Name: Mikromodelowanie i montaż mikronaczyń 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj metodę wtryskowego formowania mikronaczyń 3D do badania fizjologii naczyń krwionośnych w stanach fizjologicznych i chorobowych. Technika umożliwia tworzenie spersonalizowanych sieci naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Lynn and Mike Garvey Imaging Laboratory w Instytucie Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej oraz Washington Nanofabrication Facility na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Doceniają również wsparcie finansowe w postaci grantów Narodowego Instytutu Zdrowia DP2DK102258 (dla YZ) oraz stypendiów szkoleniowych T32EB001650 (dla SSK i MAR) i T32HL007312 (dla MAR).

<ol><li>Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelium+in+cardiovascular+homeostasis+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).</li>
<li>van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+vascular+control+of+haemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Obstet.+Gynecol.+Reprod.+Biol%22%5BJournal%5D)">The endothelium: vascular control of haemostasis.</a> Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).</li>
<li>Chiu, J. -J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Disturbed+Flow+on+Vascular+Endothelium%3A+Pathophysiological+Basis+and+Clinical+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives.</a> Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).</li>
<li>Qi, Y., Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-BB+and+TGB-b1+on+cross-talk+between+endothelial+and+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+induced+by+low+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).</li>
<li>Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+as+effector+and+target+molecules+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Chemokines as effector and target molecules in vascular biology.</a> Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).</li>
<li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Greek, R., Menache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Reviews+of+Animal+Models%3A+Methodology+versus+Epistemology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology.</a> Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+Animal+Models+of+Disease+Reliably+Inform+Human+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies.</a> PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245(2010).</li>
<li>Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+in+Cardiovascular+Research%3A+Hypertension+and+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis.</a> Biomed Res. Int. 2015, 528757(2015).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Microvascular+Networks+Work%3A+Angiogenesis%2C+Remodeling%2C+and+Pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning.</a> Physiology. 29, 446-455 (2014).</li>
<li>D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+Of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms Of Angiogenesis.</a> Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).</li>
<li>Geudens, I., Gerhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+cell+behaviour+during+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordinating cell behaviour during blood vessel formation.</a> Development. 138, 4569-4583 (2011).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+vascular+system%3A+a+historical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of the vascular system: a historical overview.</a> Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+aspects+of+physiological+vascular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis.</a> Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).</li>
<li>Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-directed+blood+vessel+patterning%3A+From+cells+to+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).</li>
<li>Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-derived+PDGF-BB+and+HB-EGF+coordinately+regulate+pericyte+recruitment+during+vasculogenic+tube+assembly+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization.</a> Blood. 116, 4720-4730 (2010).</li>
<li>Bach, T. L., Barsigian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VE-Cadherin+mediates+endothelial+cell+capillary+tube+formation+in+fibrin+and+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels.</a> Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).</li>
<li>Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+microarchitecture+and+myosin+II+determine+adhesion+in+3D+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices.</a> Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).</li>
<li>Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+Support+Migration%2C+Extracellular+Matrix+Invasion%2C+Proliferation%2C+and+Survival+of+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).</li>
<li>Bayless, K. J., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+markedly+induces+matrix+metalloproteinase+and+integrin-dependent+human+endothelial+cell+invasion+and+lumen+formation+in+three-dimensional+collagen+and+fibrin+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).</li>
<li>Hellström, M., Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pericytes+leads+to+endothelial+hyperplasia+and+abnormal+vascular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis.</a> J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).</li>
<li>Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Engineered+Human+Myocardium+With+Mechanical+Loading+and+Vascular+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture.</a> Circ. Res. 109, 47-59 (2011).</li>
<li>Davis, G. E., Saunders, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+balance+of+capillary+tube+formation+versus+regression+in+wound+repair%3A+role+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Investig.+dermatology+Symp%22%5BJournal%5D)">Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).</li>
