Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne dostarczenie roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt gospodarskich za pomocą igły za pomocą lasera. Metoda ta jest stosowana w badaniach i w dziedzinie transgenezy zwierząt, ponieważ jest powiązana z narzędziem do edycji genomu, takim jak system CRISPR Cas9, może tworzyć nowe krowy do badania funkcji genów i zwierząt transgenicznych w bardzo prosty i niezawodny sposób. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do dostarczenia dowolnego roztworu do cytoplazmy zygot dużych zwierząt.

Dzięki poręcznej osobie skuteczność iniekcji minimalizuje wskaźniki lomotylu wątroby zwierząt. Najpierw należy przygotować mikropipetę do iniekcji, umieszczając kapilarnę ze szkła borokrzemianowego w ściągaczu do mikropipet i blokując ją na miejscu. Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę z długim stożkiem.

Następnie ostrożnie wyjmij wyciągnięte pipety z urządzenia i umieść je na mikrokuźni w pozycji poziomej. Ustaw ostrość wyciągniętej pipety i żarnika grzałki microforge ze szklanym koralikiem. Użyj siatki celowniczej okularu, aby zmierzyć żądaną grubość i przesuwaj pipetę poziomo, aż żarnik grzałki osiągnie docelową średnicę wewnętrzną pięciu mikrometrów.

Dostosuj temperaturę do około 45% i delikatnie opuść pipetę, aby dotknęła filamentu. Następnie na krótko włącz grzałkę. Spowoduje to lekkie stopienie pipety, dzięki czemu przylgnie ona do filamentu, a po schłodzeniu pipeta pęknie w miejscu styku, powodując proste cięcie.

Ustawienie odpowiedniej temperatury jest kluczowe na tym etapie. Zbyt wysokie temperatury spowodują zgięcie pipety, a zbyt niskie temperatury nie będą wystarczające do przecięcia pipety. Następnie ustaw przybliżony kąt 30 stopni w pobliżu końcówki pipety, umieszczając końcówkę w odległości około 10 mikrometrów od żarnika grzałki.

Ustaw temperaturę na 60% i włącz grzałkę tak, aby pipeta pochyliła się nad filamentem pod żądanym kątem. Korzystając z pokazanych tutaj ustawień, pociągnij szklaną kapilę, w wyniku czego mikropipeta będzie miała cienką końcówkę o długich, równych stożkach i równoległych ściankach. Ostrożnie wyjmij wyciągniętą pipetę z urządzenia ściągającego i umieść ją na uchwycie mikrokuźni w pozycji poziomej.

Użyj siatki okularu, aby zmierzyć średnicę pipety i przesuwaj pipetę, aż jej średnica nad włóknem osiągnie 180 mikrometrów. Zaznacz szklaną kapilarnę pisakiem z diamentową końcówką, a następnie delikatnie naciśnij wyciągniętą końcówkę, aby rozbić szkło. Powinno to skutkować prostym cięciem.

Następnie przesuń pipetę do pozycji pionowej, tak aby jej końcówka znajdowała się blisko filamentu. Ustaw temperaturę mikrokuźni na 60% i wypoleruj końcówkę pipety, używając standardowych technik, aż średnica wewnętrzna osiągnie docelowy rozmiar. Zmierz wewnętrzną średnicę pipety, która powinna wynosić 40 mikrometrów.

Stosując tę samą procedurę, co poprzednio, zegnij końcówkę pod kątem 30 stopni. Włóż pipetę podtrzymującą do lewego uchwytu mikromanipulatora, a pipetę iniekcyjną do prawego uchwytu do mikromanipulacji. Następnie napełnić pipetę iniekcyjną olejem.

Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić pipety w środku pola widzenia mikroskopu. Korzystając z 4-krotnego powiększenia, sprawdź, czy końcówki mikropipet są ustawione pod odpowiednim kątem, tak aby były równoległe do dna naczynia. Umieść 50 mikrolitrową kroplę roztworu SOF-HEPES o temperaturze 37 stopni Celsjusza, który jest uzupełniony 20% FBS, na środku pokrywki 100-milimetrowej szalki Petriego.

Następnie należy umieścić jedną lub dwie mikrolitry kropli roztworu, który ma być wstrzyknięty, w pobliżu kropli do wstrzykiwania. Następnie przykryj krople i płytkę wtryskową około 10 mililitrami oleju mineralnego. Umieścić płytkę na stoliku mikroskopu i za pomocą mikrodozownika załadować około 20 do 30 zygot w górną stronę kropli iniekcyjnej.

