Mikromodelowanie i montaż mikronaczyń 3D

Ogólnym celem wykorzystania zmodyfikowanych mikronaczyń jest odtworzenie struktury i funkcji naczyń w organizmie w celu zbadania fizjologii naczyń krwionośnych w stanach normalnych i chorobowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej, takie jak to, jak różne komórki anatemy reagują na przepływ, jak wpływają na funkcję tkanek oraz jak choroby naczyniowe inicjują się i postępują w czasie. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo modyfikować, aby naśladować różne układy narządów i stany chorobowe.

Można to zrobić, zmieniając typy komórek, skład macierzy i mediów oraz inne zmienne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą mieć problemy, zanim zdadzą sobie sprawę z typowych błędów, które mogą prowadzić do złej jakości statku. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje kilka sztuczek prowadzących do udanej produkcji na etapach formowania wtryskowego i montażu.

Do tej procedury należy wcześniej przygotować płaskie i mikrowzorzyste formy PDMS oraz elementy obudowy PMMA. Opis sposobu wykonania tych części znajduje się w protokole tekstowym. Autoklaw formy PDMS wraz ze, szpilkami, kleszczami i szpatułką.

Nie sterylizuj kawałków PMMA w autoklawie. Muszą być wysterylizowane w wybielaczu pod kapturem. Po pozostawieniu kawałków PMMA do namoczenia w wybielaczu przez co najmniej godzinę, spłucz wybielacz dwukrotnie wodą z autoklawu.

Następnie umieść kawałki w sterylnych naczyniach. Odessaj nadmiar wody i pozwól im wyschnąć na powietrzu. Po oczyszczeniu wszystkiego rozpocznij protokół od obróbki wewnętrznych studzienek zarówno górnych, jak i dolnych kawałków PMMA za pomocą ręcznej obróbki plazmowej przez około jedną minutę.

Wyłącz światło, aby pomóc w wizualizacji pokrycia leczenia plazmą. Następnie dodaj 1% PEI do wewnętrznych dołków. Jeśli PEI nie rozprzestrzenia się łatwo, wydłuż czas obróbki plazmowej.

Po pozostawieniu PEI na reakcję przez 10 minut, usuń roztwór, a następnie spłucz urządzenia sterylną wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu nałóż 0,1% aldehydu glutarowego na obrabiane powierzchnie i pozwól aldehydowi glutarowemu reagować przez pół godziny. Następnie dwukrotnie spłucz kawałki sterylną wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Teraz przygotuj świeży 0,75% zneutralizowany kolagen do produkcji naczyń, łącząc wstępnie przydzieloną objętość kolagenu wyjściowego z roztworem neutralizującym pożywki i wodorotlenku sodu. Mieszaj powoli i ostrożnie szpatułką, aż roztwór będzie jednorodny i będzie miał pomarańczowy kolor. Następnie, jeśli to konieczne, dodaj komórki o pożądanym stężeniu i kontynuuj mieszanie roztworu, aż komórki zostaną równomiernie rozłożone.

Przygotowując się do procesu montażu, umieść formę PDMS z mikrowzorem w naczyniu o wymiarach 100 na 20 milimetrów i traktuj formę plazmą przez jedną minutę. Następnie wyrównaj górny element PMMA z PDMS tak, aby kwadratowe zbiorniki pokrywały się ze zbiornikami wlotowymi i wylotowymi. Następnie włóż kołki ustalające ze stali nierdzewnej do otworów zbiornika wlotowego i wylotowego, aby pozostały otwarte po wstrzyknięciu kolagenu.

Teraz załaduj mieszaninę komórek kolagenowych do jednomililitrowej strzykawki bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie dociśnij górny kawałek PMMA, aby przymocować go do formy PDMS i powoli wstrzyknij około pół mililitra mieszanki komórek kolagenowych do portu iniekcyjnego. Kolagen musi wypełniać obszar o wymiarach 20 na 20 milimetrów nad wzorem i nie

Następnie ostrożnie zamknij naczynie, nie popychając kołków ustalających. Następnie w dolnym kawałku PMMA umieść szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 milimetrów kwadratowych w wewnętrznej studzience. Następnie równomiernie nałóż około 0,25 mililitra kolagenu na szklankę.

Uzupełnij dolną połowę, delikatnie opuszczając płaski PDMS do kolagenu, tak aby przylegał płasko do PMMA, bez pęcherzyków powietrza pomiędzy nimi. Teraz ostrożnie umieść obie połówki urządzenia w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól roztworowi kolagenu żelować przez 30 minut przed kontynuowaniem. Po żelowaniu dodaj tyle PBS, aby otoczyć PDMS na dolnej części.

Następnie użyj kleszczyków, aby usunąć nadmiar kolagenu wokół krawędzi i powoli oderwij płaski kawałek PDMS, utrzymując kolagen nawilżony PBS. Aby przygotować górną część, użyj kleszczy, aby podnieść zespół PMMA i PDMS i odwrócić go. Następnie dodaj kilka kropli PBS do wewnętrznej powierzchni i usuń formę PDMS z górnego kawałka PMMA, obierając szybko i mocno.

Następnie za pomocą drugiej pary kleszczyków delikatnie wyjmij kołki z drugiej strony obudowy PMMA. Upewnij się, że wlot i wylot są wolne od nadmiaru kolagenu, przesuwając kołki w górę iw dół przed ich usunięciem. Jeśli kołki same wypadną, po prostu użyj innego sterylnego kołka ustalającego, aby upewnić się, że wlot i wylot są czyste.

