Name: Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj nanorozdzielcze obrazowanie PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki. Ta metoda pozwala badać sygnalizację fosfoinozytoli bez użycia detergentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. jest częściowo wspierany przez American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, dla C.J.).

1. Przygotowanie i utrwalenie arkusza membrany
<ol>
	<li>Przygotowanie arkuszy membranowych oznaczonych za pomocą iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1
	<ol>
		<li>Przygotuj plazmid DNA kodujący iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ123 przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.</li>
		<li>Hodowla komórek INS-1 na #1,5 18 mm okrągłych szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych 30 μg/ml fibronektyny do 50-70% konfluencji zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych INS-138,39. Transfekcja komórek dzień po osiągnięciu 50 do 70% konfluencji.</li>
		<li>Transfekcja komórek za pomocą iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1 przy użyciu odczynnika do transfekcji liposomów zgodnie z protokołami producenta. Po transfekcji pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin.</li>
		<li>W dniu eksperymentu posmarować szkiełka nakrywkowe (jednostronnie) ~0,5 - 1 ml 500 μg/ml Poli-D-Lizyny (PDL; rozcieńczonej wdH2O) przez 1-2 godziny. Następnie odsączyć PDL, umieszczając bibułę na krawędzi szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełka nakrywkowe na wstępnie schłodzonej (4 °C) metalowej płytce do późniejszego użycia.</li>
		<li>Wstępnie transfekowane komórki INS-1 rosnące na szkiełkach nakrywkowych przemyć ~0,5 - 1 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1 mM EGTA. Powtórz pranie trzy razy i odcedź PBS.</li>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe z hodowanymi komórkami (stroną z komórkami skierowaną w dół) na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL na wstępnie schłodzonej metalowej płytce za pomocą pęsety. Pozostaw płytkę w lodówce (4 °C) na 7 - 10 minut, aby komórki mogły przymocować się do szkiełek nakrywkowych pokrytych PDL (Rysunek 2). 
		UWAGA: Czas inkubacji powinien mieścić się w zakresie 7 - 10 minut, aby lepiej przymocować komórki do powierzchni pokrytej PDL. Środowisko lodówki jest suche, a inkubacja nie powinna być zbyt długa.</li>
		<li>Wyjmij metalową płytkę z lodówki. Delikatnie odklej szkiełko nakrywkowe zawierające wstępnie transfekowane komórki za pomocą pęsety. W ten sposób powstaje cienka warstwa arkusza błony komórkowej na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDL. Delikatnie umyj arkusze membrany ~0,5 - 1 ml lodowatego PBS, a następnie utrwal ~0,5 - 1 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA) + 0,2% aldehydu glutarowego (GA) w PBS przez 15 minut w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Paraformaldehyd i aldehyd glutarowy są toksyczne. Przechowuj je pod wyciągiem z ochroną skóry i oczu.</li>
		<li>Po utrwaleniu należy natychmiast zobrazować arkusze membrany (patrz punkt 3) lub przechowywać w ~0,5 - 1 ml PBS w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Po zamocowaniu arkusza membrany nie będzie równowagowego wiązania sond pH z cytozolu do PI(4,5)P2. Związane sondy pH będą stopniowo oddzielać się od arkusza membrany i dyfundować do roztworu (chociaż może to potrwać od kilku dni do tygodni). Dlatego zaleca się obrazowanie utrwalonych próbek zaraz po ich przygotowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować arkusze membrany do znakowania przeciwciał specyficznych dla PI(4,5)P2
	<ol>
		<li>Hodowla komórek INS-1 na #1,5, 18 mm okrągłych szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych 30 μg/ml fibronektyny do 50%-70% konfluencji. Komórki transfekcyjne z plazmidem DNA następnego dnia, jak opisano w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Powtórz kroki od 1.1.4 do 1.1.7 zgodnie z powyższym opisem. 
		UWAGA: Wykonaj następujące procedury w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć szkiełka nakrywkowe zawierające stałe arkusze PM trzykrotnie ~0,5 - 1 ml lodowatego PBS zawierającego 50 mM NH4Cl. Zgasić arkusze ~0,5 - 1 ml 0,1% borowodorku sodu w PBS przez 7 minut i przemyć ~0,5 - 1 ml PBS (bez 50 mM NH4Cl).</li>
		<li>Zablokować próbki ~0,5 - 1 ml roztworu blokującego (roztwór PBS zawierający 5% (v/v) normalnej surowicy koziej, 5% (v/v) albuminy surowicy bydlęcej i 50 mM NH4Cl) przez 45 min. Następnie inkubować z ~0,5 - 1 ml pierwszorzędowego przeciwciała PI(4,5)P2 (rozcieńczenie 1:300) w roztworze blokującym przez 1 godzinę. Przemyć trzy razy (za każdym razem 10 min) ~0,5 - 1 ml PBS zawierającym 50 mM NH4Cl.</li>
		<li>Inkubować próbki z ~0,5 - 1 ml wtórnego przeciwciała F(ab')2-koziego anty-myszy sprzężonego z fluoroforami (1:300) w buforze blokującym przez 1 godzinę. Przemyć trzykrotnie ~0,5 - 1 ml PBS.</li>
		<li>Próbki po utrwaleniu należy pobrać z 4% PFA + 0,2% GA przez 15 minut, a następnie przemyć próbki trzykrotnie PBS (za każdym razem 7 minut). Przejdź do sekcji 3 w celu obrazowania lub przechowuj w ~0,5 ~ 1 ml PBS w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania. 
