Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesny pomiar w czasie rzeczywistym szybkości utleniania glukozy i utleniania kwasów tłuszczowych w mięśniu sercowym, a także funkcji skurczowej w izolowanym pracującym sercu szczura. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii, takie jak sposób, w jaki serce adaptuje się metabolicznie do gwałtownych zmian zapotrzebowania energetycznego oraz w jaki sposób reakcje te zmieniają się w warunkach patologicznych.

Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie badaczowi pełnej kontroli nad zmiennymi środowiskowymi, takimi jak charakter i stężenia substratów, leków lub hormonów dostarczanych do serca. Prezentację poprowadzi Bhavisha Bakrania, stażysta podoktorski z centrum zasobów naczyniowo-nerkowych (Cardiovascular Reno Resource Center) w University of Mississippi Medical Center. Na początek uruchom pompę, aby zaprwać aparat perfuzyjny i dotlenić bufor.

Po przygotowaniu materiałów, poddaj szczura znieczuleniu i przygotuj go do operacji. Wygol włosy z brzucha i wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej z rozszerzeniem bocznym. Odsuń żołądek i jelita, aby uzyskać dostęp do żyły głównej dolnej, a następnie wstrzyknij 200 jednostek USP heparyny.

Odczekać od pięciu do 10 sekund, a następnie za pomocą nożyczek przeciąć przeponę oraz boki klatki piersiowej, aby odsłonić zawartość jamy klatki piersiowej. Następnie delikatnie chwycić serce ręką i wyciąć razem serce oraz płuca. Przeciąć na poziomie aorty zstępującej, uważając, aby w tym procesie nie uszkodzić łuku aorty i aorty wstępującej.

Natychmiast przenieś serce i płuca do naczynia sekcyjnego wypełnionego lodowatym buforem KH. Po zatrzymaniu akcji serca należy pracować szybko, aby możliwe było jego ponowne uruchomienie w ciągu minuty lub dwóch. Następnie zanurz serce i płuca w nowym naczyniu z lodowatym buforem KH.

Szybko odetnij wszelkie duże fragmenty tkanki płucnej, a następnie przetnij aortę zstępującą bezpośrednio nad łukiem aorty. W następnych krokach należy zachować wszelkie niezbędne środki ostrożności przy pracy z materiałami promieniotwórczymi. Następnie, używając pęsety, ostrożnie otwórz aortę i nasuń serce na kaniulę.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przekroczyć drogi aortalnej kaniulą, ponieważ może to spowodować hipoperfuzję serca i uszkodzenie zastawek aortalnych. Następnie zabezpiecz miejsce połączenia mikroklipsem i rozpocznij perfuzję serca metodą Lagendorffa. Bez pośpiechu przymocuj aortę do kaniuli aortalnej, używając szwu jedwabnego 3 0, a następnie usuń mikroklips.

Następnie zlokalizuj żyłę płucną i odetnij zbędne tkanki pozasercowe. Pozostaw wystarczającą ilość tkanki, aby zakotwiczyć lewy przedsionek do kaniuli. Kaniulacja lewego przedsionka jest drugim najistotniejszym krokiem protokołu, ponieważ niewłaściwe wprowadzenie kaniuli lub obecność przecieku osłabi skurcze i zaburzy ilościowe oznaczenie tempa metabolizmu.

Następnie przygotuj kaniulę do lewego przedsionka, analogicznie do przygotowania kaniuli prawego przedsionka. Następnie za pomocą pęsety delikatnie chwyć otwór żyły płucnej i nasuń serce na kaniulę przedsionkową. Przesuwaj tkanki w razie potrzeby, nie zginając aorty i nie nadwyrężając nadmiernie serca.

Następnie przymocuj kaniulę za pomocą szwu jedwabnego 3 0. Na koniec otwórz linię przedsionkową, jednocześnie przełączając linię aortalną w tryb roboczy. Jeśli bufor wycieka z lewego przedsionka, zamknij linię przedsionkową i przełącz z powrotem w tryb Lagendorffa.

Następnie należy użyć dodatkowych szwów, aby lepiej zabezpieczyć kaniulę i ponownie spróbować przełączyć się w tryb roboczy. Jeśli eksperyment obejmuje bezpośredni pomiar funkcji LV za pomocą cewnika, należy rozpocząć od nakłucia szczytu LV za pomocą igły 26G, wprowadzić cewnik ciśnieniowo-objętościowy i wyrównać trzon z osią podłużną LV. Następnie należy umieścić elektrodę dystalną E1 tuż poniżej zastawki aorty, przylegając do brzegu endokardium, a elektrodę proksymalną E4 tuż wewnątrz ściany komory.

Następnie umieść serce w komorze z płaszczem wodnym. Rozpocznij monitorowanie parametrów funkcjonalnych w oprogramowaniu. Gdy parametry bazowe pozostaną stabilne przez co najmniej pięć minut, rozpocznij rejestrację danych.

Aby zmierzyć przepływ wieńcowy, należy zmierzyć czas potrzebny na zebranie 20 mililitrów effluentu. Następnie, za pomocą trójdrożnego kurka, pobrać do strzykawki dwa mililitry effluentu, a pozostałą część odrzucić. Próbkę o objętości dwóch mililitrów należy niezwłocznie przenieść do probówki do mikrocentryfugii i pobrać alikwot o objętości pół mililitra w celu oznaczenia szybkości utleniania glukozy.

