Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Ogólnym celem tej procedury jest wydajna izolacja specyficznego RNA wraz z białkami, które są z nim powiązane in vivo. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu i regulacji RNA, takie jak określenie zestawu białek związanych z konkretnym transkryptem. Główną zaletą tej techniki jest wysoka wydajność izolacji, która umożliwia późniejszą identyfikację nowych białek związanych z mRNA.

Szybka metodologia wykorzystuje szczep drożdży, który koekspresuje mRNA z tagiem MS2 oraz białko fuzyjne składające się z białka wiążącego MS2 i białka wiążącego streptawidynę. Hoduj 500 mililitrów komórek drożdży w temperaturze 30 °C w syntetycznym medium z dekstrozą lub selektywnym medium SD do uzyskania OD600 w zakresie od 0,8 do 1,0. Gdy komórki będą gotowe, wiruj je przy 3000 ×g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odlej supernatant.

Przemyj komórki w PBS i ponownie odwiruj. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w równym objętościowo medium SD bez metioniny. Inkubuj przez 45 do 60 minut w temperaturze 30 °C, aby indukować ekspresję białka fuzyjnego.

Po 45–60 minutach odstaw 10 mililitrów komórek do ekstrakcji RNA, a pozostałe komórki wykorzystaj do szybkiego oczyszczania. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj do komórek 1,35 mililitra 37% formaldehydu, tak aby uzyskać stężenie końcowe 0,1%, w celu sieciowania kompleksów RNA-białko. Kontynuuj inkubację w temperaturze 30 °C przez 10 minut.

Aby zatrzymać sieciowanie, dodaj 26,5 mililitrów 2,5 molarnej glicyny, do końcowego stężenia 0,125 molarnego, i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 3 minuty. Od tego momentu trzymaj wszystkie próbki na lodzie i pracuj szybko, aby zminimalizować degradację RNA. Odwiruj komórki przy 3000 ×g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.

Odlać supernatant, dodać 45 mililitrów zimnego PBS i ponownie odwirować. Usunąć supernatant i resuspenderować komórki w 5 mililitrach buforu do szybkiej lizy zawierającego wysoką koncentrację inhibitorów RNazy. Podzielić zawiesinę komórkową na aliquoty po 500 mikrolitrów w probówkach do mikrocentryfugi z zakrętką i dodać do każdej aliquoty około 400 miligramów schłodzonych szklanych kulek.

Poddaj komórki lizie w homogenizatorze kuleczkowym przez trzy minuty. Natychmiast umieść lizat na lodzie. Przenieś lizat do nowych probówek do wirówki.

Odciąć górną część strzykawki 5 ml i nałożyć ją na pustą probówkę 15 ml, aby służyła jako adapter do probówek z nakrętką. Za pomocą rozgrzanej igły przebić mały otwór w dnie każdej probówki i umieścić je na wierzchu przystosowanych probówek 15 ml. Wirować tak przygotowane zestawy z prędkością 3000 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C, aby przenieść lizat do probówek 15 ml.

Przenieś ciecz przejściową z każdej probówki o pojemności 15 ml do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych. Połącz nadpłyn ze wszystkich probówek 1,5 ml w jednej probówce 15 ml. Odstaw odpowiednio 1/50 i 1/100 objętości lizatu do izolacji RNA oraz białek.

Rozpocznij szybką procedurę izolacji kompleksów białkowo-RНК, dodając 300 µg awidyny do lizatu komórkowego. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy stałym toczeniu. Podczas inkubacji lizatu komórkowego z awidyną, przeprowadź wstępne płukanie kulek z streptawidyną, przenieś około 300 µl zawiesiny kulek z streptawidyną do ważonej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, odwiruj preparat, a następnie usuń górny nadosad, co pozwoli uzyskać 250 µl kulek.

Do kulek należy dodać 1 mililitr buforu do szybkiej lizy i odwirować przy 660 ×g przez 2 minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Należy usunąć nadosad i ponownie przemyć kulki buforem do szybkiej lizy. W celu zablokowania kulek należy dodać 0,5 mililitra buforu do szybkiej lizy, 0,5 mililitra BSA oraz 10 mikrolitrów drożdżowego TRNA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy stałym obrocie.