		UWAGA: Przygotować próbki w temperaturze 4 °C. Użyj utrwalacza 4% PFA + 0,2% GA, aby zachować fizjologiczny rozkład fosfoinozytydów w PM. Przygotowanie RT lub utrwalenie samym 4% PFA może spowodować znaczne artefakty (Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli komórkowych do obrazowania żywych komórek za pomocą mEOS3.1-PHPLCδ1
<ol>
	<li>Przygotuj plazmid DNA kodujący mEOS3.1-PHPLCδ1, jak opisano wcześniej 23.</li>
	<li>Hodowla komórek INS-1 na #1,5 18 mm okrągłych szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych 30 μg / ml fibronektyny, aż osiągną 50%-70% konfluencji zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórek INS-138,39.</li>
	<li>Następnego dnia transfekować komórki INS-1 plazmidem DNA mEOS3.1-PHPLCδ1 za pomocą odczynnika do transfekcji liposomów zgodnie z protokołem produkcyjnym. Inkubować przez 48 godzin przed obrazowaniem.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu PALM arkuszy membranowych i żywych komórek
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu PALM arkuszy membranowych 
	UWAGA: W tym przypadku do akwizycji wszystkich obrazów używany jest system SMLM oparty na mikroskopie z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRF) (olej 100X, APO, NA = 1,49, WD 0,12 mm) 23 .
	<ol>
		<li>Przed obrazowaniem rozcieńczyć 1 μl roztworu kulek fluorescencyjnych w 10 ml PBS + 50 mM MgCl2. Dodać 200 μl rozcieńczonego roztworu do komory obrazowania zawierającej próbki komórek (z etapów 1.1.8/1.2.6) na 10 minut. Następnie trzykrotnie umyj PBS.</li>
		<li>Uruchom system obrazowania PALM. W powiązanym oprogramowaniu do obrazowania wybierz przycisk "Kanał iRFP" (wzbudzenie laserem 642 nm, emisja 700/75 nm). Znajdź sondy pH eksprymujące błonę komórkową w kanale iRFP. 
		UWAGA: Arkusz membrany powinien mieć w pobliżu koralik fluorescencyjny. Jest to wymagane do późniejszej korekty dryftu.</li>
		<li>Użyj przycisku "Przechwyć", aby zebrać konwencjonalny obraz TIRF błony komórkowej w kanale iRFP jako odniesienie do przyszłej rekonstrukcji obrazu. Ustaw normalny kąt TIRF (tj. po osiągnięciu kąta krytycznego obróć o kolejne 1,5 stopnia), wpisując 2140 w ustawieniu kąta TIRF dla obrazowania. Użyj tego ustawienia kąta dla wszystkich kroków, chyba że zaznaczono inaczej. 
		UWAGA: W opisanym tutaj systemie TIRF 3,500 to kąt pionowy w górę, 2,200 to kąt krytyczny TIRF, a 2140 to normalny kąt TIRF, który jest o 1,5 stopnia większy po kącie krytycznym TIRF. Wąski kąt TIRF wspomniany poniżej w 3.2.3 wynosi 2120, co po osiągnięciu kąta krytycznego TIRF wynosi kolejne 2 stopnie.</li>
		<li>Przełącz się na kanał PAmCherry1, klikając przycisk kanału RFP (wzbudzenie 561 nm, filtr emisji 600/50 nm). Przesuń pasek przewijania w padzie "AOTF" maksymalnie w prawo, aby uzyskać pełne oświetlenie lasera 561 nm przez 10-20 sekund, aby wybielić fluorescencję membrany tła.</li>
		<li>Ustaw optymalne ustawienie kamery (binning 2x2) w zakładce "Format" i protokół szybkiej akwizycji w zakładce "Akwizycja sekwencji ND" (zwykle 10 000-40 000 zdjęć przy 20 Hz).</li>
		<li>Akwizycję obrazów PAmCherry1 (laser 561 nm przy pełnej mocy, 50 ms/klatkę) z jednoczesną aktywacją lasera 405 nm na niskim poziomie (0,1% - 1%) należy rozpocząć od kliknięcia przycisku "Uruchom teraz". Dostosuj intensywność lasera 405 nm tak, aby przestrzennie izolowane poszczególne punkty w każdej klatce były łatwe do zidentyfikowania. 
		UWAGA: Liczba aktywowanych cząsteczek PAmCherry1 zmniejsza się stopniowo podczas akwizycji. Natężenie lasera 405 nm powinno być stopniowo zwiększane, aby utrzymać optymalną gęstość sygnałów poszczególnych cząsteczek w każdej klatce.</li>
		<li>Kontynuuj pozyskiwanie obrazów, aż nie zostanie aktywowany żaden sygnał pojedynczej cząsteczki PAmCherry1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie metodą PALM w żywych komórkach
	<ol>
		<li>Przed obrazowaniem należy rozcieńczyć kulki fluorescencyjne w komorze obrazowania na 10 minut, jak opisano w kroku 3.1.1. Następnie rozpocznij obrazowanie PALM, otwierając powiązane oprogramowanie do obrazowania. 
		UWAGA: Użyj magnetycznej komory obrazowania z szybkozłączką do obrazowania żywych komórek. Utrzymuj środek pola obrazowania na poziomie 35 °C za pomocą regulatora temperatury pod stałą perfuzją z buforem zewnątrzkomórkowym (roztwór zewnątrzkomórkowy: 135 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 3 mM glukozy i 20 mM HEPES; pH = 7,3).</li>
		<li>Wybierz przycisk kanału GFP (emisja 525/50 nm). Zidentyfikuj sondy fluorescencyjne z ekspresją błony komórkowej na podstawie zielonej fluorescencji z mEOS3 pod wzbudzeniem laserowym 488 nm. Upewnij się, że pobliskie koraliki fluorescencyjne są również uwzględnione podczas obrazowania, ponieważ jest to później wymagane do korekcji dryfu offline.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Przechwyć", aby zebrać obraz TIRF błony komórkowej w kanale mEOS3 (zielony) jako obraz referencyjny. Użyj płytkiego oświetlenia wzbudzenia falą ulotną (po osiągnięciu kąta krytycznego obróć o kolejne 2 stopnie), wpisując 2120 w ustawieniu kąta TIRF dla obrazowania żywych komórek. 