Następnie upuść więcej PBS na mikrowzorzysty kolagen, odwróć kawałek i umieść w czterech rogowych otworach. Teraz delikatnie połóż górną część na dolnej części, wyrównując w ich otworach. Nie pozwól, aby dwa elementy ślizgały się po sobie.

Następnie delikatnie skręć ze sobą elementy za pomocą szpatułki i delikatnego dotyku, aby nie zostały zbyt mocno dokręcone. Bardzo ważne jest, aby podczas montażu zachować delikatność i precyzję. Dzięki zastosowaniu dużej ilości PBS zmniejsza się tarcie między wewnętrzną powierzchnią.

Dokręcając, postępuj powoli i zatrzymaj się, gdy tylko napotkasz jakikolwiek opór. Następnie zassaj PBS otaczający powierzchnie PMMA i umieść mały kawałek bawełny pod jedną krawędzią urządzenia. Następnie odessać PBS ze zbiorników.

Teraz napełnij zbiorniki pożywką do hodowli komórkowych i inkubuj urządzenie przez co najmniej godzinę w celu żelowania. Po zmontowaniu urządzenia użyj zawiesiny komórek śródbłonka o stężeniu 10 milionów komórek na mililitr, aby zasiać urządzenie. Usuń pożywkę ze zbiorników wlotowych i wylotowych i za pomocą pipety 20 mikroletów z końcówkami do ładowania żelem dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do środka zbiornika wlotowego.

Komórki natychmiast wpłyną do sieci i pokryją ją. Gdy komórki wypełnią sieć, a przepływ się zrównoważy, dodaj 150 mikrolitrów pożywki do obu zbiorników. Następnie inkubuj urządzenie przez godzinę lub dłużej, aby komórki mogły się rozprzestrzenić i przyczepić.

W przypadku hodowli długoterminowej należy usuwać pożywkę co 12 godzin i dodawać z powrotem 150 mikrolitrów świeżej pożywki do zbiornika wlotowego i 50 mikrolitrów do zbiornika wylotowego. Po 24 godzinach hodowli można użyć pompy strzykawkowej do ustalenia warunków ciągłego przepływu. Po przyniesieniu materiałów do okapu biologicznego wyjmij rurki z worków autoklawu i umieść je w naczyniu.

Następnie przygotuj sterylne naczynie przepływowe, topiąc boczne otwory, a następnie przewlekając przez nie rurkę. Przygotować 10-mililitrową strzykawkę z pożywką hodowlaną zawierającą 3,5% dekstranu. Następnie przymocuj napełnioną strzykawkę do zamka przynęty na końcu rurki doprowadzającej.

Następnie przymocuj strzykawkę do pompy i obfitego pożywki, aż wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza opuszczą rurkę. Gdy rurka zostanie napełniona medium i oczyści się z pęcherzyków, przenieś urządzenie do nowego naczynia i włóż złącze wlotowe do wlotu obudowy. Następnie ustaw pompę strzykawkową na żądane natężenie przepływu i rozpocznij obfitowanie.

Przygotuj ujście, wypełniając rurkę pożywką do hodowli komórkowych za pomocą igły o rozmiarze 18 i strzykawki o pojemności jednego mililitra. Zaciśnięcie go i wyjęcie igły. Następnie stopić otwór w nasadce rurki zbiorczej za pomocą lutownicy.

Następnie dodaj media do rurki zbiorczej, włóż rurkę i przymocuj złącze do wylotu obudowy. W trakcie tego procesu stosuje się zacisk, który utrzymuje medium w rurce. Po zakończeniu przenieś całą konfigurację do inkubatora.

W zależności od warunków doświadczalnych, może być konieczne ponowne napełnienie strzykawki po 24 do 36 godzinach. Podczas wymiany strzykawki należy upewnić się, że do rurki nie dostały się pęcherzyki powietrza. Ludzka żyła pępowinowa i komórki edeliczne zostały przepuszczone przez osadzoną w kolagenie sieć mikrofluidyczną, tworząc opatentowane światło i zlewający się śródbłonek.

Wykorzystano kilka geometrii zbiorników w celu ustalenia różnych warunków przepływu. Zastosowano warunki hodowli z ciągłym przepływem, aby przyłożyć stałe naprężenie ścinające na śródbłonek. Urządzenia hodowane w warunkach przepływu napędzanego grawitacyjnie również utrzymywały długoterminową żywotność i drożność.

Kluczową cechą tych mikronaczyń jest ich zdolność do reagowania na bodźce zapalne. Badano to poprzez obfite napełnianie mikronaczyń krwią pełną. Niestymulowane mikronaczynia zawierały nieaktywowany śródbłonek i pozostawały w stanie spoczynku.

Pobudzone mikronaczynia zostały aktywowane, a ich odpowiedź zainicjowała tworzenie się skrzepliny. Innym interesującym zastosowaniem systemu jest badanie zmian fenotypowych w unaczynieniu utworzonym z różnych populacji komórek śródbłonka. Na przykład mikronaczynia utworzone z unikalnych populacji komórek macierzystych wykazywały różne zdolności kiełkowania angiogennego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać mikronaczynia i używać ich do badania biologii naczyń krwionośnych i budowania złożonych układów narządów. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że praktyka poprawi się wraz z szybkością pomyślnego tworzenia naczyń i pozwoli na uzyskanie bardziej spójnych wyników. Po opanowaniu można wykonać kilka urządzeń w ciągu trzech do czterech godzin.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obfitość krwi pełnej, dekstran lub zabiegi farmaceutyczne, aby ocenić spoczynek śródbłonka, przepuszczalność, odpowiedź na lek oraz ogólną morfologię komórek i naczyń.