Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyizolowanie specyficznego RNA z białkami, które są związane z RNA in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu i regulacji RNA, takie jak to, jaki jest odrębny zestaw fau-bee-pees związanych z określonym transkryptem. Główną zaletą tej techniki jest wysoka skuteczność izolacji, która pozwala na późniejszą identyfikację szlachetnych białek związanych z mRNA.

Szybka metodologia wykorzystuje szczep drożdży, który ulega koekspresji MRNA znakowanego MS2 oraz białko fuzyjne białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptavadynę. Wyhoduj 500 mililitrów komórek drożdży w temperaturze 30 stopni Celsjusza w syntetycznej dekstrozie lub pożywce selektywnej SD do OD600 od 0,8 do 1,0. Gdy komórki są gotowe, odwirować w temperaturze 3000 razy G przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.

Umyj komórki w PBS i ponownie odwiruj. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w równej objętości SD bez metioniny. Inkubować przez 45 do 60 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby wywołać ekspresję białka fuzyjnego.

Po 45 do 60 minutach odłóż 10 mililitrów komórek do ekstrakcji RNA, a pozostałe komórki wykorzystaj do szybkiego oczyszczenia. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do komórek 1,35 mililitra 37% formaldehydu, do końcowego stężenia 0,1%, aby usieciować kompleksy RNA-białko. Kontynuuj inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Aby zatrzymać sieciowanie, dodaj 26,5 mililitra glicyny 2,5 molowej do końcowego stężenia 0,125 mola i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 minuty. Od tego momentu trzymaj wszystko na lodzie i pracuj szybko, aby zminimalizować degradację RNA. Odwirować komórki w temperaturze 3000 razy G przez 4 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant, dodać 45 mililitrów zimnego PBS i ponownie odwirować. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach buforu do szybkiej lizy, który zawiera wysokie stężenie inhibitorów Rnazy. Podzielić zawiesinę komórek na porcje po 500 mikrolitrów w zakręcanych probówkach do mikrofuge i dodać około 400 miligramów schłodzonych szklanych kulek do każdej podwielokrotności.

Lizuj komórki w ubijaku do koralików przez trzy minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie. Przenieś lizat do nowych probówek do mikrofuge.

Odetnij górną część 5-mililitrowej strzykawki i umieść ją na pustej 15-mililitrowej tubce, aby służyła jako adapter do zakręcanych tubek. Użyj gorącej igły, aby przebić mały otwór w dnie każdej probówki i umieść je na dostosowanych do tego celu 15-mililitrowych rurkach. Odwirować zespoły w temperaturze 3000 razy G przez jedną minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby wymyć lizat do 15-mililitrowych probówek.

Przenieś przepływ z każdej 15-mililitrowej probówki do nowej 1,5-mililitrowej probówki i odwiruj przy 10 000 razy G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Połącz supernatant ze wszystkich 1,5 mililitrowych probówek w jedną 15-mililitrową probówkę. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.

Rozpocznij szybką procedurę izolowania kompleksów białkowych RNA, dodając 300 mikrogramów Awidyny do lizatu komórkowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza pod ciągłym toczeniem. Podczas inkubacji lizatu komórkowego z Avidin, należy wstępnie umyć kulki streptawidyny, przenieść około 300 mikrolitrów zawiesiny kulek streptavadyny do ważenia 1,5 mililitra probówki mikrowirówki, odwirować preparat, a następnie usunąć górny supernatant, co da 250 mikrolitrów kulek.

Dodaj 1 mililitr buforu do szybkiej lizy do kulek i odwiruj w temperaturze 660 razy G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie przemyć buforem do szybkiej lizy. Aby zablokować kulki, dodaj 0,5 mililitra buforu do szybkiej lizy, 0,5 mililitra BSA i 10 mikrolitrów drożdży TRNA i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją.

Umyj kulki dwukrotnie 1 mililitrem buforu do szybkiej lizy. Dodać 250 mikrolitrów wstępnie umytych kulek streptawidyny do lizatu zawierającego awidynę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją. Ten czas inkubacji jest kompromisem między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem szans na degradację RNA.

Po godzinie odwirować w temperaturze 660 razy G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć kulki streptawidyny. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 15 mililitrów. Odłożyć na bok 1/50 i 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białka.

Dodaj 1 mililitr buforu do szybkiej lizy do kulek. Wymieszać pipetując, przenieść do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i odwirować w temperaturze 660 razy G przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przemyć jeszcze trzy razy buforem do szybkiej lizy.

Po ostatnim przepłukaniu buforem do szybkiej lizy usuń supernatant, dodaj 1 mililitr buforu do szybkiego płukania i obracaj przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odwirować i umyć jeszcze 2 razy za pomocą buforu do szybkiego mycia. Umyj kulki 1 mililitrem PBS i odwiruj jak poprzednio.

Usuń supernatant, dodaj do kulek 120 mikrolitrów PBS i obracaj przez 5 minut w wałku. Odwirować jak poprzednio i zebrać cały supernatant do ekstrakcji RNA i białka jako próbkę do przemycia. Aby wymyć RNA i białka związane z RNA, dodaj 120 mikrolitrów 6-milimolowej biotyny w PBS do kulek i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza ze stałą rotacją.

Odwiruj kulki i przenieś usunięty materiał do nowej 1,5 mililitrowej probówki. Ponownie odwiruj eluowaną próbkę i przenieś górną fazę do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra, aby upewnić się, że nie ma przenoszenia kulek. Pobrać próbki do ekstrakcji RNA lub białka.

Aby określić skuteczność izolacji i jakość RNA, przeprowadzono analizę Northern dla dwóch znakowanych RNA. PMP1 i FPR1, z lizy komórek odlewanych, szybkiej lizy komórek i po elucji biotyną. Rybosomalne RNA wykryto za pomocą barwienia bromkiem etydyny, a brak rybosomalnego RNA w próbce elucyjnej wskazuje na rygorystyczność oczyszczania.

O rygorystyczności i swoistości oczyszczania świadczy również brak sygnału nieznakowanego mRNA w próbkach elucyjnych. Sygnał pozorny na torze FPR1, który nie jest wielkości ACT1, jest pozostałością po poprzedniej hybrydyzacji z sondą MS2L. Chociaż wejściowy RNA jest nieco bardziej zdegradowany w porównaniu z RNA, które zostało oczyszczone za pomocą protokołu Hot Phenol, znaczna ilość znakowanego RNA o pełnej długości jest izolowana specyficznie, co ujawnia silny sygnał we frakcjach elucyjnych.

Próbki białek mogą być analizowane za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrze przed analizą proteomiczną. Białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP, oznaczone strzałką, wykazuje równe obciążenie białka. Gwiazdki wskazują pasma o różnej intensywności, które zostały później wycięte z żelu do analizy spektrometrii mas.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nosić rękawice, zapewnić czyste miejsce pracy, przygotować roztwór z wodą wolną od RNA oraz pracować szybko i wydajnie, aby skrócić czas protokołu. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami, takimi jak fenol i formaldehyd, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze chemicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wydajnie i skutecznie oczyścić RNA z warkoczy fayna i związanego z nim ciała.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, w celu wykrycia RNA, które wiążą interesujący nas transkrypt.