		UWAGA: Minimalizuje to fluorescencję z niezwiązanego mEos3-PH w cytozolu przylegającym do błony plazmatycznej.</li>
		<li>Przełącz na przycisk "Kanał RFP" (wzbudzenie 561 nm, emisja 600/50 nm). Użyj lasera o pełnej mocy 561 nm, aby wybielić fluorescencję tła arkuszy membrany przez 10 ~ 20 sekund za pomocą paska przewijania w "Padzie AOTF" (patrz 3.1.4).</li>
		<li>Akwizycję obrazu należy rozpocząć od kliknięcia przycisku "Uruchom teraz" w kanale czerwonym (pełna moc 561 nm, ustawiona na 10 ms/klatkę w zakładce ustawień "kamera") z jednoczesną aktywacją lasera 405 nm. Dostosuj intensywność lasera 405 nm, aby aktywować przestrzennie oddzielone punkty w każdej klatce. 
		UWAGA: W miarę postępu akwizycji liczba cząsteczek δ1 nieprzekształconych mEOS3.1-PHPLC powoli maleje. Stopniowo zwiększaj moc lasera 405 nm, aby zoptymalizować sygnał pojedynczej cząsteczki. Długość akwizycji obrazowania zależy od celu eksperymentalnego. Rejestruj obrazy w sposób ciągły przez 5 minut w normalnych warunkach. Jeśli wymagane jest dłuższe pobieranie, zbierz wiele stosów obrazów zamiast jednego, dużego stosu obrazów. Rozmiar pliku każdego stosu obrazów nie powinien przekraczać 4 GB, w przeciwnym razie wpłynie to na późniejszą analizę oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i rekonstrukcja obrazu SMLM
<ol>
	<li>Prześlij pliki obrazów (.tif stosy obrazów) do stacji analizy obrazu. Uruchom program do rekonstrukcji obrazu (napisany na zamówienie) w Matlabie zgodnie z wcześniejszym opisem37 i załaduj stos obrazów, klikając zakładkę "Plik" w menu głównym, następnie "otwórz", a następnie "nowy plik".</li>
	<li>Identyfikuj i lokalizuj poszczególne zdarzenia molekularne z każdej klatki. Ustaw próg intensywności filtrowania z numerem progowym (1-10) w "falce". Przed rekonstrukcją należy zweryfikować optymalne ustawienia parametrów do wizualnego wykrywania punktów. Następnie przejdź do zakładki "PALM" i kliknij "proces jednoetapowy", aby rozpocząć rekonstrukcję obrazu. 
	UWAGA: Próg intensywności wykrywania punktów jest arbitralny i zależy od osobistego doświadczenia. Może być wymaganych kilka prób w celu wygenerowania optymalnego progu wykrywania, który ani nie wychwytuje zbyt wielu niekwalifikowanych (przyciemnionych) punktów, ani nie odfiltrowuje zbyt wielu kwalifikowanych (jasnych) punktów. Dostosuj inne parametry, aby zoptymalizować analizę danych. W tym przypadku odległość sąsiedztwa (punkty fluorescencji w sąsiednich ramkach w obrębie odległości są łączone) jest ustawiona na 65 nm (1/2 szerokości piksela) i dopasowana jako pojedyncza cząsteczka. Ramki przerwy (pojedyncze zdarzenia cząsteczkowe, które wystąpiły w tych ramkach i odległości sąsiedztwa, zostały połączone i dopasowane jako zdarzenie pojedynczej cząsteczki) jest ustawione na 26 ramek (1,3 s) dla obrazowania PAmCherry140. Dostosuj ten parametr do właściwości sond jednocząsteczkowych i szybkości akwizycji, aby uniknąć nadmiernego zliczania40 w SMLM. Zastosuj korekcję dryfu za pomocą koralików fluorescencyjnych podczas rekonstrukcji.
	<ol>
		<li>W przypadku obrazowania stałych arkuszy membranowych oznaczonych przez iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1, zrekonstruuj całe stosy obrazów z tego samego arkusza membrany w jeden obraz o wysokiej rozdzielczości37.</li>
		<li>W przypadku próbek żywych komórek oznaczonych przez mEOS3.1-PHPLCδ1 należy rozdzielić cały stos obrazów na kilka mniejszych stosów po 1,000 klatek, tak aby stos 1,000 kolejnych klatek był rekonstruowany jako pojedynczy obraz o wysokiej rozdzielczości, który ma rozdzielczość czasową 10 sekund. Na koniec połącz wszystkie obrazy szeregów czasowych w końcowy stos szeregów czasowych23, 
		UWAGA: W obrazowaniu PALM z żywymi komórkami niewielka liczba aktywowanych sond może przesunąć się lub oddzielić od PI(4,5)P2 w PM przed wybielaniem. Aby uwzględnić nadpróbkowanie sond, należy połączyć sygnały pojedynczych cząsteczek w sąsiednich ramkach w promieniu 130 nm (zamiast 65 nm) w jedno zdarzenie emisyjne podczas analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po uzyskaniu zrekonstruowanych obrazów przeprowadź dalszą analizę obrazu za pomocą specjalnie napisanego programu w Matlabie, aby określić ilościowo gęstość cząsteczek, gęstość/rozmiar mikrodomeny oraz analizę skupień z korelacją par41.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu rozwiązywania problemów należy zwrócić szczególną uwagę na dwa procesy: produkcję arkuszy membranowych i utrwalanie próbek. Jak opisano w protokole, czas inkubacji szkiełek nakrywkowych w kroku 1.1.6 jest ważny dla produkcji arkuszy membranowych. Optymalny czas inkubacji w naszych warunkach eksperymentalnych wynosi 7-10 minut (ryc. 2). Inkubacja dłuższa niż 10 minut spowoduje powstanie nienaruszonych komórek zamiast arkuszy membrany na szkiełkach nakrywkowych PDL, a krótsza inkubacja doprowadzi do zmniejszenia liczby arkuszy membrany lub ich braku na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL. Jak opisano w protokole, utrwalacze i temperatura podczas utrwalania mają kluczowe znaczenie dla utrzymania rozkładu PI(4,5)P2 w PM. Utrwalenie w RT lub użycie samego 4%-PFA może zniekształcić normalny rozkład lipidów w PM.
