Name: Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj cyfrową mikroskopię holograficzną do ilościowej oceny stanu zapalnego jelit i gojenia się ran nabłonkowych in vitro. Ta bezbarwna metoda umożliwia automatyczną analizę parametrów komórkowych i tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Faekah Gohar za korektę manuskryptu. Dziękujemy Sonji Dufentester i Elke Weber za fachową pomoc techniczną.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez regionalną komisję etyki (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Niemcy) zgodnie z niemieckim prawem o ochronie zwierząt. Lokalna komisja bioetyczna Uniwersytetu w Münster zatwierdziła wykorzystanie tkanek ludzkich do analizy histologicznej i mikroskopowej.
1. Zwierzęta i materiały
<ol>
	<li>Używaj samic lub samców myszy z wymaganego szczepu podatnego na DSS, które ważą od 20 do 25 g, i trzymaj je zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zapewnij specjalną karmę dla gryzoni i autoklawowaną wodę pitną ad libitum.</li>
	<li>Wywołaj ostre zapalenie jelita grubego DSS, podając 3% w/v siarczanu dekstranu sodu (DSS, masa cząsteczkowa: 36 000-50 000 Da) w autoklawowanej wodzie z kranu przez 5 dni. 
	nuta: Siła działania DSS jest bardzo zmienna w zależności od producenta i partii. Najpierw przetestuj DSS dostarczony przez dostawcę pod kątem indukcji aktywności choroby, dla której dzienna masa ciała jest wiarygodnym i obiektywnym wskaźnikiem.</li>
	<li>W celu oceny histologicznej próbek tkanki okrężnicy, należy poddać myszy eutanazji przez wdmuchiwanie CO2 (lub zgodnie z wytycznymi krajowymi i instytucjonalnymi) pod koniec eksperymentu.</li>
</ol>
2. Eksperymentalna konfiguracja do testów DSS-zapalenie jelita grubego i gojenie ran in vitro 
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i ustalenie testu gojenia się ran.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki Caco-2 w środowisku o wilgotności 95% i 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Użyj pożywki RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
		<li>Nasiona komórek Caco-2 o gęstości 4 x 105 komórek/cm2 na 35 mm szalkach Petriego z wkładką do hodowli (patrz rysunek 4A). 
		nuta: Wkładka generuje dwa obszary pokryte komórkami, które są oddzielone zdefiniowaną wolną przestrzenią komórkową reprezentującą zraniony obszar, który ma być analizowany.</li>
		<li>Zmień podłoże dwa dni po wysianiu. Wykonać poprzez zasysanie pozostałej pożywki z resztkami komórek za pomocą pipety automatycznej, przepłukać 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać świeżą pożywkę RPMI lub pożywkę pozbawioną surowicy.</li>
		<li>Hodowla komórek przez 24 godziny w pożywce pozbawionej surowicy (0,1% FBS) uzupełniona surowicą 20 ng EGF / ml lub 2 μg mitomycyny c / ml surowicy w celu wykrycia zmian w gojeniu się ran. Dodaj normalną pożywkę RPMI do komórek kontrolnych na 24 godziny.</li>
		<li>Po 24 godzinach hodowli należy usunąć i wyrzucić wkładki hodowlane zgodnie z opisem w kroku 3.4 i wykonać DHM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja ostrego zapalenia jelita grubego DSS
	<ol>
		<li>Rozpuść 3 g DSS w 100 ml autoklawowanej wody, aby uzyskać 3% (w/v) roztwór DSS. Podawaj ten roztwór zamiast wody pitnej myszom ad libitum przez 7 dni. Obliczyć 5 ml roztworu DSS na mysz dziennie. Zapewnij wodę autoklawowaną bez DSS dla myszy kontrolnych ad libitum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie skriostatycznych przekrojów jelita grubego u myszy i człowieka
	<ol>
		<li>Eutanazja myszy przez wdmuchiwanie CO2 pod koniec eksperymentu.</li>
		<li>Wypreparuj brzuch zwierząt przez laparotomię23. Ostrożnie usuń całą okrężnicę za pomocą pęsety i odetnij koniec jelita krętego i odbytnicy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przetnij okrężnicę nożyczkami wzdłuż od jelita ślepego do końca odbytnicy i otwórz okrężnicę. Usuń cały kał z próbki za pomocą pęsety, a następnie przemyj PBS24.</li>
		<li>Przygotuj bułeczki szwajcarskie, zwijając całą okrężnicę wacikiem wzdłużnie od jelita ślepego do końca odbytnicy z błoną śluzową zakrzywioną do wewnątrz. Próbki okrężnicy należy zatopić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Osadź ludzką tkankę okrężnicy z próbki chirurgicznej w optymalnej temperaturze cięcia związku OCT i przechowuj w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.</li>
		<li>Wyciąć odcinki o grubości 7 μm próbek zatopionych w związku OCT za pomocą kriotomu tuż przed badaniem. 
