Name: Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującym. Technika umożliwia kontrolę zmiennych środowiskowych i badanie adaptacji metabolicznej serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (dla R. H.), R01 HL108618 (dla J.P.G.), P01 HL051971 i P20 GM104357. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Neely, J. R., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+carbohydrate+and+lipid+metabolism+and+the+energy+balance+of+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle.</a> Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+regulation+of+load-induced+mTOR+signaling+and+ER+stress+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart.</a> J Am Heart Assoc. 2, e004796(2013).</li>
<li>Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+maladaptation+of+the+heart+in+diabetes%3A+Part+II%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms.</a> Circulation. 105, 1861-1870 (2002).</li>
<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).</li>
<li>Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mitochondrial+oxidative+metabolism+as+an+approach+to+treat+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).</li>
<li>Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+fatty+acid+and+carbohydrate+oxidation--a+novel+therapeutic+intervention+in+the+ischemic+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart.</a> Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).</li>
<li>Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+metabolism+as+a+target+for+the+treatment+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure.</a> Circulation. 110, 894-896 (2004).</li>
<li>Taegtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Cardiac+Metabolism%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. , (2016).</li>
<li>Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+in+vitro%2Fex+vivo+cardiac+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).</li>
<li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochem J. 186, 701-711 (1980).</li>
<li>Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart%3A+new+advances+in+cardiac+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).</li>
<li>Cingolani, O. H., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-volume+relation+analysis+of+mouse+ventricular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).</li>
<li>Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cardiac+function+using+pressure-volume+conductance+catheter+technique+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.</a> Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).</li>
<li>Abraham, D., Mao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Pressure-Volume+Loop+Analysis+Using+Conductance+Catheters+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Harmancey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+improves+metabolic+and+contractile+efficiency+in+stressed+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart.</a> FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).</li>
<li>Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+long-chain+fatty+acid+oxidation+impairs+postischemic+recovery+of+the+insulin-resistant+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart.</a> FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).</li>
<li>Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+energy+metabolism+of+the+heart+during+acute+increase+in+heart+work%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work.</a> J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).</li>
<li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).</li>
<li>Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+increased+heart+work+on+the+tricarboxylate+cycle+and+its+interactions+with+glycolysis+in+the+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart.</a> Biochem J. 128, 147-159 (1972).</li>
<li>Katz, J., Dunn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-2-t+as+a+tracer+for+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism.</a> Biochemistry. 6, 1-5 (1967).</li>
<li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused%2C+isolated%2C+working+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).</li>
<li>Qiu, Y., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ischemic+vulnerability+and+responsiveness+to+cardioplegic+protection+in+crystalloid-perfused+versus+blood-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).</li>
<li>Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketone+body+metabolism+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ketone body metabolism and cardiovascular disease.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).</li>
<li>Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+metabolism+in+heart+disease%3A+an+epiphenomenon+or+a+real+culprit%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?</a> Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).</li>
<li>Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+branched+chain+amino+acids+by+isolated+hearts+and+diaphragms+of+the+rat.+The+effect+of+fatty+acids%2C+glucose%2C+and+pyruvate+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration.</a> J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).</li>
<li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+is+better+protected+against+myocardial+infarction+in+the+fed+state+compared+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state.</a> Metabolism. 63, 127-136 (2014).</li>
<li>Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+triacylglycerol-rich+lipoproteins+by+the+working+rat+heart%3A+routes+of+uptake+and+metabolic+fates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates.</a> J Physiol. 558, 225-237 (2004).</li>
<li>Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+turnover+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glycogen turnover in the isolated working rat heart.</a> J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).</li>
<li>Sender, P. M., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+rates+of+protein+in+the+Langendorff-perfused+rat+heart+in+the+presence+and+absence+of+insulin%2C+and+in+the+working+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart.</a> Biochem J. 132, 603-608 (1973).</li>
<li>Hindlycke, M., Jansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+tolerance+and+pancreatic+islet+blood+flow+in+rats+after+intraperitoneal+administration+of+different+anesthetic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Ups+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs.</a> Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).</li>
<li>Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia%27s+effects+on+plasma+glucose+and+insulin+and+cardiac+hexokinase+at+similar+hemodynamics+and+without+major+surgical+stress+in+fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats.</a> Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).</li>
<li>Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pentobarbital+appropriate+for+basal+anesthesia+in+the+working+rat+heart+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).</li>
<li>Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anesthesia+on+cardiac+function+and+response+in+the+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).</li>
<li>Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sanguinarine+non-+versus+re-circulation+during+isolated+heart+perfusion--a+Jekyll+and+Hyde+effect%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Drugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect?</a> Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).</li>
<li>Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+and+fatty+acid+metabolism+in+the+isolated+working+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart.</a> Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).</li>
<li>Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats%21+%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Rats! </a> Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Powyższy protokół szczegółowo opisuje metody jednoczesnego ilościowego określania strumienia substratu poprzez utlenianie glukozy i utlenianie kwasów tłuszczowych w izolowanym pracującym sercu szczura. Pomiary można następnie nałożyć na zarejestrowane parametry czynnościowe serca w celu określenia związku między metabolizmem substratów a pracą serca w warunkach wyjściowych i stresowych (zmiana obciążenia, niedokrwienie-reperfuzja itp.). Możliwa jest również ocena, w jaki sposób na zależność metabolizm/skurcz wpł...

