Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza
5 września 2016
Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza w modelu tętnicy szyjnej myszy w celu uzyskania wysokiej powtarzalności wyników analizowanych za pomocą mikroskopii witalnej. Myszy te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące różnych chorób lub zaburzeń genetycznych związanych z aktywacją płytek krwi i agregacją w zamkniętym układzie naczyniowym. Głównymi zaletami tej techniki są jej prostota i czułość zarówno na leki przeciwzakrzepowe, jak i przeciwpłytkowe, a także możliwość łączenia jej z innymi metodami.
Metodę tę można wykorzystać do uzyskania cennych informacji na temat patofizjologii zakrzepicy, odkrywania nowych mechanizmów i terapii oraz oceny wpływu nowych leków, w tym celowanej nanomedycyny, na zakrzepicę. Wizualizacja tej metody jest kluczowa dla nauki strategii pozwalających na dokładne określenie czasu ustania przepływu krwi. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie w palcu stopy, należy użyć małej elektrycznej maszynki do strzyżenia zwierząt, aby usunąć sierść z szyi i górnej części klatki piersiowej myszy w wieku od 8 do 12 tygodni.
Nanieś neutralną wazelinową maść do oczu na oczy zwierzęcia i przymocuj mysz taśmą w pozycji grzbietowej do pokrywy 15-centymetrowej płytki do hodowli tkanek. Owiń siekacze szwem 4-0 i przymocuj końce szwu do pokrywy, aby utrzymać szyję w pozycji prostej. Następnie umieść zwierzę pod chirurgicznym źródłem światła i użyj gazika nasączonego alkoholem, aby zdezynfekować miejsce operacji.
Następnie, używając pęsety Micro-Adson, chwyć skórę i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości od dwóch do trzech milimetrów. Trzymając miejsce nacięcia pęsetą, wprowadź zamknięte ostrza nożyczek i przesuń je podskórnie w kierunku manubrium. Następnie rozchyl ostrza, aby oddzielić skórę od warstwy podskórnej.
Następnie wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej od rękojeści mostka do kości gnykowej, a następnie za pomocą drobnego kleszczyka hemostatycznego i pęsety Graefe przeprowadź tępe rozczłonkowanie cienkiej powięzi pomiędzy śliniankami podżuchwowymi. Po odsłonięciu tchawicy, użyj pęsety do odtrącenia tkanek miękkich po prawej stronie rękojeści mostka i wprowadź kleszczyk hemostatyczny pod powięź w kierunku godziny drugiej. Rozewrzyj ramiona kleszczyka, aby uwolnić żyłę szyjną z otaczających ją tkanek.
Następnie kontynuuj nacięcie przez powięź, tkanki miękkie i skórę w kierunku godziny drugiej, aż do odsłonięcia prawej żyły szyjnej. Teraz weź igłę 30G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej 100 µL roztworu rodaminy 6G i za pomocą igłotrzymacza zegnij końcówkę igły na długości 2-3 mm pod kątem 90 stopni. Następnie, trzymając strzykawkę w jednej ręce, a tkankę miękką w miejscu dystalnym żyły szyjnej pęsetą Graefe w drugiej, wprowadź igłę do naczynia.
Ustabilizuj igłę za pomocą pęsety i wstrzyknij rodamynę. Po podaniu całego roztworu do znakowania płytek krwi, zaklemprz miejsce wstrzyknięcia pęsetą, aby zapobiec krwawieniu, rozwierając hemostaty i wprowadzając instrument pod pęsetę w celu zacisnięcia ściany naczynia w miejscu wstrzyknięcia. Następnie użyj nici chirurgicznej 6-0, aby podwiązać miejsce wstrzyknięcia.
Przeprowadź tupą dyssekcję tkanek miękkich i powięzi wokół lewego gruczołu podżuchwowego, a następnie odciągnij gruczoł w stronę godziny siódmej, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy. Następnie przeprowadź tupą dyssekcję powięzi między lewym mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym a mięśniami łopatkowo-gnykowymi i mostkowo-gnykowymi w stronę lewej strony tchawicy. Po odsunięciu powięzi przeprowadź igłę z 15-centymetrową nicią jedwabną 6-0 pod środkową część mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego i pociągnij oba końce nici bocznie w stronę godziny dziesiątej.
Rozdziel tępym sposobem mięśnie sternohyoideus i omohyoideus, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną. Następnie, za pomocą hemostatu, oddziel tkankę miękką od tętnicy szyjnej, nie dotykając naczynia. Używając pęsety z cienkimi końcami, unieś powięź boczną wokół tętnicy szyjnej, unikając przy tym nerwu błądzącego oraz samej tętnicy.
Następnie użyj drugiej pęsety o cienkich końcach, aby przebić powięź między tętnicą szyjną a nerwem błędnym. Teraz wprowadź przez otwór tępy hak, aby delikatnie unieść tętnicę szyjną, i wsuń pęsetę o cienkich końcach pod tętnicę. Przesuwając hak i pęsetę w przeciwnych kierunkach wzdłuż tętnicy, usuń około pięciu milimetrów tkanki miękkiej z okolic osłonki naczynia z otaczających tkanek.
