Name: Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę RaPID do izolacji białek wiążących RNA in vivo w komórkach drożdży. Ta technika umożliwia identyfikację nowych białek związanych z mRNA i badanie metabolizmu RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Prof. Jeffowi Gerstowi i Borisowi Slobodinowi za ich pomocne rady w konfiguracji protokołu RaPID i dostarczeniu niezbędnych plazmidów. Dziękujemy również dr Avigail Atir-Lande za pomoc w ustaleniu tego protokołu oraz dr Tamar Ziv z Centrum Proteomiki Smoler za pomoc w analizie LC-MS/MS. Dziękujemy prof. T.G. Kinzy (Rutgers) za przeciwciało YEF3. Prace te były wspierane przez 2011013 grantowe z Binational Science Foundation.

Uwaga: Wstaw sekwencję składającą się z 12 miejsc wiążących MS2 (pętle MS2; MS2L) do pożądanego locus genomowego, zwykle między otwartą ramką odczytu (ORF) a 3' UTR. Szczegółowy protokół tej integracji znajduje się w innym miejscu22. Sprawdzić prawidłowe wprowadzenie i ekspresję za pomocą PCR, analizy północnej lub RT-PCR20,23. Ważne jest, aby sprawdzić, czy integracja nie ingerowała w syntezę 3'UTR. Ponadto do komórek należy również wprowadzić MS2-CP z ekspresją plazmidu połączonego z SBP pod wpływem ekspresji indukowalnego promotora (zubożenie metioniny)24. Identyczny szczep, z wyłączeniem wprowadzonych pętli MS12, powinien być używany jako kontrola do wykrywania sygnałów niespecyficznych.
1. Oczyszczanie RaPID
<ol>
	<li>Wyhoduj 500 ml komórek drożdży (użyj 250-1,000 ml komórek drożdży w zależności od poziomu ekspresji interesującego genu) eksprymujących mRNA20 znakowane MS2 i białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP24 do OD600 0,8 - 1,0 w temperaturze 30 oC w odpowiednim pożywce wzrostowej (np. Pożywka selektywna syntetycznej dekstrozy (SD)).</li>
	<li>Odwirować komórki przy 3 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyć komórki w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odwirować jak poprzednio (krok 1.2), ponownie zawiesić w równej objętości (krok 1.1) SD bez metioniny i inkubować przez 45 - 60 minut w temperaturze 30 oC w celu wywołania ekspresji białka fuzyjnego MS2-CP-GFP-SBP. 
	Uwaga: Dłuższy czas indukcji może spowodować agregację GFP.</li>
	<li>Odłożyć na bok 10 ml komórek i wyekstrahować RNA z tej próbki przy użyciu prostej metody "gorącego fenolu"25. Uwaga: Fenol jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa. 
	Uwaga: Ten RNA jest dobrym odniesieniem dla jakości izolowanego RNA (Figura 1A).</li>
	<li>W przypadku komórek o objętości 500 ml dodaj 1,35 ml 37% formaldehydu do końcowego stężenia 0,1%, aby usieciować kompleksy RNA-białko. Kontynuować inkubację w temperaturze 30 oC przez 10 minut. Uwaga: Formaldehyd jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa.</li>
	<li>Dodać 26,5 ml 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować przez 3 minuty, aby zatrzymać sieciowanie. Od tego kroku umieść wszystko na lodzie, aby zminimalizować degradację RNA.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 3.000 x g przez 4 minuty w temperaturze 4oC i przemyć 45 ml zimnego 1x PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy RaPID na 100 ml początkowej hodowli komórkowej.</li>
	<li>Podzielić na porcje po 500 μl w zakręcanych probówkach do mikrofuge i dodać ~ 400 mg schłodzonych szklanych kulek do każdej podwielokrotności (około 0,2 ml probówki PCR).</li>
	<li>Lizuj komórki w ubijaku do kulek przez 3 minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie. 
