Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty
28 lipca 2016
Ten protokół opisuje szybkie wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności halogenującej peroksydazy w komórkach. Metoda może być stosowana do materiału ludzkiego i innego niż ludzki i może przyczynić się do oceny nowych markerów stanu zapalnego.
Ogólnym celem tej metody usuwania erytrocytów jest szybkie i proste wzbogacenie leukocytów z małej próbki krwi. Głównymi zaletami tej techniki są niska cena, niezawodność oraz szybkość. Ponadto można ją stosować w przypadku próbek krwi ludzkiej oraz niehumanoidalnej.
Przed rozpoczęciem procedury lizy ustaw pipetę do podawania wody na dwa mililitry, a pipetę do PBS na pięć mililitrów. Następnie umieść otwarte kolby z wodą i PBS pod dygestorium z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej. Ponieważ liza hipotoniczna jest procesem krytycznym pod względem czasu, wszystko powinno zostać przygotowane wcześniej.
Ponadto procedura lizy powinna być zawsze przeprowadzana w ten sam sposób, aby uzyskać porównywalne wyniki. Następnie przenieś 100 µL z każdej próbki krwi do 15 ml probówki stożkowej. Do każdej próbki dodaj 2 ml wody destylowanej, mieszając na vortexie z ustawieniem średnim.
Pozostawić komórki na 60 sekund, a następnie dodać pięć mililitrów PBS. Próbki wymieszać za pomocą wortexa. Następnie zebrać komórki poprzez wirowanie i odlać nadsączniki.
Odwróć probówki i ostuknij ich otwory o ręcznik papierowy, aby usunąć jak najwięcej cieczy. Następnie powtórz procedurę lizy hipotonicznej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po ponownym uzyskaniu suchego osadu, resuspender każdą próbkę w 500 microliters HBSS, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
Następnie przenieś komórki do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i umieść je na lodzie. Aby sprawdzić swoistość peroksydazy w próbkach po barwieniu aminofenolofluoresceiną (APF), najpierw dodaj pięć mikrolitrów inhibitora peroksydazy hemowej, 4-ABAH, do odpowiednich próbek i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodaj pięć mikrolitrów roztworu roboczego APF do każdej probówki i delikatnie wymieszaj komórki w wirówce typu vortex przy średnich ustawieniach.
Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie do każdej próbki dodać 5 µL roztworu roboczego nadtlenku wodoru i delikatnie wymieszać probówki w wirówce typu vortex. Po 60 minutach w temperaturze 37 °C odwirować komórki i ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.
Na koniec resuspendować komórki w 250 µL HBSS i przechowywać próbki w ciemności do momentu analizy, aby uniknąć fotowybielania. Tutaj przedstawiono reprezentatywny przykład populacji leukocytów po lizie hipotonicznej i barwieniu APF, zgodnie z opisaną procedurą. Wykreślając wielkość komórek w funkcji ziarnistości, można zaobserwować skuteczną eliminację erytrocytów, przy czym populacja krwinek czerwonych i debris stanowi jedynie 22% zdarzeń.
Ponadto rozkład intensywności fluorescencji pochodzącej z APF umożliwia wyraźne rozróżnienie erytrocytów i limfocytów ujemnych pod kątem peroksydazy, przy umiarkowanym utlenianiu APF obserwowanym w przypadku monocytów i eozynofilów dodatnich pod kątem peroksydazy, oraz silnym utlenianiu peroksydazy wykazanym przez neutrofile. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, można ją zastosować równolegle do 50 próbek krwi. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak barwienie przeciwciałami, aby zidentyfikować interesujące podgrupy komórek.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się małymi zwierzętami do zgłębienia roli aktywności halogenującej MPO i EPO w modelach zwierzęcych chorób przewlekłych stanów zapalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szybką i prostą metodę wzbogacania leukocytów z niewielkich próbek krwi, którą można zastosować zarówno w przypadku materiałów ludzkich, jak i pochodzących od zwierząt. Technika ta jest kosztowo efektywna i niezawodna, co ułatwia ocenę nowych markerów stanu zapalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Wzbogacanie leukocytów jest kluczowe dla badania odpowiedzi immunologicznych.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i złożone.
- Celem niniejszej metody jest uproszczenie tego procesu.
- Można ją stosować zarówno do próbek krwi ludzkiej, jak i nie-ludzkiej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego protokołu wzbogacania leukocytów.
- Ocena aktywności peroksydazy halogenującej w leukocytach.
- Wniesienie wkładu w identyfikację markerów stanu zapalnego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pipet do podawania wody i PBS.
