"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Ogólnym celem tego protokołu jest wizualizacja powstawania fagosomów, a także dokładnego miejsca schizmy fagosomu w 3D, w żywych makrofagach, przy użyciu całkowitego wewnętrznego odbicia florescencji lub mikroskopii TIRF. Metoda ta łączy mikroskopię TIRF z epifluorescencją w celu monitorowania krok po kroku lokalizacji dwóch różnych białek fluorescencyjnych podczas wydłużania pseudopodów i fuzji końcówek. Technika ta zapewnia systematyczną metodę określania kąta krytycznego i uzyskiwania sygnału TIRF, który ma kluczowe znaczenie dla wyciągania wniosków na temat bliskości błony plazmatycznej.

Dzień przed sesją mikroskopową TIRF włącz komorę grzewczą do 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić równomierne nagrzanie stolika mikroskopowego. Następnego ranka, używając 100 mikrolitrów PBS, uzupełnionych 0,1% BSA, przemyć 7x10 do 6 owczych czerwonych krwinek lub SRBC na 35-milimetrowe naczynie ze szklanym dnem dwa razy. Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach króliczych IGG anty-SRBC, w stężeniu subaglutynacyjnym, w PBS uzupełnionym 0,1% BSA na 5 mikrolitrów komórek i inkubować komórki przez 30 minut z powolną rotacją.

Pod koniec inkubacji umyj SRBC dwa razy w PBS plus BSA i ponownie zawieś komórki w 2 mililitrach 37 stopni Celsjusza, bezsurowicy mikroskopowej na miskę. Następnie potraktuj 35-milimetrowe naczynia ze szklanym dnem 2 mililitrami 0,1% lizyny poli-L przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie umyj 2 mililitrami PBS. W celu niekowalencyjnego utrwalenia SRBC, wlej 2 mililitry opsonizowanych komórek IGG do każdej z naczyń pokrytych polilizyną i odwiruj próbki w wirówce z wirnikiem wahadłowym.

Wyrzuć supernatanty i przemyj cząstki jednorazowo 2 mililitrami PBS plus 10% BSA. Następnie inkubuj cząstki z 2 mililitrami świeżego PBS plus 10% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzy mycia z 2 mililitrami PBS. Po ostatnim praniu wymień PBS na 2 mililitry pożywki mikroskopowej bez surowicy o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umieść naczynie pokryte SRBC na stoliku mikroskopu. Następnie zeskrob transfekowane komórki będące przedmiotem zainteresowania z dna szalki hodowlanej i kilkakrotnie pipetuj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Dodaj transfekowane komórki do naczynia pokrytego SRBC.

Uruchom oprogramowanie do akwizycji na żywo. Znajdź komórkę, która wyraża białka znakowane fluorescencyjnie i dostosuj położenie naczynia tak, aby interesująca nas komórka znajdowała się w środku pola. Uzyskaj 500 obrazów pod różnymi kątami od zera do 5% w krokach co 0,01 stopnia, przy jednej długości fali wzbudzenia.

Aby określić kąt krytyczny, pod którym światło padające ma zostać całkowicie odbite na granicy faz szkło-medium i wygenerować falę ulotną, otwórz sekwencję obrazu w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania. Wybierz interesujący Cię obszar w komórce o jednolitej fluorescencji. Następnie na karcie Obraz wybierz opcję Stosy i Kreśl profil osi Z.

Aby wykreślić profil osi z, należy użyć średniej intensywności fluorescencji zmierzonej w obszarze zainteresowania za pomocą funkcji kątów na osi x. Dowolna wartość kąta na osi x, wyższa od kąta krytycznego, może być następnie wykorzystana podczas sesji mikroskopowej w celu uzyskania sygnału TIRF. Następnie w oprogramowaniu do akwizycji na żywo użyj edytora protokołów, aby ustawić parametry akwizycji.

W tym liczba sekwencji akwizycji pętli, kanały fluorescencyjne i ich intensywność lasera, kąt TIRF i czas ekspozycji. Ustaw ruch Z celu, aby osiągnąć płaszczyznę trybu epifluorescencji. Następnie, w trybie epifluorescencji, ustaw kąt TIRF na 1, a Z przesuń obiektyw z powrotem do płaszczyzny TIRF.

Następnie uzyskaj obraz komórki w trybie jasnego światła LED. Teraz znajdź interesującą komórkę o umiarkowanym poziomie ekspresji białka znakowanego fluorescencyjnie, zaangażowaną w fagocytozę za pomocą SRBC i przenieś komórkę do środka pola. Zauważ, że taką komórkę można zidentyfikować po rozszerzonej błonie plazmatycznej wokół cząsteczki.

Wprowadź liczbę klatek na karcie Liczba pętli, aby rozpocząć pobieranie strumieniowe od 500 do 1 000 klatek. W razie potrzeby zmień intensywność lasera i czas ekspozycji, aby dostosować się do różnych poziomów fluorescencji w komórce. Aby wygenerować dwie oddzielne sekwencje obrazów odpowiadające dwóm kanałom, otwórz sekwencje w oprogramowaniu imagine i kliknij kartę Obraz.

W menu Hyperstacks wybierz pozycję Stos do Hyperstack. Następnie w wyskakującym oknie wprowadź xyctz dla Kolejności, liczbę fluorochromów użytych dla Kanałów, liczbę Plasterków na osi z, liczbę obrazów podzieloną przez liczbę kanałów w obszarze Ramki i Skalę szarości dla Trybu wyświetlania. Następnie podziel kanały.

Tutaj pokazano reprezentatywny film z mikroskopii TIRF z żywych komórek testu domknięcia fagosomu w surowych makrofagach 264.7 otaczających opsonizowane IGG SRBC. Gdy końce pseudopodów przeciwstawnych do szklanego szkiełka nakrywkowego otaczają SRBC, w obszarze TIRF wykrywany jest pierścień F-aktyny, który stopniowo zwęża się, aż do zamknięcia. Równolegle niewyraźny sygnał F-aktyny wykryty przez epifluroescencję, po przesunięciu etapu o trzy mikrony powyżej obszaru TIRF odpowiada depolimeryzacji u podstawy miseczki fagocytarnej.

Po trzech minutach SRBC jest całkowicie zinternalizowany, co potwierdza obrazowanie w świetle przechodzącym. Za pomocą tej metody można wykazać aktynę u podstawy miseczki fagocytarnej, w której występuje ogniskowa egzocytoza przedziałów wewnątrzkomórkowych. Po jego pozyskaniu komórka może być dalej przetwarzana do korelacyjnej mikroskopii elektronowej lub cała populacja komórek może być utrwalona i zamrożona w celu poddania jej obróbce do klasycznej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Należy pamiętać, że fagocytoza jest bardzo wrażliwa na temperaturę, dlatego temperatura w komorze grzewczej i pożywce hodowlanej powinna być utrzymywana na stałym poziomie 37 stopni Celsjusza przez cały zabieg. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opsonizować cząstki, pokrywać szkiełka pokrywające cząstkami, określać kąty krytyczne dla mikroskopii TIRF i obrazować lokalizację interesujących białek podczas fagocytozy żywych komórek.