Pozostałą część przechowywać w lodzie. Kontynuować okresowe pobieranie próbek odpływu wieńcowego, a przed zakończeniem wstrzyknąć 10 µL soli hipertonicznej do linii przedsionkowej, bezpośrednio przed jej połączeniem z kaniulą.

Wykorzystaj odpowiedź na ten bolus do obliczenia konduktancji równoległej w celu dokładnego oznaczenia objętości serca. Następnie rozszczelnij komorę serca i usuń cewnik z LV. Potem odetnij serce od kaniul i umieść je w lodowatym buforze KH. Teraz szybko osusz serce ręcznikiem papierowym i zmierz jego masę mokrą.

Po zważeniu należy przystąpić do wycięcia wymaganych próbek tkanki, a następnie zamrozić pozostałą tkankę, używając pęsety schłodzonej na suchym lodzie. W ramach przygotowań należy napełnić szklane fiolki scyntylacyjne jednym mililitrem 10x hyamine hydroxide. Przygotuj jedną fiolkę dla każdej próbki odpływu wieńcowego oraz dwie fiolki dla kontroli.

Niezwłocznie po napełnieniu fiolki z próbką, należy umieścić ją bezpośrednio w napełnionej fiolce scyntylacyjnej. W celu przeprowadzenia analizy, delikatnie zamknąć fiolkę korkiem z gumową tuleją i uszczelnić ją za pomocą parafilmu. Następnie, używając strzykawki o pojemności 1 ml z długą igłą 23 G, wstrzyknąć 200 µL 60% kwasu nadchlorowego przez gumową tuleję.

Pozostaw wszystkie fiolki z próbkami na noc. Następnego dnia ostrożnie wyjmij każdą probówkę z próbką za pomocą pęsety i opłucz ich dna nad otwartymi fiolkami, używając jednego mililitra koktajlu scyntylacyjnego, aby odzyskać cały wodorotlenek hyaminu. Następnie dodaj kolejne dziewięć mililitrów koktajlu scyntylacyjnego do każdej fiolki.

Aby uzyskać aktywność właściwą, należy dodać 0,5 ml buforu do profuzji do dwóch fiolek. Następnie energicznie wstrząsnąć fiolkami i pozostawić je do ustabilizowania na co najmniej sześć godzin przed dokonaniem pomiarów. Aby określić szybkość utleniania oleinianu w mięśniu sercowym, należy najpierw przygotować kolumnę z żywicą wymiany anionowej dla każdej próbki.

Napełnić końcówki probówek do strzykawek o pojemności trzech mililitrów watą szklaną. Następnie, używając pipety transferowej, dodać zawiesinę żywicy w wodzie do kreski dwóch mililitrów w każdej kolumnie. Następnie przemyć żywicę, przepuszczając dwa mililitry ultra czystej wody przez każdą kolumnę trzy razy.

Następnie umieść fiolki scyntylacyjne pod kolumnami i nanieś na kolumny 0,5 ml effluentu wieńcowego. Do pomiaru tła użyj zamiast niego buforu perfuzyjnego. Teraz eluuj kolumny kolejno 0,5 ml, 1 ml, a na koniec 2 ml ultraczystej wody.

Usunąć kolumny. Następnie do probówek dodać 13 mililitrów koktajlu scyntylacyjnego. Do dwóch probówek wypełnionych 13 mililitrami ciekłego koktajlu scyntylacyjnego dodać 0,5 mililitra buforu perfuzyjnego w celu oznaczenia aktywności właściwej.

Energicznie wstrząśnij fiolkami, odstaw je na ponad sześć godzin, a następnie wykonaj pomiary. Serca wyizolowano od dwóch 16-tygodniowych szczurów i poddano różnym warunkom stresu. W przypadku jednego serca symulowano gwałtowny wzrost obciążenia poprzez zwiększenie obciążenia następczego o 40% oraz dodanie epinefryny do buforu perfuzyjnego.

Częstość akcji serca natychmiast wzrosła o ponad 50% po indukcji skoku obciążenia. Moc serca zwiększyła się o ponad 40% podczas skoku obciążenia, czemu towarzyszył wzrost szybkości utleniania zarówno glukozy, jak i oleinianu. Względny wzrost utleniania glukozy w stosunku do wartości bazowej był uderzający.

Drugie serce poddano 15 minutom niedokrwienia globalnego i 30 minutom reperfuzji. W tych warunkach eksperymentalnych ciśnienie tętna niemal do poziomu prawidłowego przywrócono po kilku minutach od rozpoczęcia reperfuzji. W ciągu 10 minut moc serca gwałtownie wzrosła powyżej wartości sprzed niedokrwienia, a następnie powróciła do wartości bliskich wyjściowym.

Było to wynikiem zwiększonego utleniania oleinianu, podczas gdy utlenianie glukozy szybko powróciło do poziomu aktywności sprzed niedokrwienia. Po opanowaniu techniki, izolacja serca aż do wstępnej reperfuzji w trybie pracy może zostać przeprowadzona w mniej niż pięciu minutach, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analizy ekspresji RNA i białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące wpływu leku lub stresu na molekularne szlaki sygnalizacyjne. Należy pamiętać, że praca z radioligandami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie pełnych środków ochrony osobistej.