Name: Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj technikę wspomaganej laserowo mikroiniekcji cytoplazmatycznej u zygot zwierząt gospodarskich. Ta metoda umożliwia dostarczanie narzędzi edycji genomu, takich jak CRISPR-Cas9, do embrionów jednokomórkowych w celu tworzenia zwierząt transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace związane z tą techniką są wspierane przez projekty NIH/NICHD RO1 HD070044 i USDA/NIFA Hatch W-3171 i W-2112.

1. Produkcja mikropipet
<ol>
	<li>Mikropipeta iniekcyjna
	<ol>
		<li>Umieść kapilarnę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna (OD): 1.0 mm, średnica wewnętrzna (ID): 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.</li>
		<li>Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę z długim gwintownikiem. (Przykład: Ciepło: 825; Uciąg: 30; Prędkość: 120; Czas: 200; Ciśnienie: 500).</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wyciągnięte pipety z urządzenia i umieść je na mikrokuźni w pozycji poziomej.</li>
		<li>Ustaw ostrość wyciągniętej pipety i żarnika microforge z kulką szklaną. Za pomocą siatki ocznej zmierz żądaną grubość i przesuwaj pipetę poziomo, aż żarnik grzałki osiągnie docelową średnicę wewnętrzną (5 μm).</li>
		<li>Dostosuj temperaturę do około 45% i delikatnie opuść pipetę, aby dotykała filamentu. Włącz na chwilę grzałkę. Spowoduje to lekkie stopienie pipety, dzięki czemu przylega ona do filamentu, a po schłodzeniu pipeta pęknie w miejscu styku, generując proste cięcie. 
		Uwaga: Ustawienie odpowiedniej temperatury ma kluczowe znaczenie na tym etapie, ponieważ zbyt wysokie temperatury spowodują, że pipeta będzie się wyginać, a tym samym proste cięcie nie będzie możliwe, a zbyt niskie temperatury nie będą wystarczające do stopienia pipety (Rysunek 1A).</li>
		<li>Ustaw przybliżony kąt 30° w pobliżu końcówki pipety, umieszczając ją w odległości około 10 μm od żarnika grzałki. Ustaw temperaturę na 60% i włącz grzałkę. 
		Uwaga: Spowoduje to zgięcie pipety nad żarnikiem. Kąt ten jest pożądany, aby końcówka igły była równoległa do powierzchni płytki iniekcyjnej po zamontowaniu we wtryskiwaczu (rysunek 1B).</li>
		<li>Z pipetami do mikroiniekcji należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ są one niezwykle ostre i delikatne. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymanie mikropipety
	<ol>
		<li>Umieść kapilarę ze szkła borokrzemianowego (OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.</li>
		<li>Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę o długim, równym zwężaniu się i równoległych ściankach (Przykład: Ciepło: 815; Uciąg: 20; Prędkość: 140; Czas: 175; Ciśnienie: 200).</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wyciągniętą pipetę z urządzenia ściągającego i umieść ją na uchwycie mikrokuźni w pozycji poziomej. Ustaw ostrość na żarniku grzałki i pipecie.</li>
		<li>Za pomocą siatki okularowej zmierz średnicę pipety i przesuwaj pipetę, aż jej średnica nad włóknem osiągnie 180 μm.</li>
		<li>Przy wskazanym rozmiarze zaznacz szklaną kapilarnę pisakiem z diamentową końcówką, a następnie delikatnie naciśnij wyciągniętą końcówkę, aby rozbić szkło. Powinno to skutkować prostym cięciem (Rysunek 1C).</li>
		<li>Przesuń pipetę do pozycji pionowej tak, aby jej końcówka znajdowała się blisko filamentu. Ustaw temperaturę mikrokuźni na 60%.</li>
		<li>Wypoleruj końcówkę pipety metodą ogniową przy użyciu standardowych technik7, aż osiągnie średnicę wewnętrzną 40 μm. Użyj siatki celowniczej okularu, aby sprawdzić średnicę wewnętrzna (Rysunek 1D).</li>
		<li>Ustaw kąt na pipecie.
