Name: Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę ilościowego pomiaru kwasu retinowego w zarodkach myszy E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ. Ta technika umożliwia badanie wpływu mutacji genetycznych na sygnalizację RA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Michaelowi Wagnerowi (SUNY Downstate Medical Center) i Benowi Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) za dostarczenie nam komórek F9 RARE-LacZ i wsparcia technicznego. Badanie to jest finansowane przez New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (numer grantu: 10-3092-SCR-E-0) oraz New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (numer grantu: CBIR13FEL006).

Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z zatwierdzonymi metodami Rutgers-RWJMS IACUC.
1. Przygotowanie roztworu i podłoża
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe i buforowe zgodnie z tabelą 1. Przygotować roztwory robocze zgodnie z tabelą 2.</li>
</ol>
2. Hodowla i utrzymanie rzadkich komórek F9-LacZ
<ol>
	<li>Rozmrażanie zamrożonych komórek
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórek RARE-LacZ F9 zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
		<li>Pokryć 10 cm szalki hodowlane (hodowle komórkowe poddane działaniu substancji) 10 ml 0,2% żelatyny (patrz Tabela 2) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Nadmiar żelatyny zmyć dwoma płukaniami po 10 ml wody destylowanej. Natychmiast dodać 9 ml pożywki do hodowli komórek rzadkich F9 LacZ do kolby, aby zapobiec wysuszeniu żelatyny.</li>
		<li>Rozmrozić fiolkę z krwistymi komórkami F9 LacZ14 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 - 3 minuty. Komórki płytki (około 1 x 106 komórek/ml) w powlekanym naczyniu zawierającym 9 ml pożywki hodowlanej. Hodowla w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 . Zmień podłoże następnego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie komórek F9 RARE-LacZ
	<ol>
		<li>Utrzymuj regularne przejście co 2 - 3 dni w stosunku 1:10, 
		Uwaga: Nie pozwól, aby komórki rosły do zbieżności, ponieważ spowoduje to ich różnicowanie.</li>
		<li>Podziel kultury na zbieg 80-90%. Usunąć pożywkę i przemyć komórki 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Usuń PBS i dodaj 1 ml trypsyny, inkubuj przez 5 minut. Dodać 9 ml pożywki hodowlanej, pipetować w górę i w dół i podzielić komórki w stosunku 1:10 do przejścia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie rzadkich komórek F9 LacZ
	<ol>
		<li>Trypsynizować 10-centymetrowe naczynie zawierające rzadkie komórki F9 LacZ przy zbiegu 80 - 90%, jak opisano w kroku 2.2.2. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml pożywki do zamrażania F9 RARE-LacZ (patrz Tabela 2). Podaniec 1 ml do oznakowanych kriowiali i przenieść fiolki do pojemników do zamrażania. Umieścić pojemnik do zamrażania w zamrażarce o temperaturze -80 °C i następnego dnia przenieść fiolki do zbiorników z ciekłym azotem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja zarodków E8.5
<ol>
	<li>Konfiguracja współpracującej klatki i kontrola wtyczki
	<ol>
		<li>Ustaw klatkę współpracującą zawierającą jedną parę współpracującą. Rano następnego dnia sprawdź, czy nie ma czopa dopochwowego i oznacz dzień znalezienia czopa jako dzień 0,523. W dniu E8.5 zbierz zarodki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja zarodków
	<ol>
		<li>Poświęć zaporę przez zwichnięcie szyjki macicy i spryskaj okolicę brzucha 70% etanolem (patrz tabela 2). Wykonaj poprzeczne nacięcie na skórze nad brzuchem za pomocą nożyczek chirurgicznych i rozsuń dwie klapy (przednią i tylną), aby odsłonić obszar brzucha. Wykonaj podobne nacięcie na otrzewnej, aby odsłonić brzuch.</li>
		<li>Zlokalizuj macicę i uwolnij macicę z jajowodów i mezometrium za pomocą nożyczek23. Umieść macicę w 6 cm naczyniu (poddanym działaniu hodowli niekomórkowej) z 10 ml 1x PBS, aby zmyć nadmiar tłuszczu i krwi. Przenieść do innego naczynia o średnicy 6 cm zawierającego świeże 10 ml 1x PBS.</li>
		<li>Oddziel jedną macicę zawierającą jeden zarodek, odcinając ją nożyczkami chirurgicznymi. Usunąć macicę i decidua i uwolnić woreczek żółtkowy zawierający zarodek za pomocą dwóch par kleszczy nr 523.</li>
		<li>Oddzielić woreczek żółtkowy od zarodka i przenieść woreczek żółtkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu ekstrakcji genomowego DNA, która ma być wykorzystana do genotypowania. Za pomocą pipety P20 z końcówką o szerokim otworze przenieść cały zarodek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 10 μl trypsyny. Umieść rurkę na lodzie.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 3.2.3 - 3.2.4, aż wszystkie zarodki zostaną wycięte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja zarodka
	<ol>
		<li>Inkubować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające zarodki w trypsynie w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby ułatwić dysocjację enzymatyczną.
		<ol>
			<li>Delikatnie roztrzeć za pomocą pipetora P20 do mechanicznej dysocjacji zarodka i pokryć całą objętość 10 μl zawierającą jeden zdysocjowany zarodek na jednej studzience komórek F9 RARE-LacZ na 96-dołkowej płytce (patrz krok 5.1 w przypadku posiewu komórek RARE-LacZ F9 na płytce 96-dołkowej). Kultura O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Laminektomia, rozwarstwienie rdzenia kręgowego odcinka lędźwiowego u dorosłych i kultura neurosfery
<ol>
	<li>Laminektomia
	<ol>
		<li>Poświęć dorosłą mysz (P60) przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Spryskaj stronę grzbietową 70% etanolem i wykonaj poprzeczne cięcie nożyczkami chirurgicznymi. Rozsuń obie klapy (przednią i tylną), aby odsłonić plecy i kręgosłup.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych odetnij mięśnie pokrywające kręgosłup. Zlokalizuj odcinek lędźwiowy rdzenia kręgowego, poniżej żeber. Za pomocą nożyczek wykonaj głębokie cięcie, aby przeciąć kręgosłup w tym miejscu, aby odsłonić rdzeń kręgowy.</li>
		<li>Podciągnij odcinek lędźwiowy kręgosłupa za pomocą kleszczyków nr 5 tak, aby odsłonięty poprzeczny odcinek rdzenia kręgowego był skierowany w stronę eksperymentatora. Za pomocą końcówek cienkich nożyczek odetnij kręg i mięsień w pozycjach godziny 3 i 9 odsłoniętego końca. Chwyć płat grzbietowy przeciętego kręgu kleszczami. Kontynuuj te cięcia doogonowo, aż długość lędźwiowego rdzenia kręgowego zostanie odsłonięta.</li>
		<li>Uwolnij rdzeń kręgowy z kręgów za pomocą kleszczy nr 5 oraz kleszczy o końcach. Przenieść rdzeń kręgowy do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml pożywki hodowlanej DMEM/F12. Przechowywać na lodzie, aż wszystkie lędźwiowe rdzenie kręgowe zostaną odizolowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie rdzenia kręgowego
	<ol>
		<li>Wlać pożywkę hodowlaną z rdzeniem kręgowym do naczynia o średnicy 6 cm (hodowla niekomórkowa poddana obróbce).</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym usuń zwoje korzenia grzbietowego i naczynia krwionośne wokół segmentu rdzenia kręgowego, chwytając zwoje i naczynia krwionośne za pomocą dwóch par kleszczy nr 5 i delikatnie odciągając je od rdzenia kręgowego. Przenieś segment rdzenia kręgowego do 6-centymetrowego naczynia bez pożywki i drobno zmiel tkankę za pomocą ostrza skalpela.</li>
		<li>Przenieść tkankę mieloną do 15 ml probówki zawierającej 1 ml pożywki do dysocjacji neurosfery (patrz Tabela 2). Umieścić rurkę na lodzie i powtarzać kroki 4.2.1 - 4.2.2, aż wszystkie rdzenie kręgowe zostaną przetworzone.</li>
		<li>Probówki zawierające tkankę mieloną inkubować w pożywce dysocjacyjnej w temperaturze 37 °C przez 10 minut, przerzucić probówkę na bok w celu wymieszania, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 10 minut. Po mineralizacji enzymatycznej rozcierać za pomocą polerowanych ogniowo pipet o zmniejszających się średnicach w celu dysocjacji mechanicznej. 
		Uwaga: Przed przystąpieniem do eksperymentów należy przygotować wypolerowane na ogniowo pipety o malejących średnicach. Weź szklaną pipetę Pasteura i zatkaj szeroki koniec czystą bawełną. Za pomocą lampy alkoholowej wypoleruj końcówki pipet w płomieniu, aby uzyskać różne średnice: "zwykłe", "drobne" i "bardzo drobne". W przypadku "zwykłych" polerowanych pipet należy obrócić koniec pipety w płomieniu, aby zaokrąglić krawędzie, nie zmniejszając średnicy (~ 1 mm). Obracaj końcówkę pipety w płomieniu przez nieco dłuższy czas, aby uzyskać "cienkie" (~ >1 mm i > 5 mm średnicy) i "bardzo drobne" (~ 0,5 mm) polerowane pipety. Nie używaj pipet o średnicy mniejszej niż 0,5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura neurosfery
	<ol>
