Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych
15 października 2016
PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.
Ogólnym celem tej pracy jest wyemitowanie nanoskalowego rozkładu 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii lokalizacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące sygnalizacji fosfoinozytolu. Na przykład, jaka jest organizacja fosfoinozytydów w nanoskali pod kompleksem sygnalizacyjnym w błonie komórkowej?
Głównymi zaletami tej techniki są wysoka rozdzielczość przestrzenna i unikanie obróbki detergentem, co jest głównym problemem w badaniach morfologicznych fosfolipidów. Podejście to obejmuje trzy główne kroki. Krok pierwszy: Przygotowanie arkusza błony plazmatycznej z żywych komórek.
Krok drugi: Znakowanie fosfoinozytolu i obrazowanie kwiatostanu pojedynczej cząsteczki. Krok trzeci: Lokalizacja pojedynczej cząsteczki i rekonstrukcja obrazowa. W dniu eksperymentu na pokrowcu ślizga się od pół do jednego mililitra PDL.
Godzinę lub dwie później wchłonąć nadmiar PDL za pomocą bibułki od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Następnie przechowuj szkiełka nakrywkowe na metalowej płytce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj wstępnie poddane kontroli komórki INS-1, które zostały wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych, z połową do jednego mililitra lodowatego PBS zawierającego jeden milimolowy EGTA.
Powtórz to pranie trzy razy i wchłonij nadmiar PBS. Teraz za pomocą pęsety umieść szkiełka nakrywkowe z hodowanymi komórkami na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL, komórką do dołu. Zrób to na schłodzonej metalowej płycie.
Następnie przenieś płytkę do czterech stopni Celsjusza na siedem do dziesięciu minut, aby dać komórkom czas na przyczepienie się. Następnie użyj pęsety, aby delikatnie usunąć szkiełko nakrywkowe załadowane komórkami, co pozostawi cienką warstwę błony komórkowej na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDL. Następnie delikatnie umyj arkusze membrany od pół do jednego mililitra lodowatego PBS.
Teraz utrwal każdy arkusz membrany w około 150 mikrolitrach lodowatego czteroprocentowego PFA z 0,2% aldehydu glutarowego w PBS. Pozwól membranom utrwalić się przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu albo natychmiast przystąp do obrazowania, albo przykryj preparaty lodowatym PBS i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Jeśli używane są sondy pH, zdecydowanie zaleca się natychmiastowe obrazowanie. Do tej procedury wykorzystuje się system SMLM oparty na mikroskopie TIRF. Przed obrazowaniem membran rozcieńczyć jeden mikrolitr roztworu kulek fluorescencyjnych w 10 mililitrach PBS z 50 milimolami chlorku magnezu.
Następnie załaduj próbkę do komory obrazowania i dodaj 200 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu, a następnie odczekaj 10 minut. Następnie przemyć próbkę trzykrotnym PBS. Teraz uruchom system obrazowania PALM.
W powiązanym oprogramowaniu do obrazowania wybierz przycisk kanału iRFP. Następnie znajdź błonę komórkową wyrażającą sondy pH w kanale iRFP, użyj kulek fluorescencyjnych do korekcji dryfu. Ustaw normalny kąt TIRF na 2140, który jest o 1,5 głębszy niż kąt krytyczny TIRF i powinien być kątem domyślnym.
Następnie użyj przycisku przechwytywania, aby zebrać konwencjonalny obraz TIRF w kanale iRFP jako odniesienie. Następnie przełącz się na kanał PAm-Cherry1, klikając przycisk Kanał RFP. Następnie przesuń pasek przewijania w padzie AOTF maksymalnie w prawo, aby uzyskać pełne oświetlenie i zastosuj laser na około 10 do 20 sekund, aby wybielić kwiatostan błony tła.
Następnie ustaw optymalne ustawienie aparatu na karcie formatu na dwa na dwa. Następnie ustaw protokół szybkiej akwizycji w zakładce ND Sequence Acquisition na 30 000 obrazów przy 20 hercach. Następnie przyłóż od 0,1 do jednego procenta mocy do lasera 405 nanometrów podczas akwizycji obrazu, aby przestrzennie izolowane punkty w każdej klatce były łatwe do zidentyfikowania.