Następnie opłukać kawałek plastikowego elementu w kształcie litery U solą fizjologiczną i za pomocą haczyka delikatnie unieść tętnicę, aby umożliwić umieszczenie plastiku pod nią. Plastik zablokuje fluorescencję tła, zapobiegając dyfuzji roztworu chlorku żelaza do otaczających tkanek, co zapewni widoczność pod mikroskopem wyłącznie tętnicy szyjnej. Natychmiast nawodnić tętnicę szyjną za pomocą dwóch do trzech kropli soli fizjologicznej.
Następnie przenieś mysz na stolik mikroskopu fluorescencyjnego pod obiektyw wodny 10X i wypełnij przestrzeń między obiektywem a tętnicą solą fizjologiczną. Teraz uruchom aplikację do cyfrowego nagrywania wideo i wykonaj zdjęcia prawidłowego naczynia. Jeśli ściana naczynia jest nieuszkodzona i zachowuje ciągłość, przenieś mysz na platformę Gibraltar i za pomocą rogu ręcznika papierowego ostrożnie osusz sól fizjologiczną wokół tętnicy szyjnej w polu operacyjnym, nie dotykając tętnicy.
Następnie, za pomocą pęsety z cienkimi końcami, przenieś kawałek papieru filtracyjnego nasyconego chlorkiem żelaza bezpośrednio na tętnicę szyjną, blisko dystalnego końca odsłoniętej tętnicy. Upewnij się, że papier filtracyjny znajduje się blisko dystalnego końca odsłoniętej tętnicy szyjnej, pozostawiając krótki odcinek po stronie proksymalnej w celu obserwacji przepływu krwi w późniejszej fazie urazu. Po jednej minucie usuń papier filtracyjny i wypłucz tętnicę co najmniej dwoma mililitrami soli fizjologicznej.
Umieść mysz z powrotem na stoliku mikroskopu i wykonaj obrazy naczynia. Powstanie zakrzepu można zidentyfikować po gromadzeniu się fluorescencyjnych płytek krwi. Kontynuuj obrazowanie naczynia przez 10 sekund w każdej minucie przez pierwsze 10 minut, a następnie przez 10 sekund co drugą minutę aż do zakończenia eksperymentu.
Infuzja tkankowego aktywatora plazminogenu pięć minut po uszkodzeniu chlorkiem żelaza wykazuje rozpoczęcie trombolizy około czterech minut po podaniu leku. Zaobserwowano, że utworzone skrzepliny ulegały powtarzającym się zmianom wielkości podczas 30-minutowego okresu obserwacji, jednak nie doszło do całkowitej ablacji skrzepliny zależnej od płytek krwi. Leczenie poliklonalnym przeciwciałem przeciwko PAR4, które opóźnia rozszczepienie PAR4, znacząco wydłuża czas do powstania skrzepliny zamykającej naczynie w modelu zakrzepicy tętnicy szyjnej indukowanej chlorkiem żelaza.
Eksperymenty z znakowaniem erytrocytów (z pominięciem płytek krwi) wskazują, że choć skrzepy indukowane chlorkiem żelaza składają się wyłącznie z płytek krwi przylegających do ściany naczynia, erytrocy zostają uwięzione w obrębie skrzepu, co z czasem wpływa na jego kształt i właściwości zamykające naczynie. Co ciekawe, podczas gdy początkowy skrzep jest widoczny w ciągu około 15 sekund od uszkodzenia tętnicy i żyły krezkowej, formowanie się skrzepu w naczyniach krezkowych jest znacznie opóźnione – do około 17 minut w żyle krezkowej oraz niemal do 24 minut w tętnicy krezkowej, co wynika przynajmniej częściowo z dyfuzji chlorku żelaza przez tkankę tłuszczową otaczającą naczynia krezkowe.
Po opanowaniu techniki, ten model zakrzepicy indukowany uszkodzeniem chlorkiem żelaza może zostać wykonany w czasie od 30 do 60 minut, w zależności od stopnia biegłości wykonawcy, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że mierzonym parametrem jest czas upływający od momentu uszkodzenia do całkowitego zamknięcia naczynia, a precyzyjna obserwacja przepływu krwi jest kluczowa dla uzyskania dokładnych wyników. Model ten można połączyć z transfuzją płytek krwi typu dzikiego poddanych obróbce ex-vivo, aby symulować specyficzne dla płytek knockouty w celu zdefiniowania funkcji szlaków regulacyjnych i płytek krwi.
Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu biologii naczyniowej do zgłębiania roli płytek krwi nie tylko w zakrzepicy, ale także w różnych innych stanach zapalnych śródbłonka. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować model zakrzepicy tętnicy szyjnej indukowanej chlorkiem żelaza u myszy, aby uzyskać wysoko powtarzalne wyniki przy użyciu mikroskopii witalnej. Należy pamiętać, że chlorek żelaza może być niezwykle niebezpieczny i podczas realizacji tego modelu zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia udoskonaloną procedurę indukowania zakrzepicy przy użyciu chlorku żelaza w modelach tętnicy szyjnej i krezkowej u myszy. Technika ta opiera się na mikroskopii witalnej, co umożliwia efektywne monitorowanie tworzenia się zakrzepów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Zakrzepica
- Biologia naczyniowa
- Mikroskopia intravitalna
Wprowadzenie
- Zakrzepica jest krytycznym procesem w wielu chorobach układu sercowo-naczyniowego.
- Zrozumienie aktywacji i agregacji płytek krwi jest niezbędne do opracowywania metod terapeutycznych.
- Modele indukowane chlorkiem żelaza(III) zapewniają powtarzalną metodę badania tych procesów.
- Mikroskopia wewnątrzżyciowa umożliwia obserwację tworzenia się zakrzepu w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- W celu doprecyzowania modelu zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza.
- W celu analizy działania leków przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych.
- W celu zbadania nowych mechanizmów i terapii związanych z zakrzepicą.
Zastosowane metody
- Indukcja zakrzepicy z użyciem chlorku żelaza w modelach mysich.
- Monitorowanie tworzenia się zakrzepu za pomocą mikroskopii witalnej.
- Ocena wpływu leków na rozwój zakrzepu.
- Techniki wizualizacji służące do oceny zatrzymania przepływu krwi.
Główne wyniki
- Skuteczna indukcja zakrzepicy w tętnicach szyjnych i krezkowych.
- Wyraźna wizualizacja powstawania zakrzepu w czasie.
- Wykazana wrażliwość na leczenie przeciwkrzepliwe i przeciwpłytkowe.
- Dostarczenie wiedzy na temat patofizjologii zakrzepicy.
Wnioski
- Udoskonalony model jest skuteczny w badaniu mechanizmów zakrzepicy.
- Może on być wykorzystywany do oceny nowych podejść terapeutycznych.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie chorób naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele zakrzepicy mysiej indukowanej chlorkiem żelaza stanowią solidną platformę in vivo do badania aktywacji płytek krwi, uszkodzeń naczyniowych oraz tworzenia zakrzepów w warunkach fizjologicznie istotnych. Model ten umożliwia ilościową ocenę interwencji antyagregacyjnych i przeciwkrzepliwych, co zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnych etapach poszukiwania leków sercowo-naczyniowych. Jego powtarzalność i czułość sprawiają, że jest on strategicznym narzędziem w celu minimalizacji ryzyka związanego z badaniem celów i mechanizmów implikowanych w portfolio chorób zakrzepowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie testowanie hipotez terapeutycznych związanych z aktywacją płytek krwi i uszkodzeniem naczyń krwionośnych.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez ilościowe określenie tworzenia zakrzepów w odpowiedzi na perturbacje genetyczne lub farmakologiczne.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla kandydatów na leki przeciwzakrzepowe i przeciwzapalne.
- Zapewnia ilościowy odczyt służący do selekcji projektów w portfolio na podstawie czasu do zamknięcia naczynia.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do oceny skuteczności związków w przeciwdziałaniu zakrzepicy.
- Standaryzuje pomiar czasu przerwania przepływu krwi jako powtarzalny punkt końcowy analizy ilościowej.
- Umożliwia skalowalność w celu porównawczego przesiewu środków przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych.
- Wspiera późniejszą integrację z platformami obrazowania i analizy molekularnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami powiązanymi z chorobami obserwowanymi w miażdżycy, cukrzycy i zaburzeniach zapalnych.
- Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację terapii celowanych w naczynia krwionośne.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, skuteczność in vivo oraz wgląd w mechanizmy działania.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez korelację dynamiki zakrzepu z punktami końcowymi o charakterze molekularnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten łączy etap wczesnego odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących celów naczyniowych i płytkowych w fizjologicznie istotnym kontekście.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w zakresie udziału szlaków płytkowych i śródbłonkowych w zakrzepicy.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe punkty końcowe do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Generuje dane dotyczące czasu do zamknięcia naczynia oraz składu zakrzepu w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie do klinicznych mechanizmów chorobowych i strategii biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptacyjną platformę dla różnorodnych programów badawczych nad naczyniami i stanami zapalnymi.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad zakrzepicą.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność w zespołach badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału w portfolio sercowo-naczyniowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów na leki przeciwzakrzepowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie chirurgii myszy, biologii naczyniowej oraz mikroskopii intravitalnej.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania oraz narzędzi do analizy ilościowej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja kroków proceduralnych i punktów końcowych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych łożysk naczyniowych i tła genetycznego w celu szerszego zastosowania.
- Niezbędne są środki ostrożności ze względu na zagrożenia związane z chlorkiem żelaza oraz wymogi dotyczące dobrostanu zwierząt.
