Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych
13 września 2016
Dokładna ocena efektów przeciwzapalnych ma ogromne znaczenie dla oceny potencjalnych nowych leków do leczenia nieswoistych zapaleń jelit. Cyfrowa mikroskopia holograficzna umożliwia ocenę stanu zapalnego w próbkach tkanki mysiej i ludzkiej okrężnicy, a także zautomatyzowaną multimodalną ocenę gojenia się ran nabłonkowych in vitro.
Ogólnym celem tego badania jest wykorzystanie cyfrowej mikroskopii holograficznej lub DHM w celu zapewnienia zautomatyzowanego, wolnego od plam, ilościowego obrazowania z kontrastem fazowym próbek tkanki okrężnicy z zapalenia jelit do multimodalnej oceny gojenia się ran nabłonkowych in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu zapalenia przewodu pokarmowego i gojenia się ran na temat aktywności choroby w stanach zapalnych u ludzi i w środowisku morskim Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wykrywanie i kwantyfikację komórek i tkanek za pomocą parametrów fizycznych w sposób wolny od plam i obiektywny. Procedury zademonstruje technik Fittest Ketelhut z Centrum Technologii Biomedycznych.
Ustaw hodowlę komórkową, inkubuj cztery razy dziesięć do piątej, Caco dwie komórki na centymetr kwadratowy na 35-milimetrowych szalkach Petriego wyposażone w wkładki do wysokiej kultury w pożywce RPMI uzupełnionej FBS i antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 95% i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po dwóch dniach potraktuj komórki interesującym Cię środkiem i zwróć kultury do inkubatora na dodatkowe 24 godziny. Następnego dnia odessać supernatant i użyć pęsety, aby usunąć wkładki.
Przemyj kulturę jeden do dwóch razy jednym mililitrem buforowanej pożywki HEPES z hodowli komórkowej, aby usunąć wszelkie martwe komórki i wszelkie pozostałe składniki komórkowe z obszaru rany. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki buforowej HEPES i zamknij naczynie. Teraz umieść szalkę Petriego w cyfrowym mikroskopie holograficznym i wybierz obiektyw 10x.
Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i wybierz tryb obrazowania w jasnym polu. Ustaw komorę grzewczą na 37 stopni Celsjusza i umieść kulturę w komorze grzewczej. Następnie przesuwaj pole widzenia, aż w oknie monitorowania na żywo będzie można zobaczyć odpowiednią ranę z pojedynczą warstwą ogromnych komórek i prostymi obwódkami po obu stronach, bez martwych komórek lub surowicy.
Uchwyć obraz w świetle białym początkowego obszaru rany. Następnie wyłącz podświetlenie światłem białym i wybierz tryb cyfrowej mikroskopii holograficznej. Włącz oświetlenie laserowe i wybierz czas naświetlania krótszy niż trzy milisekundy dla zapisu hologramu.
Jeśli holograficzne prążki interferencyjne poza dostępem pojawiają się z odpowiednim kontrastem, należy pobrać próbkę hologramu i zrekonstruować ilościowy obraz fazowy za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji, aby sprawdzić jakość obrazu. Następnie należy rozpocząć poklatkową obserwację DHM rany, zatrzymując zapis w odpowiednim punkcie końcowym i uzyskać końcowy obraz próbki w świetle białym. W przypadku ostrego siarczanu sodu dekstranu lub indukcji zapalenia jelita grubego DSS, należy podać myszom ablibidim trzy gramy DSS rozpuszczonego w 100 mililitrach autoklawowanej wody.
Po siedmiu dniach należy pobrać odcinki o grubości siedmiu mikrometrów szwajcarskich próbek okrężnicy z walcowanej okrężnicy od zwierząt kontrolnych i leczonych. Zanurz każdą sekcję w 50 do 100 mikrolitrach PBS i przykryj próbki indywidualnymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Upewnij się, że dna prowadnic są wolne od kurzu i innych zanieczyszczeń.
Następnie umieść pierwsze szkiełko na stoliku mikroskopu i dostosuj pole widzenia, aż obszar zainteresowania tkanką będzie widoczny. Ustaw ostrość próbki i uchwyć obraz w jasnym polu w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Następnie wybierz tryb obrazowania DHM i przełącz się na podświetlenie światłem laserowym.
Ustaw czas ekspozycji poniżej trzech milisekund i upewnij się, że holograficzne prążki zakłóceń poza dostępem są wyświetlane z odpowiednim kontrastem w oknie obrazowania na żywo. Następnie uchwyć cyfrowy hologram tkanki. Endoskopowo dowody umiarkowanego do ciężkiego zapalenia jelita grubego obejmują pogrubienie ściany okrężnicy, zmiany wzoru naczyniowego, niedobory włókien i ziarnistość powierzchni błony śluzowej.
