"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)
26 sierpnia 2016
Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wizualizacja powstawania fagosomów, a także dokładnego miejsca ich podziału w 3D w żywych makrofagach, przy użyciu mikroskopii TIRF (całkownego wewnętrznego odbicia fluorescencji). Metoda ta łączy mikroskopię TIRF z epifluorescencją, aby monitorować krok po kroku lokalizację dwóch różnych białek fluorescencyjnych podczas wysuwania pseudopodiów i fuzji ich końców. Technika ta zapewnia systematyczną metodę wyznaczania kąta krytycznego i uzyskiwania sygnału TIRF, co jest kluczowe dla wyciągania wniosków dotyczących obszarów znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie błony komórkowej.
Dzień przed sesją z mikroskopem TIRF włącz komorę grzewczą do 37 °C, aby zapewnić jednorodne nagrzanie stolika mikroskopu. Następnego dnia rano, używając 100 µL PBS uzupełnionego o 0,1% BSA, dwukrotnie przemyj 7x10⁶ owczych erytrocytów (SRBCs) na jedną szalkę o średnicy 35 mm z szklanym dnem. Po drugiej wirowaniu resuspenduj komórki w 500 µL przeciwciał królika IgG przeciwko SRBC w stężeniu poniżej progu aglutynacji w PBS uzupełnionym o 0,1% BSA, w przeliczeniu na 5 µL komórek, i inkubuj komórki przez 30 minut przy powolnym obracaniu.
Po zakończeniu inkubacji przemyj SRBC dwa razy w PBS z dodatkiem BSA, a następnie resuspenduj komórki w 2 mililitrach bezsurowiczego medium do mikroskopii o temperaturze 37°C na każdą płytkę. Następnie potraktuj 35-milimetrowe płytki z szklanym dnem 2 mililitrami 0,1% poly-L lysine przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj dwukrotnie 2 mililitrami PBS. W celu niewiążącej fiksacji SRBC wlej 2 mililitry komórek opsonizowanych IGG do każdej z płytek pokrytych polylysine i odwiruj próbki w wirówce z rotorem wahadłowym.
Odlej supernatanty i przemyj cząstki raz 2 mililitrami PBS z dodatkiem 10% BSA. Następnie inkubuj cząstki w 2 mililitrach świeżego PBS z dodatkiem 10% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj je trzykrotnie 2 mililitrami PBS. Po ostatnim płukaniu zastąp PBS 2 mililitrami bezserwatkowego medium do mikroskopii w temperaturze 37°C.
Umieść naczynie powlekane SRBC na stoliku mikroskopu. Następnie zeskrob interesujące komórki przetransfekowane z dna naczynia hodowlanego i kilkakrotnie pipetuj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieś przetransfekowane komórki do naczynia powlekanego SRBC.
Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów na żywo. Znajdź komórkę wykazującą ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie i dostosuj położenie naczynia tak, aby interesująca komórka znajdowała się w centrum pola widzenia. Wykonaj akwizycję 500 obrazów pod różnymi kątami od 0% do 5% w przyrostach 0,01 stopnia, przy jednej długości fali wzbudzenia.
Aby wyznaczyć kąt krytyczny dla światła padającego, przy którym następuje całkowite odbicie na styku szkło-medium i powstaje fala ewanescentna, otwórz sekwencję obrazów w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu. Wybierz obszar zainteresowania w komórce o jednorodnej fluorescencji. Następnie w karcie Image wybierz opcję Stacks, a następnie Plot Z Axis Profile.
Aby wykreślić profil osi z dla średniej intensywności fluorescencji mierzonej w obszarze zainteresowania w funkcji kątów na osi x. Każda wartość kąta na osi x, przekraczająca kąt krytyczny, może być następnie wykorzystana podczas sesji mikroskopowej do uzyskania sygnału TIRF. Następnie, w oprogramowaniu do akwizycji na żywo, należy użyć edytora protokołów, aby ustawić parametry akwizycji.
W tym m.in. liczbę sekwencji akwizycji pętli, kanały fluorescencyjne i ich intensywność laserową, kąt TIRF oraz czas ekspozycji. Ustaw przemieszczenie Z obiektywu tak, aby dotrzeć do płaszczyzny trybu epifluorescencyjnego. Następnie, w trybie epifluorescencyjnym, ustaw kąt TIRF na 1, a przemieszczenie Z obiektywu przywróć do płaszczyzny TIRF.