Stosując mikroskopię PALM do badań lipidów błonowych, jesteśmy w stanie zaobserwować rozkład PI(4,5)P2 w skali nanometrowej, kluczowego fosfoinozytydu, który pośredniczy w wielu podstawowych czynnościach komórkowych. Ten przestrzenny rozkład PI(4,5)P2 z ograniczonymi gradientami stężeń w komórkach INS-1 zapewnia ramy do ponownego przemyślenia interakcji lipidowo-białkowych i lokalnych zdarzeń sygnalizacyjnych PI(4,5)P2 w tych komórkach. Co więcej, metody opracowane w tej pracy mogą być również zastosowane do innych badań fosfolipidów błonowych za pomocą odpowiednich sond, oferując tym samym nowe narzędzia do badania fosfoinozytydów w procesach biologicznych.
Zastosowanie arkuszy membranowych w tej pracy omija dwa główne problemy w badaniach morfologicznych fosfolipidów: obróbkę detergentem i potencjalne zanieczyszczenie sygnału z cytozolu. Detergenty często powodują grupowanie się i znaczną utratę sygnału fosfolipidowego PM. Zanieczyszczenie sygnału cytozolowego jest szczególnie problematyczne w przypadku fosfoinozytydów o niskiej liczebności na PM23, takich jak PI(3,4,5)P3 i PI(3,4)P2. Próbki arkuszy membranowych są w stanie obejść te problemy bez znaczącego zakłócania struktur związanych z błoną plazmatyczną, takich jak korowa siatka aktynowa i wgłębienia pokryte klatryną42,43. Względny jednorodny rozkład PI(4,5)P2 w PM jest dobrze zgodny z innymi badaniami szybkiego zamrażania EM przy użyciu sond GST-PHPLCδ1 w błonie fibroblastów44.
Należy pamiętać, że niewłaściwe warunki przetwarzania próbki mogą generować mylące wyniki. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby wykonać etapy mocowania w niższej temperaturze (4 °C) i użyć utrwalacza GA do produkcji arkuszy membranowych. Jak pokazano na rysunku 3, ciepła temperatura i wiązanie PFA bez GA nie są wystarczające do wiązania fosfoinozytydów w komórce PM. Może to zniekształcić nienaruszoną dystrybucję PI(4,5)P2 i generować ostre skupiska, których nie obserwuje się w żywych komórkach w warunkach fizjologicznych. Po drugie, zastosowanie PAmCherry1 jako sondy SMLM, a nie innych sond, ma kluczowe znaczenie dla ilościowego obrazowania PALM. Zaletą aplikacji PAmCherry1 są dobrze scharakteryzowane jednocząsteczkowe właściwości fotofizyczne35,40,45, takie jak jasność, wysoka wydajność fotoaktywacji, a przede wszystkim bardzo ograniczone mruganie zdjęcia. Właściwości te pozwalają nam wyeliminować potencjalne artefakty klastrowe z mrugania zdjęć i ilościowo analizować gęstość cząsteczkową błony PI(4,5)P2.
Takie podejście ma też swoje ograniczenia. Po pierwsze, metoda arkusza błonowego zastosowana w tym badaniu może nie naśladować w pełni fizjologicznego rozkładu PI(4,5)P2 , ponieważ komórka jest zakłócona przed obrazowaniem. Jednak nasze obrazowanie PALM na żywo pokazuje podobny, stosunkowo jednorodny rozkład PI(4,5)P2, co potwierdza wyniki zaobserwowane w próbkach arkuszy membranowych. Po drugie, jak omówiliśmy w naszej poprzedniej pracy23, SMLM wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie obrazowania i dodatkowej uwagi, aby uniknąć artefaktów obrazowania, które mogą powstać w wyniku różnych procesów, w tym używanych sond, przygotowania i utrwalania próbek, próbkowania i rekonstrukcji obrazu. Wreszcie, chociaż sondy i przeciwciała oparte na domenie PH były szeroko stosowane w badaniach fosfoinozytydu46,47 , możliwe jest, że nie wszystkie PI(4,5)P2 w błonie można wykryć za pomocą tego podejścia. Na przykład PI(4,5)P2 związany przez inne endogenne białka może nie być dostępny dla sond PH lub przeciwciał, a to może powodować niedoszacowanie PI(4,5)P2 ze względu na przeszkodę przestrzenną samej sondy. Alternatywnym sposobem oznaczania PI(4,5)P2 byłoby użycie Top-Fluor PI(4,5)P248, wstępnie znakowanego analogu PI(4,5)P2 z modyfikacją na końcu oryginalnego PI(4,5)P2. Jednak może być szybko przekształcany w inne podtypy fosfoinozytolu przez szybki metabolizm żywych komórek, ponieważ jego pierścień inozytolowy jest taki sam jak endogenny PI(4,5)P2. Rodzi to obawy, czy ten wstępnie znakowany analog PI(4,5)P2 w żywych komórkach może wiernie reprezentować PI(4,5)P2 , a nie jego produkty metaboliczne. Dlatego, pomimo pewnych ograniczeń, sondy oparte na domenie PH są nadal jednymi z najlepszych sond, które są szeroko stosowane do monitorowania dystrybucji PI(4,5)P2 i dynamiki PM komórek.
Przyszłe zastosowanie tej metodologii może zostać rozszerzone na inne badania fosfoinozytylu, takie jak PI(3,4,5)P3 i PI(3,4)P2. Podsumowując, nowatorskie podejście SMLM zastosowane w tym projekcie otwiera nowe możliwości badania fosfoinozytolu w komórkach. Na przykładzie PI(4,5)P2 pokazujemy unikalne właściwości obrazowania PALM w badaniu morfologicznym i ilościowym cząsteczek błony komórkowej, a także jego wady. Podejście to można dostosować do innych interesujących nas cząsteczek i będzie miało szerokie zastosowanie w biologii komórki.