<li>Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+prosthetic+bypass+grafts%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B.+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Current status of prosthetic bypass grafts: a review.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).</li>
<li>Nerem, R. M., Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Vascular Tissue Engineering.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).</li>
<li>Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+techniques+to+enhance+the+in+situ+endothelialization+of+small-diameter+biodegradable+polymeric+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B.+Rev%22%5BJournal%5D)">Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts.</a> Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).</li>
<li>Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+performance+standards+for+arterial+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation and performance standards for arterial prostheses.</a> J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).</li>
<li>Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Arteries+Grown+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Arteries Grown in Vitro.</a> Science. 284 (5413), 489-493 (1999).</li>
<li>Niklason, L., Counter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+engineered+from+human+cells+-+Authors%27+reply%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply.</a> Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).</li>
<li>Zheng, Y., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-driven+assembly+of+VWF+fibres+and+webs+in+in+vitro+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels.</a> Nat. Commun. 6, 7858(2015).</li>
<li>Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Three-Dimensional+Human+Peritubular+Microvascular+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).</li>
<li>Roberts, M. A., Tran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+in+dense+collagen+promote+cardiomyocyte+and+microvascular+patterning+in+engineered+human+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue.</a> Tissue Eng. Part A. , (2016).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Alpha-Step 200 Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tencor+Instruments%22">Tencor Instruments</a>. , (1989).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+expanders+stabilize+human+microvessels+in+microfluidic+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds.</a> J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).</li>
<li>Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tousimis+Research+Corporation%22">Tousimis Research Corporation</a>. , (1987).</li>
<li>Palpant, N. J., Pabon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B2-catenin+signaling+respecifies+anterior-like+endothelium+into+beating+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes.</a> Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).</li>
<li>Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Dysfunction%2C+Hemodynamic+Forces%2C+and+Atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis.</a> Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).</li>
<li>Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+binding+to+fibronectin+and+vitronectin+maintains+the+barrier+function+of+isolated+porcine+coronary+venules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules.</a> J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity+and+organ+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematother.+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity and organ specificity.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).</li>
<li>Shanks, N., Greek, R., Greek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+animal+models+predictive+for+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Ethics.+Humanit.+Med%22%5BJournal%5D)">Are animal models predictive for humans.</a> Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmodyfikowane mikronaczynia są modelem in vitro , w którym cechy fizjologiczne, takie jak geometria światła, siły hydrodynamiczne i interakcje wielokomórkowe, są obecne i można je dostrajać. Ten typ platformy jest potężny, ponieważ oferuje możliwość modelowania i badania zachowania śródbłonka w różnych kontekstach, w których warunki hodowli in vitro można dopasować do warunków danego mikrośrodowiska. Na przykład wiadomo, że mechanizmy kierujące procesami śródbłonka, takie jak angiogeneza, zachodzą w róż...

Mikrokrążenie w każdym narządzie pomaga zdefiniować mikrośrodowisko tkankowe, utrzymać homeostazę tkanek i regulować stan zapalny, przepuszczalność, zakrzepicę i fibrynolizację 1,2. W szczególności śródbłonek mikronaczyniowy jest interfejsem między przepływem krwi a otaczającą tkanką i dlatego odgrywa kluczową rolę w modulowaniu funkcji naczyń krwionośnych i narządów w odpowiedzi na bodźce, takie jak siły hydrodynamiczne oraz krążące cytokiny i hormony 3-5. Zrozumienie szczegółowych interakcji między śródbłonkiem, krwią i otaczającym mikrośrodowiskiem tkanek jest ważne dla badań nad biologią naczyń krwionośnych i progresją choroby. Jednak postęp w badaniu tych interakcji został zahamowany przez ograniczone narzędzia in vitro, które nie podsumowują struktury i funkcji mikronaczyń in vivo 6,7. W rezultacie, postęp w tej dziedzinie i terapii w dużej mierze opierał się na kosztownych i czasochłonnych modelach zwierzęcych, które często nie przekładają się na sukces u ludzi 8-10. Chociaż modele in vivo są nieocenione w badaniu mechanizmów chorobowych i funkcji naczyniowych, są złożone i często brakuje im precyzyjnej kontroli nad indywidualnymi sygnałami komórkowymi, biochemicznymi i biofizycznymi.
