Name: Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Poznaj szybką metodę wzbogacania leukocytów z małych próbek krwi ludzkiej i zwierzęcej. Technika ta umożliwia niezawodną ocenę aktywności peroksydazy halogenującej i identyfikację nowych markerów zapalnych w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki finansowaniu z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF, 1315883), jak również dzięki projektowi Sächsische Aufbaubank (SAB) 100116526 z funduszy Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR).

Wszystkie próbki ludzkiej krwi zostały pobrane od zdrowych ochotników, a zastosowany protokół wzbogacania leukocytów jest zgodny z wytycznymi komisji etyki Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Lipsku. Eksperymenty z krwią szczurów zostały zatwierdzone przez właściwą lokalną komisję etyczną (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), zgodnie z niemieckimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
1. Konfiguracja eksperymentalna
UWAGA: Ponieważ procedura hipotonicznej lizy w celu wyczerpania erytrocytów z próbek krwi jest procedurą krytyczną czasowo, przygotuj wcześniej cały niezbędny sprzęt (np.) dla tej części protokołu.
<ol>
	<li>Oznaczyć jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml do lizy hipotonicznej i jedną probówkę o pojemności 1,5 ml do późniejszego barwienia aminofenylofluoresceiną (APF) na próbkę krwi.
	<ol>
		<li>Jeśli wzbogacanie leukocytów będzie wykonywane w sterylnych warunkach, należy wykonać to znakowanie w skrzynce przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować około 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 10 mM) na próbkę. W zależności od tego, czy leukocyty mają być izolowane w warunkach sterylnych, czy nie, PBS należy przygotować przy użyciu sterylnego roztworu dostarczonego przez dostawcę lub przez rozpuszczenie tabletek PBS w wodzie destylowanej. Sprawdź wartość pH i, jeśli to konieczne, dostosuj do pH 7,4, używając niewielkich ilości 0,1 M roztworów HCl i NaOH.
	<ol>
		<li>Rozpuścić tabletki PBS (patrz tabela materiałów) w 200 ml wody destylowanej, aby otrzymać niesterylny roztwór buforowy wystarczający na około 16 próbek. W razie potrzeby wysterylizuj ten roztwór przez sterylną filtrację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować około 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego o Ca2+ na próbkę.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 970 mg soli HBSS w 100 ml (objętość końcowa) podwójnie destylowanej wody. Przed napełnieniem do końcowej objętości sprawdź wartość pH i dostosuj ją do pH 7,4. Ze względu na małą pojemność buforową, bufor ten należy przygotowywać na świeżo każdego dnia i przeprowadzać regulację pH ze szczególną ostrożnością, używając niewielkich ilości 0,1 M roztworów HCl i NaOH. 
		UWAGA: Można użyć sterylnego roztworu, w zależności od eksperymentu. Roztwór może być sterylizowany przez sterylną filtrację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oprócz dwóch, należy wcześniej oznaczyć i przygotować probówkę (np. 50 ml probówkę wirówkową) lub kolbę (np. miarkę o pojemności 250 ml) z podwójnie destylowaną wodą do procedury lizy hipotonicznej. Przygotować około 10 ml wody na próbkę.</li>
	<li>Przygotuj pojemnik z pokruszonym lodem do barwienia APF (sekcja 3), które odbywa się na lodzie.</li>
	<li>Przygotować porcje APF z wyprzedzeniem, aby umożliwić szybkie przygotowanie roztworów roboczych używanych podczas barwienia (etap 3.2) i uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu APF. 
	UWAGA: APF jest powszechnie otrzymywany w postaci roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml (11,81 mM) w octanie metylu.
	<ol>
		<li>Zamrozić podwielokrotności 10-100 μl w probówkach o pojemności 0,5 ml. Do barwienia APF stosuje się końcowe stężenie barwnika 10 μM (krok 3.8).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hipotoniczna liza erytrocytów