Teraz pobierz obrazy PAm-Cherry1, klikając przycisk Uruchom teraz. Liczba cząsteczek, które mogą być aktywowane, będzie się stopniowo zmniejszać podczas przejęć. W odpowiedzi stopniowo zwiększaj intensywność lasera 405 nanometrów, aby utrzymać optymalną gęstość sygnałów.
Rejestruj obrazy, aż cały sygnał PAm-Cherry1 zostanie aktywowany. Później, podczas przetwarzania i rekonstrukcji obrazu, zidentyfikuj i zlokalizuj poszczególne zdarzenia molekularne z każdej klatki. Ustaw próg intensywności filtrowania za pomocą numeru progowego w falce.
Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym. Rozkład przestrzenny PIP2 jest wrażliwy na różne fiksacje przy prawidłowym utrwaleniu opisanym w tekście, sondy PIP2 wykazały spójny rozkład, gdy były znakowane przeciwciałem PIP2 lub specyficznymi domenami pH. Dla porównania, żywe komórki oznaczone domenami pH oznaczonymi EGFP nie obrazują się zbytnio.
Wszystkie próbki wykazały równomierny rozkład sond. Natomiast nieoptymalna fiksacja skutkowała ostrymi klastrami PIP2 i spadkiem intensywności sygnału. W optymalnych warunkach fiksacji, obrazy PIP2 w stałej rozdzielczości ujawniły jednorodny rozkład sond w znacznej części błony plazmatycznej z ograniczonymi gradientami stężeń.
Niektóre plastry błony wzbogacone sondami PIP2 były słabo rozmieszczone i miały różne rozmiary. Obrazy PALM z żywych komórek wykazywały podobny rozkład przestrzenny jak komórki stałe. Szczegółowa analiza sygnałów PIP2 wykazała, że ich dynamika była szybka na obszarach lokalnych, ale nie spowodowało to znaczących zmian w ich ogólnej liczebności.
Technika ta wprowadza nowy sposób dla naukowców zajmujących się fosfolipidami do badania rozmieszczenia i aktywności innych podtypów fosfoinozytolu w warunkach fizjologicznych.
Przegląd
Niniejsza praca bada rozkład w skali nanometrycznej fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu (PI(4,5)P2) w błonie plazmatycznej komórki z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Metoda ta pozwala na zgłębienie wiedzy na temat sygnalizacji fosfoinozytidów oraz organizacji fosfoinozytidów w błonach komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- PI(4,5)P2 odgrywa kluczową rolę w różnych funkcjach komórkowych.
- Nanostruktura organizacji PI(4,5)P2 w błonie komórkowej nie jest dobrze poznana.
- Istniejące techniki często wymagają zastosowania detergentów, co może wpływać na morfologię fosfolipidów.
- Celem niniejszego badania jest przezwyciężenie tych ograniczeń przy użyciu nowatorskiego podejścia obrazowego.
Cel badania
- W celu wyjaśnienia nanostrukturalnego rozkładu PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej.
- W celu zbadania dynamiki sygnalizacji fosfoinozytoldów.
- W celu opracowania metody unikającej zastosowania detergentów dla lepszych badań morfologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie arkuszy błony plazmatycznej z żywych komórek.
- Znakowanie fosfoinosytydów i obrazowanie z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek.
- Akwizycja i przetwarzanie obrazów w celu lokalizacji poszczególnych zdarzeń molekularnych.
- Porównanie metod fiksacji w celu oceny ich wpływu na rozkład PI(4,5)P2.
Główne wyniki
- Optymalne warunki fiksacji wykazały jednorodny rozkład PI(4,5)P2 w błonie komórkowej.
- Nieoptymalna fiksacja doprowadziła do powstania gęstych skupisk oraz zmniejszenia intensywności sygnału.
- Obrazowanie żywych komórek wykazało podobne wzorce rozkładu przestrzennego jak w przypadku komórek ufiksowanych.
- Dynamika PI(4,5)P2 była szybka w obszarach lokalnych, bez istotnych zmian w ogólnej zawartości.