Vasculature w całym ciele posiada dojrzałą hierarchiczną strukturę w połączeniu z ekspansywnymi łóżkami kapilarnymi, zapewniając jednocześnie zoptymalizowaną perfuzję i transport składników odżywczych 11. Początkowo układ naczyniowy tworzy się jako prymitywny splot, który we wczesnym okresie rozwoju reorganizuje się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć 12,13. Chociaż wiele sygnałów zaangażowanych w te procesy jest dobrze poznanych 14-16, pozostaje nieuchwytne, w jaki sposób taki wzorzec naczyniowy jest determinowany 15. Z kolei rekapitulacja tego procesu in vitro w celu zbudowania zorganizowanych sieci naczyniowych była trudna. Wiele istniejących platform in vitro do modelowania unaczynienia, takich jak dwuwymiarowe hodowle komórek śródbłonka, nie ma ważnych cech, takich jak bliskość wielokomórkowa, trójwymiarowa geometria światła, przepływ i macierz zewnątrzkomórkowa. Testy tworzenia probówek w hydrożelach 3D (kolagen lub fibryna) 17-19 lub testy inwazji 20,21 zostały wykorzystane do badania funkcji śródbłonka w 3D i ich interakcji z innymi typami komórek naczyniowych 17,22 lub tkankowymi 23. Jednak zmontowane lumeny w tych testach nie mają wzajemnych połączeń, przepływu hemodynamicznego i odpowiedniej perfuzji. Co więcej, skłonność do regresji naczyniowej w tych testach tworzenia probówek 24 uniemożliwia długotrwałą hodowlę i dojrzewanie, co ogranicza zakres badań funkcjonalnych, które można przeprowadzić. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba zaprojektowania platform in vitro sieci mikronaczyniowych, które mogą odpowiednio modelować cechy śródbłonka i są zdolne do długotrwałej hodowli.
Na przestrzeni lat pojawiły się różne techniki inżynierii naczyniowej do zastosowań medycznych, które zastępują lub omijają uszkodzone naczynia u pacjentów z chorobami naczyniowymi. Naczynia o dużej średnicy wykonane z materiałów syntetycznych, takich jak politereftalan etylenu (PET) i politetrafluoroetylen (ePTFE), odniosły znaczny sukces terapeutyczny przy długoterminowej drożności (średnio 95% drożność w ciągu 5 lat) 25. Chociaż przeszczepy syntetyczne o małej średnicy (< 6 mm) zazwyczaj napotykają powikłania, takie jak przerost błony wewnętrznej i małopłytkowość 26-28, przeszczepy o małej średnicy wykonane z materiału biologicznego metodą inżynierii tkankowej poczyniły znaczne postępy 29,30. Pomimo tego rodzaju postępów, statki inżynieryjne w mikroskali pozostają wyzwaniem. Aby odpowiednio modelować mikrokrążenie, konieczne jest generowanie złożonych wzorców sieciowych o wystarczającej wytrzymałości mechanicznej do utrzymania drożności i o składzie matrycy, który pozwala zarówno na przenikanie składników odżywczych do komórek miąższowych, jak i na przebudowę komórkową.
Ten protokół przedstawia nowatorską sztuczną sieć naczyń perfuzyjnych, która naśladuje natywne ustawienie in vivo z regulowanym i kontrolowanym mikrośrodowiskiem 31-34. Opisana metoda pozwala na uzyskanie mikronaczyń inżynieryjnych o średnicach rzędu 100 μm. Zmodyfikowane mikronaczynia są wytwarzane przez perfuzję komórek śródbłonka przez kanał mikroprzepływowy, który jest osadzony w miękkim hydrożelu kolagenowym typu I. System ten ma zdolność do generowania wzorzystych sieci o otwartej strukturze świetlnej, replikowania interakcji wielokomórkowych, modulowania składu macierzy zewnątrzkomórkowej i stosowania fizjologicznie istotnych sił hemodynamicznych.

