Testy do wykrywania struktur odbijających promieniowanie UV i określania ich znaczenia w preferencjach mate przy użyciu Sailfin Molly Poecilia latipinna
14 września 2016
Ten protokół opisuje użycie spektrofotometrii do wykrywania struktur odbijających promieniowanie ultrafioletowe na organizmach (w tym przykładzie żaglopłetwy Poecilia latipinna) i opisuje dychotomiczne testy wyboru dla ryb, które pozwalają na wnioskowanie o roli sygnałów ultrafioletowych podczas wyboru partnera.
Ogólnym celem wykrywania odbicia promieniowania UV u ryb, takich jak Poecilia latipinna, jest zrozumienie, w jaki sposób struktury odbijające promieniowanie UV mogą wpływać na zachowania godowe gatunków. Ta metoda może pomóc nam zrozumieć preferencje godowe, takie jak to, czy sygnały UV są ważne, a jeśli tak, to czy są używane przez obie płcie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam wykryć wskazówki, które mogą nie być dla nas widoczne, ale mogą być bardzo ważne dla ryb.
W przypadku tego protokołu należy najpierw skalibrować spektrofotometr i źródło światła zgodnie ze znanym białym wzorcem. Oświetlenie w pomieszczeniu powinno być słabe przed wszystkimi kalibracjami. Skalibruj przyrząd do wszystkich długości fal, które będą mierzone, które muszą obejmować długości fal UV od 300 do 400 nanometrów.
Teraz załóż rękawiczki i znieczul rybę w 5% roztworze soli kwasu metanosulfonowego 3-aminobenzoesanu etylu, znanego jako MS222 buforowanego równą ilością wodorowęglanu sodu. Kiedy ryba przestanie reagować, natychmiast przenieś ją na czarne, nieodblaskowe tło. Przed wykonaniem pomiarów ponownie przyciemnij światła w pomieszczeniu.
Aby zarejestrować dane dotyczące współczynnika odbicia, należy użyć oprogramowania analitycznego. Aby dopasować to ustawienie w tym miejscu, ustaw czas integracji na 2000 sekund. Ustaw średnią liczbę skanów na dwa i ustaw wartość wygładzania pikseli na pięć.
Teraz zmierz współczynnik odbicia ryby za pomocą sondy światłowodowej. Przytrzymaj sondę, aby ustawić kąt 45 stopni między światłowodem a korpusem. Wykonaj średnio kilka skanów na region ciała.
Sprawdź współczynnik odbicia w kilku obszarach ciała i poszukaj różnic między osobami. Po zakończeniu opcjonalnie nałóż komercyjny środek ochronny, aby przywrócić powłokę śluzową, a następnie zwróć ryby do dobrze natlenionego zbiornika retencyjnego. Po wyzdrowieniu ryba będzie wykazywać normalne bicie wieczka i pływanie.
W tym teście wykorzystuje się zbiornik z komorą wyboru wyposażony w filtry UV i nieprzezroczyste. Po usunięciu przegród z pleksiglasu ryba w neutralnej komorze jest w stanie zobaczyć pełne spektrum światła lub światło bez promieniowania UV dzięki filtrom w różnych częściach zbiornika. W przypadku P.latipinna użyj akwarium testowego o pojemności 75,7 litra.
Przed każdym badaniem upewnij się, że trzy sekcje zbiornika nie mają wspólnych sygnałów wodnych ani węchowych. Do testu wykorzystaj osoby wrażliwe seksualnie. W przypadku samicy P.latipinna wybierz ryby w ciągu 48 godzin po porodzie i użyj samców, które były izolowane przez co najmniej 24 godziny.
Aby przeprowadzić badanie, należy najpierw przenieść zwierzę doświadczalne do neutralnego pomieszczenia. Następnie wybierz dwóch potencjalnych partnerów do krycia, którzy są do siebie jak najbardziej podobni pod względem wielkości, ubarwienia i cech wyświetlania. Dopasowanie kolorów można wykonać precyzyjnie za pomocą instrumentów lub z grubsza na oko.
Teraz, przy pełnym oświetleniu, umieść jednego z dwóch potencjalnych partnerów w każdym z dwóch przedziałów wyboru. Filtry nieprzezroczyste i UV oraz przegrody komory muszą być na swoim miejscu. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się do tego stanu przez 15 minut.