		<li>Wirować probówki zawierające zdysocjowaną tkankę rdzenia kręgowego w proporcji 200 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli neurosfery (patrz Tabela 2). Rozprowadzić za pomocą pipety P1,000, a następnie pipety P200, aby ułatwić dysocjację. 
		Uwaga: Unikaj wprowadzania pęcherzyków, które zmniejszyłyby żywotność komórek.</li>
		<li>Przenieś 10 μl zdysocjowanych komórek do hemocytometru i uzyskaj liczbę komórek. Płytki o gęstości 1x105/10 ml w kolbie T25 z 10 ml pożywki do hodowli neurosfery. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni, aż pojawią się neurosfery 24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja neurosfery
	<ol>
		<li>Zebrać kulturę neurosfery i przenieść do probówek o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 200 x g przez 10 min. Usunąć większość sklarowanego osadu, pozostawiając 1 ml. Rozetrzeć za pomocą pipety P1,000, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i zdysocjować neurosfery na pojedyncze komórki. Przenieś 10 μl zdysocjowanych komórek do hemocytometru i uzyskaj liczbę komórek.</li>
		<li>Płytka 1 x 105 zdysocjowanych komórek neurosfery nad jednym dołkiem F9 RARE-LacZ w 96-dołkowej płytce (patrz sekcja 5.1 w celu posiewu F9 RARE-LacZ w 96-dołkowej płytce). Płytka 3 dołki jako replikaty. Kultura O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test RZS zarodków E8.5 i neurosfer rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Poszycie F9 RARE-LacZ w płytce 96-dołkowej
	<ol>
		<li>Na jeden dzień przed pobraniem zarodków E8,5 lub dysocjacją neurosfer należy pokryć 96-dołkową płytkę 100 μl 0,2% żelatyny na dołek przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać żelatynę i dwukrotnie spłukać 200 μl wody destylowanej.</li>
		<li>Trypsynizuj komórki F9 RARE-LacZ utrzymywane w 10-centymetrowych szalkach, jak opisano w kroku 2.2.2. Płytka 1 x 105 komórek/studzienka komórek F9-RARE LacZ, ale tym razem przy użyciu pożywki hodowlanej bez G418.</li>
		<li>Przygotuj wystarczającą ilość studzienek do wspólnej hodowli zarodków (~ 12 - 20, w zależności od wielkości miotu), neurosfer (3 dołki/genotyp), a także do krzywej standardowej w trzech dołkach (27 dołków).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wspólna hodowla zarodków F9 RARE-LacZ i E8.5 lub neurosfer rdzenia kręgowego
	<ol>
		<li>Pobrać zarodki zgodnie z opisem w sekcji 3.2 i umieścić je na wierzchu F9 RARE-LacZ na 96-dołkowej płytce z sekcji 5.1. W podobny sposób rozdziel neurosfery i płytkę na wierzchu F9 RARE-LacZ w 96-dołkowej płytce, jak opisano w kroku 4.4. Kultura O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie krzywej standardowej
	<ol>
		<li>Aby wygenerować krzywą wzorcową, należy przygotować roztwory all-trans RA (at-RA) o następujących stężeniach: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, przez seryjne rozcieńczanie materiału podstawowego at-RA (patrz tabela 1) pożywką hodowlaną F9 RARE-LacZ.</li>
		<li>Dodać 100 μl tych różnych stężeń at-RA do komórek F9 RARE-LacZ z sekcji 5.1. Przypisz studzienki zawierające nietraktowane komórki F9 RARE-LacZ jako kontrolę negatywną. Przygotować trzy egzemplarze każdego studzienki stężenia RZS i kontroli ujemnej. Kultura O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		Uwaga: Komórki F9 RARE-LacZ reagują w sposób liniowy zależny od dawki na różne stężenia all-trans RA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test RZS
	<ol>
		<li>Po wyhodowaniu O/N na 96-dołkowej płytce zawierającej wzorcowe krzywe i kokultury, usunąć pożywkę i utrwalić kultury, dodając 100 μl 2,5% aldehydu glutarowego (patrz Tabela 2) przez 15 minut, RT. Usunąć utrwalacz i przemyć dwukrotnie 200 μl 1x PBS, 10 minut na pranie.</li>
		<li>Usunąć PBS i przemyć trzy razy 200 μl roztworu myjącego LacZ (patrz Tabela 2), 10 minut na pranie. Podczas trzeciego prania przygotuj roztwór barwiący X-gal w probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią (patrz Tabela 2). Oblicz, ile roztworu barwiącego jest potrzebne i przygotuj odpowiednią ilość (200 μl/studzienkę). 
		Uwaga: Roztwór barwiący X-gal jest wrażliwy na światło. Roztwór barwiący należy zużyć w ciągu 15 minut po przygotowaniu.</li>
		<li>Przygotuj nawilżoną komorę, umieszczając ręcznik papierowy zwilżony wodą destylowaną w plastikowym pojemniku wystarczająco dużym, aby pomieścić 96-dołkową płytkę. Dodać 200 μl roztworu barwiącego X-gal do dołka płytki 96-dołkowej i umieścić płytkę w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Inkubować wilgotną komorę zawierającą 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić wytworzenie niebieskiego osadu. W przypadku zarodków E8,5 inkubować płytkę O/N (12 - 16 godzin). W przypadku kultur neurosfery inkubować płytkę przez 4 - 8 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt absorbancji przy OD610 i obrazowanie
	<ol>
		<li>Po reakcji barwnej usuń roztwór barwiący LacZ i zastąp 200 μl 1x PBS. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 610 nm za pomocą standardowego czytnika płytek ELISA, aby określić ilościowo odpowiedź reportera na RA. Obrazowanie poszczególnych studzienek za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Subklonowanie rzadkich komórek F9 LacZ
<ol>
	<li>Sprawdzanie odpowiedzi F9 RARE-LacZ rResponse na RA
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów przetestuj odpowiedź komórek F9 RARE-LacZ na RZS. Umieść komórki F9 RARE-LacZ na płytce 96-dołkowej (patrz sekcja 5.1) i dodaj 1 nM kwas all-trans-retinowy (patrz krok 5.3). Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C O/N.</li>
		<li>Wizualizuj rozwój osadu o niebieskim kolorze za pomocą mikroskopu. Jeśli rozwój koloru nie jest równomierny we wszystkich komórkach w studzience (patrz rysunek 1B po lewej), wykonaj subklonowanie opisane poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subklonowanie rzadkich komórek F9 LacZ
	<ol>
		<li>Podzielić komórki F9 RARE-LacZ hodowane na 10-centymetrowych szalkach, jak opisano w kroku 2.2.2. Zamiast proporcji 1:10, należy umieścić płytkę o niskiej gęstości wysiewu 1 x 105komórek/10 ml w 10-centymetrowym naczyniu, aby umożliwić wzrost izolowanych kolonii tak, aby każda kolonia powstała z pojedynczej komórki F9 RARE-LacZ.</li>
		<li>Po dwóch dniach pokryj 24-dołkową płytkę 500 μl 0,2% żelatyny na studzienkę przez 30 minut. Usuń roztwór żelatyny i dwukrotnie przepłucz studzienki 500 μl wody destylowanej. Zastąp wodę 500 μl pożywki do hodowli komórkowych F9 RARE-LacZ.</li>
		<li>Wybierz kolonię za pomocą sterylnej końcówki pipety P10 i przenieś do jednego dołka; zrób to 24 razy, aby uzyskać 24 pojedyncze kolonie. Kultura w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 - 4 dni.</li>
		<li>Podziel poszczególne kolonie na dwie 24-dołkowe płytki. Po 2 dniach w hodowli dodać 1nM RZS do każdej studzienki z jednej płytki 24-dołkowej i hodowli O/N. Wykonać barwienie LacZ, jak opisano w sekcji 5.4, aby sprawdzić, czy osoby o wysokiej odpowiedzi na leczenie. Wizualizuj reakcję kolorystyczną każdej studzienki pod mikroskopem, aby określić silne i jednolite reakcje.</li>
		<li>Po określeniu silnego subklona, który reaguje, rozwiń odpowiednią kulturę z drugiej 24-dołkowej płytki. Dalej rozwiń tę kolonię w 10-centymetrowym naczyniu, zamroź kilka fiolek, jak opisano w sekcji 2.3, i wyrzuć wszystkie inne kolonie. 
		Uwaga: Tylko około jedna czwarta pierwotnych kolonii skutkuje wysoką reakcją. Zazwyczaj pierwsza runda subklonowania nie powoduje jednolitego barwienia LacZ i należy przeprowadzić kolejną rundę subklonowania, aby uzyskać jednolite, silne odpowiedzi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid.</a> Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).</li>
<li>Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+the+functioning+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signalling%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in the functioning brain.</a> Science Signalling. 324, 1-3 (2006).</li>
<li>Lane, M. A., Bailey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+retinoid+signalling+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Role of retinoid signalling in the adult brain.</a> Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+signalling+in+the+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinoid signalling in the development of the central nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+and+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Retinoids and spinal cord development.</a> J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).</li>
<li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signalling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li>
<li>Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+synthesis+in+mouse+embryos+during+gastrulation+and+craniofacial+development+linked+to+class+IV+alcohol+dehydrogenase+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression.</a> J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).</li>