		<ol>
			<li>Ustaw pipetę z powrotem w pozycji poziomej w odległości około 10 μm od filamentu i 5 mm od jego końcówki. Ustaw temperaturę na około 60% i włącz grzałkę, aby zgiąć pipetę nad filamentem. Kontynuuj podgrzewanie, aż zostanie osiągnięty żądany kąt (około 30o). Sprawdź wizualnie kąt (Rysunek 1E). 
			Uwaga: Pipeta jest zwykle montowana do mikroiniektora pod przybliżonym kątem 60o w stosunku do dna naczynia iniekcyjnego. Końcówka pipety jest wygięta tak, aby była równoległa do dna naczynia, co jest niezbędne do prawidłowego wstrzyknięcia zarodka w jego środkowej płaszczyźnie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikromanipulatora
<ol>
	<li>Sprawdź, czy mikrowtryskiwacze są w pełni załadowane olejem i czy w układzie nie ma pęcherzyków powietrza (pęcherzyki w mikrowtryskiwaczu uniemożliwiają precyzyjną kontrolę wtrysku).</li>
	<li>Sprawdź, czy mikromanipulatory są w pozycji środkowej. Pozwoli to na szeroki zakres ruchu pipet.</li>
	<li>Włóż pipetę podtrzymującą do lewego uchwytu mikromanipulatora, a pipetę iniekcyjną do prawego uchwytu do mikromanipulacji.</li>
	<li>Pozwól, aby olej dostał się do pipet przez kapilarność i sprawdź, czy system działa prawidłowo, przesuwając olej w górę i w dół wewnątrz pipety za pomocą elementów sterujących mikrowtryskiwacza. 
	Uwaga: Jeśli nie ma ruchu oleju wewnątrz igieł, może dojść do zatkania. W takim przypadku użyj nowej igły.</li>
	<li>Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić pipety w środku pola widzenia mikroskopu. Korzystając z 4-krotnego powiększenia, sprawdź, czy końcówki mikropipet są ustawione pod odpowiednim kątem (równolegle do dna naczynia). 
	Uwaga: Prawidłowe ustawienie igieł ma kluczowe znaczenie dla udanego wstrzyknięcia i spójności wyników.</li>
	<li>Skalibruj system laserowy zgodnie z instrukcją kalibracji producenta.</li>
</ol>
3. Przygotowanie naczynia do iniekcji (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Umieść 50 μl kropli podgrzanego (37 °C) SOF-HEPES (skład szczegółowo opisany w sekcji materiały) uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na środku pokrywy płytki Petriego o średnicy 100 mm. Umieścić 1-2 μl kropli roztworu do wstrzyknięcia w pobliżu kropli do wstrzykiwania. Upewnij się, że zarodki nie schładzają się poniżej RT. 
	Uwaga: W tym protokole dodamy barwnik Dextran-Red do roztworu do wstrzykiwań, aby móc uwidocznić miejsce wstrzyknięcia i śledzić je później.</li>
	<li>Przykryć krople w płytce iniekcyjnej około 10 ml oleju mineralnego.</li>
	<li>Umieścić naczynie iniekcyjne na stoliku mikroskopu odwróconego i umieścić pipety w kropli iniekcyjnej. Sprawdź, czy igły są ostre wewnątrz kropli. Dostosuj ich wysokość w razie potrzeby za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora.</li>
	<li>Za pomocą mikrodozownika załadować około 20 - 30 zygot (17 - 20 godzin po zapłodnieniu (hpf)) w górną stronę kropli iniekcyjnej. Wstrzyknięcie należy wykonać w temperaturze pokojowej, tak aby liczba zarodków w kropli do wstrzykiwania była określona na podstawie szybkości, z jaką dana osoba może je wstrzyknąć. Nie należy ładować więcej zarodków niż te, które można wstrzyknąć w ciągu 30 minut.