Fosfoinozytydy stanowią niewielką część całkowitej warstwy lipidów błonowych, ale odgrywają kluczową rolę w różnych procesach komórkowych. Zawierają one siedem członków pochodzących z odwracalnej fosforylacji lub defosforylacji pierścieni inozytolu na3., 4. i 5. pozycji 1. 4-fosforan fosfatydyloinozytolu (PI4P) i 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) to dwa główne fosfoinozytydy, które działają stosunkowo niezależnie jako lipidy determinujące błonę komórkową plazmatyczną (PM) 2,3. Fosfatydyloinozytol (3,4,5)-trifosforan (3) występuje znacznie mniej obficie niż PI4P i PI(4,5)P2, ale ma unikalne funkcje w różnych procesach komórkowych, w tym w raku4 i cukrzycy5. Lipidy te mają złożone interakcje molekularne z ich efektorami i wieloma innymi białkami. Dlatego tak ważne jest zrozumienie organizacji przestrzennej tych fosfoinozytydów w PM w skali nanometrowej.
Coraz więcej dowodów pokazuje, że kompleksy białkowe lub klastry molekuł w ograniczonych obszarach PM mogą służyć jako hotspoty sygnalizacyjne6. Na przykład syntaksyna 1a, kluczowe białko regulujące fuzję błonową7-9, wykazuje organizację klastrów w PM. W odróżnieniu od konsensusu poglądu na organizację klastrową składni 1a, przestrzenny rozkład fosfoinozytydów w PM jest kontrowersyjny. Wzorce rozmieszczenia PI(4,5)P2 wahają się od jednolitych10-12, dużych plam13,14 do gęstych klastrów14-18, w zależności od typów komórek i zastosowanych metod eksperymentalnych. Niespójna jest również organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 w wyższej rozdzielczości. Badanie z użyciem mikroskopii wymuszonej emisji i zubożenia (STED) 19 ujawniło dużą liczbę gęstych nanoklastrów PI(4,5)P2 (o średnicy ~ 73 nm) w arkuszach PM komórek PC-12 20. Wynik ten różni się od badań wykorzystujących szybką zamrażanie mikroskopii elektronowej (EM)21,22, podejścia, które zachowuje nienaruszoną strukturę PM żywych komórek znacznie lepiej niż utrwalanie chemiczne. Ten ostatni wykazywał wyraźne pule PI(4,5)P2; stosunkowo skoncentrowany PI(4,5)P2 w kaweolach i powlekanych dołach, a także równomierny rozkład na płaskim obszarze PM. Co więcej, organizacja PI(4,5)P2 w nanoskali w arkuszach membranowych może różnić się w żywych i stałych komórkach. Nasze ostatnie prace badały ten problem zarówno w stałych, jak i żywych komórkach INS-1 przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki (SMLM)23.
SMLM opiera się na stochastycznie włączaniu tylko małego podzbioru fluoroforów w danym momencie, dzięki czemu poszczególne fluorofory mogą być zlokalizowane z dużą precyzją. Wiele podejść do obrazowania superrozdzielczego zostało opracowanych przy użyciu podobnych zasad, aby przekroczyć limit dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, takich jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM)24, mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM)25, stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)26,27 i bezpośrednia STORM (dSTORM)28. Dzięki fotoprzełączalnym lub fotoaktywowanym fluoroforom (barwnikom lub białkom fluorescencyjnym), techniki SMLM pozwalają naukowcom obrazować struktury biologiczne w rozdzielczościnanometrowej 24,29,30 z częstotliwością wideo w żywych komórkach31,32.
Używając PI(4,5)P2 jako przykładu, wprowadziliśmy podejście SMLM do badania nanoskalowego rozkładu fosfoinozytydów na PM. Domena PH PLCδ1 (fosfolipaza C δ1), która specyficznie wiąże się z PI(4,5)P2, jest dobrze ugruntowaną sondą do obrazowania dystrybucji subkomórkowej PI(4,5)P2 i dynamiki33,34 w PM. Genetycznie oznaczyliśmy tę domenę dwoma białkami fluorescencyjnymi, PAmCherry135 i iRFP36, aby wytworzyć dwukolorowe białko fuzyjne (iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1) (Figura 1A-B). PAmCherry1 służy jako fotoaktywowana sonda domeny PH dla PALM, a iRFP służy jako ogólny wskaźnik do identyfikacji transfekowanych komórek przed akwizycją PALM. Stosujemy tę dwukolorową sondę fluorescencyjną do obrazowania SMLM w stałych arkuszach membranowych. W przypadku obrazowania PALM na żywo oznaczyliśmy mEOS337 zamiast PAmCherry1 do domeny PHPLCδ1, aby wygenerować sondę mEOS3.1-PHPLCδ1 w celu uzyskania lepszej wydajności i jasności fotonów (rysunek 1C-D).