		UWAGA: Optymalna grubość próbki zależy od trwałości i właściwości rozpraszania badanego typu tkanki. W opisanych eksperymentach z wykorzystaniem tkanki jelita grubego grubość warstwy &gt; 10 μm powoduje znaczny wzrost szumu z powodu rozpraszania światła w ilościowych obrazach kontrastu fazowego DHM, podczas gdy próbki o grubości &lt; 5 μm wykazują większe ryzyko artefaktów wywołanych uszkodzeniem w procesie cięcia kriogenicznego.</li>
		<li>Przenieś sekcje na szkiełko nośne na szklane przedmioty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sprzęt techniczny, oprogramowanie i procedury do pozyskiwania i oceny hologramów cyfrowych
<ol>
	<li>Cyfrowy mikroskop holograficzny do ilościowego obrazowania komórek i tkanek
	<ol>
		<li>Użyj pozaosiowego cyfrowego systemu mikroskopii holograficznej Mach-Zehnder do obrazowania żywych komórek25, jak pokazano na rysunku 1. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w obiektyw mikroskopu 10X, stolik mikroskopowy z uchwytem na szkiełka podstawowe i szalki Petriego o średnicy 35 mm, komorę grzewczą do utrzymania temperatury fizjologicznej na poziomie 37 °C oraz oprogramowanie do ilościowego obrazowania fazowego25, 
		nuta: Na przykład, jak opisano w Kemper i wsp.26 oraz Langehanenberg i wsp.27. 
		nuta: Alternatywnie można użyć podobnego systemu, który jest w stanie wykonać mikroskopię jasnego pola i ilościowe obrazowanie fazowe żywych komórek i wypreparowanych preparatów tkankowych.</li>
		<li>Wyczyść soczewkę mikroskopu i kondensor papierem do czyszczenia soczewek i środkiem czyszczącym (np. etanolem) zgodnie z zaleceniami producenta mikroskopu w celu usunięcia kurzu lub innych zanieczyszczeń.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu mikroskopu DHM, wybierz tryb obrazowania "jasne pole" i włącz oświetlenie światłem białym. Upewnij się, że próbka jest oświetlona przez Köhlera zgodnie z zaleceniami producenta mikroskopu, obserwując próbkę w oknie obrazowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu (alternatywnie na tym etapie można użyć standardowego oprogramowania do akwizycji obrazu). 
		nuta: Intensywność obrazu powinna być równomiernie rozłożona w polu widzenia, a pozycja próbki nie powinna się przesuwać podczas optycznego ustawiania ostrości za pomocą napędu ostrości mikroskopu.</li>
		<li>Wybierz tryb obrazowania "DHM", wyłącz podświetlenie światłem białym i włącz światło lasera. Sprawdzić, czy oświetlenie światłem laserowym jest jednorodne (tj. czy natężenie światła jest jednorodnie rozłożone w oknie obrazowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazowania mikroskopu DHM) i zaobserwować, czy na przechwyconych obrazach (hologramy cyfrowe) pojawia się wzór prążków interferencyjnych poza osią z odpowiednim kontrastem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie skrawków kriostatu do obrazowania za pomocą DHM
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę (skręp kriostatu na szklanym nośniku o grubości 7 μm, jak opisano w ppkt 2.3) z zamrażarki. Rozmrażanie próbki przez około 5 minut w temperaturze pokojowej i w normalnej atmosferze.</li>
		<li>Dodać 50 - 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako pożywkę do zatapiania na wycinku tkanki za pomocą pipety, aż do całkowitego pokrycia buforem. Przykryć próbkę czystym szkiełkiem nakrywkowym (grubość szkła 170 μm). 
		UWAGA: Nadmierne suszenie może wywołać znaczące zmiany współczynnika załamania światła i właściwości rozpraszania próbki.</li>
		<li>Upewnij się, że spód szklanego nośnika i szkiełko nakrywkowe są oczyszczone z kurzu i innych zanieczyszczeń, które mogą powodować rozpraszanie światła. Próbka jest gotowa do badania za pomocą mikroskopii jasnego pola i DHM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe obrazowanie fazowe wycinków tkanek za pomocą DHM
	<ol>
		<li>Włącz cyfrowy mikroskop holograficzny, wybierz obiektyw mikroskopu 10X do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu mikroskopu DHM i wybierz tryb obrazowania jasnych plików.</li>
		<li>Umieść szkiełko tkankowe zgodnie z opisem w 2) w uchwycie szkiełka mikroskopowego, tak aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w stronę obiektywu mikroskopu.</li>
		<li>Włączyć "włączenie" oświetlenia jasnego pola mikroskopu DHM. Ustawić próbkę na stoliku mikroskopu i upewnić się, że obszar zainteresowania tkanki jest widoczny w oknie monitorowania na żywo. Popraw ostrość obrazu za pomocą napędu ostrości mikroskopu. 