Przemyj kuleczki dwukrotnie 1 mililitrem buforu do szybkiej lizy. Dodaj 250 mikrolitrów uprzednio przemytych kuleczek streptawidynowych do lizatu zawierającego awidynę i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przy stałym obrocie. Ten czas inkubacji stanowi kompromis między zapewnieniem wystarczającego czasu wiązania a zminimalizowaniem ryzyka degradacji RNA.

Po jednej godzinie odwiruj próbkę przy 660 ×g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, aby oddzielić kuleczki streptawidynowe. Przenieś nadsadź do probówki o pojemności 15 ml. Odstaw 1/50 oraz 1/100 objętości lizatu odpowiednio do izolacji RNA i białek.

Dodaj 1 ml buforu do szybkiej lizy do kulek. Wymieszaj pipetując, przenieś do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 660 ×g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Przemyj trzy kolejne razy buforem do szybkiej lizy.

Po końcowym przemyciu buforem do szybkiej lizy usunąć nadsącz, dodać 1 mililitr buforu do szybkiego płukania i inkubować w rotatorze przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odwirować i przemyć ponownie 2 razy buforem do szybkiego płukania. Przemyć kuleczki 1 mililitrem PBS i odwirować w ten sam sposób co wcześniej.

Usunąć supernatant, dodać do kulek 120 µL PBS i rotować przez 5 minut w rotatorze. OdwirCować w ten sam sposób co wcześniej i zebrać cały supernatant jako próbkę płukania do ekstrakcji RNA i białek. Aby eluować RNA oraz białka związane z RNA, dodać do kulek 120 µL 6 mM biotyny w PBS i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C przy stałej rotacji.

Odwiruj kuleczki i przenieś materiał eluat do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Ponownie odwiruj próbkę z eluatu i przenieś górną fazę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby zapobiec przeniesieniu kuleczek. Pobierz próbki do ekstrakcji RNA lub białek.

Aby określić wydajność izolacji i jakość RNA, przeprowadzono analizę Northern dla dwóch znakowanych RNA: PMP1 i FPR1, pochodzących z lizy komórek w formie odlewu, szybkiej lizy komórek oraz po elucji biotyną. Rytrybowe RNA wykryto za pomocą barwienia bromkiem etydyny, a brak rybosomalnego RNA w próbce elucyjnej wskazuje na wysoką swoistość procesu oczyszczania.

Rygorystyczność i swoistość oczyszczania są dodatkowo potwierdzone brakiem sygnału nieoznaczonego MRNA w próbkach elucji. Widoczny sygnał w ścieżce FPR1, który nie odpowiada wielkości ACT1, jest pozostałością po poprzedniej hybrydyzacji z sondą MS2L. Mimo że wejściowe RNA jest nieco bardziej zdegradowane w porównaniu do RNA oczyszczonego protokołem Hot Phenol, znacząca ilość pełnowymiarowego, oznaczonego RNA została wyizolowana w sposób swoisty, co potwierdza silny sygnał w frakcjach elucji.

Próbki białek można poddać analizie metodą SDS-PAGE oraz barwienia srebrem przed przeprowadzeniem analizy proteomicznej. Białko fuzyjne MS2-CP-GFP-SBP, wskazane strzałką, potwierdza równą ilość naniesionego białka. Gwiazdkami zaznaczono prążki o różnych intensywnościach, które zostały następnie wycięte z żelu w celu analizy spektrometrią mas.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest noszenie rękawiczek, zapewnienie czystości obszaru roboczego, przygotowanie roztworu w wodzie wolnej od RNA oraz szybka i sprawna praca w celu skrócenia czasu trwania protokołu. Należy pamiętać, że praca z takimi odczynnikami jak fenol i formaldehyd może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium chemicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak sprawnie i skutecznie oczyścić RNA fayn-tress oraz powiązanej z nim części ciała.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak RNA-Seq, w celu wykrycia cząsteczek RNA wiążących analizowany transkrypty.