Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3
October 9th, 2016
Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.
Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie proporcji i bezwzględnych poziomów transkryptów wariantu splicingu STAT3 w eozynofilach. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji splicingu, takie jak współasocjacja dystalnych zdarzeń splicingu i identyfikacja warunków, które mogą powodować różnice w proporcjach splicingu tandemowego. Główną zaletą tej techniki są wzorce plazmidowe umożliwiające pozyskiwanie bezwzględnych i względnych danych qPCR, dzięki czemu możemy określić proporcje i ogólne poziomy czterech transkryptów STAT3.
W naszym przypadku chcemy dowiedzieć się, jak zmieniają się cztery warianty STAT3: S alfa, S beta, delta S alfa i delta S beta, gdy eozynofile są stymulowane przez cytokiny. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w skład eozynofili STAT3, można ją również zastosować do innych typów komórek, dla których można uzyskać cDNA. Ponieważ S i delta S różnią się tylko trzema nukleotydami, musieliśmy poświęcić wydajność, aby osiągnąć specyficzność w obu standardach, standardach dla każdego wariantu.
W tym protokole cDNA przygotowane z ludzkich eozynofili jest używane jako matryca do amplifikacji wariantów splicingu STAT3. Po utworzeniu plazmidów zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy przygotować reakcje sekwencjonowania plazmidów z kilku kolonii. Każda 20-mikrolitrowa reakcja powinna zawierać trzy mikrolitry buforu reakcyjnego sekwencjonowania, dwa mikrolitry mieszanki reakcyjnej sekwencjonowania, 12 mikrolitrów wody ultraczystej, jeden mikrolitr plazmidu i dwa mikrolitry startera sekwencjonowania.
Gdy wyniki sekwencjonowania są dostępne, należy ocenić elektroforetogramy plazmidów kodujących każdy wariant; S alfa, S beta, delta S alfa i delta S beta. Zmierz stężenie czystego plazmidowego DNA w nanogramach na mikrolitr i oblicz liczbę kopii na mikrolitr. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania serii rozcieńczeń jeden na 10 plazmidów STAT3 przy użyciu ultraczystej wody.
Z około 10 do ósmej do 10 do trzeciej kopii na mikrolitr. Zmierzyć stężenie najbardziej stężonej próbki. Użyj rozcieńczonych plazmidów do przygotowania czterech mieszanin niedocelowych jako kontroli ujemnych dla każdego wariantu splicingu w ilości od 10 do sześciu kopii na mikrolitr dla każdego wariantu.
Przygotować docelową mieszaninę o równych stężeniach wszystkich czterech matryc, każda w ilości od 10 do 6 kopii na mikrolitr. Przygotować roztwory par starterów dla każdego wariantu splicingu z 60 mikrolitrami starterów, każdy o stężeniu siedmiu mikromolów, dla końcowego stężenia 560 nanomolowych w próbce. Rozcieńczyć polimerazę DNA, dwuniciową mieszankę barwników wiążących DNA, siedem do pięciu czystą wodą.
Ustaw test na 96-dołkowej płytce PCR zgodnie z tym szablonem. Najpierw dodaj do każdej studzienki 21 mikrolitrów rozcieńczonej polimerazy DNA, dwuniciowej mieszanki barwników wiążących DNA. Następnie dodaj dwa mikrolitry mieszanki podkładowej i dwa mikrolitry szablonu.
Do każdej studzienki kontrolnej bez szablonu dodaj dwa mikrolitry przefiltrowanej wody zamiast szablonu. Ustaw reakcje w dwóch egzemplarzach, aby ocenić powtarzalność. Uszczelnić płytkę qPCR samoprzylepną osłoną i odwirować przez pięć minut w temperaturze 1,200 g w temperaturze 12 stopni Celsjusza.
Włącz maszynę qPCR i włóż zapieczętowaną płytkę qPCR. Jeśli korzystasz z systemu ABI do PCR w czasie rzeczywistym, skonfiguruj eksperyment zgodnie z pokazano. Kliknij Plik, Nowy, Dalej, wybierz nowy Detektor, a następnie podaj nazwę i wybierz Reporter i Wygaszanie.
Skonfiguruj nowy detektor dla każdego wariantu spawu. Wybierz opcję Dalej i skonfiguruj standardy zgodnie z monitem na stronie Konfiguracja płytki próbkowania, upewniając się, że ilości zostały wprowadzone do tabeli i wybrano odpowiednie detektory. Kliknij przycisk Zakończ.
Skonfiguruj odpowiedni program cykliczny PCR. Upewnij się, że odczyt fluorescencji w celu określenia wartości progowych cyklu występuje w kroku 72 stopni Celsjusza każdego cyklu. Wybierz pozycję Uruchom.
Po zakończeniu przebiegu kliknij kartę Results (Wyniki) na karcie Ampliification (Wykres wzmocnienia). Oceń wykres Output Ampliification (Wzmocnienie wyjściowe), aby ocenić jakość danych. Wykres wykładniczy wskazuje na niezawodne wzmocnienie.
Eksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego. Analiza danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym jest kluczem do ustalenia, czy test wymaga dalszej optymalizacji ze względu na odtwarzalność. cDNA do tego testu jest przygotowywane z eozynofili traktowanych cytokinami w celu promowania transkrypcji.
Przygotować seryjne rozcieńczenia dwóch próbek podwielokrotności cDNA w zakresie rozcieńczeń od jednego do jednego do 1 024. Umieść test na 96-dołkowej płytce z reakcjami o pojemności 25 mikrolitrów, jak pokazano w celu analizy specyficzności startera, ale z kilkoma stężeniami startera dla pan STAT3 i genu porządkowego GUSB. Szablon jest pokazany w tej tabeli.
Włóż zapieczętowaną płytkę PCR do maszyny qPCR. Skonfiguruj eksperyment za pomocą oprogramowania, dodając nowy detektor dla GUSB i używając odpowiedniego programu cyklicznego PCR. Następnie wyniki są wykorzystywane do obliczenia wartości progowej cyklu dla każdej próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby rozpocząć tę procedurę, porównaj wartości progowe cyklu uzyskane w względnym qPCR dla genu porządkowego GUSB i odpowiednio rozcieńcz cDNA ultraczystą wodą, aby upewnić się, że wszystkie stężenia mieszczą się w jednym rzędzie wielkości. Ustaw bezwzględne testy qPCR próbek na płytkach 96-dołkowych. Postępuj zgodnie z tym szablonem dla S alpha i S beta oraz tym szablonem dla delta S alfa i delta S beta.
Przeprowadzić testy, jak pokazano powyżej, i powtórzyć testy co najmniej raz. Następnie ustaw absolutną 96-dołkową płytkę qPCR z 25 reakcjami mikrolitrowymi, używając starterów STAT3 o temperaturze 400 mikromolów i mieszaniny wszystkich czterech plazmidów lub pojedynczego plazmidu zgodnie z tym szablonem. Uszczelnić płytkę qPCR samoprzylepną osłoną i odwirować przez pięć minut w temperaturze 1,200 g w temperaturze 12 stopni Celsjusza.
Włóż zapieczętowaną płytkę PCR do maszyny qPCR i ustaw eksperyment, jak pokazano wcześniej, dodając nowy detektor dla patelni STAT3. Ustaw te same parametry cykliczne, co dla względnego qPCR. Po powtórzeniu testu co najmniej raz przeanalizuj wyniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Dobrej jakości dane qPCR wygenerują sigmoidalny wykres amplikacyjny oznaczający wykładniczy wzrost transkryptów w trakcie cyklu cyklowego. Dane te uzyskano z qPCR dwóch seryjnych rozcieńczeń plazmidu zawierającego STAT3 S alfa. Każda para kolorowych linii reprezentuje poziomy fluorescencji zduplikowanych rozcieńczonych próbek w ciągu 40 cykli.
Standardowe krzywe wygenerowane dla plazmidów kalibratora matryc wskażą wydajność amplifikacji. W tej krzywej dla STAT3 S alfa wydajność wzmocnienia wynosiła 83,9%W celu oceny zgodności poziomów STAT3 zmierzono wartości bezwzględne każdego z czterech wariantów spawów, a także poziom całkowitego STAT3. Idealnie byłoby, gdyby zarówno regresja liniowa, jak i nachylenie były bliskie jedności.
Bezwzględne dane qPCR są prezentowane jako wykresy kołowe, aby pokazać ich proporcje czterech wariantów splicingu STAT3 w trakcie leczenia cytokinami. Połączenie bezwzględnych i względnych danych qPCR wykazało, że poziomy wszystkich wariantów splicingu STAT3 wzrosły po stymulacji cytokinami IL3 i TNF alfa, a poziomy osiągnęły szczyt po sześciu godzinach. Zebranie danych ze wszystkich punktów czasowych ujawniło niewielkie, ale znaczące odchylenie pod względem koasocjacji zdarzeń splicingu beta i delta S.
Po zoptymalizowaniu testy oparte na tej technice można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Decyzje dotyczące splicingu, które uwzględniają lub wykluczają jeden kodon, odpowiadają za 20% zmienności splicingu w ramce.
Nasz protokół powinien być łatwy do dostosowania do kwantyfikacji takich zmian. Po jej opracowaniu, technika ta pozwoliła Mao Zhangowi pracować z moją grupą w grupie Li-Shan Rue w celu kontrolowania eksperymentów z reekspresją wariantów STAT3 w komórkach chłoniaka ABC. Eksperymenty te wykazały, że do przeżycia komórek w hodowli wymagana jest mieszanka wariantów S i delta S.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić bezwzględny i względny qPCR oraz warunki odpowiednie do rozróżnienia i ilościowego określenia subtelnych różnic w splicingu.