Znaczenie kliniczne
W sercu ssaków istnieje silna pozytywna zależność między przepływem substratów przez oksydacyjne szlaki metaboliczne, wytwarzaniem ATP i pracą serca1. W ciągu ostatnich dwóch dekad badania nad skomplikowanym związkiem między metabolizmem a funkcją serca doprowadziły do uznania, że zmiany w metabolizmie serca są przyczyną dysfunkcji skurczu i prawdopodobnie patologicznej przebudowy strukturalnej w otoczeniu różnych typów chorób serca2-4. W związku z tym oczekuje się, że nasze zrozumienie mechanizmów rządzących przebudową metaboliczną zestresowanego serca doprowadzi do identyfikacji celów terapeutycznych w zapobieganiu lub leczeniu niewydolności serca5-7. Niedawna publikacja oświadczenia naukowego American Heart Association na temat "Oceny metabolizmu serca" podkreśla rosnące zainteresowanie środowiska naukowego tą dziedziną badań8. Ale podczas gdy postęp technologiczny w obrazowaniu serca pozwala obecnie na szybką i dokładną ocenę morfologii i funkcji serca, badanie in vivo metabolizmu serca pozostaje ograniczone i uciążliwe: spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) mogą być wykorzystywane do śledzenia wysokoenergetycznego metabolizmu fosforanów w sercu i aktywności cyklu Krebsa. Techniki te są jednak nękane wysokimi kosztami operacyjnymi i niemożnością określenia udziału różnych substratów w metabolizmie oksydacyjnym w warunkach stanu ustalonego9. Do tej pory preparat pracujący na serce ex vivo stanowi jedyną i unikalną dostępną technikę do badania, jednocześnie i w czasie rzeczywistym, funkcji skurczu i przepływu substratów do oksydacyjnych szlaków metabolicznych7,9. Poniższy protokół ma na celu dostarczenie wytycznych dotyczących przygotowania i wykorzystania odczynników stosowanych do określenia wskaźników wykorzystania substratów w izolowanym pracującym sercu szczura.
Izolowany działający aparat serca gryzoni
Chociaż technika ta ma już prawie pół wieku, izolowana działająca preparatura serca szczura pozostaje metodą wyboru w badaniach sercowo-naczyniowych. Podobnie jak w przypadku preparatu na serce Langendorffa, działające serce gryzoni oferuje stosunkowo prosty, niezawodny i niedrogi sposób pomiaru szerokiego zakresu parametrów serca niezależnie od zakłócającego działania innych narządów, czynników neurohormonalnych i innych czynników krążących. Jednak w przeciwieństwie do serca z perfuzją Langendorffa, pracujące serce nadal wykonuje niemal fizjologiczną pracę serca, co jest warunkiem wstępnym do generowania oksydacyjnego strumienia metabolicznego do poziomów, które są istotne dla warunków in vivo. Osiąga się to poprzez dostarczenie buforu perfuzyjnego do lewej komory (LV) przez kaniulę podłączoną do lewego przedsionka, a gdy LV wypełnia się i kurczy, bufor jest wyrzucany przez linię aorty przy określonym obciążeniu następczym, ciśnienie hydrostatyczne. Konstrukcja aparatu perfuzyjnego pierwotnie opisana przez Neely'egoi współpracowników została następnie ulepszona przez Taegtmeyera, Hemsa i Krebsa11, ale od tego czasu niewiele się zmieniła. Jak opisano w oryginalnym urządzeniu, funkcję skurczową można ocenić poprzez określenie rzutu serca, przy użyciu nie więcej niż cylindrów z podziałką i stopera do pomiaru przepływów aortalnych i wieńcowych10,11. Kilku dostawców oferuje obecnie kompletne działające systemy perfuzji serca gryzoni. Te dostępne na rynku aparaty można nabyć z sondami przepływowymi, przetwornikami ciśnienia, cewnikiem ciśnieniowo-objętościowym i całym sprzętem niezbędnym do gromadzenia i analizy danych