	Uwaga: Liza komórek uwalnia komórkowe RNazy, które są główną przyczyną degradacji RNA. Bufor RaPID Lysis zawiera wysokie stężenie inhibitorów RNazy, takich jak niespecyficzny inhibitor RNazy heparyna i swoiste inhibitory. Zalecana jest również szybka praca i utrzymywanie wszystkiego w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Przenieś lizat do nowych probówek. Przebij mały otwór w dnie każdej probówki do mikrofuge gorącą igłą (0,8 mm x 40 mm) i umieść probówki do mikrofuge na wierzchu probówek o pojemności 15 ml. Użyj główki strzykawki o pojemności 5 ml jako łącznika między probówkami do mikrofug a probówkami o pojemności 15 ml. Odwirować zespół probówek o masie 3 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Przenieść przepływ z probówki o pojemności 15 ml do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatanty ze wszystkich probówek o pojemności 1,5 ml w jednej probówce o pojemności 15 ml i odłożyć 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka. 
	Uwaga: Będą one służyć jako próbki wejściowe do późniejszej analizy (rysunek 1).</li>
	<li>Dodać 300 μg awidyny na 500 ml początkowej kultury drożdży i inkubować przez 30 minut (można to skrócić do 10 minut) w temperaturze 4 oC przy stałym walcowaniu (10 obr./min). 
	Uwaga: Awidyna blokuje wiązanie biotyny i biotynylowanych białek z kulkami streptawidyny.</li>
	<li>Wstępnie umyj kulki streptawidyny przed inkubacją z lizatem komórkowym.
	<ol>
		<li>Przenieść około 300 μl zawiesiny kulek streptawidyny do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i usunąć górny supernatant. W ten sposób uzyskasz 250 μl kulek. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml buforu do lizy RaPID. Odwirować kulki streptawidyny w temperaturze 660 x g przez 2 minuty w temperaturze 4otemperaturze C między każdym etapem.</li>
		<li>Zablokuj kulki przez inkubację przez 1 godzinę z 0,5 ml buforu do lizy RaPID, 0,5 ml 10 mg/ml BSA i 10 μl 10 mg/ml tRNA drożdży. Koraliki można pozostawić O/N w roztworze blokującym w temperaturze 4oC z obrotem, jeśli to konieczne.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 1 ml buforu RaPID Lysis. 
		Uwaga: Koraliki magnetyczne mogą być również używane do skrócenia czasu i tła. Te jednak mają mniejszą pojemność niż koraliki sefarozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 250 μl wstępnie umytych kulek streptawidyny do lizatu zawierającego awidynę (od kroku 1.14) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją (10 obr./min). 
	Uwaga: Ten czas inkubacji jest kompromisem między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem szans na degradację RNA.</li>
	<li>Wirować przy 660 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 otemperaturze C w celu usunięcia kulek streptawidyny i przeniesienia supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka. 
	Uwaga: Będą to próbki "niepowiązane".</li>
	<li>Umyj kulki 1 ml buforu do lizy RaPID, delikatnie wstrząśnij, przenieś do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj jak w kroku 1.17. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Umyj koraliki 1 ml buforu RaPID Wash i tym razem obracaj (10 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Umyj koraliki 1 ml 1x PBS i odwiruj jak powyżej.</li>
	<li>Ponownie umyj koraliki 120 μl 1x PBS. Odwirować jak powyżej i pobrać cały supernatant do ekstrakcji RNA i białka jako próbkę "Wash". 
	Uwaga: Ta ostatnia próbka do płukania będzie wskazywać na rygorystyczność płukania i powinna mieć taką samą objętość jak próbka wymująca. Uprości to przetwarzanie i załadunek w kolejnych testach.</li>
	<li>Aby wymyć RNA i białka związane z RNA z kolumny, dodaj 120 μl 6 mM biotyny w 1x PBS i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją (10 obr./min).</li>
	<li>Odwirować kulki jak powyżej i przenieść eluowany materiał do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie odwirować eluowaną próbkę i przenieść górną fazę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, aby upewnić się, że nie ma przenoszenia kulek.</li>
	<li>Pobieranie próbek do ekstrakcji RNA lub białka. 
