Name: Różnica transferu nasycenia spinu NMR (SSTD NMR): Nowe narzędzie do uzyskiwania parametrów kinetycznych procesów wymiany chemicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metodę SSTD NMR do pomiaru parametrów kinetycznych wymiany chemicznej w małych cząsteczkach organicznych i metaloorganicznych. Technika ta pozwala jednocześnie uzyskać stałą szybkości i czas relaksacji bez konieczności koalescencji sygnałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie przez University of East Anglia, EPSRC (EP/L012855/1) i UE (H2020-MSCA-IF-2014-EF-ST-658172) jest z wdzięcznością potwierdzone (MTQ).

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów (MSDS).

1. Przygotowanie próbek do NMR
<ol>
	<li>Odważ 5 mg N,N-dimetyloacetamid, dodać do probówki NMR odpowiedniej do niskich temperatur i rozpuścić w 0,6 ml toluenu-d8.</li>
</ol>
2. Konfiguracja eksperymentu NMR25
<ol>
	<li>Pozyskiwanie widm NOE
	<ol>
		<li>Przeprowadź jednowymiarowy eksperyment NOE (efekt Nuclear Overhauser).26 
		UWAGA: Efekty NOE mogą wystąpić w każdej temperaturze. Jednowymiarowe widmo NOE z naświetlaniem sygnału, który będzie naświetlany w eksperymencie SSTD NMR, zarejestrowano w temperaturze -40 °C, aby upewnić się, że rotacja i transfer magnetyzacji w użytej tutaj próbce zostały zminimalizowane, a w konsekwencji NOE, jeśli występuje, będzie przeważać i zostanie zmierzony w tym eksperymencie. Idealnie efekty NOE między dwoma wymieniającymi się jądrami nie powinny występować, aby uniknąć interferencji z metodą SSTD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja eksperymentów SSTD NMR
	<ol>
		<li>Wprowadź próbkę do magnesu, wpisując najpierw ej w linii poleceń oprogramowania, aby włączyć przepływ powietrza. Następnie umieść próbkę na górze magnesu i wpisz ij. Poczekaj, aż próbka znajdzie się wewnątrz magnesu.</li>
		<li>Gdy próbka znajdzie się w magnesie, wpisz w linii poleceń edte. Zmień temperaturę na pierwszą wybraną temperaturę do przeprowadzenia eksperymentu (w tym przypadku 295.5 K). Pozostaw próbkę do stabilizacji w wybranej temperaturze przez co najmniej 20 min.</li>
		<li>Przeprowadź eksperyment 1D 1H-NMR na próbce.
		<ol>
			<li>Utwórz nowy zestaw danych dla eksperymentu 1H-NMR. W tym celu kliknij FILE/NEW i nazwij nowy eksperyment.</li>
			<li>Wpisuj sekwencyjnie, czekając na zakończenie poprzedniego polecenia: lock, atma, topshim, getprosol oraz rga.</li>
			<li>Wpisz zg, aby pozyskać dane eksperymentu protonowego. Po zakończeniu wpisz efp i apk, aby przeprowadzić transformację Fouriera i dostosować fazę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utwórz nowy zestaw danych, na przykład dla eksperymentu 1H NMR. W tym celu kliknij FILE/NEW i nazwij nowy eksperyment.</li>
		<li>W tym nowym zestawie danych wpisz rpar w linii poleceń. Wybierz z listy jeden z zestawów parametrów „STDDIFF”, na przykład STDDIFFESGP, kliknij „read”, a następnie „read all” (Rysunek 1). Alternatywnie wykonaj to, wpisując rpar STDDIFFESGP all. 
		UWAGA: Eksperyment można przeprowadzić z tą sekwencją impulsów. Jednak w naszym eksperymencie zastosowano program impulsowy STDDIFF.</li>
		<li>Aby wybrać sekwencję impulsów STDDIFF, kliknij przycisk z trzema kropkami w linii PULPROG (Rysunki 2 i 3).</li>
		<li>Przed przeprowadzeniem eksperymentu SSTD NMR skalibruj twardy impuls 90° dla 1H (p1). W tym celu upewnij się, że próbka znajduje się w magnesie w żądanej temperaturze (Krok 2.2.2). Wpisz pulsecal w linii poleceń i skopiuj wartość impulsu 90° przy wyższej mocy (w tym przypadku pl1 = -1 dB), tzn. tę, która daje najkrótszy impuls (Rysunek 4).</li>
		<li>Wprowadź wartości skalibrowanego impulsu twardego do eksperymentu. Wpisz getprosol 1H (wartość dla p1 uzyskana w kroku 2.2.7) (wartość dla pl1) (Rysunek 5).</li>
		<li>Ustaw długość impulsu kształtowanego. Wpisz p13 i wprowadź wartość 50,0 µsec (Rysunek 6).</li>
		<li>Ustaw kształt impulsu selektywnego. Aby to zrobić, przejdź do sekcji Power i kliknij przycisk „Edit…” obok SHAPE (Rysunek 7). Przejdź do kształtowanego impulsu 13 i wybierz: Gaus 1.10 (Rysunek 8).</li>
		<li>Ustaw moc impulsu selektywnego (SP13). Ustaw ją na odpowiednią wartość, tzn. w tym systemie między 40-60 dB (co odpowiada natężeniu pola około 120 Hz) (Rysunek 8). Nadmierne natężenie pola może prowadzić do nieakceptowalnych efektów nasycenia.27-29 
		UWAGA: W naszym przypadku optymalna wartość wynosiła 50 dB. Należy pamiętać, że jest to skala tłumienia, zatem im mniejsza wartość, tym wyższa moc częstotliwości radiowej. Ponieważ odpowiada to nasycającej kaskadzie Gaussa stosowanej przez długi czas (kilka sekund), wartość sp13 nie powinna być niższa niż 40 dB (w razie potrzeby należy zapoznać się ze specyfikacją urządzenia, ponieważ długie impulsy o wysokiej mocy mogłyby uszkodzić głowicę sondy). W naszym doświadczeniu zakres 41-61 dB powyżej tłumienia twardego impulsu 1H 90° (-1 dB w tej pracy) działa dobrze. Należy zawsze starać się wybierać najwyższe możliwe tłumienie, które prowadzi do podobnego poziomu nasycenia.</li>
		<li>Wpisz ns i ustaw wartość na 8, a następnie wpisz ds i ustaw wartość na 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja i przetwarzanie danych NMR25
<ol>
	<li>Akwizycja eksperymentu NMR SSTD
	<ol>
		<li>Otwórz 1Eksperyment H NMR wykonany w kroku 2.2.3 w celu sprawdzenia położenia sygnału, który zostanie poddany naświetlaniu. W tym celu należy odnaleźć eksperyment w przeglądarce oprogramowania, kliknąć prawym przyciskiem myszy na zestawie danych i wybrać opcję „Display in a new window”.</li>
		<li>Przesuń linię kursora na środek sygnału do napromieniowania i zapisz przesunięcie chemiczne w ppm. Wybierz szerokość widma, która zostanie zastosowana w eksperymencie. 
