Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty
28 lipca 2016
Ten protokół opisuje szybkie wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności halogenującej peroksydazy w komórkach. Metoda może być stosowana do materiału ludzkiego i innego niż ludzki i może przyczynić się do oceny nowych markerów stanu zapalnego.
Ogólnym celem tej metody zmniejszania liczby erytrocytów jest uzyskanie szybkiego i prostego wzbogacenia leukoctye z małej próbki krwi. Wiele zalet tej techniki polega na tym, że jest tania, niezawodna i szybka. Ponadto może być stosowany do próbek krwi ludzkiej i innej niż ludzka.
Przed rozpoczęciem procedury lizy należy wyregulować pipetę do podawania wody na dwa mililitry, a pipetę do PBS na pięć mililitrów. Następnie umieścić otwarte kolby z wodą i PBS pod okapem z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej. Ponieważ liza hipotoniczna jest procesem krytycznym pod względem czasu, wszystko należy przygotować wcześniej.
Co więcej, proces lizy powinien być zawsze wykonywany w ten sam sposób, aby uzyskać zgodne wyniki. Następnie przenieś 100 mikrolitrów z każdej próbki krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. I dodaj dwa mililitry wody destylowanej do każdej próbki, wirując w pożywce.
Odpocznij komórki przez 60 sekund, a następnie dodaj pięć mililitrów PBS. I wymieszaj próbki przez wirowanie. Teraz zbierz komórki przez odwirowanie i zdekantuj supernatanty.
Odwróć rurki i postukaj w otwory w ręczniku papierowym, aby usunąć jak najwięcej płynu. Następnie powtórz procedurę lizy hipotonicznej, jak właśnie pokazano. Po uzyskaniu suchego osadu po raz drugi, każdą próbkę ponownie zawiesić w 500 mikrolitrach HBSS, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
I przenieś komórki do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych na lodzie. Aby sprawdzić swoistość peroksydazy próbek po barwieniu aminofenolem fluoresceiną lub APF, najpierw dodaj pięć mikrolitrów inhibitora peroksydazy hemowej, 4-ABAH, do odpowiednich próbek na 15-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj pięć mikrolitrów roztworu roboczego APF do każdej probówki i delikatnie zwiruj komórki na pożywce.
Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj pięć mikrolitrów roztworu roboczego nadtlenku wodoru do każdej próbki i delikatnie zwiruj probówki. Po 60 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza odwirować komórki i ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu.
Na koniec ponownie zawiesić komórki w 250 mikrolitrach HBSS i przechowywać próbki w ciemności do czasu ich analizy, aby uniknąć wybielania zdjęć. Tutaj pokazano reprezentatywny przykład populacji leukocytów po hipotonicznej lizie i barwieniu APF, jak właśnie pokazano. Porównując wielkość komórki w funkcji ziarnistości, można zaobserwować znaczne zubożenie erytrocytów, przy czym populacja czerwonych krwinek i szczątków odpowiada tylko za 22% zdarzeń.
Co więcej, rozkład intensywności fluorescencji pochodzącej z APF ułatwia wyraźne rozróżnienie erytrocytów i limfocytów peroksydazo-ujemnych, z zaobserwowanym umiarkowanym utlenianiem APF dla monocytów i eozynofili dodatnich dla peroksydazy dodatniej oraz silnego utleniania peroksydazy wykazywanego przez neutrofile. Po opanowaniu technika ta może być stosowana do maksymalnie 50 próbek krwi równolegle, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak barwienie przeciwciał, w celu zidentyfikowania interesujących podzbiorów komórek.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami na małych zwierzętach do zbadania roli halogenującej aktywności MPO i EPO w modelach zwierzęcych przewlekłych chorób zapalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szybką i prostą metodę wzbogacania leukocytów z niewielkich próbek krwi, którą można zastosować zarówno w przypadku materiałów ludzkich, jak i pochodzących od zwierząt. Technika ta jest kosztowo efektywna i niezawodna, co ułatwia ocenę nowych markerów stanu zapalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Wzbogacanie leukocytów jest kluczowe dla badania odpowiedzi immunologicznych.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i złożone.
- Celem niniejszej metody jest uproszczenie tego procesu.
- Można ją stosować zarówno do próbek krwi ludzkiej, jak i nie-ludzkiej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego protokołu wzbogacania leukocytów.
- Ocena aktywności peroksydazy halogenującej w leukocytach.
- Wniesienie wkładu w identyfikację markerów stanu zapalnego.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pipet do podawania wody i PBS.