<li>Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+premature+retinoic+acid+synthesis+in+Xenopus+embryos+following+premature+expression+of+aldehyde+dehydrogenase+ALDH1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1.</a> Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).</li>
<li>Bastien, J., Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retinoid+receptors+and+the+transcription+of+retinoid-target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes.</a> Gene. 328, 1-16 (2004).</li>
<li>Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinoic+acid+function+during+embryonic+brain+development+using+retinaldehyde-rescued+Rdh10+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice.</a> Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).</li>
<li>Sakai, Y., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+retinoic+acid+catabolism+with+reporter+systems+and+by+in+situ+hybridization+for+CYP26+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes.</a> Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+retinoic+acid+catabolic+enzymes+shows+high+expression+in+the+developing+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain.</a> Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).</li>
<li>Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+retinoic+acid+response+element-hsplacZ+transgene+defines+specific+domains+of+transcriptional+activity+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis.</a> Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).</li>
<li>Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+retinoid+release+from+embryonic+neural+tissue+detected+by+an+in+vitro+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay.</a> Development. 116, 55-66 (1992).</li>
<li>Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic-acid+critical+period+in+the+early+postnatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain.</a> Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).</li>
<li>Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+the+brain+marks+formation+of+optic+projections%2C+maturation+of+the+dorsal+telencephalon%2C+and+function+of+limbic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites.</a> J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).</li>
<li>Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+organ+of+Corti+contains+retinoic+acid+and+forms+supernumerary+hair+cells+in+response+to+exogenous+retinoic+acid+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture.</a> Development. 119, 1041-1053 (1993).</li>
<li>McCaffery, P., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spots+of+retinoic+acid+synthesis+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord.</a> Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).</li>
<li>Hu, L., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+analogs+and+retinoic+acid+influence+the+expression+of+retinoic+acid+receptor+alpha%2C+beta%2C+and+gamma+mRNAs+in+F9+teratocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratocarcinomas+and+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis.</a> Science. 209 (4458), 768-776 (1980).</li>
<li>Strickland, S., Mahdavi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+differentiation+in+teratocarcinoma+stem+cells+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid.</a> Cell. 15 (2), 393-403 (1978).</li>
<li>Li, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+GPCR%2C+Gpr161%2C+regulates+the+retinoic+acid+and+canonical+Wnt+pathways+during+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation.</a> Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).</li>
<li>Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+expansion%2C+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Linia komórkowa F9 RARE-LacZ14 to potężny system, który może być używany do wykrywania RZS wytwarzanego przez eksplantaty tkanek12,14,17,18. Jest wrażliwy na stężenia RZS już od 100 fM, przy czym w komórkach nieleczonych RA12,14,18 nie wykryto niespecyficznej odpowiedzi. Ponadto komórki reporterowe reagują na all-trans RA w sposób liniowy w określonym zakresie stężeń, umożliwiając w ten sposób ilościowe określenie reakcji LacZ i wykorzystanie jej do określenia wielkości poziomów RA12,14,18. Przedstawiony tutaj szybki i łatwy test reporterowy RZS wykorzystuje linię komórek reporterowych F9 RARE-LacZ do wizualizacji (ryc. 2) i względnego pomiaru ilościowego (ryc. 3) zarodków i hodowanych dorosłych nerwowych komórek macierzystych. Ten system reporterowy umożliwia porównanie poziomów endogennego RZS między poszczególnymi próbkami, jak pokazano na rysunku 2. Jest wystarczająco czuły, aby być w stanie wykryć RZS generowane przez pojedyncze zarodki E8.5 (ryc. 2A), a także RZS wytwarzane przez hodowane neurosfery (ryc. 2B). Zależna od dawki odpowiedź tej linii komórkowej na różne stężenia RZS pozwala na ilościowe określenie poziomów RZS (ryc. 3A) w próbkach, a także porównanie względnych poziomów RZS między próbkami (ryc. 3B). Ważne jest, aby pamiętać, że linia komórkowa reporterowa F9 RARE mierzy całkowitą ilość RZS generowanego przez próbki tkanek w czasie inkubacji. Jest to równoznaczne z bilansem netto syntezy RZS i katabolizmu.
Chociaż system reportera komórkowego F9 RARE-LacZ jest bardzo czuły i wszechstronny, istnieje kilka krytycznych kroków rozwiązywania problemów, które wprowadziliśmy, aby zapewnić niezawodność tego systemu. Po pierwsze, jak pokazano na rysunku 1, ważne jest, aby utrzymać zdrowie tych komórek poprzez regularne przejścia, nie pozwalając im rosnąć do zbieżności. Po drugie, zaobserwowaliśmy, że późniejsze pasaże mają tendencję do powodowania niespójnych odpowiedzi RA, nawet jeśli kultury są stale utrzymywane w selekcji za pomocą G418. Aby rozwiązać ten problem, zaleca się odrzucenie kultur po 20 przejściach i rozmrożenie nowej fiolki. Ponadto należy przeprowadzać regularne kontrole, aby upewnić się, że komórki reporterowe nadal silnie reagują na obecność RZS w pożywce. Po trzecie, jeśli wczesne pasaże wykazują słabą lub niejednorodną odpowiedź na RZS (Figura 1B, po lewej), może być konieczna jedna lub kilka rund subklonowania, aż do uzyskania silnych odpowiedzi (Figura 1B, po prawej). Wreszcie, przed wspólną hodowlą zaleca się, aby próbki tkanek, takie jak zarodki i neurosfery, zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki. Zaobserwowaliśmy, że dysocjacja próbek skutkuje bardziej spójnymi pomiarami kolorymetrycznymi. Może to być spowodowane bardziej równomiernym rozmieszczeniem RZS w dołkach hodowlanych, ponieważ zdysocjowane komórki są w jednolitym kontakcie z komórkami reporterowymi.
Wprowadzono również kilka modyfikacji do pierwotnego protokołu14. Po pierwsze, odpowiedź RA komórek F9 RARE-LacZ określono ilościowo poprzez bezpośrednie utrwalenie komórek i pomiar absorbancji przy 610 nm zamiast zbierania komórek i analizowania lizatu pod kątem aktywności b-galaktozydazy14. Inną modyfikacją jest bezpośrednia kohodowla zdysocjowanych próbek z F9 RARE-LacZ przed kwantyfikacją odpowiedzi RA. Poprzednie metody informowały o oddzielnym hodowaniu próbek i dodawaniu tylko pożywek z tych kultur do F9 RARE-LacZ16,18.
Pomimo tego, że jest to potężny system, test reporterowy F9 RARE-LacZ ma kilka ograniczeń. Jednym z ograniczeń tej reporterowej linii komórkowej jest to, że chociaż silnie reaguje na obecność all-trans RA, reaguje również na inne izomery kwasu retinowego, w tym 9-cis-RA i 13-cis-RA; jednak są one 100-krotnie bardziej wrażliwe na all-trans RA w porównaniu z innymi izomerami18. Innym ograniczeniem tego systemu jest to, że liniowa odpowiedź zależna od dawki mieści się tylko w przedziale od 10-13 M do 10-7 M przy RA14,18; w związku z tym, w przypadku porównywania poziomów RA poza tymi granicami, może być konieczne wykonanie seryjnego rozcieńczania próbki, aż pomiary będą mieścić się w zakresie liniowym. Wreszcie, ponieważ jest to przede wszystkim test kolorymetryczny, punkt końcowy rozwoju koloru będzie się różnić w zależności od próbek i eksperymentów. Dlatego ważne jest, aby krzywa wzorcowa była zawsze siana równolegle dla każdego pojedynczego eksperymentu, aby można ją było wykorzystać do ilościowego określenia odpowiedzi komórki reporterowej.
Podsumowując, doniesiono o zastosowaniu linii komórek reporterowych RA F9 RARE-LacZ do ilościowego pomiaru poziomów RZS w zarodkach E8,5 i, wcześniej nieopisanych, w neurosferach. Wszechstronność tego systemu reporterowego może pozwolić na ilościowe określenie poziomów RZS w praktycznie każdym typie komórki lub tkanki i może zaowocować rozwojem różnorodnych zastosowań w przyszłości.