czynnościowych serca. Dostawcy udostępniają obszerną dokumentację i sesje szkoleniowe, aby zapoznać nowego użytkownika ze swoim sprzętem. Kilka artykułów przeglądowych szczegółowo opisuje również protokoły dotyczące pracującego oprzyrządowania serca i stosowania cewników do pomiaru czynności serca u gryzoniw wieku 12-15 lat. Z tego powodu wspomnimy tylko pokrótce o ustawieniu aparatu perfuzyjnego i sprzętu rejestrującego. Niniejszy protokół ma raczej na celu uzupełnienie już dostępnych informacji o opis metod, które można zastosować do jednoczesnego pomiaru szybkości utleniania glukozy i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, dwóch głównych substratów dostarczających energii w normalnym sercu. Opisujemy tutaj wszystkie etapy związane z wykorzystaniem znakowanych radioaktywnie substratów energetycznych do oceny metabolizmu oksydacyjnego mięśnia sercowego, od przygotowania odczynników i, przez odzyskiwanie i przetwarzanie próbek, po analizę danych.
Zasady metody
Kardiomiocyty generują większość swojej energii na skurcz z oksydacyjnej fosforylacji kwasów tłuszczowych (głównie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych) i węglowodanów (glukozy i mleczanu). Serce ma bardzo ograniczone rezerwy energetyczne i jest uzależnione od stałego dostarczania tej energii dostarczającej substraty z krążenia. Katabolizm glukozy poprzez szlak glikolityczny daje pirogronian, który jest następnie dekarboksylowany przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej wewnętrznej błony mitochondrialnej. Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, ekstrahowane z krążących albumin lub triglicerydów lipoprotein, są najpierw aktywowane do cząsteczek acylo-CoA w cytozolu, a następnie transportowane do wnętrza macierzy mitochondrialnej przez transport karnityny, aby wejść na szlak beta-oksydacji. Cząsteczki acetylo-CoA wytwarzane przez katabolizm glukozy i kwasów tłuszczowych napędzają cykl Krebsa w celu wytworzenia równoważników redukujących (NADH i FADH2), które są wykorzystywane przez łańcuch transportu elektronów do budowy siły napędowej protonów w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej i generowania ATP poprzez aktywność syntazy ATP. Woda i dwutlenek węgla są końcowymi produktami ubocznymi reakcji enzymatycznych zachodzących w cyklu Krebsa. Dostarczenie 14substratów znakowanych radioizotopowo C i 3H (takich jak 14C-radioznakowanej glukozy i 3H-radioizotopowany kwas oleinowy) do izolowanego serca roboczego doprowadzi w konsekwencji do wytworzenia 14CO2 i 3H2O, które można ilościowo odzyskać ze ścieków wieńcowych. Zbieranie 14CO2 odbywa się poprzez przetrzymywanie izolowanego perfuzji serca w szczelnej komorze i natychmiastowe odzyskiwanie ścieków wieńcowych, gdy opuszczają serce. Mała kolumna anionowymienna służy do oddzielenia i odzyskania 3H2O ze ścieków wieńcowych. Promieniotwórczość z przetworzonych próbek mierzy się za pomocą licznika scyntylacyjnego cieczy, a posiadając wiedzę na temat specyficznej aktywności użytych substratów znakowanych radioaktywnie, możliwe jest indywidualne określenie ilościowe strumienia glukozy i kwasów tłuszczowych w szlakach utleniania16,17.