Używając obiektywu 4X, załaduj roztwór do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej, wywierając podciśnienie na mikrowtryskiwacz. Załadować wystarczającą ilość roztworu, aby wstrzyknąć dwie do trzech zygot, a następnie przejść do kropli do wstrzykiwań. W obrębie kropli iniekcyjnej przesunąć pipetę przytrzymującą tak, aby końcówka zbliżyła się do zygoty.

Zastosuj podciśnienie za pomocą mikrowtryskiwacza przytrzymującego, aby zygota została przymocowana do pipety podtrzymującej. Gdy zygota jest już zabezpieczona, zmień obiektyw na 20X. Sprawdzić, czy pipeta do wstrzykiwań jest umieszczona na środkowej płaszczyźnie zarodka, delikatnie dotykając zygoty w miejscu wstrzyknięcia.

Jeśli nie znajduje się na płaszczyźnie środkowej, igła będzie miała tendencję do obracania zarodka, zamiast do nakłucia. Następnie za pomocą oprogramowania umieść laser pionowo w osłonie przezroczystej, w której zostanie wykonany otwór. Po prawidłowym ustawieniu użyj okna sterowania laserem i kliknij przycisk OGIEŃ.

Upewnij się, że rozmiar otworu jest wystarczająco duży, aby utworzyć otwór w osłonie przejrzystej, przez który igła może przejść bez uszkodzenia błony plazmatycznej. Przepuścić igłę do wstrzykiwań przez otwór w osłonie przezroczystej i zetknąć się z błoną plazmatyczną. Kontynuuj popychanie pipety do przodu, aż igła znajdzie się w 3/4 drogi do zarodka.

Obserwuj położenie menisku na interfazie oleju roztworu. Będzie to wykorzystywane do konsekwentnej kontroli objętości wtrysku. Zastosować podciśnienie na pipecie iniekcyjnej, aby zassać błonę plazmatyczną i cytoplazmę do igły do wstrzykiwań.

Kontynuuj, aż ruch cytoplazmy w igle przyspieszy lub gdy będzie można zobaczyć zawartość cytoplazmy zmieszaną z roztworem do wstrzykiwań. Będą one wskazywać na pęknięcie błony plazmatycznej. Wstrzyknąć z powrotem zawartość cytoplazmatyczną, a następnie roztwór do cytoplazmy zygoty, stosując nadciśnienie, aż menisk w interfazie oleju roztworu przesunie się o jeden odpowiednik średnicy zygoty poza punkt początkowy.

Następnie zmień obiektyw na 4X i przesuń wstrzyknięty zarodek na dolną stronę kropli do wstrzykiwania. Uwolnić zarodek, wywierając dodatni nacisk na mikrowstrzykiwacz podtrzymujący. Pobrać wstrzyknięte zarodki za pomocą mikrodozownika.

Umyj wstrzyknięte zarodki, przenosząc je przez trzy krople SOF-HEPES i pohoduj je, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Pomyślne dostarczenie roztworu jest widoczne na obrazie fluorescencyjnym, gdzie czerwień dexionu jest używana do śledzenia miejsca wstrzyknięcia oraz skuteczności i dokładności iniekcji. Tutaj barwnik jest jednorodnie rozprowadzany w cytoplazmie, co jest typowe przy stosowaniu tej techniki.

Protokół ten ma minimalne wskaźniki lizy u zygot bydlęcych i owczych. Niewiele z wstrzykniętych zarodków poddano lizie u bydła lub owiec w wyniku mikroiniekcji. Nie ma również statystycznie istotnych różnic w tempie rozwoju blastocyst w grupie kontrolnej i w grupie iniekcyjnej zarówno dla zarodków bydlęcych, jak i owczych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w tempie dwóch zarodków na minutę. Dzięki poręcznej skuteczności wstrzykiwania dla osób minimalizuje częstość występowania blastocyst u zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak wykonać wspomagane laserem mikroiniekcje docytoplazmatyczne u zygot zwierząt gospodarskich.

A także jak wykorzystać dodatnie i ujemne ciśnienie ssania, aby zapewnić pęknięcie błony plazmatycznej w celu wydajnego dostarczania.