UWAGA: Wykonaj etapy lizy hipotonicznej (z wyjątkiem etapów wirowania) pod stołem do przepływu laminarnego, aby uniknąć zanieczyszczenia. Całą procedurę wykonaj w temperaturze pokojowej. Ponieważ liza hipotoniczna jest procesem krytycznym pod względem czasu, należy wcześniej wyregulować pipety do dodawania wody (2 ml) i PBS (5 ml) oraz otworzyć kolby z wodą i PBS przed rozpoczęciem procedury. Przed użyciem należy przechowywać roztwór PBS i wodę destylowaną w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Z każdej próbki krwi przenieść 100 μl do odpowiedniej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: W naszych eksperymentach próbki krwi zwykle zawierają 10 j./ml heparyny, aby uniknąć krzepnięcia. Jednak ze względu na różne źródła materiału próbki, charakter i stężenie antykoagulantu mogą się różnić. Jego wpływ na barwienie APF należy zbadać poprzez porównanie wyników z wynikami uzyskanymi z próbek krwi uzupełnionych innymi typami lub stężeniami antykoagulantu.</li>
	<li>Dodać 2 ml wody destylowanej i wymieszać próbki za pomocą mieszalnika wirowego ustawionego na średni poziom. Inkubować próbki przez 60 sekund, następnie dodać 5 ml PBS na próbkę i wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego. 
	UWAGA: Równolegle można przygotować do około 5 próbek. Kolejność próbek powinna być taka sama dla dodawania wody i PBS, aby osiągnąć porównywalne czasy inkubacji.</li>
	<li>Po regeneracji warunków izotonicznych przez dodanie PBS (etap 2.2), pozostałe nienaruszone komórki we wszystkich próbkach należy osadzać przez wirowanie przez 6 minut w temperaturze pokojowej i 450 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant, wlewając go do stołowego kosza na śmieci. Usuń jak najwięcej płynu, odwracając probówkę wirówkową i stukając otworem w ręcznik papierowy. Upewnij się, że osad komórkowy jest tak suchy, jak to możliwe.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę lizy hipotonicznej, jak opisano wcześniej (krok 2.2). 
	UWAGA: Zasadniczo ta procedura lizy hipotonicznej (kroki od 2.3 do 2.5) może być powtarzana więcej niż jeden raz, w zależności od czystości mieszanej frakcji leukocytów, która ma zostać uzyskana. Po dwóch etapach lizy udział pozostałych erytrocytów w uzyskanej frakcji mieszanej komórek wynosi około 25%.</li>
	<li>Pozostałe nienaruszone komórki osadzać przez odwirowywanie przez 6 minut w temperaturze pokojowej i 450 x g. Usunąć supernatant (patrz krok 2.4). Dodać 500 μl HBSS do osadu i delikatnie rozpuścić go aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Przenieść każdą próbkę do odpowiednio oznakowanej probówki z próbką o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>W zależności od doświadczenia bezpośrednio analizować otrzymane próbki (np. za pomocą cytometrii przepływowej)25, barwić przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie (w celu identyfikacji pojedynczych typów komórek)32, inkubować z bodźcami komórkowymi (w przypadku eksperymentów z aktywacją komórek)33 lub przechowywać na lodzie i używać później. W zależności od celu badania należy natychmiast wykonować kolejne eksperymenty na mieszanej frakcji leukocytów, ponieważ granulocyty mają dość krótki okres półtrwania wynoszący około 20 godzin. 
	UWAGA: Dotyczy to również barwienia aktywnością peroksydazy opisanego poniżej.</li>
</ol>
3. Barwienie aktywności peroksydazy halogenującej
UWAGA: Produkcja HOCl i HOBr przez krwiopochodne peroksydazy hemowe MPO i EPO jest oznaczana ilościowo za pomocą APF, który jest utleniany do fluoresceiny przez wymienione kwasy podhalowe. Dlatego, jeśli znakowanie komórek przeciwciałami znakowanymi fluorescencją odbywa się w połączeniu z barwieniem APF, należy unikać fluoroforów, które zakłócają sygnał emisyjny fluoresceiny.
<ol>
	<li>Barwienie APF należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C na lodzie.</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu roboczego APF należy rozmrozić odpowiednią porcję barwnika (np. 10 μl, 11,81 mM) i rozcieńczyć go HBSS dokładnie do 1 mM (np. dodać 108,1 μl buforu do 10 μl).
	<ol>
		<li>Dla każdej próbki (500 μl roztworu komórkowego) należy przygotować 5 μl opisanego roztworu roboczego APF. W związku z tym należy użyć jednej 10 μl podwielokrotności APF (11,81 mM), co daje 118,1 μl roztworu roboczego APF (1 mM) do przygotowania około 20 próbek. Ze względu na straty podczas pipetowania należy przygotować około 10% więcej roztworu roboczego APF niż obliczono.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu sprawdzenia swoistości peroksydazy barwienia APF należy przygotować próbki kontrolne z inhibitorem peroksydazy hemowej hydrazydem kwasu 4-aminobenzoesowego (4-ABAH)35.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy 4-ABAH (151,17 g/mol) w dimetylosulfotlenku (DMSO), rozcieńczając 75,6 mg 4-ABAH w 500 μl rozpuszczalnika. Dalej rozcieńczyć 4-ABAH 1/10 w HBSS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu roboczegoH2O2należy oznaczyć dwie probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml odpowiednio "70 mM H2O 2" i "7 mM H2O2" .