Kwas retinowy (RA) jest metabolitem pochodnym retinolu lub witaminy A i jest wytwarzany przez sekwencyjną aktywność kilku dehydrogenaz komórkowych1. Ze względu na swój amfifatyczny charakter chemiczny łatwo przenika przez błony lipidowe i może działać jako rozpuszczalny czynnik morfogenetyczny1. Jest to niezbędna cząsteczka, która reguluje liczne procesy rozwojowe i dorosłe procesy komórkowe, działając jako ligand dla jądrowych receptorów retinoidowych i aktywując ekspresję genów2-10. Bez RZS te receptory RA (RAR) wiążą RZAS w DNA i działają jako represory; Wiązanie RZS z tymi receptorami przekształca je w aktywatory transkrypcji, co skutkuje ekspresją genu docelowego1,5,6.
Chociaż szlak sygnałowy RA jest dobrze scharakteryzowany, mały rozmiar (~ 300 Da) i amfipatyczny charakter RZS sprawiają, że bezpośrednia wizualizacja histologiczna i pomiar RZS są obecnie technicznieniewykonalne11. Jedyną metodą bezpośredniego pomiaru poziomów RZS jest izolacja RZS z próbek tkanek przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)11. Metoda ta zazwyczaj wymaga dużych ilości tkanki, co jest możliwe dzięki łączeniu różnych próbek12. W związku z tym technika ta nie nadaje się do pomiaru poziomu RZS w pojedynczych zarodkach lub niewielkich ilościach próbki/tkanki.
W celu zbadania funkcji komórkowej RZS, opracowano kilka metod pośredniego wnioskowania o obecności RZS. Metody te wykorzystują systemy reporterowe zawierające wysoce czuły RAR-beta RARE napędzający ekspresję beta-galaktozydazy lub lucyferazy11,13,14. Transgeniczna mysz reporterowa RARE-LacZ wygenerowana przez Rossanta i wsp.13 jest idealnym systemem do wizualizacji czasoprzestrzennych obszarów sygnalizacji RA in situ11,13,15,16, ale nie nadaje się do pomiarów ilościowych. Z drugiej strony linia komórkowa F9 RARE-LacZ14 jest przydatna do wykrywania RZS i ilościowych pomiarów poziomów RZS w eksplantatach tkanek11,12,14,17,18.
F9 komórki teratocarcinoma wyrażają endogenne receptory kwasu alfa-, beta i gamma-retinowego 19 i inicjują różnicowanie do endodermy ciemieniowej po ekspozycji na RA19-21. Komórki F9 od dawna są uznawane za model różnicowania komórkowego indukowanego przez RZS, dlatego zostały wybrane jako idealna linia komórkowa do testu reporterowego RZS. Linia komórkowa reporterowa Sil-15 RA pochodząca z F9 wygenerowana przez Wagnera i wsp.14 zawiera gen E. coli'LacZ za jedną kopią elementu odpowiedzi kwasu retinowego 64-bp (RARE) genu ludzkiego receptora kwasu beta-retinowego (RAR-beta). W celu selekcji i utrzymania stabilnych klonów, konstrukt zawiera również gen fosfotransferazy aminoglikozydowej (NEOr) jako selektywny marker w obecności G418. Konstrukt ten nadaje indukowaną ekspresję b-galaktozydazy w obecności RZS, którą można uwidocznić za pomocą barwienia LacZ, a odpowiedź tę można następnie określić ilościowo za pomocą metod kolorymetrycznych11,12,14,18.
Ta niezwykle wszechstronna linia komórek reporterowych była szeroko stosowana do wykrywania endogennej produkcji RA poprzez kohodowlę próbek tkanek z komórkami reporterowymi, takimi jak ślimak17 i embrionalne eksplantaty płytki podłogowej14. Ponadto ta linia reporterowa została wykorzystana do ilościowego określenia poziomów RZS w rozwijającym się rdzeniu kręgowym poprzez oddzielną hodowlę połączonych odcinków embrionalnych rdzeni kręgowych i dodanie kondycjonowanych pożywek z tych kultur do komórek F9 RARE-LacZ18. Oznaczanie ilościowe przeprowadzono po barwieniu LacZ poprzez odczyt kolorymetryczny przy użyciu standardowego czytnika płytek ELISA11,12,18. Wreszcie, ta reporterowa linia komórkowa została wykorzystana do wykrywania obecności enzymów metabolicznych RZS poprzez monitorowanie zmian poziomów RZS12,18.
Tutaj informujemy, że czułość tej reporterowej linii komórkowej pozwala również na pomiar poziomów RZS generowanych z indywidualnych współhodowanych zarodków E8.5. Umożliwia to porównanie poszczególnych zarodków o różnych genotypach. Jako konkretny przykład, Gpr161 jest sierocym GPCR, który reguluje neurulację częściowo poprzez szlak sygnałowy RA22, a my donosimy o użyciu tej reporterowej linii komórkowej do zbadania wpływu recesywnej mutacji w Gpr161 (Gpr161vl) na ogólny poziom RZS w zarodku. Ponadto wszechstronność i łatwość użycia tego systemu reporterowego pozwala na swobodne mierzenie i porównywanie poziomów RZS w różnych próbkach tkanek, nawet w kulturach neurosfery uzyskanych z dorosłych komórek macierzystych rdzenia kręgowego. Tutaj opisujemy ilościowe oznaczanie względnych poziomów RZS w zarodkach i kulturach neurosfery poprzez bezpośrednią współhodowlę z linią komórek reporterowych F9 RARE-LacZ RA.