- Wykorzystanie komory z laminarnym przepływem powietrza do obróbki próbek.
- Liza hipotoniczna w celu usunięcia erytrocytów.
- Krytyczny znaczenie czasu wykonania procedury lizy.
Główne wyniki
- Skuteczne wzbogacanie leukocytów z niewielkich próbek krwi.
- Niezawodna ocena aktywności peroksydazy.
- Możliwość zastosowania zarówno w próbkach ludzkich, jak i niehumanoidalnych.
- Potencjał do oceny nowych markerów stanu zapalnego.
Wnioski
- Metoda ta jest wydajna i efektywna kosztowo.
- Usprawnia ona badanie odpowiedzi immunologicznych.
- Dalsze badania mogą opierać się na niniejszym protokole.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybkie i zestandaryzowane wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi, co wspiera wczesne etapy badań nad odkrywaniem nowych mechanizmów w badaniach nad chorobami zapalnymi. Poprzez ilościowe oznaczenie aktywności peroksydazy halogenującej MPO i EPO, metoda ta dostarcza mechanistycznych danych niezbędnych do walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka związanego z badaniem szlaków sygnałowych. Kompatybilność metody z cytometrią przepływową i barwieniem przeciwciałami ułatwia jej integrację z procesami przesiewowymi oraz przepływami pracy w badaniach translacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie aktywności peroksydazy specyficznej dla leukocytów w celu walidacji MPO i EPO jako celów terapeutycznych w przewlekłym zapaleniu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje minimalną objętość próbki (50–100 µL), co pozwala na wielokrotne pobieranie materiału z modeli małych zwierząt w podłużnych badaniach nad zaangażowaniem celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Łączy barwienie APF z cytometrią przepływową w celu uzyskania ilościowych odczytów produkcji HOCl/HOBr opartych na fluorescencji w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe przetwarzanie do 50 próbek równolegle, wspierając skalowalne kampanie przesiewowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy aktywność peroksydazy leukocytarnej z istotnymi dla choroby procesami zapalnymi, co wspiera dopasowanie biomarkerów w modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Metoda działa zarówno w przypadku krwi ludzkiej, jak i gryzoni, umożliwiając międzygatunkową ciągłość translacyjną w walidacji celu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po walidację przedkliniczną, szczególnie w programach badawczych nad immunologią i chorobami zapalnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe oznaczanie aktywności peroksydazy specyficznej dla enzymu w oczyszczonych populacjach leukocytów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki za pomocą fluorescencji APF i cytometrii przepływowej, umożliwiając ocenę wpływu związków na aktywność peroksydazy.
- Analityka: Generuje mierzalne dane intensywności fluorescencji, które pozwalają na porównanie podzbiorów komórek wykazujących aktywność peroksydazy (neutrofili, monocytów, eozynofili) w warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy aktywność peroksydazy z mechanizmami chorób zapalnych, zapewniając ciągłość przedkliniczną w połączeniu z barwieniem markerów powierzchniowych komórek.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Standaryzowane wzbogacanie leukocytów i detekcja oparta na APF stanowią platformę wielokrotnego użytku dla wielu programów badawczych ukierunkowanych na cele zapalne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez izolację aktywności peroksydazy do konkretnych linii leukocytowych.
- Wartość operacyjna: Oferuje niskokosztowy, szybki protokół wymagający minimalnego instrumentarium (wirówka, wstrząsacz vortex, cytometr przepływowy).
- Wartość strategiczna: Skraca czas redukcji ryzyka biologicznego, umożliwiając szybką, iteracyjną ocenę modulacji celu w próbkach leukocytów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację inhibitorów MPO/EPO z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając wczesnych danych o aktywności funkcjonalnej w komórkach istotnych fizjologicznie.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z leukocytami, cytometrii przepływowej oraz chemii sond fluorescencyjnych.
- Zależne od dostępu do wirówek, mieszadeł vortex, komór z laminarnym przepływem powietrza oraz cytometrów przepływowych z odpowiednimi kanałami fluorescencji.
- Wymaga standaryzacji roztworów roboczych APF i nadtlenku wodoru pomiędzy laboratoriami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja do gatunków innych niż ludzkie wymaga walidacji ekspresji peroksydazy oraz wydajności barwienia APF w docelowych subpopulacjach leukocytów.
- Metoda ogranicza się do wykrywania aktywności peroksydaz halogenujących; nie mierzy innych funkcji leukocytów, chyba że zostanie połączona z dodatkowymi analizami.