		nuta: Oprócz obszaru zainteresowania, w polu widzenia powinien znajdować się również obszar szkiełka bez tkanki.</li>
		<li>Uchwyć obraz w jasnym polu ostro ostrej próbki za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu.</li>
		<li>Wybierz tryb obrazowania "DHM", wyłącz podświetlenie światłem białym i włącz podświetlenie światła laserowego. Wybierz "czas ekspozycji" dla zapisu hologramu poniżej 3 ms, obserwuj, czy holograficzne prążki interferencyjne poza osią pojawiają się z odpowiednim kontrastem w oknie obrazowania na żywo oprogramowania do akwizycji obrazu i uchwyć hologram cyfrowy.</li>
		<li>Powtarzać kroki 3.3.3 - 3.3.5 aż do zarejestrowania wystarczającej liczby obrazów w jasnym polu i hologramów cyfrowych różnych obszarów próbki. Pozyskiwanie hologramu zostało zakończone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie testów gojenia się ran do obrazowania DHM
	<ol>
		<li>Włączyć komorę grzewczą na szalkę Petriego w mikroskopie DHM na około 1 - 3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić stabilne warunki temperaturowe podczas pomiarów DHM.</li>
		<li>Przygotować stół warsztatowy z wymaganym wyposażeniem (szalka Petriego do oznaczania gojenia ran jest opisana w ppkt 2.3): pipety, pęseta, szklana pokrywka do szalki Petriego, 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowa pożywka z kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) o temperaturze fizjologicznej (37 °C) do przygotowania próbki w sterylnym środowisku. 
		UWAGA: Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco składa się z 10% płodowej surowicy cieląt (FCS), 20 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) i 850 mg/L NaHCO3.</li>
		<li>Zdjąć plastikową pokrywkę z szalki Petriego i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety. Wyjmij wkładkę z dna szalki Petriego za pomocą pęsety.</li>
		<li>Przemyć próbkę 1-2 razy 1 ml buforowanej pożywki do hodowli komórkowych HEPES w celu usunięcia martwych komórek i pozostałych składników komórkowych (np. surowicy) w obszarze rany. Dodać 2 ml buforowanej pożywki do hodowli komórkowych HEPES i przykryć szalkę Petriego szklaną pokrywką.</li>
		<li>Upewnij się, że szklana pokrywa i dno szalki Petriego zostały oczyszczone z kurzu i innych zanieczyszczeń. Próbka jest gotowa do obserwacji poklatkowej za pomocą DHM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ciągłe multimodalne monitorowanie gojenia się ran in vitro za pomocą DHM
	<ol>
		<li>Włączyć komorę grzewczą na szalkę Petriego w mikroskopie DHM na około 1 - 3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić stabilne warunki temperaturowe podczas pomiarów DHM.</li>
		<li>Włącz cyfrowy mikroskop holograficzny, wybierz obiektyw mikroskopu 10X do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu mikroskopu DHM i wybierz tryb obrazowania "jasne pole". Upewnij się, że komora grzewcza szalki Petriego ma temperaturę fizjologiczną (37 °C).</li>
		<li>Umieścić szalkę Petriego z testem gojenia się ran, przygotowanym zgodnie z opisem w pkt 4), w komorze grzewczej mikroskopu DHM.</li>
		<li>Wybierz tryb obrazowania w jasnym polu i ustaw próbkę za pomocą stolika mikroskopu, obserwując ją w oknie monitorowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu mikroskopu DHM. Zwróć uwagę, że żądany obszar próbki wydaje się ostro skupiony w świetle białym.</li>
		<li>Rejestruj obrazy w jasnym polu różnych obszarów próbki (obszar rany i otaczające obszary ze zbiegającymi się komórkami) w świetle białym za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu i dokumentuj wygląd, gęstość i jednorodność komórek.</li>
		<li>Wybierz tryb obrazowania "jasne pole" mikroskopu DHM. Wybierz odpowiedni obszar rany przy oświetleniu światłem białym w oknie monitorowania na żywo za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu DHM. Upewnij się, że obszar rany jest wolny od martwych komórek i nie ma pozostałości surowicy oraz upewnij się, że obie strony zawierają pojedynczą jednorodną warstwę komórek, najlepiej z prostymi obrzeżami.</li>
		<li>Uchwyć obraz w świetle białym początkowego obszaru rany w trybie obrazowania w jasnym polu za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu DHM.</li>
		<li>Wyłącz podświetlenie światłem białym, wybierz tryb "DHM" i włącz oświetlenie laserowe. Wybierz czas naświetlania poniżej 3 ms dla zapisu hologramu (zwróć uwagę, że holograficzne prążki interferencyjne poza osią pojawiają się z odpowiednim kontrastem w oknie obrazowania na żywo w oprogramowaniu do akwizycji obrazu mikroskopu DHM) i uchwyć hologram cyfrowy.</li>