<table><tbody><tr><td> Produkcja wafli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoGlow Plasma System</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc&nbsp;</td><td>Powlekarka wirowa PWM32&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ABM Contact Aligner</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilometr krokowy alfa</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Resist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>8-calowy wafel krzemowy</td><td>Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stołowy generator mikrowzorów</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&mu; PG 101</td><td>Do generowania fotomaski</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izpropylowy</td><td>Avantor Performance Materials</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (120 x 120 mm, kwadratowe)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,3-trifluoropropylo)silan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzacz</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Mieszany w proporcji 10:1 (w/w)</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td>Produkcja i kultura urządzeń</td>poli(metakrylan metylu) (PMMA)PlexiPlexiCorona <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Treater</td><td>Produkty elektrotechniczne, Inc.</td><td>BD-20</td><td>Ręczne urządzenie do obróbki plazmowej urządzeń PMMA i form PDMS</td></tr><tr><td>Lutownica</td><td>Weller&nbsp;</td><td>WTCPS Śruba</td><td></td></tr><tr><td>maszynowa z kratownicowym ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>Kołki ustalające ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>Można użyć dowolnej podobnej pęsety</td></tr><tr><td>Szpatułka (Micro Spoon)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>Śrubokręt</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnego płaskiego śrubokręta, autoklawowanego</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td>4460030966</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego (150 x 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego (100 x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>Bawełna, pokrojona na kawałki</td><td></td><td></td> 1 cm x 3 cm <td>Autoklawowany</td></tr><tr><td>polietylenimin (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Rozcieńczony do 1% w wodzie klasy do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Rozcieńczyć do 0,1% w wodzie</td></tr> <tr><td>klasy hodowli komórkowejSterylny kolagen typu I typu 2O</td><td></td><td></td><td>Autoklawizowany DI H2O</td></tr><tr><td>typu I, rozpuszczony w 0,1% kwasie</td><td></td><td></td> octowym <td>Wyizolowany z ogonów szczurów, jak opisano w Rajan et. al. 2006 (ref #37)</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 30 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10x Media&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (sterylne)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Rozcieńczony do 1 N w wodzie klasy do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>HUVEC Lonza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa śródbłonka</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran z Leuconostoc spp. (70&nbsp; kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do napełniania żelem</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>18 G igła do napełniania</td><td>BD&nbsp;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 G Igła dozująca ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32 " ID, 3/32" OD Rurka silikonowa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16" Złączka rura-rura</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&deg; Złącza kolankowe, rura-rurka</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Luer Lock (żeńskie, 1/16" ID)</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze plastikowe, z uchwytami szczękowymi</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>Podwójna pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polistyrenowa rurka okrągłodenna</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>Analiza urządzenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-hCD31</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>1:25 rozcieńczenie robocze</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw czynnikowi von Willebranda sprzężone FITC</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>1:100 rozcieńczenie robocze</td></tr><tr><td>Kozioł przeciwciało anty-królicze 568 Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>A-11011</td><td>1:100 rozcieńczenie robocze</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Ponownie zawieszony w DMSO</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Do produkcji 0,2 M buforu kakodylowego</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa Dekstran sprzężony z FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><silne>Dodatkowe odczynniki do hodowli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>Małocząsteczkowy inhibitor GSK-3</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany bFGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels 

Platformy in vitro do badania komórek śródbłonka i biologii naczyniowej są w dużej mierze ograniczone do hodowli komórek śródbłonka 2D, komór przepływowych z substratami na bazie polimeru lub szkła oraz testów tworzenia probówek na bazie hydrożelu. Testy te, choć pouczające, nie podsumowują geometrii światła, właściwej macierzy zewnątrzkomórkowej i bliskości wielokomórkowej, które odgrywają kluczową rolę w modulowaniu funkcji naczyń krwionośnych. Manuskrypt ten opisuje metodę formowania wtryskowego w celu wytworzenia naczyń inżynieryjnych o średnicach rzędu 100 μm. Mikronaczynia są wytwarzane przez wysiewanie komórek śródbłonka w kanale mikroprzepływowym osadzonym w natywnym hydrożelu kolagenowym typu I. Poprzez włączenie komórek miąższowych do macierzy kolagenowej przed utworzeniem kanału, można modelować i badać określone mikrośrodowiska tkankowe. Dodatkowe modulacje właściwości hydrodynamicznych i składu pożywki pozwalają na kontrolę złożonej funkcji naczyń krwionośnych w pożądanym mikrośrodowisku. Platforma ta pozwala na badanie rekrutacji komórek okołonaczyniowych, interakcji krew-śródbłonek, odpowiedzi przepływu i interakcji tkankowo-mikronaczyniowych. Zmodyfikowane mikronaczynia oferują możliwość izolowania wpływu od poszczególnych składników niszy naczyniowej i precyzyjnego kontrolowania jej właściwości chemicznych, mechanicznych i biologicznych w celu badania biologii naczyń krwionośnych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Inżynieryjna platforma naczyniowa tworzy funkcjonalne mikro naczynia krwionośne osadzone w naturalnej macierzy kolagenu typu I i pozwala na ścisłą kontrolę środowiska komórkowego, biofizycznego i biochemicznego in vitro. Aby wytworzyć inżynieryjne mikronaczynia, ludzkie komórki endotelialne żyły pępowinowej (HUVECs) są przepływane przez osadzony w kolagenie układ mikrofluidyczny, gdzie przywierają, tworząc drożny światło naczynia i zlewne endotelium. Jak pokazano na Rysun...