	<ol>
		<li>W probówce oznaczonej jako "70 mM H2O2" świeżo rozcieńczyć 10 μl 30% roztworu podstawowego (8,8 mM)H2O2przy użyciu 990 μl wody destylowanej, aby uzyskać stężenie około 88 mM. Przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 4 godzin 
		UWAGA:H2O2 jest zwykle dostarczany przez dostawców jako 30% roztwór podstawowy. Przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C jest stabilny przez około 3 lata. Przeprowadzić rozcieńczeniaH2O2w wodzie destylowanej, aby uniknąć rozkładu. RozcieńczeniaH2O2można również przygotować w 0,1 M roztworze NaOH.</li>
		<li>W celu oznaczenia dokładnego stężeniaH2O2należy przygotować dalsze rozcieńczenie 1-10 z pierwszego roztworu podstawowegoH2O2(około 88 mM), dodając 100 μl z tego roztworu do 900 μl wody destylowanej w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "7 mM H2O2".</li>
		<li>Zarejestrować widmo w bliskim zakresie UV (np. 200-300 nm) za pomocą fotospektrometru UV-Vis i użyć absorbancji przy 240 nm (ε240 = 34 M-1 cm-1) w celu określenia rzeczywistego stężeniaH2O2w drugim roztworze podstawowymH2O234. Upewnij się, że kuweta referencyjna zawiera tylko wodę destylowaną. Do pomiaru należy użyć kuwet kwarcowych, ponieważ rejestrowane jest widmo w zakresie UV.</li>
		<li>Na podstawie tego wyniku należy obliczyć dokładne stężenia obu roztworów podstawowychH2O2. Dostosować stężenie pierwszego roztworu podstawowego w probówce z próbką "70 mMH 2O2" dokładnie do 70 mM, dodając odpowiednią ilość wody destylowanej. Otrzymany roztwór roboczy należy przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu jednej godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu roboczego 4-ABAH (100 mM) do odpowiednich próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze przed dodaniem APF.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu roboczego APF (1 mM) do każdej próbki o objętości 500 μl, aby uzyskać końcowe stężenie barwnika wynoszące 10 μM. Próbki należy delikatnie wymieszać (np. przy użyciu mieszalnika wirowego na poziomie pożywki) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu roboczego H2O2 (70 mM) do każdej próbki o objętości 500 μl, aby uzyskać końcowe stężenie 700 μM. Delikatnie wymieszać próbki i inkubować je przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Wykonać odpowiednie pomiary kontrolne równolegle. 
	UWAGA: Pomiary kontrolne wykazały, że 700 μMH2O2 nie jest toksyczne dla komórek. Nie zaobserwowano również żadnych istotnych odpowiedzi komórkowych. 
	UWAGA: Barwienie APF można również przeprowadzić z pominięciem dodatkuH2O2, w zależności od kwestii naukowej. W przypadku braku nadtlenku wodoru określa się tylko podstawową aktywność chlorowania, MPO i EPO, podczas gdy dodanieH2O2pozwala na wykrycie maksymalnej produkcji HOCl i HOBr przez komórki. To ostatnie oznacza znacznie wyższy sygnał fluorescencyjny.</li>
	<li>W celu granulowania komórek należy odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej i 400 x g. Dokładnie usunąć supernatant bez niszczenia osadu i dodać 250 μl HBSS w celu ponownego zawieszenia komórek. 
	UWAGA: Próbki są teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej25.</li>
	<li>Przechowuj próbki w ciemności do czasu analizy, aby uniknąć bielenia. Po wzbudzeniu przy 480-490 nm wykryj emisję fluoresceiny przy około 525 nm37.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ neutrofile są najliczniejszymi leukocytami we krwi ludzkiej, izolacja komórek z dodatnim wynikiem peroksydazy często koncentruje się tylko na tych komórkach i obejmuje oddzielenie neutrofili od innych leukocytów przez wirowanie w gradiacji gęstości38. Ponieważ jednak neutrofile występują znacznie rzadziej w próbkach krwi mysiej39 , w przypadku tych ostatnich konieczne jest zastosowanie bardziej skomplikowanych metod40. Ponadto obie metody prowadzą również do usunięcia z próbek mo...