Konwencjonalna ocena histologiczna odcinków okrężnicy ujawnia wyraźny obrzęk ściany okrężnicy u DSS leczonego w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, zlokalizowanymi głównie w błonie podśluzowej. Odpowiednie ilościowe obrazy kontrastu fazowego DHM i związane z nimi mapy indeksu refrakcji również pokazują, że te zmiany tkankowe bez widocznych różnic w gęstości nabłonkowej menstromy są szczególnie widoczne w natywnych próbkach tkanek niebarwionych. Współczynnik załamania światła jest znacznie obniżony w nabłonku, błonie podśluzówkowej i zrębie myszy z colitem w porównaniu ze zdrowymi kontrolami, z istotną korelacją między względną utratą masy ciała a współczynnikiem załamania światła u zwierząt doświadczalnych.
Pokazano tutaj reprezentatywne ciągłe monitorowanie procesu gojenia się ran za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej przez 45 godzin. Umożliwienie obliczeń powierzchni pokrytej komórką, średniej grubości komórki i suchej masy komórkowej w trakcie procesu gojenia. Wykazaliśmy, że DHM umożliwia ciągłe monitorowanie gojenia się ran nabłonkowych, jednocześnie dostarczając informacji biologicznych o zmianach komórkowych wywołanych cytokinami.
Ponadto wykazujemy dokładną ocenę uszkodzeń histologicznych w modelach zapalenia jelita grubego i próbkach tkanki jelita grubego człowieka za pomocą DHM poprzez pomiar zmian indeksu refrakcji. Ponieważ DHM opiera się na wykrywaniu opóźnień długości ścieżki optycznej, bezwzględne parametry biofizyczne, takie jak gęstość tkanki, sucha masa lub grubość komórki, mogą być analizowane za pomocą bezplamnego ilościowego obrazowania z kontrastem fazowym. Kulminacja DHM z powszechnymi mikroskopami badawczymi i solidność tej techniki toruje drogę do rutynowych zastosowań tej metody w biologii komórki i patologii cyfrowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać cyfrowej mikroskopii holograficznej do analizy tkanek żywych kultur komórkowych w środowisku laboratorium biomedycznego. Podsumowując, DHM tworzy cenne, nowatorskie i ilościowe narzędzie do oceny bezwzględnych parametrów stanu zapalnego, a także do uproszczonej kwantyfikacji nabłonka dobrowolnie in vitro o wysokim potencjale do translacyjnego zastosowania diagnostycznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano cyfrową mikroskopię holograficzną (DHM) do zautomatyzowanego, bejobarwnikowego obrazowania ilościowego stanu zapalnego jelit w próbkach tkanki okrężnicy. Metoda ta ma na celu usprawnienie oceny gojenia ran nabłonkowych in vitro, dostarczając informacji na temat zapalenia przewodu pokarmowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Gastrologia
Wprowadzenie
- Nieswoiste zapalenia jelit wymagają dokładnej oceny efektów przeciwzapalnych.
- DHM umożliwia obiektywne obrazowanie bez konieczności barwienia.
- Technika ta pozwala na skuteczną kwantyfikację parametrów komórkowych i tkankowych.
- Zrozumienie procesów zapalnych i gojenia ran jest kluczowe w badaniach nad układem pokarmowym.
Cel badania
- W celu oceny stanu zapalnego jelit w próbkach tkanki okrężnicy.
- W celu oceny gojenia ran nabłonkowych in vitro z wykorzystaniem DHM.
- W celu zapewnienia multimodalnego podejścia do badania zapaleń przewodu pokarmowego.
Zastosowane metody
- Cyfrowa mikroskopia holograficzna do obrazowania.
- Hodowla komórek Caco-2 w kontrolowanym środowisku.
- Traktowanie komórek odpowiednimi czynnikami po inkubacji.
- Zautomatyzowana analiza stanu zapalnego i gojenia ran.
Główne wyniki
- DHM skutecznie ilościowo określa poziom stanu zapalnego w tkankach mysich i ludzkich.
- Zautomatyzowane obrazowanie dostarcza obiektywnych danych na temat gojenia ran nabłonkowych.
- Metoda ta wykazuje potencjał w ocenie leków w zapaleniach jelit.
- Wyniki potwierdzają przydatność DHM w badaniach nad przewodem pokarmowym.
Wnioski
- Cyfrowa mikroskopia holograficzna jest cennym narzędziem do oceny stanu zapalnego jelit.
- Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie procesu gojenia ran nabłonkowych.