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ogólnym celem wykorzystania inżynieryjnych mikonaczyń jest odtworzenie struktury i funkcji naczyń w organizmie w celu badania fizjologii naczyniowej w stanach prawidłowych i chorobowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii naczyniowej, takie jak sposób, w jaki różne komórki anathema reagują na przepływ, jak wpływają one na funkcję tkanki oraz w jaki sposób choroby naczyniowe inicjują się i postępują w czasie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej łatwej modyfikacji w celu naśladowania różnych układów organów i stanów chorobowych.Można to osiągnąć poprzez zmianę typów komórek, składu macierzy i pożywek oraz innych zmiennych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, zanim uświadomią sobie powszechne błędy, które mogą prowadzić do niskiej jakości naczyń. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ istnieje kilka sposobów na skuteczną fabrykację podczas etapów wtryskiwania i montażu.Przed przystąpieniem do tej procedury należy wcześniej przygotować płaskie i mikrowzorowane formy z PDMS oraz elementy obudowy z PMMA. Opis sposobu wykonania tych części znajduje się w protokole tekstowym. Formy z PDMS należy wysterylizować w autoklawie wraz ze śrubami, pinami, pęsetą i szpatułką.Nie należy autoklawować elementów z PMMA. Muszą one zostać wysterylizowane w roztworze wybielacza pod dygestorium. Po namoczeniu elementów z PMMA w wybielaczu przez co najmniej godzinę, należy dwukrotnie wypłukać wybielacz wodą autoklawowaną.Następnie umieść elementy w sterylnych naczyniach. Odessij nadmiar wody i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu. Po oczyszczeniu wszystkich elementów rozpocznij procedurę od potraktowania wewnętrznych otworów obu elementów PMMA (górnego i dolnego) za pomocą przenośnego urządzenia do plazmowania przez około jedną minutę.Wyłącz światło, aby ułatwić wizualizację stopnia pokrycia po obróbce plazmą. Następnie dodaj 1% PEI do wewnętrznych otworów. Jeśli PEI nie rozprowadza się łatwo, wydłuż czas obróbki plazmą.Po pozostawieniu PEI do reakcji przez 10 minut, należy usunąć roztwór, a następnie wypłukać urządzenia wodą sterylną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu na przetworzone powierzchnie należy nanieść 0,1% glutaraldehydu i pozostawić go do reakcji na pół godziny. Następnie elementy należy dwukrotnie wypłukać wodą sterylną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.Następnie przygotuj świeży 0,75% zneutralizowany kolagen do wytwarzania naczyń, łącząc wcześniej odmierzoną objętość kolagenu z roztworem neutralizującym składającym się z pożywki i wodorotlenku sodu. Mieszaj powoli i ostrożnie szpatułką, aż roztwór stanie się jednorodny i nabierze pomarańczowego koloru. Następnie, w razie potrzeby, dodaj komórki w pożądanym stężeniu i kontynuuj mieszanie roztworu, aż komórki zostaną równomiernie rozmieszczone.W przygotowaniu do procesu montażu umieść mikrostrukturyzowaną formę z PDMS w szalce o wymiarach 100 na 20 mm i poddaj formę działaniu plazmy przez jedną minutę. Następnie wyrównaj górny element z PMMA względem PDMS tak, aby kwadratowe zbiorniki pokrywały się ze zbiornikami wlotowym i wylotowym. Potem włóż stalowe bolce ustalające do otworów zbiornika wlotowego i wylotowego, aby pozostały one otwarte po wstrzyknięciu kolagenu.Następnie należy pobrać mieszaninę komórek z kolagenem do strzykawki o pojemności 1 ml, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie, używając pęsety, należy delikatnie docisnąć górny element z PMMA, aby przymocować go do formy z PDMS, i powoli wstrzyknąć około 0,5 ml mieszaniny komórek z kolagenem przez port wtryskowy. Kolagen musi wypełnić obszar o wymiarach 20 by 20 mm nad wzorem i nie może wyciekać na zewnątrz.Następnie ostrożnie zamknij szalkę, uważając, aby nie poruszyć bolców pozycjonujących. Dalej, w dolnej części