Obrazowanie SMLM za pomocą tych nowatorskich sond w PM komórek INS-1 wydzielających insulinę38 odkryło jednorodne znakowanie PI(4,5)P2 w większości regionów PM, jak również skoncentrowane mikrodomeny PI(4,5)P2, które są słabo wymieszane w płaskim PM i niektóre struktury podobne do filopodiów23. Nanoskalowy rozkład PI(4,5)P2 stanowi strukturalną podstawę do ponownego przemyślenia jego funkcjonowania w żywych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS</td><td>camera Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Wirujący dysk</td><td>Yokogawa</td><td>CSU X-1, 10 000 obr./min&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Monolityczny łącznik laserowy dużej mocy SP z laserami 405, 488, 561 i 642 nm.</td>Oryginalne moce i moce lasera <td>Agilent</td><td>MLC400</td><td>na końcu światłowodu) 405&nbsp; nm: 15 mW & 13&nbsp; Mw; 488&nbsp; nm: 45 mW i 42&nbsp; Mw; 561&nbsp; nm: 45 mW i 40&nbsp; Mw; 640&nbsp; nm: 35 mW i 16&nbsp; Mw.</td></tr><tr><td>Obiektyw 100X</td><td>Nikon</td><td></td><td>APO 100X Olej, NA 1.49, WD 0.12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy Nikon (NIS Element)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Warner</td><td>64-0714</td><td>Round 18&nbsp; mm szkiełko nakrywkowe, #1.5</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore</td><td>FC010-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 (odczynnik do transfekcji)</td> <td>Invitrogen</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td> <td>aldehydu glutarowego</td> <td>Nauka#16120</td><td></td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 1st przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53412</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne&nbsp; F(ab')2-kozioł anty-myszy Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21237</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Tetraspeck</td> Magnetyczna komora obrazowania <td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr> z <tr><td>szybkozłączką&nbsp;</td><td>Regulator temperatury Warner Instruments</td><td>Cat#641994</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3780</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldyhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Fosfoinozytydy w błonie komórkowej są lipidami sygnalizacyjnymi o wielu funkcjach komórkowych. 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) jest determinantem fosfoinozytolu błony komórkowej (PM) i jest niezbędny do modulowania kanałów jonowych, dynamiki aktyny, egzocytozy, endocytozy, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i wielu innych procesów komórkowych. Jednak organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 w PM jest kontrowersyjna, a jej rozkład w nanoskali jest słabo poznany ze względu na ograniczenia techniczne podejść badawczych. Tutaj, wykorzystując mikroskopię lokalizacji pojedynczych cząsteczek i dwukolorowe sondy fluorescencyjne oparte na domenie Pleckstrin Homology (PH), opisujemy nowatorską metodę wizualizacji nanoskalowego rozkładu PI (4,5) P2 w PM w utrwalonych arkuszach membranowych, a także w żywych komórkach.

Niepewność lokalizacji (σ) naszego systemu superrozdzielczego wynosi 14,73 nm23. Bezpośrednie porównania obrazów TIRF i PALM wykazały znaczną poprawę rozdzielczości przestrzennej. Rycina 3A-B przedstawia reprezentatywne obrazy TIRF PI(4,5)P2 znakowane przeciwciałem przeciwko PI(4,5)P2 oraz iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1 w typowych arkuszach błony oraz żywych komórkach. Obrazy uzyskane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii TIRF w arkuszach błony są niezwykle podobne do obrazów nienaruszonych żywych komórek znakowanych domenami PH z tagiem wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) (EGFP-PHPLCδ1) (Rycina 3C). Wszystkie próbki wykazały równomierny rozkład sond. W przeciwieństwie do tego, nieoptymalna fiksacja próbek doprowadziła do powstania ostrych, gęstych klastrów PI(4,5)P2 oraz spadku intensywności sygnału (Rycina 4). W optymalnych warunkach fiksacji obrazy superrozdzielcze PI(4,5)P2 w utrwalonych komórkach (Rycina 5) ujawniły jednorodny rozkład sond w znacznej części PM z jedynie ograniczonymi gradientami stężeń. Niektóre fragmenty błony wzbogacone w sondy PI(4,5)P2 były rozproszone i miały różne rozmiary. Obrazy PALM żywych komórek wykazują podobny rozkład przestrzenny jak w komórkach utrwalonych (Rycina 6). Szczegółowa analiza sygnałów PI(4,5)P2 w czasie wskazuje na szybką dynamikę w obszarach lokalnych, bez znaczących zmian ich liczebności w obszarach szerokich.
<img alt="Schemat mikroskopii TIRF i nadrozdzielczej; szczegóły długości fal wzbudzenia i emisji; konfiguracja obrazowania." src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat sond fluorescencyjnych użytych w niniejszym badaniu. (A-B) Sonda iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1 użyta w eksperymentach z utrwalonym arkuszem błony. Podczas konwencjonalnego obrazowania TIRF (A) laser 640 nm jest używany do wzbudzenia iRFP (Ex: 692 nm; Em: 713 nm). Obraz TIRF wykonany w tych warunkach służy jako obraz referencyjny TIRF dla obrazowania nadrozdzielczego uzyskanego metodą PALM (B). Laser 405 nm jest używany do fotoaktywacji fluoroforu PAmCherry1, a laser 561 nm do wzbudzenia PAmCherry1 (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) w celu obrazowania PALM. (C-D) Sonda mEos3.1-PHPLCδ1 użyta w eksperymentach na żywych komórkach. (C) Podczas konwencjonalnego obrazowania TIRF laser 488 nm jest używany do wzbudzenia mEOS3.1 (Ex: 506 nm; Em: 519 nm). (D) Po fotokonwersji laserem 405 