<table><tbody><tr><td>Szczep myszy C3H/HeSn-Gpr161vl/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000316</td><td></td></tr><tr><td>linia</td><td></td><td></td> reporterowa RARE-LacZ F9 <td>od dr Michaela Wagnera (SUNY Downstate Medical Center) i Bena Thiede (laboratorium dr Jeffa Corwina, University of Virginia)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (z L-glutaminą i HEPES)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 10 ml podwielokrotnościach, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania; Ciepły w 37 & C do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C w 10 ml podwielokrotnościach, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania; światłoczuły</td></tr><tr><td>G418</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-027</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C; światłoczuły</td></tr><tr><td>2% żelatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>B-27 suplement (2 % roztwór podstawowy)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C w podwielokrotnościach 1 ml, aby uniknąć powtarzającego się zamrażania i rozmrażania; ciepło w temperaturze pokojowej do przygotowania podłoża</td></tr><tr><td>Mysi naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td>Przygotuj 100 &mu; g/ml roztworu podstawowego w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w 1xPBS; przygotować stężenia robocze przez rozcieńczenie 1x PBS; Przechowywać w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>Mysi czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-basic</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td>Przygotuj 100 &mu; g/ml roztworu podstawowego w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS; przygotować stężenia robocze przez rozcieńczenie 1x PBS; Przechowywać w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>50% aldehyd glutarowy</td><td>Amresco</td><td>M155</td><td>Przechowywać w 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu jednowodny (C24H39NaO4 &middot; H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5670</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-d-galaktopiranozyd)</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>kwas all-trans retinowy (at-RA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R-2625</td><td>Przechowywać 1 ml porcji bulionu w -80 &deg; C; wyjątkowo wrażliwy na światło</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td>alternatywa dla TrypLE Express; podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>10x roztwór buforowany fosforanem (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LK003176</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003703</td><td>Przechowywać w porcjach 1 ml w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kwas hialuronowy&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>385908</td><td>Sklep 200 &mu; l podwielokrotności przy -20 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td>Sklep w 200 &mu; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375</td><td>Przechowywać w 200 &mu; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>95% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli 10 cm (bez hodowli komórkowych)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli 10 cm (po podaniu działaniu kultur komórkowych)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli 6 cm (po podaniu danych działaniu kultur komórkowych)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>do<td>mikrowirówek 1,5 ml do mikrowirówek</td></tr><tr><td>1,5 ml Cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & Deg; C</td> nożyczki chirurgiczne do kąpieli <td></td><td></td><td></td>wodnej</tr><tr><td>cienkie nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>nr 5 kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tępo zakończone kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ostrze</td><td></td><td></td><td></td>skalpela</tr><tr><td>szklane pipety pasteura bawełniane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lampa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alkoholowa Czytnik</td><td></td><td></td><td></td>płytek ELISA</tr> mikroskop <tr><td>stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach e8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego f9 rare-lacz

