniach hodowli kolonie należy przenieść do dwóch 24-dołkowych płytek powlekanych żelatyną – jednej do testów, a drugiej do namnażania.

Po kolejnych dwóch dniach hodowli, dodać 1 nM RA do każdej studzienki jednej płytki 24-dołkowej i inkubować przez noc. Następnego dnia przeprowadzić barwienie LacZ w celu zidentyfikowania silnych responderów i namnożyć odpowiadającą im kulturę. Na jeden dzień przed pobraniem embrionów E8.5 lub dysocjacją neurosfer, pokryć płytkę 96-dołkową 100 µL 0,2% żelatyny na każdą studzienkę i pozostawić płytkę na 30 minut.

Następnie odessać żelatynę i dwukrotnie przemyć studzienki 200 µL wody destylowanej. Kolejnie przeprowadzić trypsynizację wybranych komórek F9 RARE-LacZ hodowanych w szalkach o średnicy 10 cm. Następnie wysiać 100 000 komórek do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, używając pożywki hodowlanej bez G418.

Napełnij odpowiednią liczbę studni, aby przeprowadzić ko-kulturę każdego zarodka, lub przygotuj trzy studnie na genotyp, jeśli pracujesz z neurosferami. Przygotuj również 24 studnie do krzywej standardowej. Następnie inkubuj płytkę przez 24 godziny.

W celu kokultywacji komórek embrionalnych należy rozpocząć sekcję embrionów w stadium E8.5. Następnie do nowej probówki o pojemności 1,5 ml należy wpiąć 10 µl trypsyny, a następnie za pomocą końcówki do pipety P20 o szerokim otworze przenieść cały embrion do probówki i umieścić ją na lodzie. Po wyizolowaniu wszystkich embrionów należy inkubować wszystkie probówki w temperaturze 37 °C przez pięć minut w celu dysocjacji tkanek.

Po pięciu minutach delikatnie zmieszać zawartość każdej probówki za pomocą końcówki pipety P20, a następnie przenieść 10 µL do dołka przygotowanej płytki 96-dołkowej z komórkami F9 RARE-LacZ. Inkubować płytkę przez noc. W przypadku kokultur neurosfer należy rozpocząć od przeniesienia hodowli neurosfer do probówek o pojemności 15 ml.

Wirować probówki przy 200 g przez 10 minut, a następnie usunąć cały supernatant z wyjątkiem jednego mililitra. Następnie rozdrobzić zawartość za pomocą pipety P1000. Teraz pobrać niewielką objętość, aby oznaczyć gęstość zdysocjowanych komórek.

Następnie wysiej 100 000 zdysocjowanych komórek neurosfer na komórki F9 RARE-LacZ. Do trzech dołków dodaj każdy typ hodowli neurosfer. Teraz należy przygotować dołki dla krzywej wzorcowej.

W trzech powtórzeniach dodaj 100 µL roztworów all-trans RA, przygotowanych poprzez rozcieńczenia seryjne w siedmiu różnych stężeniach w pożywce hodowlanej F9 RARE-LacZ. Uwzględnij kontrole negatywne w postaci niepoddanych działaniu preparatu komórek. Na koniec inkubuj w pełni wypełnioną płytkę 96-dołkową przez noc.

Następnego dnia usunąć medium i utrwalić hodowle, stosując 100 µL 2,5% glutaraldehydu na każdą studnię. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć studnie 200 µL PBS, wykonując każde płukanie przez 10 minut.

Następnie opłucz studnie trzykrotnie 200 µL roztworu do płukania LacZ, płucząc przez 10 minut podczas każdego cyklu. Podczas trzeciego płukania przygotuj roztwór barwiący X-gal w 15 ml probówce owiniętej folią. Przygotuj również komorę wilgotnościową dla płytki 96-dołkowej.

Następnie dodaj 200 µL roztworu barwiącego X-gal do każdej studni. Umieść płytkę w komorze nawilżanej i inkubuj w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usuń roztwór barwiący LacZ i zastąp go 200 µL PBS.

Następnie zmierz absorbancję przy 610 nanometrach i wykonaj obrazowanie płytki. Linia komórkowa reporterowa F9 RARE-LacZ składa się z adhezyjnych komórek raka zarodkowego, które reagują ilościowo na RA poprzez proporcjonalną indukcję beta-galaktozydazy. Wykazują one również morfologię nabłonkową.

Mimo hodowli z selekcją G418, odpowiedź tych komórek na RA będzie słabnąć wraz z kolejnymi pasażami. Dlatego konieczne jest okresowe subklonowanie, aby zapewnić silną i jednolitą odpowiedź na RA. Przewiduje się, że embriony E8.5 homozygotyczne pod kątem mutacji vl w genie Gpr161 wykażą zmniejszone embrionalne sygnalizowanie RA. Oczekiwanie to zostało potwierdzone przy użyciu opisanego testu kokultury rozdzielonych embrionów z komórkami F9 RARE-LacZ.

Do wykrywania RA w kulturach neurosfer wykorzystano również kokulturę neurosfer pochodzących od dorosłych osobników typu dzikiego z komórkami F9 RARE-LacZ. Zwiększone barwienie w porównaniu z komórkami w stadium E8.5 może wynikać z homogeniczności kultur neurosfer. Dzięki sporządzeniu krzywej wzorcowej dla poziomu RA, możliwe było ilościowe oznaczenie poziomu RA w kulturach neurosfer typu dzikiego oraz w embrionach E8.5.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o okresowym podpodziale komórek F9 RARE-LacZ, które wykazują silną odpowiedź na RA. Należy również upewnić się, że próbka została dokładnie zdysocjowana, aby ułatwić homogeniczną dystrybucję i uzyskać spójne pomiary RA. Po przeprowadzeniu tej procedury można zbadać wpływ mutacji genetycznych na poziomy RA, a następnie zastosować inne metody w celu ustalenia, które komponenty szlaku sygnałowego RA są bezpośrednio dotknięte.