Testy do wykrywania struktur odbijających promieniowanie UV i określania ich znaczenia w preferencjach mate przy użyciu Sailfin Molly Poecilia latipinna
14 września 2016
Ten protokół opisuje użycie spektrofotometrii do wykrywania struktur odbijających promieniowanie ultrafioletowe na organizmach (w tym przykładzie żaglopłetwy Poecilia latipinna) i opisuje dychotomiczne testy wyboru dla ryb, które pozwalają na wnioskowanie o roli sygnałów ultrafioletowych podczas wyboru partnera.
Ogólnym celem wykrywania odbicia promieni UV u ryb, takich jak Poecilia latipinna, jest zrozumienie, w jaki sposób struktury odbijające UV mogą wpływać na zachowania kopulacyjne tego gatunku. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu preferencji w doborze partnera, na przykład tego, czy sygnały UV są istotne i jeśli tak, czy są wykorzystywane przez obie płcie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia bodźców, które mogą być dla nas niewidoczne, ale mogą mieć kluczowe znaczenie dla ryb.
W ramach niniejszego protokołu należy najpierw skalibrować spektrofotometr i źródło światła względem znanego wzorca białego. Przed przeprowadzeniem wszystkich kalibracji oświetlenie w pomieszczeniu powinno być przygaszone. Instrument należy skalibrować dla wszystkich mierzonych długości fal, w tym obowiązkowo dla długości fal UV z zakresu od 300 do 400 nanometrów.
Teraz załóż rękawiczki i znieczul rybę w 5% roztworze soli kwasu metanosulfonowego etylu 3-aminobenzoesanowego, znanym jako MS222, buforowanym równą ilością wodorowęglanu sodu. Gdy ryba przestanie reagować, natychmiast przenieś ją na czarne, nierefleksyjne tło. Przed wykonaniem pomiarów ponownie przyciemnij światła w pomieszczeniu.
Do rejestracji danych odbiciowości należy użyć oprogramowania analitycznego. Aby uzyskać parametry zgodne z opisanymi tutaj, ustaw czas integracji na 2000 sekund. Ustaw średnią liczbę skanów na dwa oraz wartość wygładzania pikseli na pięć.
Teraz zmierz współczynnik odbicia światła ryby za pomocą sondy światłowodowej. Trzymaj sondę tak, aby kąt między światłowodem a ciałem wynosił 45 stopni. Oblicz średnią z kilku pomiarów dla każdego regionu ciała.
Sprawdź odbijalność światła dla kilku obszarów ciała i poszukaj różnic między osobnikami. Po zakończeniu, opcjonalnie zastosuj komercyjny preparat ochronny, aby przywrócić warstwę śluzu, a następnie umieść rybę w dobrze natlenionym zbiorniku przechowawczym. Po regeneracji u ryby wystąpią prawidłowe ruchy pokryw skrzelowych oraz normalne pływanie.
Test ten wykorzystuje zbiornik z komorami wyboru, wyposażony w filtry UV oraz filtry nieprzepuszczalne dla światła. Po usunięciu pleksiglasowych przegród ryba znajdująca się w komorze neutralnej może obserwować światło pełnego spektrum lub światło pozbawione promieniowania UV dzięki filtrom umieszczonym w różnych częściach zbiornika. W przypadku P.latipinna należy użyć akwarium testowego o pojemności 75,7 litra.
Przed każdym testem należy upewnić się, że trzy sekcje zbiornika nie są połączone w sposób umożliwiający wymianę wody lub sygnałów zapachowych. Do testu należy wykorzystać osobniki receptywne seksualnie. W przypadku samicy P.latipinna należy wybrać rybę w ciągu 48 godzin poyarjeniu, natomiast samce powinny być izolowane przez co najmniej 24 godziny.
Aby przeprowadzić test, w pierwszej kolejności przenieś zwierzę testowe do komory neutralnej. Następnie wybierz dwóch potencjalnych partnerów do kopulacji, którzy w jak największym stopniu przypominają się pod względem wielkości, ubarwienia i cech prezentacyjnych. Dopasowanie kolorów można przeprowadzić precyzyjnie za pomocą instrumentów lub w przybliżeniu, na oko.
Następnie, przy pełnowartościowym oświetleniu, umieść jednego z dwóch potencjalnych partnerów w każdym z dwóch przedziałów wyboru. Filtry nieprzezroczyste i UV oraz ścianki działowe przedziałów muszą być na swoich miejscach. Pozostaw zwierzęta do aklimatyzacji w tych warunkach na 15 minut.