- DHM może wspomóc opracowywanie nowych metod leczenia nieswoistych zapaleń jelit.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM) zapewnia bezbarwną, ilościową obrazowanie kontrastu fazowego, które umożliwia obiektywną ocenę stanu zapalnego jelit oraz gojenia ran nabłonkowych bez naruszania integralności próbki. Zdolność ta wspomaga wczesną walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie poszukiwania leków na nieswoiste zapalenia jelit (IBD), dostarczając absolutnych parametrów biofizycznych, takich jak gęstość tkanki, masa sucha i grubość warstwy. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez zmniejszenie zmienności związanej z barwieniem i subiektywną interpretacją histologiczną, co w konsekwencji poprawia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do rozwoju przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację zmian współczynnika refrakcji jako bezpośredniego korelatu zmian gęstości tkanki w zapalnej tkance okrężnicy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia obiektywną, bezetykietową kwantyfikację zmian zapalnych w warstwach tkankowych, ograniczając zależność od zależnego od eksperta oceniania histologicznego.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu dzięki istotnej korelacji między przesunięciami współczynnika refrakcji a markerami aktywności choroby, takimi jak utrata masy ciała w modelach colitis.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie walidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez umożliwienie ciągłego, zautomatyzowanego monitorowania gojenia ran nabłonkowych in vitro.
- Wartość operacyjna: Pozwala na jednoczesne określenie powierzchni rany, suchej masy komórkowej oraz grubości warstwy, dostarczając wieloparametrycznych odczytów do przesiewowej analizy związków.
- Gotowość testu: Umożliwia skalowalną, powtarzalną kwantyfikację dynamiki gojenia w czasie, wspierając ponowne wykorzystanie platformy w ocenie związków przeciwzapalnych i regenerujących tkanki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykazuje zastosowanie zarówno w próbkach tkanek okrężnicy mysiej, jak i ludzkiej, co wzmacnia istotność w kontekście ludzkiej patofizjologii.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ilościowo określa zmiany w zrostach i nabłonku w modelach colitis bez konieczności barwienia, co umożliwia uzyskanie wglądu mechanistycznego w efekty działania leków na poziomie tkankowym.
- Zgodność przedkliniczna: Wspiera decyzje o postępie dostosowane do ryzyka, dostarczając ilościowych, powtarzalnych punktów końcowych dla procesów uszkodzeń histologicznych i gojenia ran.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
DHM integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do zapaleń przewodu pokarmowego oraz szlaków naprawy błony śluzowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie bezetykietowych zmian biofizycznych w gęstości tkanek i morfologii komórkowej podczas stanu zapalnego i gojenia.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu poklatkowemu procesu zamykania rany oraz jednoczesnemu pomiarowi masy suchej i grubości, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Generuje wyniki ilościowe, w tym mapy współczynnika załamania światła, gęstość tkanek, masę suchą i grubość warstw, co ułatwia obiektywne porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez wykazaną stosowność zarówno w modelach zapalenia jelit u myszy, jak i w próbkach tkanek ludzkich.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje DHM jako wielokrotnego użytku, kompatybilną z platformą funkcjonalność do bezetykietowego, ilościowego obrazowania w wielu modelach chorobowych i typach komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną dzięki bezbarwnemu, bezstainowemu ilościowemu określeniu parametrów biofizycznych, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach stanu zapalnego i gojenia ran.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność poprzez zautomatyzowane pozyskiwanie i analizę obrazów, minimalizując zmienność zależną od użytkownika.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając obiektywnych danych wieloparametrycznych, które redukują późnowykrywalne ryzyko biologiczne w rozwoju terapii IBD.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe histologiczne i funkcjonalne punkty końcowe gojenia ran.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie ilościowego obrazowania fazowego i cyfrowej rekonstrukcji holograficznej w celu dokładnej interpretacji danych.
- Zależność od aparatury zdolnej do rejestracji hologramów laserowych oraz oprogramowania do rekonstrukcji fazy z kontrolą środowiskową (np. komorą grzewczą).
- Konieczność standaryzacji protokołów obrazowania i potoków analitycznych pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójności danych między zespołami badawczymi a przedklinicznymi.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu techniki w różnych systemach modelowych (np. jednowarstwy 2D vs. 3D przekroje tkankowe) przy jednoczesnym zachowaniu wierności ilościowej.
- Ograniczenia wynikające z pola widzenia i rozdzielczości podczas oceny dużych obszarów tkankowych, choć metoda ta jest odpowiednia do celowej analizy histologicznej i komórkowej, co wykazano w badaniach tkanki okrężnicy oraz testach gojenia ran.