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Kwas retinowy (RA) jest ważnym morfogenem rozwojowym, który koordynuje kształtowanie osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej, różnicowanie somitowe, neurogenezę, wzorzec tyłomózgowia i rdzenia kręgowego oraz rozwój wielu układów narządowych. Ze względu na jego chemiczny charakter jako małego amfipatycznego lipidu, bezpośrednie wykrycie i wizualizacja RZS histologicznie pozostaje technicznie niemożliwe. Obecnie metody stosowane do wnioskowania o obecności i lokalizacji RZS wykorzystują systemy reporterowe, które wykrywają aktywność biologiczną RZS. Większość uznanych systemów reporterowych, zarówno myszy transgenicznych, jak i linii komórkowych, wykorzystuje bardzo silny element odpowiedzi RA (RARE) przed genem RAR-beta do napędzania indukowanej przez RZS ekspresji genów reporterowych, takich jak beta-galaktozydaza lub lucyferaza. Transgeniczna mysz RARE-LacZ jest przydatna w wizualizacji czasoprzestrzennych zmian w sygnalizacji RA, zwłaszcza podczas rozwoju embrionalnego. Nie mierzy jednak bezpośrednio ogólnych poziomów RZS. Jako system reporterowy, linia komórkowa F9 RARE-LacZ może być wykorzystywana na wiele sposobów, od prostego wykrywania RZS po ilościowe pomiary poziomów RZS w eksplantatach tkanek. W tym miejscu opisano ilościowe oznaczanie względnych poziomów RZS generowanych w zarodkach i kulturach neurosfery przy użyciu linii komórek reporterowych F9 RARE-LacZ.