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Żywica Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8, postać chlorkowa, 100 - 200 suchy rozmiar oczek, 500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>Ten element można wymienić, kupując bezpośrednio formę hydrotlenku&nbsp; (patrz odniesienie poniżej), ale będzie to kosztować prawie 8 razy więcej</td></tr><tr><td>żywicy AG 1-X8, forma wodorotlenkowa, 100 - 200 suchych oczek, 100 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1432445</td><td>Zakup tego elementu pozwala ominąć konwersję żywicy anionowymiennej z postaci chlorkowej do postaci wodorotlenkowej (patrz sekcja 1.2 protokołu)</td></tr><tr><td>Szklany uchwyt filtra próżniowego do mikroanalizy</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>. Zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania informacji na temat prawidłowego obchodzenia się i przechowywania.</td></tr><tr><td>Rurka dyspersyjna gazu ze spiekanym cylindrem</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Albumina surowicy bydlęcej Bez kwasów tłuszczowych, proszek</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>Zalecamy stosowanie odtłuszczonego węgla drzewnego BSA, ponieważ inne procesy oczyszczania, takie jak frakcjonowanie zimnego etanolu, mogą pozostawiać pozostałości toksyczne dla serca.</td></tr><tr><td>Sodium Oleate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>Materiał radioaktywny. Postępuj zgodnie z wytycznymi biura ds. bezpieczeństwa radiologicznego swojej instytucji dotyczącymi zamawiania i obsługi.</td></tr><tr><td>Rurka membranowa do dializy, średnica 29 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>Materiał radioaktywny. Postępuj zgodnie z wytycznymi biura ds. bezpieczeństwa radiologicznego swojej instytucji dotyczącymi zamawiania i obsługi.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat inaktyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>Substancja kontrolowana na USDEA Harmonogram III</td></tr><tr><td>3-0 Jedwabny warkocz</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Wodorotlenek hiaminy</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>Wysoce toksyczny i powoduje poważne oparzenia. Zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania informacji o prawidłowym obchodzeniu się i przechowywaniu</td></tr><tr><td>20 ml szklanych fiolek scyntylacyjnych</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25E</td><td>Używaj szklanych fiolek do ilościowego odzyskiwania 14CO2</td></tr><tr><td>20 ml Fiolki scyntylacyjne HDPE</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>Używaj fiolek HDPE do ilościowego odzyskiwania 3H2O</td></tr><tr><td>Czerwony Zatyczki gumowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit 20 ml fiolki scyntylacyjne; Igła wielokrotnego użytku</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>Służy do wstrzykiwania kwasu nadchlorowego przez gumowy korek tulei pułapki CO2</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy, 60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>Silnie i może działać jako utleniacz i/lub powodować zagrożenie wybuchem. Zapoznaj się z kartą charakterystyki produktu w celu uzyskania informacji na temat prawidłowego obchodzenia się i przechowywania</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Koktajl scyntylacyjny</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Wełna szklana</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean Detergent w proszku</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>Do czyszczenia naczyń szklanych, części plastikowych i rurek</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Detergent z aktywnymi enzymami</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-115</td><td>Do czyszczenia "trudno dostępnych" powierzchni (rurki, szkło) zanieczyszczonych pozostałościami kwasów tłuszczowych BSA</td></tr></tbody></table>

metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

Serce ssaków jest głównym konsumentem ATP i wymaga stałego dostarczania substratów energetycznych do skurczu. Nic dziwnego, że zmiany w metabolizmie mięśnia sercowego zostały powiązane z rozwojem dysfunkcji skurczu i niewydolności serca. Dlatego odkrycie związku między metabolizmem a skurczem powinno rzucić światło na niektóre mechanizmy rządzące adaptacją lub nieprzystosowaniem serca w stanach chorobowych. Wyizolowany preparat działający na serce szczura może być używany do jednoczesnego i w czasie rzeczywistym śledzenia funkcji skurczowej serca i strumienia energii dostarczającej substraty do oksydacyjnych szlaków metabolicznych. Niniejszy protokół ma na celu dostarczenie szczegółowego opisu metod stosowanych w przygotowaniu i wykorzystaniu do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych, głównych substratów energetycznych serca. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych. Krótko mówiąc, technika opiera się na dostarczaniu 14C- znakowanej radioaktywnie glukozy i 3H- znakowanego radioizotopem długołańcuchowego kwasu tłuszczowego do bijącego ex vivo serca poprzez normotermiczną perfuzję krystaloidową. 14CO2 i 3H2O, końcowe produkty uboczne reakcji enzymatycznych biorących udział w wykorzystaniu tych substratów dostarczających energię, są następnie ilościowo odzyskiwane ze ścieków wieńcowych. Posiadając wiedzę na temat specyficznej aktywności zastosowanych substratów znakowanych radioizotopem, możliwe jest indywidualne określenie ilościowe strumienia glukozy i kwasów tłuszczowych w szlakach utleniania. Funkcja skurczowa izolowanego serca może być określana równolegle z odpowiednim sprzętem rejestrującym i bezpośrednio skorelowana z wartościami strumienia metabolicznego. Technika ta jest niezwykle przydatna do badania zależności metabolizm/skurcz w odpowiedzi na różne warunki stresowe, takie jak zmiany przed i po obciążeniu i niedokrwieniu, leku lub czynnika krążącego, lub po zmianie ekspresji produktu genu.

Na poniższych rysunkach opisano dwa reprezentatywne eksperymenty. W obu przypadkach wyizolowano serce 16-tygodniowego samca szczura Sprague Dawley i poddano je perfuzji w trybie roboczym z użyciem buforu KH przygotowanego zgodnie z poprzednim protokołem. W każdym eksperymencie serce poddano warunkom stresowym w celu wpłynięcia na pracę serca. Funkcję kurczliwości serca oceniano poprzez ciągły zapis ciśnienia tętna po wprowadzeniu przetwornika ciśnienia do linii aorty oraz poprzez wyznacze...

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesny pomiar w czasie rzeczywistym szybkości utleniania glukozy i utleniania kwasów tłuszczowych w mięśniu sercowym, a także funkcji skurczowej w izolowanym pracującym sercu szczura. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiologii, takie jak sposób, w jaki serce adaptuje się metabolicznie do gwałtownych zmian zapotrzebowania energetycznego oraz w jaki sposób reakcje te zmieniają się w warunkach patologicznych.Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie badaczowi pełnej kontroli nad zmiennymi środowiskowymi, takimi jak charakter i stężenia substratów, leków lub hormonów dostarczanych do serca. Prezentację poprowadzi Bhavisha Bakrania, stażysta podoktorski z centrum zasobów naczyniowo-nerkowych (Cardiovascular Reno Resource Center) w University of Mississippi Medical Center. Na początek uruchom pompę, aby zaprwać aparat perfuzyjny i dotlenić bufor.Po przygotowaniu materiałów, poddaj szczura znieczuleniu i przygotuj go do operacji. Wygol włosy z brzucha i wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej z rozszerzeniem bocznym. Odsuń żołądek i jelita, aby uzyskać dostęp do żyły głównej dolnej, a następnie wstrzyknij 200

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Badanie metabolizmu staje się coraz bardziej istotne dla badań immunologicznych. W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w mysich splenocytach oraz limfocytach T i B.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach jest ważna dla utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie. Protokół ten przedstawia ocenę wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych przy jednoczesnym określeniu wpływu różnych interwencji fizjologicznych na metabolizm glukozy w całym organizmie.

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Tutaj opisano szczegółowy protokół do przeprowadzania testu stresu mitochondrialnego i testu szybkości glikolitycznej w próbkach tkanki siatkówki ex vivo przy użyciu komercyjnego bioanalizatora.

Oznaczanie oddychania mitochondrialnego i glikolizy w próbkach tkanki siatkówki ex vivo

Opisujemy eksperymentalny układ do podawania hiperspolaryzowanych metabolitów znakowanych 13znakowanymi C w trybie ciągłej perfuzji do izolowanego perfundowanego serca myszy. Dedykowane podejście do akwizycji 13C-NMR umożliwiło ilościowe określenie aktywności enzymów metabolicznych w czasie rzeczywistym, a wieloparametryczna analiza 31P-NMR umożliwiła określenie zawartości ATP i pH w tkankach.

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR

Poznaj metodę oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującym. Technika umożliwia kontrolę zmiennych środowiskowych i badanie adaptacji metabolicznej serca.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Przeglądaj więcej filmów