Dla każdej próby losowo przypisz, która komora posiada filtr UV. Następnie zdejmij nieprzezroczyste osłony z przegród. Po 15 minutach rozpocznij pomiar czasu, jaki osobnik ogniskowy spędza w określonych strefach preferencji, używając stoperem.
Obszar w odległości dwóch długości ciała od wybranej komory stanowi strefę preferencji. Alternatywnie można zastosować oprogramowanie do rejestrowania zdarzeń. Rejestruj aktywność ryb przez 15 minut.
Jeśli ryba nie odwiedzi każdej strefy preferencji przynajmniej raz, należy uznać ją za nienasłuchującą i wykluczyć z danych z badania. Pomiar odbicia UV u P.latipinna wykazuje, że obie płcie posiadają cechy UV, które różnią się między osobnikami. Cechy te są najbardziej wyraźne wzdłuż boków ich ciał.
Po zidentyfikowaniu cech UV test dyskryminacyjny wykazał, że samice, w przeciwieństwie do samców, wykorzystują te cechy w decyzjach dotyczących doboru partnera. Ponieważ obie płcie posiadają cechy UV, możliwe jest, że biorą one udział w innych interakcjach społecznych, takich jak tworzenie ławic czy żerowanie. Po opanowaniu technik pomiaru UV, pomiary te można przeprowadzić w czasie krótszym niż dwie godziny.
Próby preferencji partnera można przeprowadzić w czasie krótszym niż godzina dla każdej ryby. Podczas wykonywania procedury ważne jest upewnienie się, że ryby są w okresie gotowości rozrodczej. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać dodatkowe eksperymenty w celu zbadania roli cech UV w rozpoznawaniu osobników lub gatunków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie spektrofotometrii do wykrywania struktur odbijających promieniowanie ultrafioletowe u organizmów, a konkretnie u żałby szerkopłetwej Poecilia latipinna. Opisano w nim testy dychotomicznego wyboru dla ryb, które pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących roli sygnałów ultrafioletowych podczas wyboru partnera.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ekologia behawioralna
- Komunikacja zwierząt
Wstęp
- Zrozumienie odbicia promieniowania UV u ryb może dostarczyć cennych informacji na temat zachowań związanych z doborem partnera do rozrodu.
- Sygnały w zakresie UV mogą odgrywać istotną rolę w wyborze partnera.
- Wykrywanie odbicia UV wymaga zastosowania specjalistycznych technik.
- Ryby mogą dostrzegać sygnały, które są niewidoczne dla ludzi.
Cel badania
- Zbadanie wpływu struktur odbijających promieniowanie UV na zachowania kopulacyjne.
- Określenie, czy sygnały UV są istotne dla wyboru partnera u Poecilia latipinna.
- Ocena wykorzystania sygnałów UV przez obie płcie podczas kopulacji.
Zastosowane metody
- Kalibracja spektrofotometru i źródła światła względem znanego wzorca białego.
- Pomiar długości fal UV w zakresie od 300 do 400 nanometrów.
- Przeprowadzenie testów wyboru dychotomicznego u ryb.
- Obserwacja preferencji kopulacyjnych opartych na sygnałach UV.
Główne wyniki
- Identyfikacja struktur odbijających promieniowanie UV u Poecilia latipinna.
- Dowody na to, że sygnały UV wpływają na dobór partnera.
- Wyniki sugerują, że obie płcie mogą wykorzystywać sygnały UV.
- Demonstracja skuteczności spektrofotometrii w badaniach biologicznych.
Wnioski
- Odbicie promieniowania UV odgrywa kluczową rolę w zachowaniach godowych Poecilia latipinna.
- Zrozumienie tych sygnałów może poszerzyć wiedzę na temat komunikacji ryb.