	Uwaga: Pobrana objętość powinna zależeć od następującego testu i poziomu ekspresji RNA lub białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jako wskazówkę, w przypadku analizy północnej26 należy pobrać 80% próbki, w przypadku Western blot23,27 lub RT-PCR28 należy pobrać 20%, a w przypadku spektrometrii mas29 w celu odkrycia nowych białek należy pobrać całą próbkę.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Dodać równą objętość 2x sieciującego buforu odwracalnego i inkubować przez 45 minut w temperaturze 65 °C. Kontynuować bezpośrednio w celu ekstrakcji RNA. 
	Uwaga: Bufor odwracający sieciowanie zawiera kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), który znacznie poprawia ekstrakcję RNA20.</li>
	<li>Użyć standardowej metody fenol:chloroform26 w celu ekstrakcji RNA z próbek "wejściowych" i "niezwiązanych" (etapy 1.13 i 1.17). 
	Uwaga: Próbki te zawierają dużą ilość heparyny, inhibitora RNazy, która może hamować późniejsze testy z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy (RT) (np. RT-PCR), dlatego zaleca się jej usunięcie LiCl precipitation30. Próbki "wash" i "elucion" (kroki 1.21 i 1.24) zawierają niewielkie ilości RNA i są wytrącane w następujących etapach.</li>
	<li>Dodać równą objętość 8M guanidynium-HCl (GuHCl) i dwie objętości 100% etanolu do próbek "wash" i "elucion". Inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 godziny. 
	Uwaga: Guanidynium skutecznie denaturuje białka, a tym samym hamuje RNazy i proteazy w próbce.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 20 000 x g, 4 °C przez 30 minut i odrzucić supernatant. Umyć granulat zimnym 80% etanolem i ponownie odwirować przy 20 000 x g, 4 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Rozpuść osad RNA w 400 μl wody wolnej od RNaz i ponownie wytrąc, aby usunąć wszelkie resztki GuHCl lub inne zanieczyszczenia. Dodać 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 800 μl 100% etanolu, inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować i umyć jak w kroku 2.4 i usunąć cały etanol za pomocą końcówki o pojemności 10 μl. Zawiesić osad RNA w 10 μl wody wolnej od RNazy. Zachowaj szczególną ostrożność, ponieważ osadek RNA zwykle nie jest widoczny. 
	Uwaga: Próbki można wykorzystać do analizy północnej, jak opisano w23 (rysunek 1).</li>
</ol>
3. Przygotowanie białka do analizy metodą Western Blot lub spektrometrii mas
<ol>
	<li>Dodać 1/3 objętości 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) do próbek białek i inkubować 45 minut w 65 °C, aby odwrócić sieciowanie RNA i białek. 
	Uwaga: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Uruchom białka na żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE)31. Dostosuj zawartość procentową żelu do wielkości białek, które mają być analizowane. 
	Uwaga: 10% żel akrylamidowy daje szeroki zakres separacji i jest dobry jako pierwsze przybliżenie.</li>
	<li>Przenieś białka do błony, jak w standardowej analizie immunoblot27 w celu kontroli skuteczności izolacji (ryc. 1C). Zabarwić barwą Coomassie Blue R250 lub srebrem przed analizą spektrometrii mas. 
	Uwaga: Srebrna plama jest preferowanym wyborem, ponieważ jest bardziej czuła i umożliwia lepsze wykrywanie (Rysunek 1B). Barwienie można wykonać za pomocą ręcznie przygotowanych roztworów lub zestawów komercyjnych. Czas inkubacji żelu w końcowym roztworze barwnika należy określić doświadczalnie. Długa inkubacja może ujawnić niską obfitość białek, ale może spowodować, że białka o wysokiej ekspresji, takie jak MS2-CP-SBP-GFP, będą nadmiernie wybarwione i mogą maskować otaczające białka w ich pobliżu. Dodatkowo może wystąpić wysokie tło. Uważnie śledź reakcję i dodaj roztwór zatrzymujący w odpowiednim czasie.</li>
	<li>Wytnij pasma z żelu i przenieś je do tubek o pojemności 1,5 ml. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub wyślij do ekstrakcji białka i trawienia trypsyny, a następnie do analizy LC-MS/MS 32.</li>
	<li>Jako alternatywne podejście proteomiczne w celu wykluczenia etapu separacji żelu, trawić eluowany materiał z kroku 1.24 w roztworze przy użyciu trypsyny i poddawać analizie LC-MS/MS33. 