		<li>Uchwyć hologram próbki w trybie DHM za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu i zrekonstruuj ilościowy obraz fazowy za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji mikroskopu DHM w celu sprawdzenia jakości obrazu.</li>
		<li>Wybierz odpowiednie opóźnienie czasowe (np. 3 - 5 min) dla akwizycji hologramu poklatkowego za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu DHM.</li>
		<li>Wybierz tryb akwizycji poklatkowej w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, w którym próbka jest oświetlana tylko światłem laserowym podczas akwizycji hologramu.</li>
		<li>Rozpocznij poklatkową obserwację DHM w teście gojenia się ran.</li>
		<li>Zatrzymaj akwizycję poklatkową po zamierzonym czasie, wybierz tryb obrazowania w jasnym polu i udokumentuj ostateczny wygląd próbki w obrazowaniu w świetle białym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstrukcja cyfrowych hologramów wypreparowanych tkanek i określenie średniego współczynnika załamania światła jako parametru do ilościowego określenia gęstości tkanek
	<ol>
		<li>Rekonstrukcja ilościowych obrazów fazowych z hologramów cyfrowych wypreparowanych tkanek za pomocą oprogramowania mikroskopu DHM, np. zgodnie z opisem w Kemper i wsp.26 oraz Langehanenberg i wsp.Lokal mieszkalny 27.</li>
		<li>Określ średni kontrast fazowy Δφ w różnych warstwach tkanek (nabłonek, błona podśluzowa, zrąb) w odpowiednio dobranych obszarach zainteresowania (ROI)19.</li>
		<li>Określić współczynnik załamania światła ośrodka osadzającego za pomocą refraktometru lub alternatywnie, używając odpowiedniej wartości z literatury. (wartości współczynnika załamania światła dla typowych pożywek do zatapiania: nwody = 1,334 28, nsoli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) = 1,337 29, npożywki do hodowli komórkowych = 1,337-1,339 29,30).</li>
		<li>Oblicz współczynniki załamania światła różnych warstw tkankowych na podstawie średnich wartości kontrastu fazowego19 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq1.jpg"> (1) 
		nuta: W równaniu 1 λ to długość fali światła laserowego (tutaj: λ = 532 nm), d to grubość wypreparowanych tkanek (tutaj: 7 μm), a nośrodek to współczynnik załamania światła ośrodka zatapiającego (tutaj: nmedium = nPBS = 1,337, wyznaczony za pomocą refraktometru Abbego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstrukcja i ocena hologramów cyfrowych na podstawie obserwacji serii gojenia się ran poklatkowych
	<ol>
		<li>Rekonstrukcja ilościowych obrazów fazowych z serii hologramów poklatkowych uzyskanych podczas obserwacji gojenia się ran za pomocą oprogramowania mikroskopowego DHM26,27.</li>
		<li>Normalizuj każdą serię ilościowych obrazów fazowych do obrazu z maksymalnym kontrastem fazowym.</li>
		<li>Określ obszar Scc, który jest pokryty przez komórki w ilościowych obrazach fazy DHM poprzez segmentację obrazu, którą można wykonać za pomocą bezpłatnego programowego profilera komórek (www.cellprofiler.org31).</li>
		<li>Obliczyć średni kontrast fazowy komórek Δφkomórki w obszarze Sc.</li>
		<li>Pobrać komórkową suchą masę masy zkomórki Δφ o średnim kontraście fazowym w obszarze Sc15 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq2.jpg"> (2) 
		nuta: W równaniu 2 DM oznacza suchą masę komórkową, Sc przedstawia powierzchnię zajmowaną przez komórki i α = 0,002 m2 / kg.</li>
		<li>Określić całkowy komórkowy współczynnik załamania światła nkomórek i współczynnik załamania światła pożywki do hodowli komórkowych npożywki. Oznaczyć nkomórek oddzielnie doświadczalnie od zawieszonych komórek, jak opisano w pkt 30 i zmierzyć npożywki za pomocą refraktometru. Alternatywnie można użyć wartości literatury dla nkomórki30 i npożywki29,30.</li>
		<li>Obliczyć średnią grubość komórki dkomórki z λ, Δφkomórki, nkomórki i npożywki 26,32 
		<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/54460/54460eq3.jpg"> (3) 
		nuta: W równaniu 3 parametr d komórka to średnia grubość komórki, λ oznacza długość fali świetlnej światła laserowego,komórka Δφ oznacza średni kontrast fazowy, a komórka n i ośrodek n to całkowy komórkowy współczynnik załamania światła i współczynnik załamania otaczającego ośrodka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pokazujemy, że DHM zapewnia dokładną ocenę uszkodzeń histologicznych w modelach mysiego zapalenia jelita grubego i próbkach ludzkiej tkanki okrężnicy ex vivo. Co więcej, wykazaliśmy, że DHM może stale monitorować gojenie się ran nabłonkowych, jednocześnie dostarczając multimodalnych informacji o zmianach komórkowych. W DHM rekonstrukcja cyfrowo przechwyconych hologramów jest wykonywana numerycznie32. W związku z tym, w porównaniu z mikroskopią jasnego pola, mikroskopią kontrastu fazowego Zernike i mik...