Przegląd
To badanie przedstawia metodę ilościowego określania proporcji i absolutnych poziomów transkryptów wariantów splajsowych STAT3 w eozynofilach. Protokół wykorzystuje ilościową PCR absolutną do analizy wariantów splajsowych powstałych w wyniku zdarzeń splajsowania tandemowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Tło
- Zdarzenia splajsowania tandemowego występują w miejscach oddalonych o mniej niż 12 nukleotydów.
- Ilościowe określanie wariantów splajsowych jest niezbędne do zrozumienia regulacji genów.
- Warianty splajsowe STAT3 obejmują S alfa, S beta, delta S alfa i delta S beta.
- Zrozumienie tych wariantów może dostarczyć informacji na temat funkcji eozynofilów i ich reakcji na cytokiny.
Cel badania
- Ilościowe określanie poziomów wariantów splajsowych STAT3 w eozynofilach.
- Badanie, jak stymulacja cytokinami wpływa na ekspresję tych wariantów.
- Dostarczenie niezawodnej metody oceny proporcji wariantów splajsowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie cDNA z ludzkich eozynofilów.
- Wykorzystanie standardów plazmidowych do uzyskiwania danych qPCR absolutnych i względnych.
- Reakcje sekwencjonowania do oceny konstrukcji plazmidowych dla każdego wariantu splajsowego.
- Konfiguracja assayów qPCR w formacie 96-dołkowym w celu analizy poziomów transkryptów.
Główne wyniki
- Udane ilościowe określenie czterech wariantów splajsowych STAT3.
- Wykazane zmiany w poziomach wariantów splajsowych po stymulacji cytokinami.
- Dostarczenie metody stosowanej do różnych typów komórek w analizie wariantów splajsowych.
- Dane wskazują na potrzebę optymalizacji powtarzalności assayu.
Wnioski
- Metoda skutecznie ilościowo określa warianty splajsowe STAT3 w eozynofilach.
- Zdobyte informacje mogą poprawić zrozumienie regulacji splajsowania.
- To podejście można dostosować do innych typów komórek i warunków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of splice variant proportions enables mechanistic de-risking in target validation by resolving transcriptional heterogeneity that can confound functional assays. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking isoform-specific expression to phenotypic outcomes in disease-relevant systems. The method’s adaptability to tandem splicing sites offers a scalable strategy for early discovery workflows where subtle transcriptional changes inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by quantifying isoform-specific expression changes in response to cytokine stimulation.
- Operational Value: Provides absolute quantification via plasmid standards, reducing reliance on comparative methods that may introduce normalization bias.
- Predictive Value: Supports assessment of co-splicing interdependence, aiding in the prioritization of targets with coordinated regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducibility-ready data for four highly similar splice variants, enabling precise discrimination in multiplexed assays.
- Operational Value: Establishes standardized workflows using calibrated plasmid dilutions, facilitating cross-lab consistency in transcript quantification.
- Scalability: Compatible with 96-well qPCR formats, allowing medium-throughput screening of splice variant dynamics under experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links eosinophil STAT3 isoform shifts to cytokine exposure, providing a disease-relevant system for inflammatory pathway analysis.
- Mechanistic De-risking: Reveals co-splicing patterns between distal tandem sites, informing biomarker strategies that account for coordinated transcriptional regulation.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated adaptability to lymphoma cells, supporting cross-system validation of splice variant functional roles.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by delivering absolute and relative transcript data that inform both target validation and assay readiness stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing regulation by quantifying isoform-specific responses to stimuli, clarifying pathway-level effects.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs from absolute qPCR, enabling reliable comparison of splice variant proportions across conditions.
- Analytics: Combines absolute quantification with efficiency-corrected relative qPCR to derive both proportional and total transcript levels, enhancing data interpretability.
- Translational Research: Connects isoform dynamics in primary eosinophils to preclinical models, supporting continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based standardization allows the assay to be reused across projects and cell types as a plug-and-play quantification module.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific expression, improving target confidence in STAT3-related pathways.
- Operational Value: Ensures reproducibility through plasmid standard curves and optimized cycling parameters, minimizing inter-assay variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking splice variant ratios to functional outcomes in cellular models.
- Portfolio Impact: Enables data-driven triage of targets based on isoform expression stability and co-splicing behavior under pathophysiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization, plasmid preparation, and sequence validation to ensure splice variant specificity.
- Dependent on access to qPCR instrumentation with fluorescence detection and thermal cycling precision for accurate threshold cycle determination.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid dilution series and primer concentration protocols to maintain assay comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to new cell types, including cDNA quality and transcript abundance thresholds.
- Practical limitation: Primer specificity must be balanced with amplification efficiency due to minimal nucleotide differences between variants, as noted in the protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Creating Plasmids as Template Standards
2:20
Analyzing Primer Specificity for Absolute qPCR
5:49
Performing Relative qPCR Assays
6:57
Analyzing Absolute qPCR Data for Unknown Samples
8:27
Results: Measurement of STAT3 Splice Variant Levels in Eosinophils Treated with Cytokines
10:06
Conclusion