PMMA w wewnętrznej studni umieść szklaną lamellkę o wymiarach 22 mm². Następnie rozprowadź równomiernie około 0,25 ml kolagenu na szkle.Uzupełnij dolną połowę, delikatnie opuszczając płaski PDMS do kolagenu, tak aby przylegał płasko do PMMA, bez pęcherzyków powietrza pomiędzy nimi. Następnie ostrożnie umieść obie połowy urządzenia w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostaw roztwór kolagenu do żelowania na 30 minut przed kontynuacją. Po żelowaniu dodaj odpowiednią ilość PBS, aby otoczyć PDMS na dolnej części.Następnie za pomocą pęsety usuń nadmiar kolagenu z krawędzi i powoli odklej płaski element PDMS, dbając o to, aby kolagen pozostał nawilżony za pomocą PBS. Aby przygotować górny element, użyj pęsety, aby podnieść zespół PMMA i PDMS i odwrócić go. Następnie dodaj kilka kropli PBS na wewnętrzną powierzchnię i usuń formę PDMS z górnego elementu PMMA, odklejając ją szybko i zdecydowanie.Następnie, używając drugiej pary pęsety, ostrożnie wyjmij piny z drugiej strony obudowy z PMMA. Przed ich wyjęciem przesuń piny w górę i w dół, aby upewnić się, że wlot i wylot są wolne od nadmiaru kolagenu. Jeśli piny wypadną same, użyj innego sterylnego pinu ustalającego, aby upewnić się, że wlot i wylot są drożne.Następnie nanieś więcej PBS na mikrowzorowany kolagen, odwróć element i umieść śruby w czterech otworach narożnych. Teraz ostrożnie połóż górny element na dolnym, dopasowując śruby do otworów. Nie dopuść do przesuwania się obu elementów względem siebie.Następnie delikatnie skręć elementy za pomocą szpatułki, robiąc to z wyczuciem, aby nie dokręcić ich zbyt mocno. Podczas montażu kluczowe jest zachowanie ostrożności i precyzji. Zastosowanie odpowiedniej ilości PBS zmniejsza tarcie między wewnętrznymi powierzchniami.Podczas dokręcania śrub należy robić to powoli i przestać natychmiast po napotkaniu jakiegokolwiek oporu. Następnie należy odessać PBS otaczający powierzchnie PMMA i umieścić mały kawałek waty pod jedną krawędzią urządzenia. Na koniec należy odessać cały PBS z rezerwuarów.Następnie należy ponownie napełnić zbiorniki pożywką do hodowli komórkowej i inkubować urządzenie przez co najmniej godzinę w celu żelowania. Po złożeniu urządzenia, do zasiedlenia zastosować zawiesinę komórek śródbłonka o stężeniu 10 milionów komórek na mililitr. Usunąć pożywkę ze zbiorników wlotowego i wylotowego, a następnie za pomocą pipety 20 µL z końcówkami do nakładania żelu dodać 10 µL zawiesiny komórek do środka zbiornika wlotowego.Komórki natychmiast wpłyną do sieci i ją pokryją. Po wypełnieniu sieci przez komórki i wyrównaniu przepływu, należy dodać 150 µL pożywki do obu zbiorników. Następnie inkubować urządzenie przez godzinę lub dłużej, aby komórki mogły się rozprzestronić i przytwierdzić.W przypadku hodowli długoterminowej należy usuwać medium co 12 godzin i dodawać 150 µl świeżego medium do zbiornika wlotowego oraz 50 µl do zbiornika wylotowego. Po 24 godzinach hodowli można zastosować pompę strzykawkową w celu ustanowienia warunków przepływu ciągłego. Po przeniesieniu materiałów do dygestorium należy wyjąć rurki z worków do autoklawowania i umieścić je w naczyniu.Następnie należy przygotować sterylną komorę przepływową, wytapiając otwory boczne, a następnie przeciągając przez nie rurki. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z pożywką hodowlaną zawierającą 3,5% dekstranu. Następnie wypełnioną strzykawkę należy przymocować do złącza Luer-lock na końcu rurki doprowadzającej.Następnie przymocuj strzykawkę do pompy i przepływaj pożywkę, aż wszystkie uwięzione pęcherzyki powietrza zostaną usunięte z drenu. Gdy dren zostanie wypełniony pożywką i będzie wolny od pęcherzyków, przenieś urządzenie do nowej szalki i włóż złącze wlotowe do wlotu obudowy. Następnie ustaw pompę strzykawkową na pożądany przepływ i rozpocznij perfuzję.Przygotuj wylot, wypełniając rurkę pożywką do hodowli komórek za