Leukocyty wielojądrzaste (PMN, zwane również granulocytami) i monocyty reprezentują ważne składniki komórkowe wrodzonego układu odpornościowegowe krwi 1,2. Przyczyniają się do podstawowej obrony przed patogenami, a także do aktywacji nabytego układu odpornościowego i zainicjowania ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej2-4. Jednak szczególnie neutrofile, najliczniejszy typ granulocytów, oraz monocyty również znacząco przyczyniają się do regulacji i zakończenia ostrych zdarzeń zapalnych5. Dlatego komórki te mogą również odgrywać ważną rolę w przewlekłych chorobach zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów6,7. W rzeczywistości astma, przewlekła choroba zapalna dróg oddechowych, charakteryzuje się upośledzoną apoptozą eozynofili, drugiego co do wielkości typu granulocytówwe krwi. Jednak apoptoza granulocytów i ich szybkie usuwanie przez makrofagi to dwa zasadnicze etapy podczas komórkowego zakończenia zapalenia9-11.
W wymienionych komórkach odpornościowych można znaleźć dwa blisko spokrewnione enzymy, a mianowicie mieloperoksydazę (MPO, neutrofile i monocyty) oraz peroksydazę eozynofilową (EPO, eozynofile)12,13. Te peroksydazy hemowe są klasycznie związane z humoralną odpowiedzią immunologiczną, ponieważ dwuelektronicznie utleniają (pseudo)halogenki do odpowiednich kwasów hipo(pseudo)halawych, które są znane ze swoich właściwości bakteriobójczych14-16. W warunkach fizjologicznych MPO tworzy głównie kwas podchlorawy (HOCl) i hipotiocyjanit (-OSCN), podczas gdy ten ostatni i kwas podbromowy (HOBr) są tworzone przez EPO17-19. Nowe wyniki sugerują, że ta aktywność enzymu (pseudo)halogenującego może również przyczyniać się do regulacji odpowiedzi zapalnych i zakończenia reakcji immunologicznych20,21. W rzeczywistości wykazano, że produkcja HOCl przez MPO i produkty pochodne hamuje adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne oparte na limfocytach T22-24.
Aby uzyskać więcej informacji na temat immunologicznej roli leukocytów z wrodzonego układu odpornościowego w przewlekłych chorobach zapalnych i określić wkład MPO i EPO w tę fizjologiczną funkcję, opracowaliśmy metodę szybkiego wzbogacania leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności peroksydazy halogenującej w tych komórkach. Do zmniejszania liczby erytrocytów wybraliśmy standardową metodę, obejmującą dwa kolejne etapy lizy hipotonicznej wodą destylowaną, co prowadzi do szybkiego wzbogacenia leukocytów przy niskich kosztach materiałowych. Do późniejszego oznaczania aktywności halogenujących MPO i EPO wykorzystano barwnik specyficzny dla HOCl i HOBr, aminofenylofluoresceinę (APF)25-27. W przeciwieństwie do stosowania niespecyficznych metod barwienia peroksydazą28,29, podejście to pozwala na selektywne wykrywanie aktywności peroksydazy halogenującej, która często jest upośledzona przy ciężkim zapaleniu30,31.