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD), tj. wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) są idiopatycznymi zaburzeniami zapalnymi przewodu pokarmowego1. Szczególnie ważne są badania nad patofizjologią leżącą u podstaw IBD oraz ocena potencjalnych nowych leków lub nowatorskich podejść diagnostycznych. Zarówno w badaniach podstawowych, jak i w postępowaniu klinicznym z pacjentami z IBD, błona śluzowa jelit stała się przedmiotem zainteresowania2,3. Błona śluzowa stanowi anatomiczną granicę, na której interakcja między bakteriami komensalnymi, komórkami nabłonkowymi i różnymi składnikami komórkowymi jelitowego układu odpornościowego koordynuje homeostazę jelit4,5. Jednak u pacjentów z IBD niekontrolowane i uporczywe zapalenie jelit prowadzi do uszkodzenia błony śluzowej, wykrywalnego jako owrzodzenia lub zwężenie, co może ostatecznie doprowadzić do załamania funkcji bariery nabłonkowej, co z kolei nasila miejscowy stan zapalny6.
Gojenie się ran nabłonkowych jest zatem kluczowe dla regeneracji nabłonka po stanie zapalnym, ale jest również podstawowym wymogiem dla gojenia się wrzodów żołądkowo-jelitowych lub nieszczelności zespolenia po operacji przewodu pokarmowego7. Nabłonkowe gojenie się ran można symulować w testach gojenia ran in vitro oraz w mysich modelach zapalenia jelit8,9. Zarówno podejścia in vitro, jak i in vivo mają wady, które ograniczają dokładność oceny doświadczalnej. Testy in vitro, podobnie jak klasyczne testy zarysowania, wymagają długotrwałych procedur barwienia lub transfekcji za pomocą fluorescencyjnych chromoforów. Często są one ograniczone przez nieciągłe monitorowanie proliferacji i migracji komórek, którego nie można zautomatyzować10. Modele in vivo, takie jak zapalenie jelita grubego wywołane dekstranem siarczanem sodu (DSS), często nie mają solidnych odczytów, częściowo ze względu na znaczną zmienność obserwowaną w markerach laboratoryjnych, co sprawia, że takie markery są nieodpowiednie do oceny ciężkości zapalenia jelita grubego11,12. Analiza histologiczna błony śluzowej objętej stanem zapalnym jest obecnie nadal najbardziej odpowiednim podejściem do określania ciężkości zapalenia jelita grubego, ale to, podobnie jak testy gojenia się ran nabłonkowych in vitro, wymaga barwienia i zależy od wiedzy badacza13.
Ostatnio cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM), wariant ilościowej mikroskopii fazowej14, została uznana za użyteczne narzędzie do oceny gojenia się ran nabłonkowych in vitro i in vivo15. DHM umożliwia ocenę gęstości tkanki poprzez pomiar opóźnienia długości ścieżki optycznej (OPD), co pozwala na nową diagnozę raka16-18 i ilościowe określenie zmian w tkankach związanych ze stanem zapalnym19. Dodatkowo DHM umożliwia monitorowanie dynamiki morfologii komórek poprzez określenie grubości komórki, powierzchni pokrytej komórką oraz ilości wewnątrzkomórkowej (białka)15,20. W testach in vitro DHM umożliwia również analizę procesów fizjologicznych, np. przepuszczalności wody komórkowej poprzez ocenę zmian objętości i grubości komórek21,22. Co więcej, pomiary DHM można zautomatyzować, co zapobiega stronniczości próbki związanej z badaczami.