Następnie wykonaj obraz komórki w trybie LED światła białego. Teraz znajdź komórkę o umiarkowanym poziomie ekspresji białka znakowanego fluorescencyjnie, która wykazuje aktywność fagocytozy w stosunku do SRBC, i przemieść ją na środek pola widzenia. Należy zauważyć, że taką komórkę można zidentyfikować po rozszerzonej błonie komórkowej otaczającej cząstkę.
Wprowadź liczbę klatek w zakładce Loop Count, aby rozpocząć seryjną akwizycję od 500 do 1 000 klatek. W razie potrzeby zmień intensywność lasera oraz czas ekspozycji, aby dostosować je do różnych poziomów fluorescencji w komórce. Aby wygenerować dwie oddzielne sekwencje obrazów odpowiadające dwóm kanałom, otwórz sekwencje w oprogramowaniu do obrazowania i kliknij zakładkę Image.
W menu Hyperstacks wybierz opcję Stack to Hyperstack. Następnie, w oknie pop-up, wprowadź xyctz w polu Order, liczbę użytych fluorochromów w polu Channels, liczbę warstw (Slices) w osi z, liczbę obrazów podzieloną przez liczbę kanałów w polu Frames oraz Grayscale w polu Display Mode. Następnie rozdziel kanały.
Tutaj przedstawiono reprezentatywny film z mikroskopii TIRF żywych komórek z testu zamykania fagosomu w makrofagach RAW 264.7 pochłaniających SRBC opsonizowane IGG. W miarę jak końce pseudopodiów przeciwnych do szkiełka przedmiotowego otaczają SRBC, w obszarze TIRF wykrywany jest pierścień F-aktyny, który stopniowo zwęża się aż do zamknięcia. Równolegle rozmyty sygnał F-aktyny wykrywany metodą epifluorescencji, po przesunięciu stolika o trzy mikrony powyżej obszaru TIRF, odpowiada depolimeryzacji u podstawy czary fagocytarniej.
Po trzech minutach SRBC zostaje całkowicie zinternalizowane, co potwierdzono za pomocą obrazowania w świetle przechodzącym. Wykorzystując tę metodę, można zademonstrować rozmieszczenie aktyny u podstawy kubka fagocytarnego, gdzie zachodzi ogniskowa egzocytoza przedziałów wewnątrzkomórkowych. Po akwizycji pojedynczą komórkę można poddać dalszej obróbce w celu przeprowadzenia korelacyjnej mikroskopii elektronowej lub można utrwalić i zamrozić całą populację komórek w celu wykonania klasycznej mikroskopii immunofluorescence.
Należy pamiętać, że fagocytoza jest bardzo wrażliwa na temperaturę, dlatego temperatura w komorze grzewczej oraz w medium w naczyniu hodowlanym powinna być utrzymywana na stałym poziomie 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak opsonizować cząstki, pokrywać szkiełka podstawkowe tymi cząstkami, wyznaczać kąty krytyczne dla mikroskopii TIRF oraz obrazować lokalizację interesujących białek podczas fagocytozy w żywych komórkach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę wizualizacji tworzenia i zamykania się fagosomów w żywych makrofagach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Technika ta pozwala na wysokorozdzielcze monitorowanie pucharka fagocytarnego oraz wysuwania pseudopodiów w trzech wymiarach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Fagocytoza jest kluczowym procesem w odpowiedzi immunologicznej.
- Zrozumienie dynamiki fagosomów może dostarczyć wiedzy na temat funkcji makrofagów.
- Mikroskopia TIRF oferuje rozszerzone możliwości wizualizacji.
- Połączenie TIRF z epifluorescencją pozwala na szczegółowe śledzenie procesów komórkowych.
Cel badania
- Wizualizacja procesu tworzenia i zamykania się fagosomów w czasie rzeczywistym.
- Identyfikacja dokładnego miejsca odsznurowania fagosomu.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania makrofagów podczas fagocytozy.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie mikroskopii TIRF do obserwacji żywych makrofagów.
- Zastosowanie białek fluorescencyjnych do śledzenia składników komórkowych.
- Przygotowanie owczych erytrocytów do testów fagocytozy.
- Monitorowanie wysuwania pseudopodiów i fuzji ich końców podczas fagocytozy.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja dynamiki fagosomów w trzech wymiarach.
- Identyfikacja kluczowych etapów fagocytozy.
- Wykazanie skuteczności mikroskopii TIRF w obrazowaniu żywych komórek.
- Wgląd w mechanizmy oddziaływań makrofagów z celami.
Wnioski
- Badanie przedstawia nowatorskie podejście do wizualizacji fagocytozy.
- Mikroskopia TIRF jest potężnym narzędziem do badania procesów komórkowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji komórek odpornościowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wizualizacja zamykania się fagosomu w trzech wymiarach wypełnia istotną lukę w rozumieniu oczyszczania organizmu z patogenów za pośrednictwem makrofagów, co stanowi kluczowy mechanizm w badaniach nad immunologią i chorobami zakaźnymi. Ten test oparty na technice TIRF umożliwia śledzenie dynamiki aktyny i zdarzeń fuzji błon w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością, co pozwala na mechanistyczną minimalizację ryzyka w procesie walidacji celów podczas poszukiwania leków immunomodulujących. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków, łącząc perturbacje molekularne z funkcjonalnymi efektami fagocytozy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację wysuwania pseudopodi z udziałem aktyny oraz fuzji ich wierzchołków podczas tworzenia fagosomu.
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych w zakresie regulatorów cytoszkieletu i mechanizmów egzocytozy zaangażowanych w internalizację patogenów.
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność predykcyjną poprzez korelację lokalizacji białek z wydajnością fagocytozy i kinetyką zamykania fagosomu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustanowienie ilościowych odczytów dynamiki pucharów fagocytarnych.
- Wartość naukowa: Rozwiązuje kwestię standaryzacji testu poprzez kontrolowane powlekanie cząstek, utrzymywanie temperatury oraz kalibrację kąta TIRF.
- Wartość naukowa: Podkreśla gotowość do badań przesiewowych dzięki obrazowaniu dwukanałowemu białek znakowanych fluorescencyjnie podczas fagocytozy w żywych komórkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia znaczenie dla patogenezy chorób, umożliwiając wizualizację defektów fagocytarnych w modelach makrofagów z dysfunkcją odpornościową.
- Wartość naukowa: Opisuje ciągłość translacyjną od mechanizmu molekularnego do fenotypu komórkowego w walidacji przedklinicznej.
- Wartość naukowa: Koncentruje się na predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez identyfikację cząsteczek, których zaburzenie hamuje zamykanie fagosomu bez wpływu na tworzenie się kubka fagocytarnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego po identyfikację związków wiodących – dostarczając wglądu w mechanizmy funkcji fagocytarnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację dynamiki czasoprzestrzennej aktyny i markerów egzocytozy podczas formowania się kubka fagocytarnego.
- Screening: Opisuje gotowość analizy poprzez powtarzalne generowanie sygnałów TIRF i śledzenie lokalizacji białek w dwóch kanałach.
- Analityka: Wskazuje na ilościowe pomiary kinetyki zamykania fagosomu i zwężania się pierścienia aktynowego jako funkcjonalne odczyty efektów zaburzeń genetycznych lub wywołanych związkami chemicznymi.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając korelację fenotypów obrazowania z wynikami funkcjonalnymi w modelach makrofagów.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnego użytku platformę obrazowania do badania fagocytozy dla różnych typów cząstek i linii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu dzięki bezpośredniej wizualizacji zdarzeń zamykania fagosomu.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki kontrolowanemu wyznaczaniu kąta krytycznego oraz obrazowaniu żywych komórek z zachowaniem stałej temperatury.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach cytoszkieletowych i egzocytozy.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich wpływ na wydajność fagocytozy i dynamikę zamykania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu obrazowania żywych komórek, transfekcji oraz kalibracji mikroskopii TIRF.
- Wymagane instrumentarium obejmuje mikroskop z możliwością obrazowania TIRF i epifluorescencją, system kontroli temperatury oraz kamery o wysokiej czułości.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga wspólnych protokołów opsonizacji cząsteczek, powlekania oraz parametrów obrazowania.
- Kwestie adaptacyjne obejmują zróżnicowany rozmiar cząsteczek, przenikanie fluorescencji (bleed-through) oraz fototoksyczność podczas długoterminowego obrazowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na wahania temperatury oraz konieczność stosowania konstruktów białek fluorescencyjnych o niskim poziomie ekspresji, aby uniknąć artefaktów związanych z nadekspresją.