	Uwaga: Pominięcie separacji SDS-PAGE upraszcza protokół i zwiększa wydajność. Jednak próbki mogą zawierać śladowe ilości detergentu NP-40, który hamuje analizę spektrometrii mas. Aby rozwiązać ten problem, wykonaj następujące czynności:
	<ol>
		<li>Uruchom białko na SDS-PAGE31 przez 10 - 15 minut.</li>
		<li>Wytnij całą część pasa (tj. miejsce, w którym znajdują się białka). 
		Uwaga: Próbka białka może zawierać znaczną ilość białka MS2-CP-SBP, które może przesłaniać sygnały białek o niskiej obfitości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255(2008).</li>
<li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li>
<li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+processing+and+its+regulation%3A+global+insights+into+biological+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li>
<li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li>
<li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203(2014).</li>
<li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li>
<li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li>
<li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li>
<li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+yeast+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li>
<li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li>
<li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Genomics%3A+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li>
<li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13(2014).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li>
<li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation+factor+eEF3+%28Yef3%29+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17(2015).</li>
<li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li>
<li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RaPID%3A+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li>
<li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRFbeta%2C+a+novel+regulator+of+calcium+signaling%2C+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li>
<li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells%3A+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li>
<li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25(2009).</li>
<li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li>
<li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StreptoTag%3A+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li>
<li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+steps+forward--one+step+back%3A+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li>
<li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li>
<li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li>
<li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Lopez de Heredia,, M,, Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+%3A+a+comparison+of+yeast+lysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14(2004).</li>
<li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR%2FCas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572(2015).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li>
<li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC+yeast%3A+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Różne metody wykorzystują izolację określonych mRNA do identyfikacji powiązanych z nimi białek11,34 35. Metody te mają zastosowanie w strategiach in vitro i in vivo do badania interakcji RNA-białko. Metody in vitro inkubują egzogennie transkrybowane RNA z lizatem komórkowym w celu wychwycenia RBP i wyizolowania kompleksów RNP36,37. Niedawno zaprezentowano skuteczne podejście tego typu, które umożliwiło identyfikację nowych białek wiążących regulatorowy motyw RNA...

Białka wiążące RNA (RBP) stanowią około 10% białek S. cerevisiae 1,2 i około 15% białek ssaków3-5. Są zaangażowane w wiele procesów komórkowych, takich jak przetwarzanie i regulacja potranskrypcyjna mRNA, translacja, biogeneza rybosomów, aminoacylacja i modyfikacja tRNA, przebudowa chromatyny i inne. Ważną podgrupą RBP są białka wiążące mRNA (mRNP)6,7. W trakcie dojrzewania mRNA różne RBP wiążą transkrypt i pośredniczą w jego przetwarzaniu jądrowym, eksporcie z jądra, lokalizacji komórkowej, translacji i degradacji6-8. W ten sposób odrębny zestaw RBP związanych z określonym transkryptem w dowolnym punkcie czasowym determinuje jego przetwarzanie i ostatecznie jego los.