<table><tbody><tr><td>Materiały/Wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>VWR/Corning</td><td>734-0451-1,5</td><td></td></tr> <tr><td>ml Probówki do próbek</td><td>VWR/Eppendorf</td><td>211-2130DE</td><td></td></tr> <tr><td>Pipety do objętości do 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>np. , 3120000070</td><td>Używamy pipet Eppendorf Resarch plus o regulowanych objętościach w zakresie 1-10 i mikro; l, 10-100 i mikro; l, 100-1,000 i mikro; l an 500-5,000 &mikro; l</td></tr><tr><td>ławka z przepływem laminarnym</td><td>Thermo Electron Corperation</td><td>Mieszalnik HeraSafe-Vortex</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Giętarka & Hobein AG</td><td>Wirówka stołowa Vortex Genie 2</td><td></td></tr> Produkty <tr><td></td><td>laboratoryjne Kendro</td><td>Laborfuge 400R</td><td>Wirówka powinna być używana przy 450 x g</td></tr><tr><td>Mała wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Wirówka powinna być używana przy 400 x g</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heraeus</td><td>cytoperm 2</td><td>Ustawienia: 37 &deg; C, wilgotność 95%, zawartość CO2</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Varian</td><td>Cary 50 bio</td><td>Widmo między 200 a 300 nm musi być rejestrowane. W związku z tym należy zastosować kuwety kwarcowe</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Becton, Dickinson</td><td>BD Facs Calibur</td><td>Można użyć dowolnego cytometru przepływowego, który jest wyposażony w laser odpowiedni do wzbudzenia fluoresceiny (np. , laser argonowy 488 nm)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>amresco</td><td>K812</td><td>sterylny roztwór, gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>tabletki do rozpuszczania w 200 ml miliporowej wody</td></tr><tr><td>Hanks zrównoważony roztwór soli (HBSS) z Ca2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td>970 mg/100 ml, dokładnie sprawdzić i dostosować wartość pH do 7,4</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09057.1000</td><td>1 M roztwór</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Riedel-deHa&euml; n</td><td>30620</td><td>Granulki stałe. Dla 1 M roztworu rozpuścić 4 g/100 ml Milipore wody</td></tr><tr><td>Aminophenyl fluorescein</td><td>Cayman</td><td>10157</td><td>5 mg/ml roztwór (11,81 mM) w octanie metylu, podwielokrotnościach (np. 100 &mikro; l) powinien być przygotowany i przechowywany w temperaturze -20 &; C</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Ten 30% roztwór podstawowy odpowiada stężeniu około 8,8 M. Dalsze rozcieńczenia muszą być świeżo przygotowane w wodzie destylowanej bezpośrednio przed użyciem i określone ilościowo za pomocą pomiarów absorbancji</td></tr><tr><td>Hydrazyd kwasu 4-aminobenzoesowego (4-ABAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A41909</td><td>Pierwszy roztwór podstawowy 1 M należy przygotować w DMSO, drugi roztwór 100 mM w rozcieńczeniu 1:10 w chemikaliach HBSS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>23500.26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

