Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID
30 września 2016
Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyizolowanie specyficznego RNA z białkami, które są związane z RNA in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu i regulacji RNA, takie jak to, jaki jest odrębny zestaw fau-bee-pees związanych z określonym transkryptem. Główną zaletą tej techniki jest wysoka skuteczność izolacji, która pozwala na późniejszą identyfikację szlachetnych białek związanych z mRNA.
Szybka metodologia wykorzystuje szczep drożdży, który ulega koekspresji MRNA znakowanego MS2 oraz białko fuzyjne białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptavadynę. Wyhoduj 500 mililitrów komórek drożdży w temperaturze 30 stopni Celsjusza w syntetycznej dekstrozie lub pożywce selektywnej SD do OD600 od 0,8 do 1,0. Gdy komórki są gotowe, odwirować w temperaturze 3000 razy G przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
Umyj komórki w PBS i ponownie odwiruj. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w równej objętości SD bez metioniny. Inkubować przez 45 do 60 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby wywołać ekspresję białka fuzyjnego.
Po 45 do 60 minutach odłóż 10 mililitrów komórek do ekstrakcji RNA, a pozostałe komórki wykorzystaj do szybkiego oczyszczenia. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do komórek 1,35 mililitra 37% formaldehydu, do końcowego stężenia 0,1%, aby usieciować kompleksy RNA-białko. Kontynuuj inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Aby zatrzymać sieciowanie, dodaj 26,5 mililitra glicyny 2,5 molowej do końcowego stężenia 0,125 mola i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 minuty. Od tego momentu trzymaj wszystko na lodzie i pracuj szybko, aby zminimalizować degradację RNA. Odwirować komórki w temperaturze 3000 razy G przez 4 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Odrzucić supernatant, dodać 45 mililitrów zimnego PBS i ponownie odwirować. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach buforu do szybkiej lizy, który zawiera wysokie stężenie inhibitorów Rnazy. Podzielić zawiesinę komórek na porcje po 500 mikrolitrów w zakręcanych probówkach do mikrofuge i dodać około 400 miligramów schłodzonych szklanych kulek do każdej podwielokrotności.
Lizuj komórki w ubijaku do koralików przez trzy minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie. Przenieś lizat do nowych probówek do mikrofuge.
Odetnij górną część 5-mililitrowej strzykawki i umieść ją na pustej 15-mililitrowej tubce, aby służyła jako adapter do zakręcanych tubek. Użyj gorącej igły, aby przebić mały otwór w dnie każdej probówki i umieść je na dostosowanych do tego celu 15-mililitrowych rurkach. Odwirować zespoły w temperaturze 3000 razy G przez jedną minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby wymyć lizat do 15-mililitrowych probówek.
Przenieś przepływ z każdej 15-mililitrowej probówki do nowej 1,5-mililitrowej probówki i odwiruj przy 10 000 razy G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Połącz supernatant ze wszystkich 1,5 mililitrowych probówek w jedną 15-mililitrową probówkę. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.
Rozpocznij szybką procedurę izolowania kompleksów białkowych RNA, dodając 300 mikrogramów Awidyny do lizatu komórkowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza pod ciągłym toczeniem. Podczas inkubacji lizatu komórkowego z Avidin, należy wstępnie umyć kulki streptawidyny, przenieść około 300 mikrolitrów zawiesiny kulek streptavadyny do ważenia 1,5 mililitra probówki mikrowirówki, odwirować preparat, a następnie usunąć górny supernatant, co da 250 mikrolitrów kulek.
Dodaj 1 mililitr buforu do szybkiej lizy do kulek i odwiruj w temperaturze 660 razy G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie przemyć buforem do szybkiej lizy. Aby zablokować kulki, dodaj 0,5 mililitra buforu do szybkiej lizy, 0,5 mililitra BSA i 10 mikrolitrów drożdży TRNA i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją.
Umyj kulki dwukrotnie 1 mililitrem buforu do szybkiej lizy. Dodać 250 mikrolitrów wstępnie umytych kulek streptawidyny do lizatu zawierającego awidynę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją. Ten czas inkubacji jest kompromisem między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem szans na degradację RNA.
Po godzinie odwirować w temperaturze 660 razy G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć kulki streptawidyny. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 15 mililitrów. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.