Identyfikacja RBP związanych z mRNA może znacznie poprawić nasze zrozumienie procesów leżących u podstaw ich regulacji potranskrypcyjnej. Do identyfikacji białek zaangażowanych w regulację mRNA wykorzystano różne metody genetyczne, mikroskopowe, biochemiczne i bioinformatyczne (przegląd w9-11). Jednak tylko kilka z tych metod umożliwia identyfikację białek związanych z konkretnym docelowym mRNA. Na uwagę zasługuje system hybrydowy Yeast Three (Y3H), który wykorzystuje mRNA jako przynętę do badania przesiewowego biblioteki ekspresji w komórkach drożdży. Dodatnie klony są zwykle obserwowane poprzez selekcję wzrostu lub ekspresję reporterową12-14. Kluczową zaletą tej metody jest duża liczba białek, które mogą być skanowane w środowisku komórkowym oraz możliwość pomiaru siły oddziaływania RNA-białko. Wady obejmują stosunkowo dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich spowodowanych niespecyficznym wiązaniem oraz wysoki potencjał wyników fałszywie ujemnych, częściowo spowodowany nieprawidłowym fałdowaniem ofiary z białka fuzyjnego lub RNA przynęty.
Alternatywą dla podejścia genetycznego jest oczyszczanie RNA z powiązanymi z nim białkami. MRNA zawierające poliA można wyizolować za pomocą kolumn oligo dT, a związane z nimi białka są wykrywane za pomocą spektrometrii mas. Interakcja RNA-białko jest zachowana w kontekście komórkowym przez sieciowanie, które tworzy wiązania kowalencyjne krótkiego zasięgu. Zastosowanie kolumny oligo dT daje globalny obraz całego proteomu, który jest związany z dowolnym mRNA3,5,15 zawierającym poli A. Nie zapewnia to jednak listy białek, które są związane z konkretnym mRNA. Dostępnych jest bardzo niewiele metod umożliwiających dokonanie takiej identyfikacji. Metoda PAIR polega na transfekcji kwasu nukleinowego z komplementarnością do docelowego mRNA16,17. Kwas nukleinowy jest również przyłączony do peptydu, co umożliwia sieciowanie z RBP w bliskim sąsiedztwie miejsca interakcji. Po usieciowaniu kwas nukleinowy peptydowy RBP można wyizolować i poddać analizie proteomicznej. Niedawno z powodzeniem zastosowano metodologię opartą na aptamie do ekstraktów z linii komórkowych ssaków18. Opracowano aptamer RNA o zwiększonym powinowactwie do streptawidyny i połączono go z interesującą sekwencją (w tym przypadku pierwiastkiem bogatym w AU (ARE)). RNA aptamer-ARE przyłączono do kulek streptawidyny i zmieszano z lizatem komórkowym. Białka związane z sekwencją ARE oczyszczono i zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas (MS). Chociaż metoda ta wykryła asocjacje zachodzące poza ustawieniami komórkowymi (tj. in vitro), prawdopodobnie zostanie zmodyfikowana w przyszłości tak, aby wprowadzić aptamery do genomu, a tym samym umożliwić izolację białek związanych z mRNA w środowisku komórkowym (tj. in vivo). W przypadku drożdży, w przypadku których manipulacje genetyczne są dobrze ugruntowane, metoda RaPID (opracowana w laboratorium prof. Jeffa Gersta) daje wgląd w powiązania in vivo 19. RaPID łączy w sobie specyficzne i silne wiązanie białka płaszcza MS2 (MS2-CP) z sekwencją RNA MS2 oraz domeny wiążącej streptawidynę (SBP) z kulkami sprzężonymi ze streptawidyną. Umożliwia to skuteczne oczyszczanie mRNA znakowanych MS2 za pomocą kulek streptawidyny. Co więcej, ekspresja 12 kopii pętli MS2 pozwala na jednoczesne wiązanie się do sześciu MS2-CP z RNA i zwiększanie skuteczności jego izolacji. W związku z tym zaproponowano ten protokół, aby umożliwić identyfikację nowych białek związanych z mRNA po poddaniu eluowanych próbek analizie proteomicznej za pomocą spektrometrii mas.
Niedawno wykorzystaliśmy RaPID do identyfikacji nowych białek związanych z drożdżowym mRNA PMP1 20. Wcześniej wykazano, że mRNA PMP1 jest związane z błoną ER, a jego nieulegający translacji region 3' (UTR) okazał się głównym wyznacznikiem tego związku21. W związku z tym RBP, które wiążą PMP1 3' UTR, prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w jego lokalizacji. RaPID, a następnie chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas/spektrometrią mas (LC-MS/MS) doprowadziły do identyfikacji wielu nowych białek, które oddziałują z PMP120. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół metodologii RaPID, ważne kontrole, które należy wykonać, oraz wskazówki techniczne, które mogą poprawić wydajność i swoistość.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny fenol (pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny fenol: Chloroform (5:1, pH 4,3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza&nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>średnica 0,4-0,6 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Streptawidin</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>pepton</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Bufor do próbek (LSB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M Tris-HCl pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerol, 0,04% błękit bromofenolowy.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do lizy gorących fenoli</td><td>10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% SDS&nbsp;</td></tr><tr><td>3 M octan sodu pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% i 70% Etanol</td> (EtOH)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaz woda bez</td> RaPID bufor do lizy 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Heparyna, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), 10 i mikro;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> g/ml Leupeptyna, 10 i mikro; g/ml Aprotynina, 10 i mikro; g/ml Inhibitor trypsyny sojowej, 10 &mikro; g/ml Pepstatyna, 20 U/ml DNazy I, 100 U/ml Rybonukleaza&nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Sieciowany bufor</td><td></td><td></td> odwracalny <td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>płuczący RaPID</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,5,&nbsp; 300 mM NaCl, 0,5% NP-40</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Silver Stain Plus</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>Do wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych</td></tr><tr><td>SD selektywne podłoże&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów i siarczanu amonu, 5 g/l Siarczan amonu, 2% glukozy, 350 mg/l Treonina, 40 mg/l Metionina, 40 mg/l adenina, 50 mg/l Lizyna, 50 mg/l Tryptofan, 20 mg/l Histydyna, 80 mg/l Leucyna, 30 mg/l Tyrozyna, 40 mg/l Arginina</td></tr><tr><td>Anty-eEF3 (EF3A, YEF3)</td> <td>Prezent od Kinzy TG. (UMDNJ Szkoła Medyczna im. Roberta Wooda Johnsona)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty królicze IgG-HRP sprzężone</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

izolacja nowych białek wiążących rna metodą rapid

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Białka wiążące RNA (RBP) odgrywają ważną rolę w każdym aspekcie metabolizmu i regulacji RNA. Ich identyfikacja jest dużym wyzwaniem we współczesnej biologii. Tylko kilka metod in vitro i in vivo umożliwia identyfikację RBP związanych z określonym docelowym mRNA. Jednak ich głównymi ograniczeniami są identyfikacja RBP w środowisku niekomórkowym (in vitro) lub niska skuteczność izolacji interesującego RNA (in vivo). Opracowano metodologię oczyszczania i identyfikacji białek wiążących RNA (RaPID), aby przezwyciężyć te ograniczenia u drożdży i umożliwić skuteczną izolację białek związanych in vivo. Aby to osiągnąć, interesujący RNA jest znakowany pętlami MS2 i ulega koekspresji z białkiem fuzyjnym białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptawidynę (SBP). Komórki są następnie poddawane sieciowaniu i lizie, a kompleksy są izolowane za pomocą kulek streptawidyny. Białka, które oczyszczają się jednocześnie ze znakowanym RNA, można następnie określić za pomocą spektrometrii mas. Niedawno wykorzystaliśmy ten protokół do identyfikacji nowych białek związanych z mRNA PMP1 związanym z ER. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół RaPID oraz omawiamy niektóre z jego ograniczeń i zalet.

Metoda RaPID umożliwia izolację specyficznego docelowego RNA wraz z powiązanymi z nim białkami. Kluczowym czynnikiem sukcesu jest utrzymanie RNA w jak najmniej zdegradowanym stanie, co pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości białek. W celu określenia wydajności izolacji oraz jakości RNA przeprowadza się analizę northern (Ryc. 1A). Analiza northern ma tę zaletę, że bezpośrednio informuje o wydajności i jakości procesu RaPID. Dzięki temu w jednym przebiegu można określić...

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Ogólnym celem tej procedury jest wydajna izolacja specyficznego RNA wraz z białkami, które są z nim powiązane in vivo. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu i regulacji RNA, takie jak określenie zestawu białek związanych z konkretnym transkryptem. Główną zaletą tej techniki jest wysoka wydajność izolacji, która umożliwia późniejszą identyfikację nowych białek związanych z mRNA.Szybka metodologia wykorzystuje szczep drożdży, który koekspresuje mRNA z tagiem MS2 oraz białko fuzyjne składające się z białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptawidynę. Hoduj 500 mililitrów komórek drożdży w temperaturze 30 °C w syntetycznym medium z dekstrozą lub selektywnym medium SD do uzyskania OD600 w zakresie od 0,8 do 1,0. Gdy komórki będą gotowe, wiruj je przy 3000 ×g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odlej supernatant.Przemyj komórki w PBS i ponownie odwiruj. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w równym objętościowo medium SD bez metioniny. Inkubuj przez 45 do 60 minut w temperaturze 30 °C, aby indukować ekspresję białka fuzyjnego.Po 45–60 minutach odstaw 10 mililitrów komórek do ekstrakcji RNA, a pozostałe komórki wykorzystaj do szybkiego oczyszczania. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do komórek 1,35 mililitra 37% formaldehydu, tak aby uzyskać stężenie końcowe 0,1%, w celu sieciowania kompleksów RNA-białko. Kontynuuj inkubację w temperaturze 30 °C przez 10 minut.Aby zatrzymać sieciowanie, dodaj 26,5 mililitrów 2,5 molarnej glicyny, do końcowego stężenia 0,125 molarnego, i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 3 minuty. Od tego momentu trzymaj wszystkie próbki na lodzie i pracuj szybko, aby zminimalizować degradację RNA. Odwiruj komórki przy 3000 ×g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.Odlać supernatant, dodać 45 mililitrów zimnego PBS i ponownie odwirować. Usunąć supernatant i resuspenderować komórki w 5 mililitrach buforu do szybkiej lizy zawierającego wysoką koncentrację inhibitorów RNazy. Podzielić zawiesinę komórkową na aliquoty po 500 mikrolitrów w probówkach do mikrocentryfugi z zakrętką i dodać do każdej aliquoty około 400 miligramów schłodzonych szklanych kulek.Poddaj komórki lizie w homogenizatorze kuleczkowym przez trzy minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie. Przenieś lizat do nowych probówek do wirówki.Odciąć górną część strzykawki 5 ml i nałożyć ją na pustą probówkę 15 ml, aby służyła jako adapter do probówek z nakrętką. Za pomocą rozgrzanej igły przebić mały otwór w dnie każdej probówki i umieścić je na wierzchu przystosowanych probówek 15 ml. Wirować tak przygotowane zestawy z prędkością 3000 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C, aby przenieść lizat do probówek 15 ml.Przenieś ciecz przejściową z każdej probówki o pojemności 15 ml do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych. Połącz nadpłyn ze wszystkich probówek 1,5 ml w jednej probówce 15 ml. Odstaw odpowiednio 1/50 i 1/100 objętości lizatu do izolacji RNA oraz białek.Rozpocznij szybką procedurę izolacji kompleksów białkowo-RНК, dodając 300 µg awidyny do lizatu komórkowego. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy stałym toczeniu. Podczas inkubacji lizatu komórkowego z awidyną, przeprowadź wstępne płukanie kulek z streptawidyną, przenieś około 300 µl zawiesiny kulek z streptawidyną do ważonej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, odwiruj preparat, a następnie usuń górny nadosad, co pozwoli uzyskać 250 µl kulek.Do kulek należy dodać 1 mililitr buforu do szybkiej lizy i odwirować przy 660 ×g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Należy usunąć nadosad i ponownie przemyć kulki buforem do szybkiej lizy. W celu zablokowania kulek należy dodać 0,5 mililitra buforu do szybkiej lizy, 0,5 mililitra BSA oraz 10 mikrolitrów drożdżowego TRNA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy stałym obrocie.Przemyj kuleczki