W tym artykule opisany jest protokół szybkiego i standaryzowanego wzbogacania leukocytów z małych próbek krwi pełnej. Procedura ta opiera się na hipotonicznej lizie erytrocytów i może być stosowana do próbek ludzkich, a także do krwi pochodzenia innego niż ludzki. Mała początkowa objętość próbki wynosząca około 50 do 100 μl sprawia, że metoda ta ma zastosowanie do powtarzających się próbek krwi od małych zwierząt laboratoryjnych. Co więcej, wzbogacenie leukocytów osiąga się w ciągu kilku minut i przy niewielkim wysiłku materiałowym związanym z chemikaliami i oprzyrządowaniem, dzięki czemu metoda ta ma zastosowanie w wielu środowiskach laboratoryjnych.
Standaryzowane oczyszczanie leukocytów jest połączone z wysoce selektywną metodą barwienia w celu oceny aktywności peroksydazy halogenującej peroksydazy hemowej, mieloperoksydazy (MPO) i peroksydazy eozynofilowej (EPO), tj. tworzenia kwasu podchlorawego i podbromowego (HOCl i HOBr). Podczas gdy MPO ulega silnej ekspresji w neutrofilach, najliczniejszym typie komórek odpornościowych w ludzkiej krwi, a także w monocytach, pokrewny enzym EPO ulega ekspresji wyłącznie w eozynofilach. Aktywność halogenująca tych enzymów jest regulowana za pomocą barwnika aminofenylofluoresceiny (APF) prawie specyficznego dla HOCl i HOBr oraz głównego substratu peroksydazy, nadtlenku wodoru. Po późniejszej analizie cytometrii przepływowej wszystkie komórki peroksydazo-dodatnie (neutrofile, monocyty, eozynofile) są rozróżnialne i można określić ilościowo ich aktywność peroksydazy halogenującej. Ponieważ barwienie APF można połączyć z zastosowaniem markerów powierzchniowych komórek, protokół ten można rozszerzyć, aby specyficznie zająć się podfrakcjami leukocytów. Metoda ma zastosowanie do wykrywania wytwarzania HOCl i HOBr zarówno w leukocytach ludzi, jak i gryzoni.
Biorąc pod uwagę szeroko i różnorodnie dyskutowaną immunologiczną rolę tych produktów enzymatycznych w przewlekłych chorobach zapalnych, ten protokół może przyczynić się do lepszego zrozumienia immunologicznego znaczenia peroksydaz hemowych pochodzących z leukocytów.