Tutaj demonstrujemy użycie DHM w mysim modelu zapalenia jelit, a także stosujemy DHM do analizy próbek tkanek ludzkich do ilościowego monitorowania gojenia się ran jako bezznacznikowego testu in vitro. Najpierw oceniamy zmiany zapalne różnych warstw ściany okrężnicy u myszy z coliką i skrawków tkanek od ludzi z IBD. Po opisaniu procedury obrazowania fazy ilościowej DHM, podajemy szczegółową instrukcję korzystania z elementów mikroskopu, przygotowania wycinków tkanek, a także opisujemy ocenę uzyskanych ilościowych obrazów fazowych.
Następnie pokazujemy, że DHM może być wykorzystany do ciągłego multimodalnego monitorowania gojenia się ran nabłonkowych in vitro, a analiza cech komórkowych, takich jak grubość warstwy komórkowej, sucha masa i objętość komórki, daje wgląd w indukowane lekami i fizjologiczne zmiany komórek.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoxymethane (AOM)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Niemcy</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette</td><td>Corning Inc., Nowy Jork, USA</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Konsultacja siarczanu dekstranu sodu (DSS)</td><td>TdB, Uppsala, Szwecja</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>PAA Laboratories - Pasching - Austria</td><td>E15-813</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>SPR3196</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgia</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Izopentan (2-metylobutan)</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy</td> Szkiełka mikroskopowe <td>M4287</td><td></td></tr><tr><td></td><td>G. Menzel, Brunszwik, Niemcy</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Związek O.C.T. Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Holandia</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Amfoterycyna B</td><td>Lonza, Verviers, Belgia</td><td>1558</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgia</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza, Verviers, Belgia</td><td>3626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta standardowa</td><td>Altromin, Lage, Niemcy</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Holandia</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Lonza, Verviers, Belgia</td><td>7815</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clud</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Niemcy</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &micro;-Dish 35 mm z wkładką kulturową, high</td><td>ibidi GmbH, Monachium, Niemcy</td><td>81176</td><td></td></tr><tr><td>DIC Pokrywka do &mikro-naczyń, z wkładem szklanym</td><td>ibidi GmbH, Monachium, Niemcy</td><td>80050</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROM HM550</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA</td><td>46320</td><td></td></tr><tr><td><silny>Cyfrowy mikroskop holograficzny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Component</td><td>Model</td><td>Firma</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>iMIC</td><td>Till Photonics, Graefelfing, Niemcy</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laser Compass 315M</td><td>Coherent GmbH, Lubeka, Niemcy</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>mikroskopu Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3</td><td>Zeiss, Getynga, Niemcy</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>DMK 41BF02</td><td>The Imaging Source, Brema, Niemcy</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Częstość występowania chorób zapalnych jelit, tj. choroby Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady. Etiologia IBD pozostaje nieznana, a obecne strategie terapeutyczne opierają się na nieswoistej supresji układu odpornościowego. Opracowanie metod leczenia, które są ukierunkowane na zapalenie jelit i gojenie się ran nabłonkowych, może znacznie poprawić leczenie IBD, jednak wymaga to dokładnego wykrywania zmian zapalnych. Obecnie potencjalni kandydaci na leki są zwykle oceniani przy użyciu modeli zwierzęcych in vivo lub technik opartych na hodowlach komórkowych in vitro. Badanie histologiczne zwykle wymaga wybarwienia komórek lub tkanek będących przedmiotem zainteresowania, co może zmienić charakterystykę próbki, a ponadto interpretacja wyników może się różnić w zależności od wiedzy badacza. Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM), oparta na detekcji opóźnienia długości ścieżki optycznej, umożliwia obrazowanie ilościowe z kontrastem fazowym bez plam. Pozwala to na bezpośrednie skorelowanie wyników z bezwzględnymi parametrami biofizycznymi. Pokazujemy, w jaki sposób pomiar zmian gęstości tkanek za pomocą DHM, oparty na pomiarze indeksu refrakcji, może określić ilościowo zmiany zapalne, bez barwienia, w różnych warstwach próbek tkanki okrężnicy od myszy i ludzi z zapaleniem jelita grubego. Dodatkowo demonstrujemy ciągłe, multimodalne, bezznacznikowe monitorowanie gojenia się ran nabłonkowych in vitro, możliwe przy użyciu DHM poprzez proste automatyczne oznaczanie zranionego obszaru i jednoczesne określanie parametrów morfologicznych, takich jak sucha masa i grubość warstwy migrujących komórek. Podsumowując, DHM stanowi cenne, nowatorskie i ilościowe narzędzie do oceny stanu zapalnego jelit z wartościami bezwzględnymi parametrów, możliwymi do uproszczenia określeniem ilościowym gojenia się ran nabłonkowych in vitro, a zatem ma duży potencjał do zastosowania w diagnostyce translacyjnej.

Typowa konfiguracja obrazowania DHM dla cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM)
Aby wykonać obrazowanie w jasnym polu i ilościowe obrazowanie kontrastu fazowego DHM, zastosowaliśmy mikroskop odwrócony, jak pokazano na rysunku 1B. System został zmodyfikowany poprzez dołączenie modułu DHM, jak opisano wcześniej25. Hologramy cyfrowe wygenerowano poprze...

Dokładna ocena efektów przeciwzapalnych ma ogromne znaczenie dla oceny potencjalnych nowych leków do leczenia nieswoistych zapaleń jelit. Cyfrowa mikroskopia holograficzna umożliwia ocenę stanu zapalnego w próbkach tkanki mysiej i ludzkiej okrężnicy, a także zautomatyzowaną multimodalną ocenę gojenia się ran nabłonkowych in vitro.

Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Ogólnym celem tego badania jest wykorzystanie cyfrowej mikroskopii holograficznej lub DHM w celu zapewnienia zautomatyzowanego, wolnego od plam, ilościowego obrazowania z kontrastem fazowym próbek tkanki okrężnicy z zapalenia jelit do multimodalnej oceny gojenia się ran nabłonkowych in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu zapalenia przewodu pokarmowego i gojenia się ran na temat aktywności choroby w stanach zapalnych u ludzi i w środowisku morskim Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wykrywanie i kwantyfikację komórek i tkanek za pomocą parametrów fizycznych w sposób wolny od plam i obiektywny. Procedury zademonstruje technik Fittest Ketelhut z Centrum Technologii Biomedycznych.Ustaw hodowlę komórkową, inkubuj cztery razy dziesięć do piątej, Caco dwie komórki na centymetr kwadratowy na 35-milimetrowych szalkach Petriego wyposażone w wkładki do wysokiej kultury w pożywce RPMI uzupełnionej FBS i antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 95% i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po dwóch dniach potraktuj komórki interesującym Cię środkiem i zwróć kultury do inkubatora na dodatkowe 24 godziny. Następnego dnia odessać supernatant i użyć pęsety, aby usunąć wkładki.Przemyj kulturę jeden do dwóch razy jednym mililitrem buforowanej pożywki HEPES z hodowli komórkowej, aby usunąć wszelkie martwe komórki i wszelkie pozostałe składniki komórkowe z obszaru rany. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki buforowej HEPES i zamknij naczynie. Teraz umieść szalkę Petriego w cyfrowym mikroskopie holograficznym i wybierz obiektyw 10x.Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu i wybierz tryb obrazowania w jasnym polu. Ustaw komorę grzewczą na 37 stopni Celsjusza i umieść kulturę w komorze grzewczej. Następnie przesuwaj pole widzenia, aż w oknie monitorowania na żywo będzie można zobaczyć odpowiednią ranę z pojedynczą warstwą ogromnych komórek i prostymi obwódkami po obu stronach, bez martwych komórek lub surowicy.Uchwyć obraz w świetle białym początkowego obszaru rany. Następnie wyłącz podświetlenie światłem białym i wybierz tryb cyfrowej mikroskopii holograficznej. Włącz oświetlenie laserowe i wybierz czas naświetlania krótszy niż trzy milisekundy dla zapisu hologramu.Jeśli holograficzne prążki interferencyjne poza dostępem pojawiają się z odpowiednim kontrastem, należy pobrać próbkę hologramu i zrekonstruować ilościowy obraz fazowy za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji, aby sprawdzić jakość obrazu. Następnie należy rozpocząć poklatkową obserwację DHM rany, zatrzymując zapis w odpowiednim punkcie końcowym i uzyskać końcowy obraz próbki w świetle białym. W przypadku ostrego siarczanu sodu dekstranu lub indukcji zapalenia jelita grubego DSS, należy podać myszom ablibidim trzy gramy DSS rozpuszczonego w 100 mililitrach autoklawowanej wody.Po siedmiu dniach należy pobrać odcinki o grubości siedmiu mikrometrów szwajcarskich próbek okrężnicy z walcowanej okrężnicy od zwierząt kontrolnych i leczonych. Zanurz każdą sekcję w 50 do 100 mikrolitrach PBS i przykryj próbki indywidualnymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Upewnij się, że dna prowadnic są wolne od kurzu i innych zanieczyszczeń.Następnie umieść pierwsze szkiełko na stoliku mikroskopu i dostosuj pole widzenia, aż obszar zainteresowania tkanką będzie widoczny. Ustaw ostrość próbki i uchwyć obraz w jasnym polu w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Następnie wybierz tryb obrazowania DHM i przełącz się na podświetlenie światłem laserowym.Ustaw czas ekspozycji poniżej trzech milisekund i upewnij się, że holograficzne prążki zakłóceń