dwukrotnie 1 mililitrem buforu do szybkiej lizy. Dodaj 250 mikrolitrów uprzednio przemytych kuleczek streptawidynowych do lizatu zawierającego awidynę i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy stałym obrocie. Ten czas inkubacji stanowi kompromis między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem ryzyka degradacji RNA.Po jednej godzinie odwiruj próbkę przy 660 ×g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, aby oddzielić kuleczki streptawidynowe. Przenieś nadsadź do probówki o pojemności 15 ml. Odstaw 1/50 oraz 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białek.Dodaj 1 ml buforu do szybkiej lizy do kulek. Wymieszaj pipetując, przenieś do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 660 ×g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Przemyj trzy kolejne razy buforem do szybkiej lizy.Po końcowym przemyciu buforem do szybkiej lizy usunąć nadsącz, dodać 1 mililitr buforu do szybkiego płukania i inkubować w rotatorze przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odwirować i przemyć ponownie 2 razy buforem do szybkiego płukania. Przemyć kuleczki 1 mililitrem PBS i odwirować w ten sam sposób co wcześniej.Usunąć supernatant, dodać do kulek 120 µL PBS i rotować przez 5 minut w rotatorze. OdwirCować w ten sam sposób co wcześniej i zebrać cały supernatant jako próbkę płukania do ekstrakcji RNA i białek. Aby eluować RNA oraz białka związane z RNA, dodać do kulek 120 µL 6 mM biotyny w PBS i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C przy stałej rotacji.Odwiruj kuleczki i przenieś materiał eluat do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Ponownie odwiruj próbkę z eluatu i przenieś górną fazę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby zapobiec przeniesieniu kuleczek. Pobierz próbki do ekstrakcji RNA lub białek.Aby określić wydajność izolacji i jakość RNA, przeprowadzono analizę Northern dla dwóch znakowanych RNA: PMP1 i FPR1, pochodzących z lizy komórek w formie odlewu, szybkiej lizy komórek oraz po elucji biotyną. Rytrybowe RNA wykryto za pomocą barwienia bromkiem etydyny, a brak rybosomalnego RNA w próbce elucyjnej wskazuje na wysoką swoistość procesu oczyszczania.Rygorystyczność i swoistość oczyszczania są dodatkowo potwierdzone brakiem sygnału nieoznaczonego MRNA w próbkach elucji. Widoczny sygnał w ścieżce FPR1, który nie odpowiada wielkości ACT1, jest pozostałością po poprzedniej hybrydyzacji z sondą MS2L. Mimo że wejściowe RNA jest nieco bardziej zdegradowane w porównaniu do RNA oczyszczonego protokołem Hot Phenol, znacząca ilość pełnowymiarowego, oznaczonego RNA została wyizolowana w sposób swoisty, co potwierdza silny sygnał w frakcjach elucji.Próbki białek można poddać analizie metodą SDS-PAGE oraz barwienia srebrem przed przeprowadzeniem analizy proteomicznej. Białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP, wskazane strzałką, potwierdza równą ilość naniesionego białka. Gwiazdkami zaznaczono prążki o różnych intensywnościach, które zostały następnie wycięte z żelu w celu analizy spektrometrią mas.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest noszenie rękawiczek, zapewnienie czystości obszaru roboczego, przygotowanie roztworu w wodzie wolnej od RNA oraz szybka i sprawna praca w celu skrócenia czasu trwania protokołu. Należy pamiętać, że praca z takimi odczynnikami jak fenol i formaldehyd może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium chemicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak sprawnie i skutecznie oczyścić RNA fayn-tress oraz powiązanej z nim części ciała.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak RNA-Seq, w celu wykrycia cząsteczek RNA wiążących analizowany transkrypty.

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę RaPID do izolacji białek wiążących RNA in vivo w komórkach drożdży. Ta technika umożliwia identyfikację nowych białek związanych z mRNA i badanie metabolizmu RNA.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Przeglądaj więcej filmów