Dodaj 1 mililitr buforu do szybkiej lizy do kulek. Wymieszać pipetując, przenieść do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i odwirować w temperaturze 660 razy G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przemyć jeszcze trzy razy buforem do szybkiej lizy.
Po ostatnim przepłukaniu buforem do szybkiej lizy usuń supernatant, dodaj 1 mililitr buforu do szybkiego płukania i obracaj przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odwirować i umyć jeszcze 2 razy za pomocą buforu do szybkiego mycia. Umyj kulki 1 mililitrem PBS i odwiruj jak poprzednio.
Usuń supernatant, dodaj do kulek 120 mikrolitrów PBS i obracaj przez 5 minut w wałku. Odwirować jak poprzednio i zebrać cały supernatant do ekstrakcji RNA i białka jako próbkę do przemycia. Aby wymyć RNA i białka związane z RNA, dodaj 120 mikrolitrów 6-milimolowej biotyny w PBS do kulek i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją.
Odwiruj kulki i przenieś usunięty materiał do nowej 1,5 mililitrowej probówki. Ponownie odwiruj eluowaną próbkę i przenieś górną fazę do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra, aby upewnić się, że nie ma przenoszenia kulek. Pobrać próbki do ekstrakcji RNA lub białka.
Aby określić skuteczność izolacji i jakość RNA, przeprowadzono analizę Northern dla dwóch znakowanych RNA. PMP1 i FPR1, z lizy komórek odlewanych, szybkiej lizy komórek i po elucji biotyną. Rybosomalne RNA wykryto za pomocą barwienia bromkiem etydyny, a brak rybosomalnego RNA w próbce elucyjnej wskazuje na rygorystyczność oczyszczania.
O rygorystyczności i swoistości oczyszczania świadczy również brak sygnału nieznakowanego mRNA w próbkach elucyjnych. Sygnał pozorny na torze FPR1, który nie jest wielkości ACT1, jest pozostałością po poprzedniej hybrydyzacji z sondą MS2L. Chociaż wejściowy RNA jest nieco bardziej zdegradowany w porównaniu z RNA, które zostało oczyszczone za pomocą protokołu Hot Phenol, znaczna ilość znakowanego RNA o pełnej długości jest izolowana specyficznie, co ujawnia silny sygnał we frakcjach elucyjnych.
Próbki białek mogą być analizowane za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrze przed analizą proteomiczną. Białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP, oznaczone strzałką, wykazuje równe obciążenie białka. Gwiazdki wskazują pasma o różnej intensywności, które zostały później wycięte z żelu do analizy spektrometrii mas.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nosić rękawice, zapewnić czyste miejsce pracy, przygotować roztwór z wodą wolną od RNA oraz pracować szybko i wydajnie, aby skrócić czas protokołu. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami, takimi jak fenol i formaldehyd, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze chemicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wydajnie i skutecznie oczyścić RNA z warkoczy fayna i związanego z nim ciała.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, w celu wykrycia RNA, które wiążą interesujący nas transkrypt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę in vivo izolacji specyficznego RNA wraz z jego białkami towarzyszącymi. Technika ta ma na celu pogłębienie wiedzy na temat regulacji RNA wewnątrz komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Interakcje białko-RNA
- Procesy komórkowe
- Metabolizm RNA
Wprowadzenie
- Oddziaływania RNA-białko są kluczowe dla wielu funkcji komórkowych.
- Zrozumienie tych oddziaływań może dostarczyć cennych informacji na temat regulacji RNA.
- Istniejące metody mogą charakteryzować się niską wydajnością w izolowaniu specyficznych kompleksów RNA-białko.
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście z wykorzystaniem szczepów drożdży.
Cel badania
- Wyizolowanie specyficznego RNA i zidentyfikowanie powiązanych z nim białek in vivo.
- Odpowiedź na pytania dotyczące metabolizmu i regulacji RNA.
- Poprawa wydajności technik izolacji kompleksów RNA-białko.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie szczepu drożdży koekspresującego mRNA z etykietą MS2.
- Białko fuzyjne białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptawidynę.
- Wzrost komórek drożdży w syntetycznym medium z dekstrozą.