nm, mEos3.1 przekształca się w formę czerwoną (Ex: 573 nm; Em: 584 nm), a laser 561 nm jest używany do akwizycji PALM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat obrazowania TIRF i PALM; układ hodowli komórkowej na szkiełku podstawowym pokrytym PDL; przyleganie błony." src="/files/ftp_upload/54466/54466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat przygotowania arkusza błony z komórek INS-1. (A) Położyć szkiełko podstawowe z hodowlą komórek stroną z komórkami do dołu na szkiełko podstawowe pokryte PDL i odczekać 7 ~ 10 min w temperaturze 4 °C, aby umożliwić przyleganie komórek do szkiełka pokrytego PDL. (B) Odczepić górne szkiełko podstawowe za pomocą pęsety i utrwalić arkusz błony przytwierdzony do szkiełka wstępnie pokrytego PDL. (C) Wykonać obrazowanie próbek metodami TIRFM i PALM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia arkuszy błony, PI(4,5)P, barwienie przeciwciałami, PFA, GA, fluorescencja, próbka żywych komórek." src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 jest podobna w arkuszach błony i w nienaruszonych żywych komórkach pod konwencjonalnym mikroskopem TIRF. (A) Typowy obraz TIRF arkuszy błony utrwalonych w 4 °C za pomocą 4% PFA i 0,2% GA. PI(4,5)P2 został znakowany specyficznym przeciwciałem przeciwko PI(4,5)P2. (B) Arkusz błony z komórki INS-1 wykazującej ekspresję iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1. (C) Obraz TIRF dwóch nienaruszonych żywych komórek wykazujących ekspresję EGFP-PHPLCδ1 na różnych poziomach. Paski skali: (A): 3 µm; (B) i (C): 5 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej, porównanie fiksacji komórek w 37°C i w temperaturze pokojowej (RT) z użyciem 4% PFA, eksperyment." src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Organizacja przestrzenna PI(4,5)P2 w arkuszach błony jest wrażliwa na powszechnie stosowane warunki fiksacji. (A) Arkusze błony utrwalone w 37 °C samym 4% PFA i znakowane swoistym przeciwciałem przeciwko PI(4,5)P2 (podobnie jak na Rycini 3A). (B) Arkusz błony utrwalony w RT samym PFA i znakowany swoistym przeciwciałem przeciwko PI(4,5)P2. Należy zauważyć, że gęste skupiska sond PI(4,5)P2 są wyraźnie widoczne pod mikroskopem TIRF, w przeciwieństwie do znacznie bardziej jednorodnych obrazów fluorescencji przedstawionych na Rycini 3A. Paski skali: A-B: 3 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia TIRF i PALM: schemat trójpanelowy, obrazowanie komórki, analiza wysokiej rozdzielczości." src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Obrazowanie PALM sond PI(4,5)P2 ujawnia ich rozkład w skali nanometrycznej w błonie plazmatycznej (PM) komórki INS-1. (A) Obraz iRFP TIRF arkusza błony z komórki INS-1 wykazującej ekspresję iRFP-PAmCherry1-PHPLCδ1. (B) Odpowiadający mu obraz PALM PM w tym samym obszarze, oparty na rekonstrukcji sygnału PAmCherry1. Zauważalny jest jednorodny rozkład przestrzenny PI(4,5)P2 w głównych regionach PM oraz kilka mikrodomen PI(4,5)P2 . (C) Powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w (B). Strzałki wskazują rzadko rozmieszczone mikrodomeny PM wzbogacone w sondy PI(4,5)P2. Paski skali: A i B: 3 µm; C: 500 nm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dynamika komórkowa; obrazy mikroskopowe, time-lapse, analiza fluktuacji fluorescencji." src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Obrazowanie PALM w żywych komórkach INS-1. (A) Obraz TIRF dla PI(4,5)P2 w żywej komórce INS-1 wykazującej ekspresję mEos3.1-PHPLCδ1. Obraz został szybko zarejestrowany w kanale zielonym przed akwizycją PALM (35 °C). (B) Sekwencyjne obrazy PALM żywych komórek w odstępach 10 sec. Wstawki przedstawiają profile intensywności lokalnej gęstości PI(4,5)P2 wzdłuż tej samej linii prostej 1 w różnych punktach czasowych na obrazach (B) i (C). Należy zwrócić uwagę na duże lokalne zmiany intensywności w ciągu 10 sec. (D) Przebieg czasowy średnich zmian intensywności PI(4,5)P2 w dużym obszarze (box2, 3x3 µm) oraz w małych okręgach (3, 4 i 5, średnica 500 nm) na obrazie (B) podczas 5 min obrazowania PALM (klatka/10 sec). Zauważalne są szybkie fluktuacje intensywności lokalnych sond PI(4,5)P2 (okręgi 3, 4 i 5) w porównaniu z bardzo niewielkimi zmianami w szerokim obszarze (box 2). (E) Powiększone obrazy PALM obszaru box2 z obrazu (B) w zaznaczonych punktach czasowych. Strzałki wskazują obszary błony wzbogacone w PI(4,5)P2 w warunkach fizjologicznych. Paski skali: C: 3 µm; E: 500 nm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Ogólnym celem niniejszej pracy jest zobrazowanie rozkładu fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu w nanoskali w błonie plazmatycznej komórki przy użyciu mikroskopii lokalizacji fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące sygnalizacji fosfoinozytydów, takie jak: jaka jest organizacja fosfoinozytydów w nanoskali pod kompleksem sygnałowym w błonie komórkowej?Głównymi zaletami tej techniki są wysoka rozdzielczość przestrzenna oraz pominięcie obróbki detergentem, która stanowi istotny problem w badaniach morfologicznych fosfolipidów. Podejście to obejmuje trzy główne etapy. Krok pierwszy: przygotowanie płatów błony plazmatycznej z żywych komórek.Krok drugi: Znakowanie fosfoinozytoldów i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek. Krok trzeci: Lokalizacja pojedynczych cząsteczek i rekonstrukcja obrazu. W dniu przeprowadzenia eksperymentu pokryć szkiełka podstawowe od 0,5 do 1 mL PDL.Po jednej lub dwóch godzinach odsączyć nadmiar PDL za pomocą ręcznika papierowego z krawędzi szkiełka nakrywkowego. Następnie przechowywać szkiełka nakrywkowe na metalowej płytce w