	<ol>
		<li>Aby załadować zarodki do mikrodozownika, należy całkowicie wcisnąć tłok i zanurzyć końcówkę w roztworze zawierającym zarodki. Dotknij zarodków, które mają zostać podniesione, końcówką szklanej kapilary (pojedynczo) i powoli zwolnij tłok, aby każdy zarodek wszedł do naczynia włosowatego. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zarodki zostaną zebrane lub pojemność mikrodozownika będzie pełna.</li>
		<li>Aby uwolnić załadowane zarodki, należy delikatnie wcisnąć tłok, aż cała objętość zawierająca zarodki zostanie uwolniona z naczynia włosowatego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Używając obiektywu 4X, załaduj roztwór do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej, stosując podciśnienie (zasysanie). Załadować roztwór wystarczający do wstrzyknięcia 2-3 zygot. Następnie przejdź do kropli do wstrzykiwań.</li>
	<li>W obrębie kropli iniekcyjnej przesunąć pipetę przytrzymującą tak, aby końcówka zbliżyła się do zygoty. Zastosuj podciśnienie (aspirat) za pomocą mikroiniektora przytrzymującego, aby zygota została przymocowana do pipety podtrzymującej i zmień obiektyw na 20X.</li>
	<li>Po przymocowaniu zygoty do pipety podtrzymującej sprawdź jej jakość za pomocą pipety do wstrzykiwań, aby delikatnie przesunąć zarodek bez jego odłączania. Dobrej jakości zygota powinna mieć dwa ciała biegunowe (chociaż czasami widać tylko jedno) i jednorodną cytoplazmę. Nie należy wstrzykiwać nieprawidłowych zygot (ryc. 3A).</li>
	<li>W razie potrzeby należy zmienić położenie zarodka w celu uzyskania właściwego miejsca wstrzyknięcia. Dobrym pozycjonowaniem byłoby takie, w którym jest pewna przestrzeń między ZP a PM, aby PM nie został uszkodzony przez laser.</li>
	<li>Sprawdzić, czy pipeta do wstrzykiwań jest umieszczona na środkowej płaszczyźnie zarodka, delikatnie dotykając zygoty w miejscu wstrzyknięcia. Jeśli nie znajduje się na płaszczyźnie środkowej, igła będzie miała tendencję do obracania zarodka zamiast do nakłucia. W razie potrzeby wyreguluj wysokość pipety iniekcyjnej.</li>
	<li>Wykonaj otwór w ZP za pomocą lasera (rysunek 3B).
	<ol>
		<li>Za pomocą oprogramowania lasera umieść siatkę laserową w ZP, w miejscu, w którym zostanie wykonany otwór (po przeciwnej stronie niż miejsce, w którym zarodek jest przymocowany do pipety trzymającej). Korzystając z okna sterowania laserem, kliknij przycisk ognia. Upewnij się, że rozmiar otworu jest wystarczająco duży, aby utworzyć otwór w ZP, przez który igła może przejść bez uszkodzenia PM (przykład: szerokość impulsu 0,662 ms / rozmiar otworu 6,9 μm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przełóż igłę do wstrzykiwań przez otwór w ZP i zetknij się z PM. Kontynuuj popychanie pipety do przodu, aż igła znajdzie się w 3/4 drogi do zarodka (ryc. 3C).</li>
	<li>Obserwuj położenie menisku na interfazie roztwór-olej, ponieważ będzie to wykorzystywane do konsekwentnej kontroli objętości wtrysku.</li>
	<li>Zastosować podciśnienie (aspirat) na pipetę iniekcyjną, co spowoduje zassanie PM i cytoplazmy do igły iniekcyjnej. Kontynuuj, aż ruch cytoplazmy do igły przyspieszy lub gdy będzie można zauważyć mieszanie się cytoplazmy z roztworem do wstrzykiwań. Będą one wskazywać na pęknięcie PM (rysunek 3D).</li>
	<li>Wstrzyknąć z powrotem zawartość cytoplazmatyczną, a następnie roztwór do cytoplazmy zygoty, stosując nadciśnienie (wstrzyknięcie), aż menisk na interfazie roztwór-olej przesunie się o jeden odpowiednik średnicy zygoty poza punkt początkowy. 
	Uwaga: W naszych warunkach odpowiada to około 7 pl wstrzykniętego roztworu (ryc. 3E).</li>
	<li>Zmień obiektyw na 4X i przesuń wstrzyknięty zarodek/zarodki na dolną stronę kropli do wstrzykiwania. Uwolnić zarodek, wywierając dodatni nacisk na mikrowstrzykiwacz podtrzymujący. Trzymaj zarodki, którym nie wstrzyknięto, należy trzymać na górnej stronie, a zarodki, którym wstrzyknięto, na dolnej stronie kropli, aby śledzić zarodki, w które wstrzyknięto/nie wstrzyknięto zarodków i pracować wydajnie.</li>
</ol>
5. Wyniki odzyskiwania zarodków i iniekcji
<ol>
	<li>Przygotuj 3 krople po około 200 μl w nowym naczyniu z podgrzanym SOF-HEPES. Pobrać wstrzyknięte zarodki za pomocą mikrodozownika (jak opisano powyżej). Umyj wstrzyknięte zarodki, przesuwając je przez 3 krople SOF-HEPES.</li>
	<li>Policz zarodki poddane lizie podczas mikroiniekcji i wyrzuć je. 
	Uwaga: Lizowaną zygotę można łatwo odróżnić od nienaruszonej, ponieważ pierwsza z nich wydaje się półprzezroczysta, wypełnia cały ZP i zwykle ma zawartość cytoplazmatyczną wyciekającą na zewnątrz zarodka.</li>
	<li>Opcjonalnie należy sprawdzić skuteczność mikroiniekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Należy pamiętać, że ekspozycja na światło UV może wywołać uszkodzenie zarodka, które może wpłynąć na późniejszy rozwój.</li>
	<li>Grupy hodowlane składające się z 25 wstrzykniętych zarodków w 50 μl kropli pożywki optymalizacyjnej potasu pospolitego (KSOM) uzupełnionej 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w oleju mineralnym w temperaturze 38,5 °C, 5% CO2 w powietrzu i wilgotności do nasycenia.</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę hodowlaną 5% FBS dwa dni po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Sprawdź częstość występowania blastocysty (BL) 7 dni po wstrzyknięciu. Obliczyć wskaźniki BL jako całkowitą liczbę zarodków blastocysty/całkowitą liczbę zarodków wyhodowanych w tym kropli.</li>
</ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li>
<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
<li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR%2FCas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li>
<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pipette+Cookbook+2015+P-97+%26+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instrument. 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf</a> (2015).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf">www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf</a> (2014).</li>
<li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCibelli%2C+JB+%22Principles+of+cloning%22">Principles of cloning</a>. , Academic Press. (2002).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroiniekcja zygot jest dobrze znaną metodą wprowadzania roztworów do zarodków ssaków. Z pewnymi różnicami w zależności od gatunku i celu eksperymentu, technika ta może być szeroko stosowana. Pokazujemy, jak wykonać mikroiniekcję docytoplazmatyczną za pomocą lasera, aby wspomóc wejście mikropipety z końcem. Zygoty niektórych gatunków zwierząt gospodarskich (takich jak bydło, owce i świnie) mają ciemną cytoplazmę, co utrudnia wizualizację pipety do wstrzykiwań wewnątrz zarodka. Ponadto ich błony plazmatyczne są bardzo el...

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna zarodków 1-komórkowych jest bardzo skuteczną techniką. Może być używany do dostarczania dowolnego roztworu do zarodka, na przykład w celu wytworzenia nokautów genów w celu badania funkcji genów lub do generowania zwierząt z edytowanymi genami. Większość zygot zwierząt gospodarskich o znaczeniu rolniczym ma bardzo wysoki skład kwasów tłuszczowych, który sprawia, że ich cytoplazma jest nieprzezroczysta i ciemna1. Mają też dość elastyczną błonę plazmatyczną (PM). Te cechy sprawiają, że mikroiniekcja przy użyciu konwencjonalnej iniekcji przedjądrowej/cytoplazmatycznej, stosowanej u gatunków gryzoni, jest trudna i często niedokładna.
Mikroiniekcja cytoplazmatyczna ma przewagę nad mikroiniekcją projądrową, ponieważ jest łatwiejsza do wykonania, a także powoduje mniejsze uszkodzenia wstrzykniętych zarodków, co skutkuje wyższą żywotnością2. Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt gospodarskich. Aby móc wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną z wysoką skutecznością na zarodkach zwierząt gospodarskich, do wygenerowania otworu w osłonie przejrzystej (ZP) wykorzystuje się laser, a następnie do mikroiniekcji używa się szklanej igły o końcu. Strategia ta ma na celu zmniejszenie uszkodzeń mechanicznych odciskających się na zarodku podczas iniekcji. Następnie, aspiracja zawartości cytoplazmatycznej do wnętrza igły iniekcyjnej pozwala na skuteczne i pewne złamanie PM, zapewniając, że roztwór zostanie dostarczony do cytoplazmy zarodka.
Ta technika została już z powodzeniem wykorzystana na bydlęcych embrionach do dostarczania siRNA do cytoplazmy zygotycznej3,4 i generowania mutacji za pomocą zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) / systemu związanego z CRISPR 9 (Cas9)5. Nadaje się również (z niewielkimi modyfikacjami) do wstrzykiwania oocytów zamkniętych w kłębikach bydlęcych6. W tym miejscu opisujemy nasz protokół iniekcji dostarczający barwnik, który może być stosowany do wstrzykiwania dowolnego pożądanego roztworu do zygoty i pokazujemy, że użycie tej techniki powoduje minimalną lizę i nie wpływa na wczesny rozwój zarodka.

<table><tbody><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>B100-75-10</td><td>Te kapilary służą do wykonywania pipet do przytrzymywania i wstrzykiwania. Można użyć dowolnych grubych/standardowych rur borokrzemianowych bez żarnika.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Wyposażony w soczewkę o powiększeniu 10X.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Wyposażony w obiektywy 4X, 20X oraz w system laserowy.</td></tr><tr><td>Laserowe</td><td>instrumenty badawcze</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Aktywny laser.</td></tr><tr><td>Mikrodozownik</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>Mikrodozownik służy do przenoszenia zarodków. Można również użyć pipety p10, ale ładującej jak najmniejszą objętość.</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 100 x 15 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Użyj pokrywki naczynia, aby wykonać płytkę iniekcyjną, ponieważ mają one dolne ścianki i ułatwiają pozycjonowanie i przesuwanie mikromanipulatora. Można również użyć pokrywki naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>Te naczynia są używane do hodowli zarodków w 50 &mu; l krople pokryte olejem mineralnym. Alternatywnie można również użyć naczynia 4-dołkowego. Niezależnie od wybranej dawki do hodowli zarodków, zawsze muszą one być zrównoważone w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny przed przeniesieniem zarodków do nich.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Dowolny inkubator, który można ustawić na 38,5 &deg; C, można zastosować warunki 5% CO2.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Służy do wizualizacji zarodków w kroplach hodowlanych i podczas mycia. Można użyć dowolnego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 10x.</td></tr><tr><td>Jednostka sterująca HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>System grzewczy podłączony do stereomikroskopu.</td></tr><tr><td>Podgrzewany stolik mikroskopowy</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>System grzewczy dołączony do mikroskopu stereoskopowego.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>Do wstrzykiwań stosuje się sterylny roztwór o stężeniu 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Olej mineralny należy przechowywać w temperaturze pokojowej i&nbsp; chronić przed światłem za pomocą papieru foliowego.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Uzupełniony o 4 mg/ml BSA. Płytki KSOM do hodowli zarodków należy przechowywać w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny przed użyciem.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Użyj FBS z kwalifikacją komórek macierzystych.</td></tr><tr><td>Zygoty</td><td></td><td></td><td>Zygoty wstrzykuje się 17 - 20 hpf i mogą pochodzić in vitro lub in vivo.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Stężenie końcowe: 107,7 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Stężenie końcowe: 7,16 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Stężenie końcowe: 1,19 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Stężenie końcowe: 0,49 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>DL-mleczan sodu</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Stężenie końcowe: 5,3 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Stężenie końcowe: 1,71 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>D-(&minus;)-Fruktoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Stężenie końcowe: 0,5 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Stężenie końcowe: 21 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Stężenie końcowe: 1x. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Stężenie końcowe: 1x. Składnik pożywki SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Stężenie końcowe: 4 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Stężenie końcowe: 0,33 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Stężenie końcowe: 1 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Stężenie końcowe: 1 mg/ml. Składnik pożywki SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Stężenie końcowe: 5 &mu; g/ml. Składnik podłoża SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Woda do transferu zarodków</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Składnik pożywki SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>Podłoże SOF-HEPES</td><td>Wyprodukowano w laboratorium</td><td></td><td>pH 7,3 - 7,4, 280 &plusmn; 10 mOs. Filtr sterylizowany przez 22 &mu; m filtr można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 stopni C przez 1 miesiąc. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr></tbody></table>

wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna do jednokomórkowych embrionów jest bardzo potężną techniką. Na przykład umożliwia dostarczenie narzędzi do edycji genomu, które mogą tworzyć modyfikacje genetyczne, które będą obecne w każdej komórce dorosłego organizmu. Może być również stosowany do dostarczania siRNA, mRNA lub przeciwciał blokujących w celu badania funkcji genów w zarodkach preimplantacyjnych. Konwencjonalna technika mikroiniekcji zarodków stosowana u gryzoni polega na bardzo cienkiej mikropipecie, która bezpośrednio przenika przez błonę plazmatyczną po wprowadzeniu do zarodka. Gdy ta technika jest stosowana u zwierząt gospodarskich, zwykle skutkuje niską wydajnością. Dzieje się tak głównie dlatego, że w przeciwieństwie do myszy i szczurów, zygoty bydlęce, owcze i świńskie mają bardzo ciemną cytoplazmę i wysoce elastyczną błonę plazmatyczną, co utrudnia wizualizację podczas wstrzykiwania i penetracji błony plazmatycznej. W tym protokole opisujemy odpowiednią metodę mikroiniekcji do dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot bydlęcych, która okazała się skuteczna również w przypadku zarodków owiec i świń. Najpierw laser służy do tworzenia w osłonie przejrzystej. Następnie przez otwór wprowadza się szklaną mikropipetę o końcu i przesuwa się do momentu, gdy końcówka igły dotrze około 3/4 do zarodka. Następnie błona plazmatyczna zostaje przerwana przez aspirację zawartości cytoplazmatycznej wewnątrz igły. Na koniec zasysana zawartość cytoplazmatyczna, a następnie roztwór będący przedmiotem zainteresowania, jest wstrzykiwana z powrotem do cytoplazmy embrionalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do dostarczania różnych roztworów do zygot bydlęcych i owczych ze 100% wydajnością, minimalną lizą i normalnym tempem rozwoju blastocyst.

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna wspomagana laserem to skuteczny i niezawodny protokół wprowadzania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt hodowlanych. Rysunek 3 przedstawia ogólny zarys zygot przed i po iniekcji, a także ogólny schemat techniki. W celu monitorowania miejsca iniekcji oraz oceny jej wydajności i precyzji jako roztworu wstrzykiwanego zastosowano dekstran-red. Skuteczne wprowadzenie roztworu zilustrowano na Rysunku 4, przedstawiającym niedawno...

Ten protokół pokazuje, jak wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną u zygot zwierząt hodowlanych. Technika ta może być wykorzystana do dostarczenia dowolnego roztworu do zarodka jednokomórkowego, takiego jak narzędzia do edycji genomu w celu wygenerowania zwierząt z nokautem.

Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywne wprowadzanie roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt hodowlanych przy użyciu igły o tępych końcach wspomaganej laserem. Metoda ta jest stosowana w badaniach oraz w dziedzinie transgenezy zwierząt; ponieważ może być powiązana z narzędziami do edycji genomu, takimi jak system CRISPR Cas9, umożliwia ona tworzenie nowych krów do badania funkcji genów oraz zwierząt transgenicznych w sposób bardzo prosty i niezawodny. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wprowadzenia dowolnego roztworu do cytoplazmy zygot dużych zwierząt.Dzięki sprawnej technice iniekcji minimalizuje się wskaźniki strat w wątrobie zwierząt. W pierwszej kolejności należy przygotować mikropipetę do iniekcji, umieszczając kapilarę z borokrzemianowego szkła w wyciągaczu mikropipet i blokując ją w odpowiednim miejscu. Należy zastosować odpowiedni program wyciągania kapilary, aby uzyskać cienką końcówkę o długim zwężeniu.Następnie ostrożnie wyjmij wyciągnięte pipety z urządzenia i umieść je w pozycji poziomej w mikrokuźni. Ustaw ostrość na wyciągniętą pipetę oraz włókno grzejne mikrokuźni wraz z szklaną kuleczką. Użyj siatki okularowej, aby zmierzyć pożądaną grubość, i przemieszczaj pipetę poziomo, aż włókno grzejne osiągnie docelową średnicę wewnętrzną wynoszącą pięć mikrometrów.Ustaw moc grzania na około 45% i delikatnie opuść pipetę tak, aby dotknęła filamentu. Następnie krótko uruchom grzałkę. Spowoduje to lekkie stopienie pipety, dzięki czemu przylgnie ona do filamentu, a po ochłodzeniu pipeta pęknie w punkcie styku, tworząc proste cięcie.Ustawienie odpowiedniej temperatury jest kluczowe w tym kroku. Zbyt wysoka temperatura spowoduje wygięcie pipety, natomiast zbyt niska nie będzie wystarczająca do przecięcia pipety. Następnie, ustawiając końcówkę w odległości około 10 µm od włókna grzejnego, ustaw kąt około 30 stopni w pobliżu końcówki pipety.Ustaw temperaturę na 60% i uruchom grzałkę tak, aby pipeta wygięła się nad włóknem pod pożądany kąt. Stosując parametry przedstawione w tym miejscu, wyciągnij kapilarę szklaną w taki sposób, aby powstała mikropipeta z cienką końcówką o długim, równomiernym zwężeniu i równoległych ściankach. Ostrożnie wyjmij wyciągniętą pipetę z urządzenia do wyciągania i umieść ją w pozycji poziomej w uchwycie mikrokuźni.Użyj siatki okularowej do pomiaru średnicy pipety i przesuwaj ją, aż średnica nad włóknem osiągnie 180 µm. Zaznacz kapilarę szklaną rysikiem z diamentowym grotem, a następnie delikatnie naciśnij wyciągniętą końcówkę, aby przełamać szkło. Powinno to skutkować prostym cięciem.Następnie ustaw pipetę w pozycji pionowej, tak aby jej końcówka znajdowała się blisko włókna. Ustaw temperaturę mikrokuźni na 60% i przeprowadź polerowanie ogniowe końcówki pipety, stosując standardowe techniki, aż średnica wewnętrzna osiągnie docelowy rozmiar. Zmierz średnicę wewnętrzną pipety, która powinna wynosić 40 micrometers.Stosując tę samą procedurę co poprzednio, zgnij końcówkę pod kątem 30 stopni. Włóż pipetę przytrzymującą do uchwytu lewego mikromanipulatora, a pipetę iniekcyjną do uchwytu prawego mikromanipulatora. Następnie napełnij pipetę iniekcyjną olejem.Użyj sterowników mikromanipulatora, aby wprowadzić pipety do centrum pola widzenia mikroskopu. Przy powiększeniu 4X sprawdź, czy końcówki mikropipet są pod odpowiednim kątem, tak aby były równoległe do dna naczynia. Nanieś kroplę 50 µL roztworu SOF-HEPES o temperaturze 37 °C, uzupełnionego o 20% FBS, na środek pokrywki płytki Petriego o średnicy 100 mm.Następnie nanieś kroplę od 1 do 2 µL roztworu do wstrzyknięcia obok kropli inkubacyjnej. Następnie pokryj krople oraz płytkę do mikroiniekcji około 10 mL oleju mineralnego. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu i za pomocą mikrodyspensera przenieś około 20 do 30 zygot do górnej części kropli inkubacyjnej.Używając obiektywu 4X, należy nabić roztwór do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej, wywierając podciśnienie za pomocą mikroiniekcyjnika. Należy nabić ilość roztworu wystarczającą do wstrzyknięcia do dwóch lub trzech zygot, a następnie przejść do kropli iniekcyjnej. W obrębie kropli iniekcyjnej należy przesunąć pipetę trzymającą tak, aby jej końcówka znalazła się blisko zygoty.Zastosuj podciśnienie za pomocą mikrostrzykawki przytrzymującej, aby zygota została unieruchomiona w pipecie przytrzymującej. Gdy zygota zostanie zabezpieczona, przełącz na obiektyw 20X. Sprawdź, czy pipeta do iniekcji znajduje się w płaszczyźnie środkowej embrionu, delikatnie dotykając zygoty w miejscu iniekcji.Jeśli igła nie znajduje się w płaszczyźnie środkowej, będzie ona powodować rotację zarodka zamiast jego punkcji. Następnie należy użyć oprogramowania, aby ustawić laser prostopadle do strefy błonowej w miejscu, w którym zostanie wykonany otwór. Po prawidłowym ustawieniu należy skorzystać z okna sterowania laserem i kliknąć przycisk FIRE.Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby stworzyć przejście w strefie przejrzystej (zona pellucida), przez które igła będzie mogła przejść bez uszkodzenia błony plazmatycznej. Przeciągnij igłę do iniekcji przez otwór w strefie przejrzystej i zetknij ją z błoną plazmatyczną. Kontynuuj przesuwanie pipety do przodu, aż igła znajdzie się w 3/4 głębokości zarodka.Obserwuj położenie menisku na granicy faz roztwór-olej. Pozwoli to na spójną kontrolę objętości wstrzykiwanej cieczy. Zastosuj podciśnienie w pipecie do mikroiniekcji, aby wciągnąć błonę plazmatyczną i cytoplazmę do igły wtryskiwacza.Kontynuuj, aż ruch cytoplazmy w igle przyspieszy lub gdy pojawi się zawartość cytoplazmy mieszająca się z roztworem wstrzykiwanym. Zjawiska te będą wskazywać na przerwanie błony plazmatycznej. Wstrzyknij z powrotem zawartość cytoplazmatyczną, a następnie roztwór do cytoplazmy zygoty, przykładając ciśnienie dodatnie, aż menisk na granicy faz roztwór-olej przesunie się o wartość równą średnicy jednej zygoty poza punkt początkowy.Następnie należy zmienić obiektyw na 4X i przesunąć wstrzyknięty embrion na dolną stronę kropli do wstrzykiwania. Zwolnić embrion, przykładając dodatnie ciśnienie w mikro-injektorze utrzymującym. Zebrane wstrzyknięte embriony należy pobrać za pomocą mikro-dyspensera.Przemyj wstrzyknięte embriony, przenosząc je przez trzy krople medium SOF-HEPES, a następnie inkubuj je zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Prawidłowe wprowadzenie roztworu jest widoczne na obrazie fluorescencyjnym, w którym użyto barwnika dexion red do śledzenia miejsca wstrzyknięcia oraz oceny wydajności i precyzji iniekcji. W tym przypadku barwnik jest jednorodnie rozłożony w cytoplazmie, co jest charakterystyczne dla zastosowania tej techniki.Protokół ten charakteryzuje się minimalnym wskaźnikiem lizy w zygotach bydła i owiec. Niewiele wstrzykniętych embrionów u bydła lub owiec uległo lizie w wyniku mikroiniekcji. Ponadto nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w tempie rozwoju blastocyst między grupami kontrolną a wstrzykniętą zarówno w przypadku embrionów bydlęcych, jak i owczych.Po opanowaniu tej techniki można przeprowadzać ją w tempie dwóch embrionów na minutę. Dzięki sprawnej pracy operatora wydajność iniekcji wzrasta, co minimalizuje liczbę blastocyst zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo rozumieć, jak przeprowadzać wspomaganą laserowo mikroiniekcję wewnątrzcytoplazmatyczną w zygotach zwierząt hodowlanych.A także jak wykorzystać dodatnie i ujemne ciśnienie ssania, aby zapewnić przerwanie błony plazmatycznej dla efektywnego dostarczenia.

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

W tym filmie demonstrujemy wspomagane laserem przenikanie warstwy ochronnej osłonki przejrzystej do zapłodnionych jaj myszy w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych. Lentiwirus umożliwia generowanie zwierząt transgenicznych, których gen jest stabilnie zintegrowany z ich genomem.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych: technika przenikania zapłodnionych jaj myszy w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Jaja zapłodnione myszami i zarodki we wczesnym stadium są chronione przez osłonkę przejrzystą, matrycę glikoproteinową, która tworzy barierę przed dostarczaniem genów. W artykule opisano protokół perforacji zony za pomocą lasera w celu transdukcji komórek embrionalnych za pomocą wektorów lentiwirusowych i stworzenia myszy transgenicznych.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Poznaj technikę wspomaganej laserowo mikroiniekcji cytoplazmatycznej u zygot zwierząt gospodarskich. Ta metoda umożliwia dostarczanie narzędzi edycji genomu, takich jak CRISPR-Cas9, do embrionów jednokomórkowych w celu tworzenia zwierząt transgenicznych.

Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Przeglądaj więcej filmów