- Wirowanie w celu wyizolowania kompleksów RNA-białko.
Główne wyniki
- Osiągnięto wysoką wydajność w izolacji kompleksów RNA-białko.
- Ułatwiono identyfikację nowych białek związanych z mRNA.
- Metoda ta umożliwia szybkie przetwarzanie próbek.
- Dzięki temu podejściu uzyskano nową wiedzę na temat regulacji RNA.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania oddziaływań białko-RNA.
- Umożliwia ona pogłębienie wiedzy na temat metabolizmu i regulacji RNA.
- Przyszłe zastosowania mogą prowadzić do odkryć w zakresie procesów komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja białek wiążących RNA (RBP) związanych z konkretnymi transkryptami ma kluczowe znaczenie dla walidacji celu w terapeutykach RNA oraz w odkrywaniu biomarkerów. Metodologia RaPID umożliwia efektywną izolację kompleksów białkowo-RNA in vivo, wspierając redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnianie interakcji funkcjonalnych w systemie istotnym dla danej choroby. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną na wczesnym etapie odkryć, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych na temat powiązań RBP-mRNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez identyfikację białek wiążących RNA (RBP) związanych z istotnymi dla choroby mRNA, takimi jak PMP1 powiązane z receptorem estrogenowym (ER).
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny schemat izolacji natywnych kompleksów białkowo-RNA z drożdży, ograniczając liczbę wyników fałszywie dodatnich charakterystycznych dla metod in vitro.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu dzięki specyficznemu i wysokowydajnemu wychwytywaniu oddziaływań in vivo, co wspomaga selekcję projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie zwalidowanych systemów biologicznych (szczepów drożdży wykazujących ekspresję RNA z markerem MS2 oraz białka fuzyjnego) do późniejszych zastosowań w badaniach przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje złożony proces izolacji za pomocą wytrącania na kuleczkach z streptawidyną, co poprawia powtarzalność między doświadczeniami.
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie oczyszczonych frakcji RNA i białek odpowiednich do analizy ilościowej za pomocą spektrometrii mas lub analizy Northern blot.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy identyfikację RBP w fazie odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając analizy uzupełniające, takie jak RNA-Seq i SDS-PAGE.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wykazuje rygorystyczność i swoistość poprzez brak sygnałów rRNA oraz nieoznaczonego mRNA w próbkach elucji.
- System istotny dla patologii: Zastosowanie w drożdżowych modelach metabolizmu RNA, z możliwością adaptacji do układów ssaków w celu walidacji celów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda RaPID wpisuje się w etap wczesnego odkrywania, wspierając testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego przed identyfikacją wiodących związków oraz walidacją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez poprzez izolację specyficznych kompleksów RNA-białko w warunkach vivo, co pozwala na wyjaśnienie powiązań funkcjonalnych.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów dzięki standaryzowanej izolacji kompleksów RNA-białko, co wspiera powtarzalne przesiewanie związków lub genetyczne.
- Analityka: Generuje wyniki ilościowe za pomocą spektrometrii mas i analizy Northern blot, umożliwiając porównanie poziomu RBP w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych poprzez dostarczanie oczyszczonych kompleksów do późniejszej walidacji w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do odkrywania RBP w obrębie wielu transkryptów, ograniczając redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w regulacji RNA.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki zdefiniowanym etapom sieciowania, lizy oraz oczyszczania za pomocą kulek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wiarygodnych danych na temat oddziaływań RBP-mRNA, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane asocjacje RBP w kontekstach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii molekularnej, hodowli drożdży oraz technik badania oddziaływań RNA-białko.
- Wymaga aparatury do sieciowania (formaldehyd), separacji na kulekach oraz wirowania z różnymi prędkościami.
- Wymaga standaryzacji składu buforu do lizy oraz stosowania inhibitorów RNazy w ramach zespołu w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga uwzględnienia kwestii adaptacyjnych przy przenoszeniu metody z drożdży na inne systemy modelowe, szczególnie w odniesieniu do znakowania i ekspresji białek fuzyjnych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko degradacji RNA podczas przetwarzania oraz konieczność szybkiego prowadzenia prac w niskiej temperaturze w celu zachowania integralności kompleksów.