temperaturze 4 °C. W kolejnym kroku przemyć komórki INS-1 przeznaczone do transfekcji, które były hodowane na szkiełkach nakrywkowych, od 0,5 do 1 ml lodowatego PBS zawierającego 1 mM EGTA.Powtórz to płukanie trzykrotnie i odsącz nadmiar PBS. Następnie, używając pęsety, umieść szkiełka podstawowe z hodowlą komórek na szkiełkach podstawowych pokrytych PDL, stroną z komórkami do dołu. Wykonaj tę czynność na schłodzonej płycie metalowej.Następnie przenieś płytkę do temperatury 4 °C na siedem do dziesięciu minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się. Następnie za pomocą pęsety delikatnie ododerwij szkiełko nakrywkowe z naniesionymi komórkami, co pozostawi cienką warstwę błony komórkowej na szkiełku nakrywowym powleczonym PDL. Następnie delikatnie przemyj arkusze błon od 0,5 do 1 ml lodowatego PBS.Następnie utrwal każdy arkusz membrany w około 150 µL lodowatego, czteroprocentowego PFA z 0,2% glutaraldehydu w PBS. Pozostaw membrany do utrwalenia na 15 minut w temperaturze 4 °C. Po utrwaleniu niezwłocznie przystąp do obrazowania lub pokryj preparaty lodowatym PBS i przechowuj je w temperaturze 4 °C.W przypadku użycia sond pH zdecydowanie zaleca się niezwłoczne obrazowanie. W tej procedurze wykorzystuje się system SMLM oparty na mikroskopie TIRF. Przed obrazowaniem błon należy rozcieńczyć jeden mikrolitr roztworu kulek fluorescencyjnych w 10 mililitrach PBS z 50 milimolarnym chlorkiem magnezu.Następnie należy wprowadzić próbkę do komory obrazowania i dodać 200 µL rozcieńczonego roztworu, a potem odczekać 10 minut. W kolejnym kroku próbkę należy trzykrotnie przemyć buforem PBS. Teraz należy uruchomić system obrazowania PALM.W powiązanym oprogramowaniu do obrazowania należy wybrać przycisk kanału iRFP. Następnie w kanale iRFP należy odnaleźć błonę komórkową wykazującą ekspresję sond pH, wykorzystując kuleczki fluorescencyjne do korekcji dryftu. Ustawić standardowy kąt TIRF na 2140, co stanowi wartość o 1,5 głębszą niż krytyczny kąt TIRF i powinno być kątem domyślnym.Następnie użyj przycisku capture, aby zarejestrować konwencjonalny obraz TIRF w kanale iRFP jako referencję. Następnie przełącz się na kanał PAm-Cherry1, klikając przycisk kanału RFP. Po tym dostosuj suwak w panelu AOTF, przesuwając go maksymalnie w prawo dla pełnego oświetlenia, i naświetlaj laserem przez około 10 do 20 s, aby wybielić fluorescencję tła błony komórkowej.Następnie w zakładce format ustaw optymalne parametry kamery na binning 2x2. W zakładce ND Sequence Acquisition ustaw protokół szybkiej akwizycji na 30 000 obrazów przy częstotliwości 20 Hz. Podczas akwizycji obrazów zastosuj moc lasera 405 nm w zakresie od 0,1% do 1%, aby przestrzennie odizolowane punkty w każdej klatce były łatwo identyfikowalne.Teraz należy pozyskać obrazy PAm-Cherry1, klikając przycisk Run Now. Liczba cząsteczek, które można aktywować, będzie stopniowo spadać w trakcie akwizycji. W odpowiedzi na to należy stopniowo zwiększać intensywność lasera 405 nanometr, aby utrzymać optymalną gęstość sygnałów.Należy pozyskiwać obrazy do momentu aktywacji całego sygnału PAm-Cherry1. Następnie, podczas przetwarzania i rekonstrukcji obrazów, należy zidentyfikować i zlokalizować poszczególne zdarzenia molekularne w każdej klatce. Próg intensywności filtrowania należy ustawić za pomocą wartości progowej w falkach.Dalsze szczegóły zostały przedstawione w protokole tekstowym. Przestrzenny rozkład PIP2 jest wrażliwy na różne metody utrwalania; przy zastosowaniu właściwej metody utrwalania opisanej w tekście, sondy PIP2 wykazały spójny rozkład podczas znakowania przeciwciałem przeciwko PIP2 lub specyficznymi domenami pH. W porównaniu z nimi, żywe komórki znakowane domenami pH z tagiem EGFP nie wykazują istotnych różnic w obrazowaniu.Wszystkie próbki wykazały równomierny rozkład sond. W przeciwieństwie do tego, nieoptymalna fiksacja doprowadziła do powstania gęstych, ostrych skupisk PIP2 oraz spadku intensywności sygnału. W optymalnych warunkach fiksacji obrazy super-rozdzielcze PIP2 w utrwalonych komórkach ujawniły jednorodny rozkład sond w znacznej części błony plazmatycznej, przy jedynie ograniczonych gradientach stężeń.Niektóre fragmenty błony wzbogacone w sondy PIP2 były rzadko rozmieszczone i miały różną wielkość. Obrazy PALM z żywych komórek wykazały podobny rozkład przestrzenny, co w przypadku komórek utrwalonych. Szczegółowa analiza sygnałów PIP2 ujawniła, że ich dynamika w obszarach lokalnych była szybka, ale nie doprowadziło to do znaczących zmian w ich ogólnej ilości.Technika ta wprowadza nowy sposób umożliwiający badaczom z dziedziny fosfolipidów badanie rozmieszczenia i aktywności innych podtypów fosfoinozytydów w warunkach fizjologicznych.

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Poprzez znakowanie domen pozakomórkowych receptorów błonowych za pomocą superecliptic pHluorin oraz obrazowanie tych receptorów fuzyjnych w hodowlanych neuronach mysich, możemy bezpośrednio wizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania pęcherzyków z receptorami w błonę plazmatyczną. Technika ta będzie miała kluczowe znaczenie w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów sterujących wbudowywaniem receptorów w błonę plazmatyczną.

Obrazowanie wbudowywania receptorów znakowanych pHluoriną w błonę plazmatyczną w pierwotnych kulturach neuronów mysich

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Poznaj nanorozdzielcze obrazowanie PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki. Ta metoda pozwala badać sygnalizację fosfoinozytoli bez użycia detergentów.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów