Name: Test zamykania fagosomu do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji powstawania fagosomów w żywych makrofagach przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia obserwację dynamiki fagocytozy w trzech wymiarach z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paryż, Francja) za wstępne dyskusje na temat eksperymentalnego podejścia oraz Dr. Jamilowi Jubrailowi za przeczytanie manuskryptu. Nadège Kambou i Susanna Borreill są cenione za przeprowadzanie eksperymentów z tą metodą w naszym laboratorium. Prace te były wspierane przez granty z CNRS (Program ATIP), Ville de Paris i Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 w tym stypendium doktoranckie dla CMW) dla FN oraz Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales" (ANRS), w tym stypendium doktoranckie dla JM.

Uwaga: Plazmid użyty Lifeact-mCherry jest miłym darem od dr Guillaume'a Montagnaca z Instytutu Curie w Paryżu, wygenerowanym po 17 roku.
1. Komórki i transfekcja
Uwaga: Makrofagi RAW264.7 są hodowane do subkonfluencji w kompletnym pożywce (pożywka RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy i 10% FCS (surowica cielęca płodu)) na płytce o średnicy 100 mm. Są one transfekowane plazmidami kodującymi fluorescencyjnie znakowane białka za pomocą elektroporacji. Rutynowo około 5 - 6 x 106 komórek jest transfekowanych 20 μg lub 10 μg plazmidu odpowiednio dla każdej transfekcji lub kotransfekcji. Należy pamiętać, że inne metody transfekcji oparte na elektroporacji lub lipofekcji mogą być stosowane jako alternatywne podejścia.
<ol>
	<li>Zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i ponownie zawiesić je w 10 ml pożywki hodowlanej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek 300 x g, 5 min przy RT w wirniku o kącie wychylnym.</li>
	<li>Rozgrzać 10 ml kompletnego podłoża uzupełnionego 10 μg/ml gentamycyny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml "buforu płuczącego A" z zestawu do elektroporacji.</li>
	<li>Zawiesinę komórek odwirować 300 x g, 5 min w temperaturze pokojowej w wirniku o kącie wychylnym.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj mieszankę DNA w temperaturze pokojowej: 120 μl 2x bufor B, 20 μg plazmidowego DNA kodującego interesujące nas białko, q.s.p. 240 μl H2O.</li>
	<li>Po odwirowaniu wyrzucić cały supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w mieszance DNA i przenieść do kuwet do elektroporacji o średnicy 4 mm.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Elektroporacja przy 250 V, 900 μF.</li>
	<li>Natychmiast ponownie zawiesić komórki w podgrzanym (37 °C) kompletnym podłożu uzupełnionym gentamycyną i umieścić je w naczyniu o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Inkubować transfekowane komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego ranka zastąp całe podłoże 10 ml pożywki mikroskopowej bez surowicy (RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy).</li>
</ol>
2. Opsonizacja czerwonych krwinek
Uwaga: Jako model docelowych cząstek dla makrofagów stosuje się owcze krwinki czerwone (SRBC). Zwykle stosuje się około 7 x 106 SRBC na naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
<ol>
	<li>Przepłukać SRBC 100 μl 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)/0,1% BSA (albumina surowicy bydlęcej) i odwirować (600 x g, 4 min).</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić SRBC w 100 μl 1x PBS/0,1% BSA i odwirować (600 x g, 4 min).</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić SRBC w 1x PBS/0,1% BSA z króliczymi IgG anty-SRBC w stężeniu subaglutynacyjnym. Użyć 500 μl roztworu zawierającego przeciwciała/5 μl SRBCs. 
	Uwaga: Stężenie subaglutynacyjne przeciwciał odpowiada najniższemu stężeniu, które nie wywołało aglutynacji wykrytej jako tworzenie sieci. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie subaglutynacyjne wynosi 8,2 μg/ml.
	<ol>
		<li>Określić stężenie IgG anty-SRBC wymagane do opsonizacji SRBC za pomocą testu hemaglutynacji. Stopniowo rozcieńczyć IgG anty-SRBC (zapas w stężeniu 13,1 mg/ml) w proporcjach 1/50 - 1/25 600 na mikropłytce. Dodaj 2 x 106 SRBC do każdej studzienki. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z powolną rotacją.</li>
	<li>Po dwóch płukaniach w 1x PBS/0,1% BSA, jak opisano powyżej, ponownie zawiesić IgG-opsonizowane SRBC (IgG-SRBCs) we wstępnie podgrzanym pożywce mikroskopowej bez surowicy (2 ml / naczynie).</li>
</ol>
3. Powłoka polilizynowa szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>W międzyczasie potraktuj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 2 ml 0,01% poli-L-lizyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj naczynia dwa razy 2 ml 1x PBS.</li>
</ol>
4. Niekowalencyjne utrwalanie SRBC na naczyniach ze szklanym dnem
<ol>
	<li>Wlać 2 ml zawiesiny SRBC na szklane naczynie o dnie 35 mm.</li>
	<li>Wirować z wirnikiem wahliwym o sile 500 x g przez 2 minuty na naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad i przemyć go raz 2 ml 1x PBS/10% BSA.</li>
	<li>Inkubować cząstki przez 30 minut z 2 ml 1x PBS/10% BSA na naczynie.</li>
	<li>Umyj naczynia trzy razy 2 ml 1x PBS.</li>
	<li>Zastąp 1x PBS 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża mikroskopowego bez surowicy.</li>
</ol>
5. Fagocytoza wizualizowana przez TIRFM
<ol>
	<li>Mikroskop 
	Uwaga: TIRFM przeprowadzono przy użyciu mikroskopu wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju (N 100X, NA1.49), komorę grzewczą z CO2 oraz dwie kamery do wykrywania pojedynczych fotonów EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) sprzężone z soczewką 1,5X.
	<ol>
		<li>Dzień przed sesją mikroskopową TIRF włączyć komorę grzewczą na 37 ºC, aby umożliwić jednorodne podgrzanie stolika mikroskopowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczanie kąta krytycznego 
	Uwaga: Oprogramowanie ImageJ Color Profiler służy do przetwarzania strumieni obrazów TIRF.
	<ol>
		<li>Umieścić pod mikroskopem naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierające opsonizowane SRBC z pożywką mikroskopową bez surowicy.</li>
		<li>Zeskrobać komórki i ponownie zawiesić je w pożywce przed dodaniem ich (100 - 500 μl) do naczynia.</li>
		<li>Użyj oprogramowania "Live Acquisition" do sterowania mikroskopem i przeprowadzenia wzbudzenia za pomocą lasera 491 nm i/lub 561 nm w celu identyfikacji komórek wykazujących ekspresję fluorescencyjnie znakowanych białek.</li>
		<li>Zidentyfikuj komórkę, która wyraża fluorescencyjnie znakowane białka.</li>
		<li>Umieść go na środku pola i uzyskaj 500 obrazów na jednej długości fali wzbudzenia, pod różnymi kątami od 0º do 5º, z krokiem 0,01º (rysunek 2A). Kąty są automatycznie zmieniane przez system mikroskopu.</li>
		<li>Określ kąt krytyczny, aby padające światło zostało całkowicie odbite na granicy szkła / medium i wygeneruj falę ulotną. Za pomocą oprogramowania ImageJ Color Profiler otwórz sekwencję obrazów, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierz plik.</li>
		<li>Wybierz obszar zainteresowania (ROI) za pomocą prostokątnego narzędzia w komórce o jednolitej fluorescencji (Rysunek 2B żółty 1).</li>
		<li>Wykreśl "Profil osi Z" średnią intensywność fluorescencji mierzoną w ROI z funkcją kątów na osi x, klikając zakładkę "Obraz", "Stosy" w menu rozwijanym i "Wykres profilu osi Z" (rysunek 2B czerwony 2). 
		Uwaga: Kąt krytyczny to kąt prowadzący do maksymalnej fluorescencji przed gwałtownym spadkiem fluorescencji.</li>
		<li>Użyj dowolnej wartości kąta na osi x większej niż kąt krytyczny podczas sesji mikroskopowej, aby uzyskać sygnał TIRF, jak w przykładzie 2.00 (Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejęcia
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania Live Acquisition, ustaw parametry akwizycji za pomocą modułu "Edytor protokołów" (Rysunek 3A).
		<ol>
			<li>Stwórz protokół z "pętlą" obejmującą akwizycję "Multi Channels" w celu uzyskania sygnału fluorescencyjnego z białek będących przedmiotem zainteresowania w regionie TIRF. Wprowadź kąt TIRF (na przykład 2,00), czas naświetlania (na przykład 50 ms) i intensywność lasera (na przykład 50%) (Rysunek 3B 1).</li>
			<li>Wprowadź ruch "Z" celu 3 μm powyżej obszaru TIRF, aby uzyskać akwizycję sygnału w epifluorescencji za pomocą narzędzia "Multi Channels". Wprowadź kąt poniżej kąta krytycznego (jak w przykładzie 1.00), czasu naświetlania (50 ms) i natężenia lasera (50%) (rysunek 3B, 2 i 3).</li>
			<li>Następnie dodaj ruch "z" celu 3 μm poniżej, aby powrócić do obszaru TIRF (Rysunek 3B 4). Dodaj "migawkę" ogniwa w jasnym świetle LED (dioda elektroluminescencyjna) (Rysunek 3B 5).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Znajdź interesującą komórkę o umiarkowanym poziomie fluorescencyjnie znakowanej ekspresji białka, która inicjuje fagocytozę SRBC poprzez rozszerzenie błony plazmatycznej wokół cząsteczki.</li>
		<li>Umieść go na środku pola.</li>
		<li>Rozpocznij akwizycję strumieniową od 500 do 1 000 klatek. W zakładce "liczba pętli" wpisz "750 klatek" (Rysunek 3B 1). 
		Uwaga: Oprogramowanie ImageJ Color Profiler służy do przetwarzania strumieni obrazów TIRF.</li>
		<li>Otwórz obrazy sekwencji w oprogramowaniu Image J, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierając plik.</li>
		<li>Oddziel kanały, klikając zakładkę "Obraz", menu rozwijane "Hyperstacks" i funkcję "Stos do hiperstosu". Wypełnij wyświetlone okno: Zamówienie: xyctz; Kanał (c): liczba kanałów (np. "2", jeśli masz dwa fluorochromy); Plasterki (z): liczba wycinków na osi z (np. "1", jeśli nie ma ruchu w osi z); Klatki (t): liczba obrazów podzielona na liczbę kanałów; Tryb wyświetlania: Skala szarości. 
		Uwaga: Generowane są dwie oddzielne sekwencje obrazów, odpowiadające dwóm różnym kanałom.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity%3A+learning+on+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptors+in+homeostasis+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptors in homeostasis and immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Scott, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+hydrolysis+directs+actin+remodeling+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis.</a> J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).</li>
<li>Schlam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+enables+phagocytosis+of+large+particles+by+terminating+actin+assembly+through+Rac%2FCdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Nat Commun. 6, 8623(2015).</li>
<li>Marion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF-kappaB+Signaling+Protein+Bcl10+Regulates+Actin+Dynamics+by+Controlling+AP1+and+OCRL-Bearing+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles.</a> Dev Cell. 23, 954-967 (2012).</li>
<li>Loovers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phagocytosis+in+Dictyostelium+by+the+inositol+5-phosphatase+OCRL+homolog+Dd5P4%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4.</a> Traffic. 8, 618-628 (2007).</li>
<li>Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+cytokinesis%3A+do+cells+use+common+tools+to+cut+and+to+eat%3F+Highlights+on+common+themes+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences.</a> Traffic. 14, 355-364 (2013).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+12%2C+Unit+12.29%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Curr Protoc Cytom. , (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li>
<li>Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-actin+cross-talk+contributes+to+phagosome+formation+and+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure.</a> Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół eksperymentalny proponuje bezprecedensową metodę śledzenia w czasie rzeczywistym i w żywych komórkach, z wysoką rozdzielczością, tworzenia fagosomu, a w szczególności jego zamknięcia. Należy omówić kilka aspektów technicznych. Po pierwsze, test jest bardzo wrażliwy na temperaturę. Bardzo ważne jest sprawdzenie, czy komora grzewcza ma temperaturę 37 °C i czy wszystkie media, urządzenia lub komórki są przechowywane w komorze, aby uniknąć zmian temperatury, które mogłyby pogorszyć wydajność fagocytozy...

Fagocytoza to główna funkcja komórki, która zaczyna się od rozpoznania i związania materiału z receptorami powierzchniowymi, co następnie prowadzi do internalizacji i degradacji spożytego materiału. Podczas gdy jednokomórkowe eukarionty, takie jak pleśń Dictyostelium discoideum i ameby, wykorzystują fagocytozę do odżywiania się bakteriami, organizmy wyższe wyewoluowały z komórkami profesjonalnymi. Makrofagi lub komórki dendrytyczne są pierwszą linią obrony przed patogenami w różnych tkankach i narządach i mają kluczowe znaczenie dla aktywacji adaptacyjnego układu odpornościowego poprzez prezentację antygenu i produkcję cytokin 1-4. W pewnych okolicznościach fagocytoza może być wykonywana przez nieprofesjonalne komórki fagocytarne, np. komórki śródbłonka i nabłonka. Proces ten jest ważny dla utrzymania homeostazy podczas rozwoju i w wieku dorosłym dla prawidłowego obrotu i przebudowy tkanek. Wreszcie, wyspecjalizowane fagocyty, takie jak komórki Sertoliego w jądrze lub komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, są niezwykle silnymi fagocytami 5.
Tworzenie fagosomu, w którym następuje degradacja mikroorganizmów lub szczątków komórkowych, rozpoczyna się od zgrupowania receptorów fagocytarnych na powierzchni komórki fagocytarnej. Zdarzenia sygnalizacyjne następujące po grupowaniu receptorów opsonicznych, takich jak receptory Fc (FcR) lub receptory dopełniacza (CR), zostały dobrze scharakteryzowane. Istnieje jednak również wiele receptorów nieopsonicznych, w tym receptory Toll-podobne (TLR), lektyny, receptory mannozy i receptory padlinożerców. Receptory te rozpoznają determinanty na powierzchni cząstek, takie jak reszty mannozy lub fukozy, fosfatydyloseryna i lipopolisacharydy 1,6-9.
Rozpoznawanie patogenów lub szczątków komórkowych polega na wiązaniu i grupowaniu kilku typów receptorów fagocytarnych, co następnie prowadzi do intensywnej i przejściowej przebudowy aktyny. Równolegle ogniskowa egzocytoza przedziałów wewnątrzkomórkowych przyczynia się do uwolnienia napięcia błonowego i jest ważna dla efektywnej fagocytozy dużych cząstek. Zdarzenia sygnalizacyjne prowadzące do polimeryzacji aktyny i deformacji błony zostały przeanalizowane w modelach eksperymentalnych, które wyzwalały pojedynczy receptor fagocytarny. Podczas fagocytozy za pośrednictwem FcR zachodzi intensywna polimeryzacja aktyny, która jest regulowana przez małe GTPazy (Rac, Cdc42). Białko zespołu Wiskotta-Aldricha (WASP) prowadzi do aktywacji kompleksu 2/3 białka związanego z aktyną (Arp2/3), który zarodkuje włókna aktynowe 1,2,4,10. Lokalna produkcja fosfatydyloinozytolu-4, 5-bisfosforanu (PI(4,5)P2) ma kluczowe znaczenie dla początkowej polimeryzacji aktyny, która napędza tworzenie pseudopodów. Jego konwersja do PI(3,4,5)P3 jest wymagana do wydłużenia pseudopoda i zamknięcia fagosomu 11. Do zaniku PI(4,5)P2 przyczynia się kilka szlaków. Po pierwsze, oderwanie kinaz fosforanowych fosfatydyloinozytolu () od fagosomu zatrzymuje syntezę PI(4,5)P2. Po drugie, może być fosforylowany i zużywany przez kinazy PI3K klasy I (PI3K) i przekształcany w PI(3,4,5)P3 12. Rola fosfataz i fosfolipaz została również zasugerowana w hydrolizie PI(4,5)P2 i usuwaniu F-aktyny podczas fagocytozy w komórkach ssaków i w Dictyostelium13,14. Fosfolipaza C (PLC)δ hydrolizuje PI(4,5)P2 do diacyloglicerolu i inozytolo-1,4,5-trifosforanu. Fosfataza PI(4,5)P2 i PI(3,4,5)P3 OCRL (zespół oczno-mózgowo-nerkowy Lowe'a) jest również zaangażowana w tworzenie fagosomów. Precyzyjne miejscowe tworzenie F-aktyny i jej depolimeryzacja jest ściśle regulowana w czasie i przestrzeni, a my wykazaliśmy, że rekrutacja przedziałów wewnątrzkomórkowych jest ważna dla lokalnego dostarczania fosfatazy OCRL, przyczyniając się w ten sposób do lokalnej depolimeryzacji aktyny u podstawy miseczki fagocytarnej 13,15. W tym celu użyliśmy opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej.
Mechanizm i czynniki molekularne niezbędne do zamknięcia fagosomu i rozszczepienia błony pozostają słabo zdefiniowane z powodu trudności w wizualizacji i monitorowaniu miejsca zamknięcia fagosomu. Do niedawna fagocytozę obserwowano na stałych lub żywych komórkach, które internalizują cząstki na swojej powierzchni grzbietowej lub po bokach, co utrudnia terminową wizualizację miejsca zamknięcia fagosomu. Ponadto metody mocowania mogą powodować cofanie się błon i zniekształcać wyniki dotyczące wydłużania i zamykania pseudopodiów. W przeciwieństwie do tego, test, który skonfigurowaliśmy i opisaliśmy tutaj, pozwala nam uwidocznić wydłużenie pseudopoda i etap zamykania fagocytozy w żywych komórkach 13, w oparciu o całkowitą mikroskopię wewnętrznego odbicia (TIRFM) 16. Ta technika optyczna wykorzystuje falę ulotną do wzbudzenia fluoroforów w cienkim obszarze na granicy między przezroczystym ciałem stałym (szkiełko nakrywkowe) a cieczą (pożywką do hodowli komórkowych). Grubość głębokości wzbudzenia wynosi około 100 nm od powierzchni ciała stałego, co pozwala na wizualizację zdarzeń molekularnych w pobliżu błony plazmatycznej. TIRFM pozwala na wysoki stosunek sygnału do tła i ogranicza zebraną fluorescencję nieostrą oraz cytotoksyczność spowodowaną oświetleniem komórek.
Korzystając z TIRFM, opracowaliśmy "test zamykania fagosomu", w którym szkiełka nakrywkowe są aktywowane polilizyną, a następnie pokrywane IgG-opsonizowanymi czerwonymi krwinkami (IgG-SRBC). Makrofagi wykazujące ekspresję przejściowo znakowanych fluorescencyjnie białek będących przedmiotem zainteresowania mogą następnie pochłonąć IgG-SRBC. Podczas gdy komórki odrywają cząstki docelowe, które są niekowalencyjnie związane z powierzchnią szkła, końcówki pseudopodów można obserwować i rejestrować w trybie TIRF. Akwizycje TIRF łączy się z akwizycjami w trybie epifluorescencji, po przesunięciu stopnia o 3 μm powyżej, co pozwala na wizualizację podstawy miseczki fagocytarnej. Możliwe jest również dodanie leków farmakologicznych, takich jak leki hamujące aktynę lub dynaminę podczas procesu, w celu dalszej analizy procesu na poziomie molekularnym.
Protokół opisany tutaj szczegółowo dotyczy mysiej linii komórkowej makrofagów RAW264.7 i opsonizowanych cząstek, ale praktycznie można go dostosować do dowolnej innej komórki fagocytarnej i z innymi celami, takimi jak koraliki. Metoda ta pozwoli na lepsze scharakteryzowanie regulacji w czasie i przestrzeni graczy molekularnych zaangażowanych w wydłużanie pseudopodów i zamykanie fagosomów podczas różnych procesów fagocytarnych.

<table><tbody><tr><td>Anty-owcze czerwone krwinki IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina frakcja szoku cieplnego, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety 4 mm</td><td>Projekt ogniwa</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Zestaw elektrobufora</td><td>Projekt ogniwa</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór gentamycyny</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem 35 mm niepowlekane 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Obiektyw zanurzeniowy w oleju (N 100X, NA1.49), komora grzewcza z CO2, kamera do wykrywania pojedynczych fotonów EMCCD (Electron Urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotniającym) i soczewka 1,5X</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny 0,1%</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Rozcieńczenie 0,01% w wodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni GLUTAMAX&nbsp; Suplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, bez czerwieni fenolowej (10 x 500 ml)</td><td>Technologie życia</td><td>11835-105</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Owcze krwinki czerwone (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Konserwowane w buforze Alsever w temperaturze 4 & stopni; C przed użyciem</td></tr></tbody></table>

"test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (tirfm)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Fagocytoza jest mechanizmem wykorzystywanym przez wyspecjalizowane komórki do internalizacji i eliminacji mikroorganizmów lub resztek komórkowych. Opiera się na głębokich rearanżacjach cytoszkieletu aktynowego, który jest siłą napędową rozszerzania błony plazmatycznej wokół cząstki. Ponadto skuteczne pochłanianie dużego materiału opiera się na ogniskowej egzocytozie przedziałów wewnątrzkomórkowych. Proces ten jest bardzo dynamiczny i opisano wielu graczy molekularnych, którzy odgrywają rolę w tworzeniu miseczek fagocytarnych. Precyzyjna regulacja w czasie i przestrzeni wszystkich tych cząsteczek pozostaje jednak nieuchwytna. Ponadto ostatni etap zamykania fagosomu był bardzo trudny do zaobserwowania, ponieważ hamowanie przez interferencję RNA lub dominujące ujemne mutanty często prowadzi do zahamowania tworzenia miseczki fagocytarnej. 
Stworzyliśmy dedykowane eksperymentalne podejście wykorzystujące mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM) w połączeniu z epifluorescencją, aby krok po kroku monitorować przedłużenie pseudopodów i ich końcówek w fagosomie rosnącym wokół cząstki luźno związanej z szkiełkiem nakrywkowym. Metoda ta pozwala nam obserwować z wysoką rozdzielczością same czubki pseudopodów i ich fuzję podczas zamykania fagosomu w żywych komórkach dla dwóch różnych fluorescencyjnie znakowanych białek w tym samym czasie.

Układ eksperymentalny opisany w niniejszym manuskrypcie przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. Makrofagi RAW264.7 po transfekcji, wykazujące ekspresję białek zainteresowania połączonych z markerem fluorescencyjnym, zostają doprowadzone do kontaktu z opsonizowanymi IgG owczymi erytrocytami (SRBCs), które zostały niespecyficznie przytwierdzone do szkiełka podstawowego. Makrofagi mogą odłączyć SRBC od szkiełka w celu ich fagocytozy. Zastosowany mikroskop TIRF umożliwia je...

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wizualizacja powstawania fagosomów, a także dokładnego miejsca ich podziału w 3D w żywych makrofagach, przy użyciu mikroskopii TIRF (całkownego wewnętrznego odbicia fluorescencji). Metoda ta łączy mikroskopię TIRF z epifluorescencją, aby monitorować krok po kroku lokalizację dwóch różnych białek fluorescencyjnych podczas wysuwania pseudopodiów i fuzji ich końców. Technika ta zapewnia systematyczną metodę wyznaczania kąta krytycznego i uzyskiwania sygnału TIRF, co jest kluczowe dla wyciągania wniosków dotyczących obszarów znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie błony komórkowej.Dzień przed sesją z mikroskopem TIRF włącz komorę grzewczą do 37 °C, aby zapewnić jednorodne nagrzanie stolika mikroskopu. Następnego dnia rano, używając 100 µL PBS uzupełnionego o 0,1% BSA, dwukrotnie przemyj 7x10⁶ owczych erytrocytów (SRBCs) na jedną szalkę o średnicy 35 mm z szklanym dnem. Po drugiej wirowaniu resuspenduj komórki w 500 µL przeciwciał królika IgG przeciwko SRBC w stężeniu poniżej progu aglutynacji w PBS uzupełnionym o 0,1% BSA, w przeliczeniu na 5 µL komórek, i inkubuj komórki przez 30 minut przy powolnym obracaniu.Po zakończeniu inkubacji przemy

phagosome-closure-assay-to-visualize-phagosome-formation-three

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych w neuronach korowych. Wrażliwy na pH marker białka zielonej fluorescencji (GFP) fluoryzuje po fuzji pęcherzyków, z selektywnym wzbudzeniem TIRF wychwytującym egzocytozę...

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych 

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Poznaj metodę wizualizacji powstawania fagosomów w żywych makrofagach przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia obserwację dynamiki fagocytozy w trzech wymiarach z wysoką rozdzielczością.

Test zamykania fagosomu do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) (Wideo) | JoVE Journal

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Przeglądaj więcej filmów