Wnioski
- Badanie wprowadza nową metodę badania rozkładu fosfoinozytoldów.
- Wyniki pogłębiają zrozumienie sygnalizacji fosfoinozytoldowej w warunkach fizjologicznych.
- Technikę tę można zastosować do badania innych podtypów fosfoinozytoldów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie organizacji w nanoskali fosfoinozytoldów, takich jak PI(4,5)P2, jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celu w szlakach transdukcji sygnału. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w mechanizmy dynamiki lipidów błonowych bez artefaktów wywołanych przez detergenty, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków. Odnosi się ona do kluczowego punktu zwrotnego w walidacji celu, wyjaśniając organizację przestrzenną istotną dla oddziaływań lek-cel w błonie komórkowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ujawnienie organizacji przestrzennej PI(4,5)P2, kluczowego regulatora kanałów jonowych i kompleksów sygnalizacyjnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej wizualizacji organizacji nanodomen lipidowych w środowiskach błonowych zbliżonych do naturalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio, zapewniając jasność mechanistyczną w odniesieniu do celów zależnych od fosfoinozytoli w warunkach fizjologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne (utrwalone arkusze błon oraz żywe komórki) do dalszych testów przesiewowych ukierunkowanych na związki modulujące fosfoinozytolidy.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych odczytów przestrzennych o superrozdzielczości, co zwiększa standaryzację i powtarzalność testów.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla różnych podtypów fosfoinozytolidów, co pozwala na spójną ocenę związków w procesach odkrywania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje wierność systemu istotną dla przebiegu choroby poprzez utrzymanie rozkładu PI(4,5)P2 w obrazowaniu żywych komórek, co wspiera ekstrapolację do modeli przedklinicznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane efekty sygnalizacyjne wynikają z reorganizacji lipidów, a nie ze zmian w ich ilości, co zwiększa pewność co do wyboru celu terapeutycznego.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie nanoskalowej dynamiki lipidów z wynikami funkcjonalnymi w kontekstach patofizjologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w ciąg procesu odkrywania leków – od walidacji hipotezy dotyczącej celu, poprzez opracowanie testów, aż po przedkliniczną walidację mechanistyczną, w szczególności w przypadku celów związanych z sygnalizacją fosfoinozytydów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez rozstrzyganie organizacji nanoskalowej PI(4,5)P2 w mikrodomenach błony plazmatycznej.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne ilościowe dane przestrzenne, niezbędne do wiarygodnego screeningu związków przeciwko celom modulującym lipidy.
- Analityka: Zapewnia wyniki lokalizacji i rekonstrukcji pojedynczych cząsteczek, które umożliwiają porównanie rozkładu lipidów w zmiennych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną dzięki obrazowaniu żywych komórek, które odzwierciedla wzorce rozkładu w komórkach utrwalonych w warunkach fizjologicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania metod obrazowania do badania wielu podtypów fosfoinozytoli, redukując nadmiarowe prace nad opracowaniem metod w ramach poszczególnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacyjnych zależnych od fosfoinozytydów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki protokołom zoptymalizowanym pod kątem fiksacji oraz obrazowaniu pojedynczych cząsteczek z korekcją dryfu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez wyjaśnienie mechanizmów zależnych od lipidów, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach rozwoju celów terapeutycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną organizację przestrzenną kluczowych lipidów sygnalizacyjnych błony.
Kwestie implementacyjne
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek oraz przygotowywania arkuszy błon plazmatycznych.
- Konieczny jest system SMLM oparty na TIRF z aktywacją laserową i korekcją dryftu przy użyciu kulek fluorescencyjnych.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów fiksacji między zespołami, aby uniknąć artefaktów w postaci klastrowania sygnałów PI(4,5)P2.
- Należy rozważyć niezbędne modyfikacje przy rozszerzaniu metody na inne podtypy fosfoinozytoli lub modele komórkowe istotne dla badanych schorzeń.
- Ograniczenie praktyczne: interpretacja sygnału musi uwzględniać szybką dynamikę lokalną, która nie zmienia całkowitej zawartości lipidów, co odnotowano w danych z żywych komórek.