- Opisane metody można zastosować u innych gatunków w celu przeprowadzenia podobnych badań.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie pozawizualnych wskazówek sensorycznych, takich jak odbicie promieniowania UV, rozszerza walidację celów w neuronauce behawioralnej poprzez ujawnianie istotnych mechanistycznie szlaków w procesach podejmowania decyzji społecznych. Niniejszy test umożliwia przesiewy fenotypowe zachowań zależnych od wskazówek, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego w modelach przedklinicznych, w których percepcja sensoryczna wpływa na odpowiedź terapeutyczną. Metoda ta dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników, które zwiększają pewność prognostyczną w badaniach nad angażowaniem celów z udziałem obwodów neuronalnych sterujących wyborem partnera i afiliacją społeczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne dotyczące zachowań sterowanych sensorycznie poprzez wyizolowanie odbicia promieniowania UV jako mierzalnej zmiennej biologicznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki standaryzowanemu wykrywaniu struktur odbijających promieniowanie UV u różnych osobników i płci.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez określenie, czy sygnały UV istotnie wpływają na decyzje dotyczące doboru partnera u samic molli żaglowej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez potwierdzenie obecności cech UV oraz ich zmienności w obrębie różnych regionów ciała.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestię standaryzacji testu poprzez kalibrację spektrofotometru do długości fal UV (300–400 nm) i spójne pozycjonowanie sondy światłowodowej pod kątem 45 stopni.
- Skalowalność: Wskazuje na gotowość do badań przesiewowych i możliwość ponownego wykorzystania platformy, przy czym pomiar UV zajmuje mniej niż dwie godziny na jedną rybę.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omawia znaczenie w kontekście chorób, łącząc wybór partnera zapśredniczony przez promieniowanie UV z szerszymi interakcjami społecznymi, takimi jak formowanie ławic czy żerowanie, co wskazuje na potencjalną rolę w rozpoznawaniu gatunków.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Opisuje ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, wykazując, że cechy UV występują u obu płci, lecz są istotne behawioralnie tylko u samic, co pozwala na modelowanie odpowiedzi specyficznych dla płci.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Koncentruje się na predykcyjnej wartości ograniczania ryzyka, demonstrując, w jaki sposób manipulacja bodźcami sensorycznymi (filtry blokujące UV) zmienia wynik behawioralny w testach wyboru dychotomicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Pozycjonuje tę metodę w kontinuum odkryć, od etapu wczesnego odkrywania (Early Discovery) do identyfikacji związku wiodącego (Lead Identification), wspierając testowanie hipotez dotyczących szlaków sensorycznych oraz fenotypowanie behawioralne przed etapem screeningu związków.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie zmienności odbicia promieni UV i wiązanie go z obszarami preferencji kopulacyjnych, zdefiniowanymi jako przestrzeń w obrębie dwóch długości ciała od komory wyboru.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez projekt dychotomicznego testu wyboru z wykorzystaniem filtrów UV i nieprzezroczystych w akwarium o pojemności 75,7 litra, co umożliwia rzetelną ocenę związków modyfikujących percepcję sensoryczną.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, takie jak czas spędzony w strefach preferencji rejestrowany za pomocą stoperem lub oprogramowania do rejestracji zdarzeń, co dostarcza ilościowych wyników do porównywania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, wykazując, że cechy UV mogą leżeć u podstaw rozpoznawania osobników lub gatunków, co sugeruje potencjał dopasowania biomarkerów w modelach zachowań społecznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnego użytku potencjał, a nie technikę jednorazową, stosowalną u różnych gatunków ryb w celu wykrywania sygnałów UV i standaryzacji testów behawioralnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w zachowaniach sterowanych sensorycznie.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów odbicia UV oraz testów preferencji partnera.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji wykorzystania specyficznych dla płci bodźców.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju w zależności od tego, czy bodźce UV istotnie wpływają na wybór partnera w badanych populacjach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu spektrofotometrii, obchodzenia się z rybami oraz protokołów obserwacji behawioralnych.
- Zapotrzebowanie na instrumentację i infrastrukturę analityczną, w tym spektrofotometr skalibrowany do zakresu 300–400 nm, sondę światłowodową, środek znieczulający MS222 oraz zbiornik z komorami wyboru wyposażony w filtry UV/nieprzepuszczalne.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów znieczulania (5% MS222 buforowany wodorowęglanem sodu), warunków oświetlenia oraz definicji stref preferencji.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych, w tym gatunkowa lokalizacja cech UV oraz wybór osobników receptywnych seksualnie (samice do 48 godzin po porodzie, samce izolowane przez 24 godziny).
- Ograniczenia praktyczne wynikające z materiałów źródłowych: ryby muszą być reaktywne rozrodczo; brak odwiedzenia każdej strefy preferencji przynajmniej raz skutkuje wykluczeniem z danych z badania.