- Wykorzystanie komory z laminarnym przepływem powietrza do obróbki próbek.
- Liza hipotoniczna w celu usunięcia erytrocytów.
- Krytyczny znaczenie czasu wykonania procedury lizy.
Główne wyniki
- Skuteczne wzbogacanie leukocytów z niewielkich próbek krwi.
- Niezawodna ocena aktywności peroksydazy.
- Możliwość zastosowania zarówno w próbkach ludzkich, jak i niehumanoidalnych.
- Potencjał do oceny nowych markerów stanu zapalnego.
Wnioski
- Metoda ta jest wydajna i efektywna kosztowo.
- Usprawnia ona badanie odpowiedzi immunologicznych.
- Dalsze badania mogą opierać się na niniejszym protokole.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybkie i zestandaryzowane wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi, co wspiera wczesne etapy badań nad odkrywaniem nowych mechanizmów w badaniach nad chorobami zapalnymi. Poprzez ilościowe oznaczenie aktywności peroksydazy halogenującej MPO i EPO, metoda ta dostarcza mechanistycznych danych niezbędnych do walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka związanego z badaniem szlaków sygnałowych. Kompatybilność metody z cytometrią przepływową i barwieniem przeciwciałami ułatwia jej integrację z procesami przesiewowymi oraz przepływami pracy w badaniach translacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie aktywności peroksydazy specyficznej dla leukocytów w celu walidacji MPO i EPO jako celów terapeutycznych w przewlekłym zapaleniu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje minimalną objętość próbki (50–100 µL), co pozwala na wielokrotne pobieranie materiału z modeli małych zwierząt w podłużnych badaniach nad zaangażowaniem celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Łączy barwienie APF z cytometrią przepływową w celu uzyskania ilościowych odczytów produkcji HOCl/HOBr opartych na fluorescencji w celu standaryzacji testu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe przetwarzanie do 50 próbek równolegle, wspierając skalowalne kampanie przesiewowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy aktywność peroksydazy leukocytarnej z istotnymi dla choroby procesami zapalnymi, co wspiera dopasowanie biomarkerów w modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Metoda działa zarówno w przypadku krwi ludzkiej, jak i gryzoni, umożliwiając międzygatunkową ciągłość translacyjną w walidacji celu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po walidację przedkliniczną, szczególnie w programach badawczych nad immunologią i chorobami zapalnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe oznaczanie aktywności peroksydazy specyficznej dla enzymu w oczyszczonych populacjach leukocytów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki za pomocą fluorescencji APF i cytometrii przepływowej, umożliwiając ocenę wpływu związków na aktywność peroksydazy.
- Analityka: Generuje mierzalne dane intensywności fluorescencji, które pozwalają na porównanie podzbiorów komórek wykazujących aktywność peroksydazy (neutrofili, monocytów, eozynofili) w warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy aktywność peroksydazy z mechanizmami chorób zapalnych, zapewniając ciągłość przedkliniczną w połączeniu z barwieniem markerów powierzchniowych komórek.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Standaryzowane wzbogacanie leukocytów i detekcja oparta na APF stanowią platformę wielokrotnego użytku dla wielu programów badawczych ukierunkowanych na cele zapalne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez izolację aktywności peroksydazy do konkretnych linii leukocytowych.
- Wartość operacyjna: Oferuje niskokosztowy, szybki protokół wymagający minimalnego instrumentarium (wirówka, wstrząsacz vortex, cytometr przepływowy).
- Wartość strategiczna: Skraca czas redukcji ryzyka biologicznego, umożliwiając szybką, iteracyjną ocenę modulacji celu w próbkach leukocytów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację inhibitorów MPO/EPO z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając wczesnych danych o aktywności funkcjonalnej w komórkach istotnych fizjologicznie.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z leukocytami, cytometrii przepływowej oraz chemii sond fluorescencyjnych.
- Zależne od dostępu do wirówek, mieszadeł vortex, komór z laminarnym przepływem powietrza oraz cytometrów przepływowych z odpowiednimi kanałami fluorescencji.
- Wymaga standaryzacji roztworów roboczych APF i nadtlenku wodoru pomiędzy laboratoriami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja do gatunków innych niż ludzkie wymaga walidacji ekspresji peroksydazy oraz wydajności barwienia APF w docelowych subpopulacjach leukocytów.
- Metoda ogranicza się do wykrywania aktywności peroksydaz halogenujących; nie mierzy innych funkcji leukocytów, chyba że zostanie połączona z dodatkowymi analizami.