Linia reporterowa F9 RARE-LacZ to adherentna linia komórek raka zarodkowego hodowana na powierzchni powlekanej żelatyną. Konstrukt reporterowy pozwala komórkom na ilościową odpowiedź na RA poprzez proporcjonalną indukcję beta-galaktozydazy. 1,12,14,18. Komórki te wykazują morfologię nabłonkową (Rysunek 1A). Ze względu na ich wysoką szybkość podziałów zaleca się pasażowanie tych komórek co 2 - 3 dni w stosunku 1:10. Podczas pracy z tą linią reporterową zaobserwowaliśmy, że nawet przy dodaniu G418 do pożywki hodowlanej odpowiedź tych komórek na RA słabnie po kilku pasażach (Rysunek 1B, lewa strona), co może wpływać na zdolność reporterową tej linii komórkowej. Ta utrata reaktywności może wynikać z częściowej utraty transgenu w późniejszych pasażach. W związku z tym konieczne jest okresowe subclonowanie, aby zapewnić silną i jednolitą odpowiedź na RA (Rysunek 1B, prawa strona).
Choć w literaturze opublikowano już różne zastosowania tej linii komórkowej12,14-18, w niniejszej pracy przedstawiono wykorzystanie jej do pomiaru endogennych poziomów RA w poszczególnych embrionach E8.5 o różnych genotypach. Mutacja Gpr161vl/vl skutkuje zmniejszeniem embrionalnego sygnału RA22. Jak wykazano w badaniu kokultury zdisocjowanych embrionów z komórkami F9 RARE-LacZ, embriony Gpr161vl/vl charakteryzują się obniżonym poziomem endogennego RA w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego (Rycina 2A). Ze względu na wszechstronność tej linii komórek reporterowych, opisano tutaj również nowatorskie zastosowanie tych komórek do wykrywania poziomów RA wytwarzanych przez kultury neurosfer uzyskane z dorosłych myszy Gpr161wt/wt (Rycina 2B). Ta linia komórek reporterowych pozwoliła wykazać, że kultury neurosfer z dorosłych komórek macierzystych rdzenia kręgowego produkują endogenny RA. Znaczna różnica w intensywności barwienia wskazuje na silniejszą odpowiedź komórek reporterowych na neurosfery rdzenia kręgowego w porównaniu z embrionami E8.5. Może to wynikać z znacznie wyższych poziomów RA generowanych przez neurosfery w czasie w porównaniu z embrionami E8.5, co z kolei może być spowodowane faktem, że kultury neurosfer są bardziej homogenne niż embriony E8.5 i tym samym zawierają więcej komórek produkujących RA.
Dodanie różnych stężeń at-RA skutkuje zależną od dawki liniową odpowiedzią komórek reporterowych. Odpowiedź tę można zmierzyć kolorymetrycznie, odczytując absorbancję przy 610 nm. Wygenerowana krzywa wzorcowa może następnie służyć do ilościowego oznaczenia poziomów RA w próbkach, takich jak hodowle neurosfer typu dzikiego (Rycina 3A) lub zarodki w stadium E8.5 (Rycina 3B).
<img alt="Eksperyment dotyczący morfologii komórkowej i barwienia, obrazy mikroskopowe przedstawiające strukturę komórki i pochłanianie barwnika." src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Utrzymanie i subklonowanie komórek F9 RARE-LacZ. (A) Przedstawiono obraz komórek F9 RARE-LacZ wykonany w mikroskopii fazowej. Komórki te charakteryzują się czasem podwojenia wynoszącym ok. 10 h i muszą być pasażowane co 3 dni (przy konfluencji około 70–80%) w stosunku 1:10. (B) Należy przeprowadzać okresowe testy kultur z dodatkiem 1 nM at-RA i następującym po tym barwieniem LacZ, aby upewnić się, że kultury pozostają silnymi i jednolitymi responderami na RA (po prawej). W przypadku słabych i niejednolitych responderów (po lewej) należy przeprowadzić subklonowanie. Paski skali 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj w celu wyświetlenia powiększonej wersji tej ryciny.</a>
<img alt="Ekspresja Gpr161; obraz mikroskopowy tkanki nerwowej i neurosfer; analiza porównawcza." src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Barwienie LacZ próbek w ko-kulturze (dysocjowane embriony E8.5/neurosfery) oraz komórek F9 RARE-LacZ. (A) Zdysocjowano zarodki mysie w stadium E8.5 o różnych genotypach i wysiano je na komórki F9 RARE-LacZ. Barwienie LacZ przeprowadzone 24 godziny później pozwala na wizualizację odpowiedzi komórek F9 RARE-LacZ na endogenny kwas retinowy (RA) produkowany przez współhodowane próbki. Gpr161vl mutacja prowadzi do zmniejszenia poziomu endogennego RA, co objawia się zredukowaną odpowiedzią komórek reporterowych. (B) Po lewej: przedstawiono obraz w kontraście fazowym neurosfer hodowanych z komórek macierzystych neuronów rdzenia kręgowego osobników dorosłych. Po prawej: neurosfery pochodzące z Gpr161 osobników dorosłychm/m rdzeń kręgowy został rozdzielony i wysiany na komórki F9 RARE-LacZ. Obecność niebieskiego osadu po barwieniu LacZ wskazuje na obecność endogennego RA w tych neurosferach. Różnica w intensywności barwienia między kokulturami neurosfer a zarodkami E8.5 wskazuje na wyższe poziomy RA w neurosferach niż w zarodkach E8.5. Paski skali 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza kolorymetryczna, wykres zależności stężenia RA odczytu, wykres słupkowy względnych poziomów RA, badanie Gpr161." src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Krzywa standardowa i kolorymetryczne oznaczanie ilościowe poziomów RA. Odpowiedź linii komórkowej reporterowej F9 RARE-LacZ można zmierzyć kolorymetrycznie przy 610 nm przy użyciu standardowego czytnika płytek ELISA. (A) Reprezentatywna krzywa wzorcowa użyta do ilościowego oznaczenia względnych poziomów RA w hodowli neurosfer typu dzikiegos. (B) Ilościowe oznaczenie względnych poziomów RA z kokultur zarodków E8.5. N= 3; *p&lt; 0,05, test t studenta. Słupki błędów SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buforowe roztwory stokowe</td>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Warunki przechowywania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Deoksycholan sodu monohydrat (C24H39NaO4 · H2O)</td>
			<td>10 ml w 10 ml dH2O2O</td>
			<td>4 ºC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M chlorek magnezu (MgCl2)2)</td>
			<td></td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x żelazocyjanek potasu (K4[Fe(CN)6]·3H6O)</td>
			<td>2,12 g w 10 ml dH2O2O</td>
			<td>RT w ciemności</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x żelazicyjank potasu (K3[Fe(CN)6])</td>
			<td>1,64 g w 10 ml dH2O2O</td>
			<td>RT w ciemności</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosyd)</td>
			<td>dodać 5 ml dimetyloformamidu, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml</td>
			<td>-20 ºC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM (3 mg/ml) kwasu retinowego all-trans</td>
			<td>Rozpuścić 50 mg w 16,67 ml bezwodnego etanolu. Przygotować alikwoty o objętości 1 ml.</td>
			<td>-80 ºC w ciemności, w bursztynowych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaina</td>
			<td>rozpuścić jedną fiolkę w 7 ml HBSS</td>
			<td>4 ºC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Bufory i składy roztworów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bufory/roztwory robocze</td>
			<td>Komponenty</td>
			<td>Warunki przechowywania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pośrodki hodowlane dla komórek F9 RARE-LacZ</td>
			<td>50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (stężenie końcowe 10%)</td>
			<td>Sterylizować przez filtrowanie. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5 ml 10x penicyliny i streptomycyny (stężenie końcowe 1X)</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 ºC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4 ml G418 o stężeniu 50 mg/ml (stężenie końcowe 0,4 mg/ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>do 50 ml DMEM/F-12 (z L-glutaminą i HEPES)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2% żelatyny</td>
			<td>25 ml 2,0% żelatyny</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 ºC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>80 ml wody destylowanej</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dokładnie wymieszać</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% etanol</td>
			<td>30 ml 95% etanolu</td>
			<td>Przenieść do butelki z atomizerem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>70 ml wody destylowanej</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do dysocjacji neurosfer</td>
			<td>1 ml 20 J papainy</td>
			<td>przygotowywać na świeżo za każdym razem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 μl 13 mg/ml trypsyny</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 μl 7 mg/ml kwasu hialuronowego</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>28 μl 10 mg/ml DNazy I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 μl 4 mg/ml kwasu kynurenowego</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do hodowli neurosfer</td>
			<td>DMEM/F-12 (z L-glutaminą i HEPES)</td>
			<td>przygotowywać świeżą porcję za każdym razem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2% suplement B-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20 ng czynnika wzrostu naskórka (EGF)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5% glutaraldehydu</td>
			<td>250 μl 50% glutaraldehydu</td>
			<td>przygotowywać świeżą partię za każdym razem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4750 μl 1x PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór do płukania LacZ</td>
			<td>0,5 ml 10% deoksycholanu (stężenie końcowe 0,1%)</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 ºC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1,0 ml 10% NP-40 (stężenie końcowe 0,2%)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>50 ml 10X PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>woda destylowana do objętości 50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór barwiący X-gal</td>
			<td>1x żelazocyjanek potasu</td>
			<td>przygotowywać na świeżo za każdym razem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1x żelazkowian potasu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 mg/ml X-gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>do odpowiedniej objętości, używając roztworu płuczącego LacZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka do mrożenia linii F9 RARE-LacZ</td>
			<td>pożywka do hodowli F9 RARE-LacZ + 5% DMSO</td>
			<td>przygotowywać na świeżo za każdym razem</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Składy buforów i roztworów roboczych.