Do każdej próby losowo przypisz, która komora ma filtr UV. Następnie zdejmij nieprzezroczyste osłony z przegródek. Po 15 minutach zacznij rejestrować czas, jaki osoba ogniskowa spędza w określonych strefach preferencji za pomocą stopera.
Obszar w obrębie dwóch długości ciała przedziału do wyboru stanowi strefę preferencji. Alternatywnie użyj oprogramowania do nagrywania zdarzeń. Rejestruj aktywność ryby przez 15 minut.
Jeśli ryba nie odwiedzi każdej strefy preferencji przynajmniej raz, potraktuj ją jako niereagującą i wyklucz ją z danych próbnych. Pomiar współczynnika odbicia promieniowania UV P.latipinna pokazuje, że obie płcie mają cechy UV, które różnią się u poszczególnych osób. Cechy są najbardziej widoczne wzdłuż boków ich ciał.
Po znalezieniu cech UV, test dyskryminacji ujawnił, że samice, ale nie samce, wykorzystywały te cechy w swoich decyzjach krygodowych. Ponieważ obie płcie posiadają cechy UV, możliwe jest, że są zaangażowane w inne interakcje społeczne, takie jak ławice lub żerowanie. Po opanowaniu techniki pomiaru UV można wykonać w mniej niż dwie godziny.
Próby preferencji partnerskich można przeprowadzić w czasie krótszym niż godzina dla każdej ryby. Podczas próby zabiegu ważne jest, aby upewnić się, że ryby są otwarte reprodukcyjnie. Zgodnie z tą procedurą mogą zostać przetestowane dodatkowe eksperymenty w celu zbadania roli cech UV w rozpoznawaniu osobników lub gatunków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie spektrofotometrii do wykrywania struktur odbijających promieniowanie ultrafioletowe u organizmów, a konkretnie u żałby szerkopłetwej Poecilia latipinna. Opisano w nim testy dychotomicznego wyboru dla ryb, które pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących roli sygnałów ultrafioletowych podczas wyboru partnera.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Ekologia behawioralna
- Komunikacja zwierząt
Wstęp
- Zrozumienie odbicia promieniowania UV u ryb może dostarczyć cennych informacji na temat zachowań związanych z doborem partnera do rozrodu.
- Sygnały w zakresie UV mogą odgrywać istotną rolę w wyborze partnera.
- Wykrywanie odbicia UV wymaga zastosowania specjalistycznych technik.
- Ryby mogą dostrzegać sygnały, które są niewidoczne dla ludzi.
Cel badania
- Zbadanie wpływu struktur odbijających promieniowanie UV na zachowania kopulacyjne.
- Określenie, czy sygnały UV są istotne dla wyboru partnera u Poecilia latipinna.
- Ocena wykorzystania sygnałów UV przez obie płcie podczas kopulacji.
Zastosowane metody
- Kalibracja spektrofotometru i źródła światła względem znanego wzorca białego.
- Pomiar długości fal UV w zakresie od 300 do 400 nanometrów.
- Przeprowadzenie testów wyboru dychotomicznego u ryb.
- Obserwacja preferencji kopulacyjnych opartych na sygnałach UV.
Główne wyniki
- Identyfikacja struktur odbijających promieniowanie UV u Poecilia latipinna.
- Dowody na to, że sygnały UV wpływają na dobór partnera.
- Wyniki sugerują, że obie płcie mogą wykorzystywać sygnały UV.
- Demonstracja skuteczności spektrofotometrii w badaniach biologicznych.
Wnioski
- Odbicie promieniowania UV odgrywa kluczową rolę w zachowaniach godowych Poecilia latipinna.
- Zrozumienie tych sygnałów może poszerzyć wiedzę na temat komunikacji ryb.