pomocą igły o rozmiarze 18 G i strzykawki o pojemności 1 ml. Następnie zaklemuj rurkę i usuń igłę. Potem, za pomocą lutownicy, wypal otwór w zakrętce probówki do zbierania wylotu.Następnie do probówki zbiorczej należy dodać pożywkę, włożyć rurkę i przymocować złączkę do wylotu obudowy. Przez cały czas trwania tego procesu stosuje się zacisk w celu zatrzymania pożywki w rurce. Po zakończeniu tych czynności cały układ należy przenieść do inkubatora.W zależności od warunków eksperymentalnych, strzykawkę może być konieczne napełnić ponownie po 24 do 36 godzinach. Podczas wymiany strzykawki należy upewnić się, że do cewki nie dostały się pęcherzyki powietrza. Komórki żylne i nabłonkowe pępowiny człowieka były perfundowane przez mikrofluidyczną sieć zatopioną w kolagenie w celu utworzenia drożnego światła i zlewnego endotelium.W celu ustanowienia różnych warunków przepływu zastosowano kilka geometrii naczyń. Warunki hodowli w przepływie ciągłym wykorzystano do przyłożenia stałego naprężenia ścinającego do endotelium. Urządzenia inkubowane w warunkach przepływu grawitacyjnego również zachowały długoterminową żywotność i drożność.Kluczową cechą tych mikronaczyń jest ich zdolność do reagowania na bodźce zapalne. Zbadano to poprzez perfuzję mikronaczyń pełną krwią. Mikronaczynia niestymulowane zawierały nieaktywne śródbłonie i pozostawały w stanie spoczynku.Stymulowane mikonaczynia uległy aktywacji, a ich odpowiedź zainicjowała tworzenie zakrzepów. Innym interesującym zastosowaniem systemu jest badanie zmian fenotypowych w układzie naczyniowym powstałym z różnych populacji komórek śródbłonka. Na przykład mikonaczynia utworzone z unikalnych populacji komórek macierzystych wykazały odmienne zdolności do angiogennego kiełkowania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać mikonaczynia oraz jak wykorzystywać je do badania biologii naczyniowej i budowania złożonych modelowych systemów organowych. Podczas próby przeprowadzenia tej procedury należy pamiętać, że praktyka zwiększy odsetek pomyślnego formowania naczyń i pozwoli na uzyskanie bardziej spójnych wyników. Po opanowaniu tej techniki, w ciągu trzech do czterech godzin można wykonać kilka urządzeń.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak perfuzja krwi pełnej, podanie dekstranu lub leczenie farmakologiczne, w celu oceny stanu spoczynku śródbłonka, przepuszczalności, odpowiedzi na leki oraz ogólnej morfologii komórek i naczyń.

micropatterning-and-assembly-of-3d-microvessels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Proces waporyzacji składnika ofiarnego (VaSC) jest używany do wytwarzania struktur mikronaczyniowych. Ta procedura wykorzystuje protektorowe włókna kwasu poli(mlekowego) do tworzenia pustych mikrokanalików z precyzyjnym pozycjonowaniem geometrycznym 3D zapewnianym przez laserowo obrabiane mikroobrabiane płytki prowadzące.

Proces wytwarzania trójwymiarowych mikrostruktur z wykorzystaniem parowania składnika protektorowego

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Tutaj demonstrujemy prostą metodę produkcji mikrokropelek o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, typu woda w oleju (W/O) za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Metoda ta wymaga jedynie niewielkiej objętości próbki i umożliwia produkcję o wysokiej wydajności. Spodziewamy się, że ta metoda będzie przydatna do szybkich analiz biochemicznych i komórkowych.

Kapilarne odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do formowania mikrokropel monodyspersyjnych o kontrolowanej wielkości

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Poznaj metodę wtryskowego formowania mikronaczyń 3D do badania fizjologii naczyń krwionośnych w stanach fizjologicznych i chorobowych. Technika umożliwia tworzenie spersonalizowanych sieci naczyniowych.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Przeglądaj więcej filmów