Metody dokładnego pomiaru poziomu kwasu retinowego (RA) w małych ilościach tkanek nie istnieją. Protokół ten opisuje łatwy, ilościowy pomiar względnych poziomów RZS w zarodkach i neurosferach E8.5 przy użyciu linii komórek reporterowych RA.

Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w preparatach tkankowych, takich jak embriony myszy w stadium E8.5 lub dorosłe hodowle neurosfer, z wykorzystaniem komórkowego testu reporterowego. Choć szlak sygnalizacyjny RA jest dobrze scharakteryzowany, bezpośredni pomiar histologiczny RA jest technicznie niewykonalny. Niniejszy test może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mutacje genetyczne mogą wpływać na poziomy RA.Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka czułość i wszechstronność, umożliwiająca pomiar szerokiego zakresu stężeń RA w różnych próbkach tkanek. Chociaż metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie poziomów RA w różnorodnych próbkach tkanek, może być ona również stosowana w innych badaniach, takich jak ustalanie obecności lub braku enzymów metabolicznych RA poprzez monitorowanie zmian w poziomach RA. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów należy sprawdzić odpowiedź komórek F9 RARE-LacZ na RA. Do komórek F9 RARE-LacZ wysianych na płytce 96-dołkowej dodaj jeden nanomol all-trans RA.Następnie inkubuj płytkę i hoduj w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia przeprowadź barwienie LacZ i sprawdź, czy w komórkach pojawił się niebieski osad. Jeśli kolor nie jest jednolity we wszystkich komórkach, przystąp do subclonowania komórek.Przenieść wybrane hodowle do szalek 10 cm w zagęszczeniu 100 000 komórek na 10 ml. Po dwóch dniach hodowli przygotować płytkę 24-dołkową z 500 µl 0,2% żelatyny na dołek i pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usunąć żelatynę i dwukrotnie przepłukać dołki 500 µl wody destylowanej.Następnie do dołków należy dodać 500 µL pożywki do hodowli komórek F9 RARE-LacZ. W kolejnym kroku, używając sterylnej końcówki do pipety P10, należy pobrać kolonie komórek F9 i przenieść każdą z nich do osobnego dołka. Po trzech lub czterech dniach hodowli kolonie należy przenieść do dwóch 24-dołkowych płytek powlekanych żelatyną – jednej do testów, a drugiej do namnażania.Po kolejnych dwóch dniach hodowli, dodać 1 nM RA do każdej studzienki jednej płytki 24-dołkowej i inkubować przez noc. Następnego dnia przeprowadzić barwienie LacZ w celu zidentyfikowania silnych responderów i namnożyć odpowiadającą im kulturę. Na jeden dzień przed pobraniem embrionów E8.5 lub dysocjacją neurosfer, pokryć płytkę 96-dołkową 100 µL 0,2% żelatyny na każdą studzienkę i pozostawić płytkę na 30 minut.Następnie odessać żelatynę i dwukrotnie przemyć studzienki 200 µL wody destylowanej. Kolejnie przeprowadzić trypsynizację wybranych komórek F9 RARE-LacZ hodowanych w szalkach o średnicy 10 cm. Następnie wysiać 100 000 komórek do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, używając pożywki hodowlanej bez G418.Napełnij odpowiednią liczbę studni, aby przeprowadzić ko-kulturę każdego zarodka, lub przygotuj trzy studnie na genotyp, jeśli pracujesz z neurosferami. Przygotuj również 24 studnie do krzywej standardowej. Następnie inkubuj płytkę przez 24 godziny.W celu kokultywacji komórek embrionalnych należy rozpocząć sekcję embrionów w stadium E8.5. Następnie do nowej probówki o pojemności 1,5 ml należy wpiąć 10 µl trypsyny, a następnie za pomocą końcówki do pipety P20 o szerokim otworze przenieść cały embrion do probówki i umieścić ją na lodzie. Po wyizolowaniu wszystkich embrionów należy inkubować wszystkie probówki w temperaturze 37 °C przez pięć minut w celu dysocjacji tkanek.Po pięciu minutach delikatnie zmieszać zawartość każdej probówki za pomocą końcówki pipety P20, a następnie przenieść 10 µL do dołka przygotowanej płytki 96-dołkowej z komórkami F9 RARE-LacZ. Inkubować płytkę przez noc. W przypadku kokultur neurosfer należy rozpocząć od przeniesienia hodowli neurosfer do probówek o pojemności 15 ml.Wirować probówki przy 200 g przez 10 minut, a następnie usunąć cały supernatant z wyjątkiem jednego mililitra. Następnie rozdrobzić zawartość za pomocą pipety P1000. Teraz pobrać niewielką objętość, aby oznaczyć gęstość zdysocjowanych komórek.Następnie wysiej 100 000 zdysocjowanych komórek neurosfer na komórki F9 RARE-LacZ. Do trzech dołków dodaj każdy typ hodowli neurosfer. Teraz należy przygotować dołki dla krzywej wzorcowej.W trzech powtórzeniach dodaj 100 µL roztworów all-trans RA, przygotowanych poprzez rozcieńczenia seryjne w siedmiu różnych stężeniach w pożywce hodowlanej F9 RARE-LacZ. Uwzględnij kontrole negatywne w postaci niepoddanych działaniu preparatu komórek. Na koniec inkubuj w pełni wypełnioną płytkę 96-dołkową przez noc.Następnego dnia usunąć medium i utrwalić hodowle, stosując 100 µL 2,5% glutaraldehydu na każdą studnię. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie usunąć utrwalacz i dwukrotnie przemyć studnie 200 µL PBS, wykonując każde płukanie przez 10 minut.Następnie opłucz studnie trzykrotnie 200 µL roztworu do płukania LacZ, płucząc przez 10 minut podczas każdego cyklu. Podczas trzeciego płukania przygotuj roztwór barwiący X-gal w 15 ml probówce owiniętej folią. Przygotuj również komorę wilgotnościową dla płytki 96-dołkowej.Następnie dodaj 200 µL roztworu barwiącego X-gal do każdej studni. Umieść płytkę w komorze nawilżanej i inkubuj w temperaturze 37 °C. Po inkubacji usuń roztwór barwiący LacZ i zastąp go 200 µL PBS.Następnie zmierz absorbancję przy 610 nanometrach i wykonaj obrazowanie płytki. Linia komórkowa reporterowa F9 RARE-LacZ składa się z adhezyjnych komórek raka zarodkowego, które reagują ilościowo na RA poprzez proporcjonalną indukcję beta-galaktozydazy. Wykazują one również morfologię nabłonkową.Mimo hodowli z selekcją G418, odpowiedź tych komórek na RA będzie słabnąć wraz z kolejnymi pasażami. Dlatego konieczne jest okresowe subklonowanie, aby zapewnić silną i jednolitą odpowiedź na RA. Przewiduje się, że embriony E8.5 homozygotyczne pod kątem mutacji vl w genie Gpr161 wykażą zmniejszone embrionalne sygnalizowanie RA. Oczekiwanie to zostało potwierdzone przy użyciu opisanego testu kokultury rozdzielonych embrionów z komórkami F9 RARE-LacZ.Do wykrywania RA w kulturach neurosfer wykorzystano również kokulturę neurosfer pochodzących od dorosłych osobników typu dzikiego z komórkami F9 RARE-LacZ. Zwiększone barwienie w porównaniu z komórkami w stadium E8.5 może wynikać z homogeniczności kultur neurosfer. Dzięki sporządzeniu krzywej wzorcowej dla poziomu RA, możliwe było ilościowe oznaczenie poziomu RA w kulturach neurosfer typu dzikiego oraz w embrionach E8.5.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o okresowym podpodziale komórek F9 RARE-LacZ, które wykazują silną odpowiedź na RA. Należy również upewnić się, że próbka została dokładnie zdysocjowana, aby ułatwić homogeniczną dystrybucję i uzyskać spójne pomiary RA. Po przeprowadzeniu tej procedury można zbadać wpływ mutacji genetycznych na poziomy RA, a następnie zastosować inne metody w celu ustalenia, które komponenty szlaku sygnałowego RA są bezpośrednio dotknięte.

quantitative-measurement-relative-retinoic-acid-levels-e85-embryos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Ten film demonstruje prostą technikę neurogenezy wywołanej kwasem retinowym w komórkach raka embrionalnego myszy P19. Kwas retinowy aktywuje czynniki transkrypcyjne i wyzwala ekspresję genów w celu różnicowania neuronów.

Neurogeneza indukowana kwasem retinowym przy użyciu mysich komórek raka embrionalnego

Ten film demonstruje technikę oceny aktywności kwasu retinowego w zarodkach myszy. Po wyizolowaniu komórek z zarodków myszy, komórki są hodowane wspólnie z komórkami reporterowymi kwasu retinowego (RA). Komórki embrionalne wytwarzają RZS, który indukuje ekspresję beta-galaktozydazy w komórkach reporterowych, wskazując na aktywność RA w komórkach embrionalnych.

Wykorzystanie komórek reporterowych w kokulturze do badania produkcji kwasu retinowego przez komórki embrionalne myszy

Ten film pokazuje pomiar wydzielania kwasu retinowego (RA) przez komórki neurosfery za pomocą komórek reporterowych RA. Przedstawiono w nim etapy związane ze współhodowlą komórek neurosfery z komórkami reporterowymi RZS i wykonaniem testu kolorymetrycznego RZS w celu zmierzenia poziomów RZS.

Pomiar poziomu kwasu retinowego w neurosferach za pomocą linii komórkowej reporterowej kwasu retinowego

Opracowano metodę ilościowego określania wielkości i kształtu zarodków Xenopus laevis. W tym protokole tradycyjne pomiary wielkości są połączone z morfometrią geometryczną, aby umożliwić bardziej wyrafinowane analizy rozwoju i wad ustno-twarzowych.

Kwantyfikacja fenotypów ustno-twarzowych u Xenopus

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

Elektrofizjologia to złoty standard w badaniu aktywności kanałów jonowych. Istnieje jednak wiele alternatywnych podejść, w tym metod optycznych. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania aktywności bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego 8-kanałowe (LRRC8) kanały anionowe utworzone przy użyciu metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między podjednostkami.

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj metodę ilościowego pomiaru kwasu retinowego w zarodkach myszy E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ. Ta technika umożliwia badanie wpływu mutacji genetycznych na sygnalizację RA.

Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ

Przeglądaj więcej filmów