- Opisane metody można zastosować u innych gatunków w celu przeprowadzenia podobnych badań.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie pozawizualnych wskazówek sensorycznych, takich jak odbicie promieniowania UV, rozszerza walidację celów w neuronauce behawioralnej poprzez ujawnianie istotnych mechanistycznie szlaków w procesach podejmowania decyzji społecznych. Niniejszy test umożliwia przesiewy fenotypowe zachowań zależnych od wskazówek, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego w modelach przedklinicznych, w których percepcja sensoryczna wpływa na odpowiedź terapeutyczną. Metoda ta dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników, które zwiększają pewność prognostyczną w badaniach nad angażowaniem celów z udziałem obwodów neuronalnych sterujących wyborem partnera i afiliacją społeczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne dotyczące zachowań sterowanych sensorycznie poprzez wyizolowanie odbicia promieniowania UV jako mierzalnej zmiennej biologicznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki standaryzowanemu wykrywaniu struktur odbijających promieniowanie UV u różnych osobników i płci.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez określenie, czy sygnały UV istotnie wpływają na decyzje dotyczące doboru partnera u samic molli żaglowej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez potwierdzenie obecności cech UV oraz ich zmienności w obrębie różnych regionów ciała.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestię standaryzacji testu poprzez kalibrację spektrofotometru do długości fal UV (300–400 nm) i spójne pozycjonowanie sondy światłowodowej pod kątem 45 stopni.
- Skalowalność: Wskazuje na gotowość do badań przesiewowych i możliwość ponownego wykorzystania platformy, przy czym pomiar UV zajmuje mniej niż dwie godziny na jedną rybę.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omawia znaczenie w kontekście chorób, łącząc wybór partnera zapśredniczony przez promieniowanie UV z szerszymi interakcjami społecznymi, takimi jak formowanie ławic czy żerowanie, co wskazuje na potencjalną rolę w rozpoznawaniu gatunków.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Opisuje ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, wykazując, że cechy UV występują u obu płci, lecz są istotne behawioralnie tylko u samic, co pozwala na modelowanie odpowiedzi specyficznych dla płci.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Koncentruje się na predykcyjnej wartości ograniczania ryzyka, demonstrując, w jaki sposób manipulacja bodźcami sensorycznymi (filtry blokujące UV) zmienia wynik behawioralny w testach wyboru dychotomicznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Pozycjonuje tę metodę w kontinuum odkryć, od etapu wczesnego odkrywania (Early Discovery) do identyfikacji związku wiodącego (Lead Identification), wspierając testowanie hipotez dotyczących szlaków sensorycznych oraz fenotypowanie behawioralne przed etapem screeningu związków.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie zmienności odbicia promieni UV i wiązanie go z obszarami preferencji kopulacyjnych, zdefiniowanymi jako przestrzeń w obrębie dwóch długości ciała od komory wyboru.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez projekt dychotomicznego testu wyboru z wykorzystaniem filtrów UV i nieprzezroczystych w akwarium o pojemności 75,7 litra, co umożliwia rzetelną ocenę związków modyfikujących percepcję sensoryczną.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, takie jak czas spędzony w strefach preferencji rejestrowany za pomocą stoperem lub oprogramowania do rejestracji zdarzeń, co dostarcza ilościowych wyników do porównywania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, wykazując, że cechy UV mogą leżeć u podstaw rozpoznawania osobników lub gatunków, co sugeruje potencjał dopasowania biomarkerów w modelach zachowań społecznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnego użytku potencjał, a nie technikę jednorazową, stosowalną u różnych gatunków ryb w celu wykrywania sygnałów UV i standaryzacji testów behawioralnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w zachowaniach sterowanych sensorycznie.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów odbicia UV oraz testów preferencji partnera.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji wykorzystania specyficznych dla płci bodźców.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju w zależności od tego, czy bodźce UV istotnie wpływają na wybór partnera w badanych populacjach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu spektrofotometrii, obchodzenia się z rybami oraz protokołów obserwacji behawioralnych.
- Zapotrzebowanie na instrumentację i infrastrukturę analityczną, w tym spektrofotometr skalibrowany do zakresu 300–400 nm, sondę światłowodową, środek znieczulający MS222 oraz zbiornik z komorami wyboru wyposażony w filtry UV/nieprzepuszczalne.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów znieczulania (5% MS222 buforowany wodorowęglanem sodu), warunków oświetlenia oraz definicji stref preferencji.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych, w tym gatunkowa lokalizacja cech UV oraz wybór osobników receptywnych seksualnie (samice do 48 godzin po porodzie, samce izolowane przez 24 godziny).
- Ograniczenia praktyczne wynikające z materiałów źródłowych: ryby muszą być reaktywne rozrodczo; brak odwiedzenia każdej strefy preferencji przynajmniej raz skutkuje wykluczeniem z danych z badania.
