"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wizualizacja powstawania fagosomów, a także dokładnego miejsca ich podziału w 3D w żywych makrofagach, przy użyciu mikroskopii TIRF (całkownego wewnętrznego odbicia fluorescencji). Metoda ta łączy mikroskopię TIRF z epifluorescencją, aby monitorować krok po kroku lokalizację dwóch różnych białek fluorescencyjnych podczas wysuwania pseudopodiów i fuzji ich końców. Technika ta zapewnia systematyczną metodę wyznaczania kąta krytycznego i uzyskiwania sygnału TIRF, co jest kluczowe dla wyciągania wniosków dotyczących obszarów znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie błony komórkowej.

Dzień przed sesją z mikroskopem TIRF włącz komorę grzewczą do 37 °C, aby zapewnić jednorodne nagrzanie stolika mikroskopu. Następnego dnia rano, używając 100 µL PBS uzupełnionego o 0,1% BSA, dwukrotnie przemyj 7x10⁶ owczych erytrocytów (SRBCs) na jedną szalkę o średnicy 35 mm z szklanym dnem. Po drugiej wirowaniu resuspenduj komórki w 500 µL przeciwciał królika IgG przeciwko SRBC w stężeniu poniżej progu aglutynacji w PBS uzupełnionym o 0,1% BSA, w przeliczeniu na 5 µL komórek, i inkubuj komórki przez 30 minut przy powolnym obracaniu.

Po zakończeniu inkubacji przemyj SRBC dwa razy w PBS z dodatkiem BSA, a następnie resuspenduj komórki w 2 mililitrach bezsurowiczego medium do mikroskopii o temperaturze 37°C na każdą płytkę. Następnie potraktuj 35-milimetrowe płytki z szklanym dnem 2 mililitrami 0,1% poly-L lysine przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj dwukrotnie 2 mililitrami PBS. W celu niewiążącej fiksacji SRBC wlej 2 mililitry komórek opsonizowanych IGG do każdej z płytek pokrytych polylysine i odwiruj próbki w wirówce z rotorem wahadłowym.

Odlej supernatanty i przemyj cząstki raz 2 mililitrami PBS z dodatkiem 10% BSA. Następnie inkubuj cząstki w 2 mililitrach świeżego PBS z dodatkiem 10% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj je trzykrotnie 2 mililitrami PBS. Po ostatnim płukaniu zastąp PBS 2 mililitrami bezserwatkowego medium do mikroskopii w temperaturze 37°C.

Umieść naczynie powlekane SRBC na stoliku mikroskopu. Następnie zeskrob interesujące komórki przetransfekowane z dna naczynia hodowlanego i kilkakrotnie pipetuj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieś przetransfekowane komórki do naczynia powlekanego SRBC.

Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów na żywo. Znajdź komórkę wykazującą ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie i dostosuj położenie naczynia tak, aby interesująca komórka znajdowała się w centrum pola widzenia. Wykonaj akwizycję 500 obrazów pod różnymi kątami od 0% do 5% w przyrostach 0,01 stopnia, przy jednej długości fali wzbudzenia.

Aby wyznaczyć kąt krytyczny dla światła padającego, przy którym następuje całkowite odbicie na styku szkło-medium i powstaje fala ewanescentna, otwórz sekwencję obrazów w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu. Wybierz obszar zainteresowania w komórce o jednorodnej fluorescencji. Następnie w karcie Image wybierz opcję Stacks, a następnie Plot Z Axis Profile.

Aby wykreślić profil osi z dla średniej intensywności fluorescencji mierzonej w obszarze zainteresowania w funkcji kątów na osi x. Każda wartość kąta na osi x, przekraczająca kąt krytyczny, może być następnie wykorzystana podczas sesji mikroskopowej do uzyskania sygnału TIRF. Następnie, w oprogramowaniu do akwizycji na żywo, należy użyć edytora protokołów, aby ustawić parametry akwizycji.

W tym m.in. liczbę sekwencji akwizycji pętli, kanały fluorescencyjne i ich intensywność laserową, kąt TIRF oraz czas ekspozycji. Ustaw przemieszczenie Z obiektywu tak, aby dotrzeć do płaszczyzny trybu epifluorescencyjnego. Następnie, w trybie epifluorescencyjnym, ustaw kąt TIRF na 1, a przemieszczenie Z obiektywu przywróć do płaszczyzny TIRF.

Następnie wykonaj obraz komórki w trybie LED światła białego. Teraz znajdź komórkę o umiarkowanym poziomie ekspresji białka znakowanego fluorescencyjnie, która wykazuje aktywność fagocytozy w stosunku do SRBC, i przemieść ją na środek pola widzenia. Należy zauważyć, że taką komórkę można zidentyfikować po rozszerzonej błonie komórkowej otaczającej cząstkę.

Wprowadź liczbę klatek w zakładce Loop Count, aby rozpocząć seryjną akwizycję od 500 do 1 000 klatek. W razie potrzeby zmień intensywność lasera oraz czas ekspozycji, aby dostosować je do różnych poziomów fluorescencji w komórce. Aby wygenerować dwie oddzielne sekwencje obrazów odpowiadające dwóm kanałom, otwórz sekwencje w oprogramowaniu do obrazowania i kliknij zakładkę Image.

W menu Hyperstacks wybierz opcję Stack to Hyperstack. Następnie, w oknie pop-up, wprowadź xyctz w polu Order, liczbę użytych fluorochromów w polu Channels, liczbę warstw (Slices) w osi z, liczbę obrazów podzieloną przez liczbę kanałów w polu Frames oraz Grayscale w polu Display Mode. Następnie rozdziel kanały.

Tutaj przedstawiono reprezentatywny film z mikroskopii TIRF żywych komórek z testu zamykania fagosomu w makrofagach RAW 264.7 pochłaniających SRBC opsonizowane IGG. W miarę jak końce pseudopodiów przeciwnych do szkiełka przedmiotowego otaczają SRBC, w obszarze TIRF wykrywany jest pierścień F-aktyny, który stopniowo zwęża się aż do zamknięcia. Równolegle rozmyty sygnał F-aktyny wykrywany metodą epifluorescencji, po przesunięciu stolika o trzy mikrony powyżej obszaru TIRF, odpowiada depolimeryzacji u podstawy czary fagocytarniej.

Po trzech minutach SRBC zostaje całkowicie zinternalizowane, co potwierdzono za pomocą obrazowania w świetle przechodzącym. Wykorzystując tę metodę, można zademonstrować rozmieszczenie aktyny u podstawy kubka fagocytarnego, gdzie zachodzi ogniskowa egzocytoza przedziałów wewnątrzkomórkowych. Po akwizycji pojedynczą komórkę można poddać dalszej obróbce w celu przeprowadzenia korelacyjnej mikroskopii elektronowej lub można utrwalić i zamrozić całą populację komórek w celu wykonania klasycznej mikroskopii immunofluorescence.

Należy pamiętać, że fagocytoza jest bardzo wrażliwa na temperaturę, dlatego temperatura w komorze grzewczej oraz w medium w naczyniu hodowlanym powinna być utrzymywana na stałym poziomie 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak opsonizować cząstki, pokrywać szkiełka podstawkowe tymi cząstkami, wyznaczać kąty krytyczne dla mikroskopii TIRF oraz obrazować lokalizację interesujących białek podczas fagocytozy w żywych komórkach.