Jak zgłoszono wcześniej, opisana powyżej metoda okazała się możliwa do zastosowania zarówno w materiale ludzkim, jak i pozaludzkim32. Ponadto, jak wykazano w przypadku myszy z objawami astmy, barwienie APF może być odpowiednim narzędziem do wykrywania różnic w ogólnoustrojowym stanie prozapalnym. W związku z tym w kolejnym badaniu zastosowaliśmy ten protokół do wielokrotnej oceny aktywności halogenującej MPO (oraz EPO) u samic szczurów Dark Agouti z zapaleniem stawów i...

Ten protokół opisuje szybkie wzbogacanie leukocytów z małych próbek krwi w celu późniejszego specyficznego określenia aktywności halogenującej peroksydazy w komórkach. Metoda może być stosowana do materiału ludzkiego i innego niż ludzki i może przyczynić się do oceny nowych markerów stanu zapalnego.

Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Ogólnym celem tej metody usuwania erytrocytów jest szybkie i proste wzbogacenie leukocytów z małej próbki krwi. Głównymi zaletami tej techniki są niska cena, niezawodność oraz szybkość. Ponadto można ją stosować w przypadku próbek krwi ludzkiej oraz niehumanoidalnej.Przed rozpoczęciem procedury lizy ustaw pipetę do podawania wody na dwa mililitry, a pipetę do PBS na pięć mililitrów. Następnie umieść otwarte kolby z wodą i PBS pod dygestorium z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej. Ponieważ liza hipotoniczna jest procesem krytycznym pod względem czasu, wszystko powinno zostać przygotowane wcześniej.Ponadto procedura lizy powinna być zawsze przeprowadzana w ten sam sposób, aby uzyskać porównywalne wyniki. Następnie przenieś 100 µL z każdej próbki krwi do 15 ml probówki stożkowej. Do każdej próbki dodaj 2 ml wody destylowanej, mieszając na vortexie z ustawieniem średnim.Pozostawić komórki na 60 sekund, a następnie dodać pięć mililitrów PBS. Próbki wymieszać za pomocą wortexa. Następnie zebrać komórki poprzez wirowanie i odlać nadsączniki.Odwróć probówki i ostuknij ich otwory o ręcznik papierowy, aby usunąć jak najwięcej cieczy. Następnie powtórz procedurę lizy hipotonicznej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po ponownym uzyskaniu suchego osadu, resuspender każdą próbkę w 500 microliters HBSS, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.Następnie przenieś komórki do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i umieść je na lodzie. Aby sprawdzić swoistość peroksydazy w próbkach po barwieniu aminofenolofluoresceiną (APF), najpierw dodaj pięć mikrolitrów inhibitora peroksydazy hemowej, 4-ABAH, do odpowiednich próbek i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodaj pięć mikrolitrów roztworu roboczego APF do każdej probówki i delikatnie wymieszaj komórki w wirówce typu vortex przy średnich ustawieniach.Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie do każdej próbki dodać 5 µL roztworu roboczego nadtlenku wodoru i delikatnie wymieszać probówki w wirówce typu vortex. Po 60 minutach w temperaturze 37 °C odwirować komórki i ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.Na koniec resuspendować komórki w 250 µL HBSS i przechowywać próbki w ciemności do momentu analizy, aby uniknąć fotowybielania. Tutaj przedstawiono reprezentatywny przykład populacji leukocytów po lizie hipotonicznej i barwieniu APF, zgodnie z opisaną procedurą. Wykreślając wielkość komórek w funkcji ziarnistości, można zaobserwować skuteczną eliminację erytrocytów, przy czym populacja krwinek czerwonych i debris stanowi jedynie 22% zdarzeń.Ponadto rozkład intensywności fluorescencji pochodzącej z APF umożliwia wyraźne rozróżnienie erytrocytów i limfocytów ujemnych pod kątem peroksydazy, przy umiarkowanym utlenianiu APF obserwowanym w przypadku monocytów i eozynofilów dodatnich pod kątem peroksydazy, oraz silnym utlenianiu peroksydazy wykazanym przez neutrofile. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, można ją zastosować równolegle do 50 próbek krwi. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak barwienie przeciwciałami, aby zidentyfikować interesujące podgrupy komórek.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się małymi zwierzętami do zgłębienia roli aktywności halogenującej MPO i EPO w modelach zwierzęcych chorób przewlekłych stanów zapalnych.

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę pomiaru markerów biochemicznych hipoksji i niedokrwienia u noworodków. Podejście to wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS).

Biochemiczny pomiar hipoksji noworodkowej

Ten film demonstruje test degranulacji granulek azurofilowych u neutrofili myszy, polegający na stymulacji neutrofili do uwalniania granulek azurofilowych zawierających mieloperoksydazę. Następująca po niej reakcja enzymatyczna jest wykorzystywana do ilościowego określenia poziomów mieloperoksydazy, dostarczając informacji na temat aktywacji neutrofili.

Test do monitorowania degranulacji granulek azurofilowych w neutrofilach po aktywacji

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Ten artykuł przedstawia ekonomiczny i efektywny protokół badania leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu można uzyskać w ciągu łącznie 60 minut, skutecznie poprawiając wydajność laboratorium andrologicznego i andrologów.

Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Kwantyfikacja zarówno utlenionych, jak i zredukowanych form glutationu (odpowiednio GSSG i GSH) została osiągnięta dzięki zastosowaniu aldehydu ortoftaldehydu (OPA). OPA staje się wysoce fluorescencyjny po sprzęgnięciu z GSH, ale nie jest w stanie sprzęgnąć GSSG, dopóki nie zostanie zredukowany. W tym miejscu opisujemy test wieloparametryczny do ilościowego określenia obu przy użyciu kwantyfikacji białka w celu normalizacji.

Szybkie oznaczanie ilościowe utlenionych i zredukowanych form glutationu przy użyciu orto-ftaldehydu w hodowanych komórkach ssaków in vitro

Generowanie anionów ponadtlenkowych jest niezbędne do stymulacji płytek krwi, a jeśli są rozregulowane, krytyczne dla chorób zakrzepowych. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły selektywnego wykrywania anionów ponadtlenkowych oraz badania regulacji płytek krwi zależnej od redoks.

Alternatywne metody wykrywania wytwarzania anionów ponadtlenkowych w płytkach krwi

Poznaj szybką metodę wzbogacania leukocytów z małych próbek krwi ludzkiej i zwierzęcej. Technika ta umożliwia niezawodną ocenę aktywności peroksydazy halogenującej i identyfikację nowych markerów zapalnych w badaniach immunologicznych.

Szybka i swoista ocena aktywności peroksydazy halogenującej w próbkach krwi wzbogaconej w leukocyty

Przeglądaj więcej filmów