poza dostępem są wyświetlane z odpowiednim kontrastem w oknie obrazowania na żywo. Następnie uchwyć cyfrowy hologram tkanki. Endoskopowo dowody umiarkowanego do ciężkiego zapalenia jelita grubego obejmują pogrubienie ściany okrężnicy, zmiany wzoru naczyniowego, niedobory włókien i ziarnistość powierzchni błony śluzowej.Konwencjonalna ocena histologiczna odcinków okrężnicy ujawnia wyraźny obrzęk ściany okrężnicy u DSS leczonego w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, zlokalizowanymi głównie w błonie podśluzowej. Odpowiednie ilościowe obrazy kontrastu fazowego DHM i związane z nimi mapy indeksu refrakcji również pokazują, że te zmiany tkankowe bez widocznych różnic w gęstości nabłonkowej menstromy są szczególnie widoczne w natywnych próbkach tkanek niebarwionych. Współczynnik załamania światła jest znacznie obniżony w nabłonku, błonie podśluzówkowej i zrębie myszy z colitem w porównaniu ze zdrowymi kontrolami, z istotną korelacją między względną utratą masy ciała a współczynnikiem załamania światła u zwierząt doświadczalnych.Pokazano tutaj reprezentatywne ciągłe monitorowanie procesu gojenia się ran za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej przez 45 godzin. Umożliwienie obliczeń powierzchni pokrytej komórką, średniej grubości komórki i suchej masy komórkowej w trakcie procesu gojenia. Wykazaliśmy, że DHM umożliwia ciągłe monitorowanie gojenia się ran nabłonkowych, jednocześnie dostarczając informacji biologicznych o zmianach komórkowych wywołanych cytokinami.Ponadto wykazujemy dokładną ocenę uszkodzeń histologicznych w modelach zapalenia jelita grubego i próbkach tkanki jelita grubego człowieka za pomocą DHM poprzez pomiar zmian indeksu refrakcji. Ponieważ DHM opiera się na wykrywaniu opóźnień długości ścieżki optycznej, bezwzględne parametry biofizyczne, takie jak gęstość tkanki, sucha masa lub grubość komórki, mogą być analizowane za pomocą bezplamnego ilościowego obrazowania z kontrastem fazowym. Kulminacja DHM z powszechnymi mikroskopami badawczymi i solidność tej techniki toruje drogę do rutynowych zastosowań tej metody w biologii komórki i patologii cyfrowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać cyfrowej mikroskopii holograficznej do analizy tkanek żywych kultur komórkowych w środowisku laboratorium biomedycznego. Podsumowując, DHM tworzy cenne, nowatorskie i ilościowe narzędzie do oceny bezwzględnych parametrów stanu zapalnego, a także do uproszczonej kwantyfikacji nabłonka dobrowolnie in vitro o wysokim potencjale do translacyjnego zastosowania diagnostycznego.

multimodal-quantitative-phase-imaging-with-digital-holographic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Trójwymiarowe lokalizacje słabo rozpraszających obiektów mogą być jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DIHM), która obejmuje niewielką modyfikację standardowego mikroskopu.  Nasze oprogramowanie wykorzystuje prostą heurystykę obrazowania sprzężoną z propagacją wsteczną Rayleigha-Sommerfelda, aby uzyskać trójwymiarowe położenie i geometrię mikroskopijnego obiektu fazowego.

Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DIHM) obiektów o słabym rozproszeniu

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Tutaj prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów jelita po zranieniu wywołanym laserem. Poprzez wystawienie jelita myszy na działanie lasera wielofotonowego, utrata jednej lub wielu krypt jest indukowana lokalnie. Poprzez wielokrotne obrazowanie uszkodzonego obszaru przez miesiące, uchwycona jest dynamika regeneracji jelit w czasie rzeczywistym.

Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Badanie to przedstawia metodę obrazowania 3D z wykorzystaniem tkanek jelitowych w całości oraz mikroskopii wielofotonowej do ilościowego określenia wydzielanego śluzu, umożliwiając precyzyjną analizę objętościową i wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na bodźce takie jak chlorek karbamoilocholiny.

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

Poznaj cyfrową mikroskopię holograficzną do ilościowej oceny stanu zapalnego jelit i gojenia się ran nabłonkowych in vitro. Ta bezbarwna metoda umożliwia automatyczną analizę parametrów komórkowych i tkanek.

Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalne ilościowe obrazowanie fazowe z cyfrową mikroskopią holograficzną dokładnie ocenia stan zapalny jelit i gojenie się ran nabłonkowych

Przeglądaj więcej filmów