		UWAGA: W tym przypadku sygnał poddawany naświetlaniu znajduje się przy 2,17 ppm, a zastosowana szerokość widma wyniosła 1,46 ppm. Należy upewnić się, że nie zastosowano korekcji przesunięcia chemicznego, w przeciwnym razie częstotliwość naświetlania może zostać ustawiona nieprawidłowo.</li>
		<li>Przejdź do wcześniej utworzonego eksperymentu SSTD NMR z konfiguracją opisaną w sekcji 2.2.</li>
		<li>Utwórz listę z częstotliwościami naświetlań. W tym celu wpisz lista fq2 w wierszu poleceń i wybierz istniejącą listę.</li>
		<li>Edytuj listę częstotliwości naświetlań, wprowadzając następujące dane w trzech pierwszych wierszach (Rysunek 9): Rząd 1. P (oznacza, że następujące dane podano w ppm); Rząd 2. Częstotliwość sygnału do naświetlania w ppm, zmierzona w punkcie 3.1.1; wartość 3,40 ppm (częstotliwość znacznie oddalona od 1sygnały H związku, zatem naświetlanie tą częstotliwością nie wpływa na widma).</li>
		<li>Zapisz listę pod nową nazwą, a następnie wpisz fq2list w wierszu poleceń i wybierz listę, która została właśnie utworzona.</li>
		<li>Aby skupić eksperyment na analizowanych sygnałach, należy wprowadzić o1p i wybrać jako centrum eksperymentu przesunięcie chemiczne sygnału, który będzie naświetlany.</li>
		<li>Typ sw aby wybrać szerokość widma (w tym przypadku 1,46 ppm, lecz można wybrać dowolną inną szerokość widma). 
		UWAGA: Jeśli czas akwizycji uzyskany po zmianie szerokości widmowej jest zbyt długi (co spowoduje wprowadzenie większej ilości szumów do widm), można go skorygować, wpisując AQ aby zapewnić pożądaną rozdzielczość sygnału swobodnego zaniku indukcyjnego (FIDRES, w tym przypadku 0,25 Hz).</li>
		<li>Wybierz wartość opóźnienia relaksacyjnego między skanami D1Upewnij się, że wartość ta jest od 1 do 5 razy większa od wartości T1 najwolniej rozluźniających się proton 
		UWAGA: Ustawiliśmy czas na 40 s, co stanowi najdłuższy czas nasycenia (D20) w eksperymencie. W ten sposób we wszystkich eksperymentach zachowany zostanie ten sam całkowity czas „na skan” (czas opóźnienia + czas nasycenia + impulsy + czas akwizycji).</li>
		<li>Typ D1 i ustawić go na 40 s.</li>
		<li>Wprowadź pierwszą wartość czasu nasycenia, wpisując D20 oraz ustawiając go na 40 s. Wyznacz wzmocnienie odbiornika (rg) automatycznie poprzez wpisywanie rga.</li>
		<li>Utwórz kolejny eksperyment, wpisując iexpnoTyp D20 oraz wybierz czas nasycenia wynoszący 20 s w tym doświadczeniu. Wpisz rga, aby automatycznie określić rg.</li>
		<li>Powtórz ostatni krok dla D20 = 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3 s.</li>
		<li>Po utworzeniu wszystkich eksperymentów otwórz pierwszy z nich i wpisz wierszu poleceń multizg oraz określić liczbę eksperymentów, w tym przypadku 8 (t. j., multizg 8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie eksperymentu NMR SSTD
	<ol>
		<li>Otwórz PROCNO 1 (numer procesu) z EXPNO 1 (numer eksperymentu) z zestawu (tego z dłuższym czasem saturacji).</li>
		<li>W wierszu poleceń wpisz lb i ustaw wartość na 1,5. 
		UWAGA: W przypadku widm o bardzo wysokim stosunku sygnału do szumu wartość tę można zmniejszyć; przeciwnie, można ją zwiększyć dla eksperymentów z dużym poziomem szumów, o ile nie wpłynie to znacząco na rozdzielczość widmową.</li>
		<li>W wierszu poleceń wpisz efp oraz przetworzyć FID # = 1 (widmo „na rezonansie”) w PROCNO = 2 (Rycina 10).</li>
		<li>Popraw fazę eksperymentu, klikając w Interaktywna korekcja fazy przycisk i zapisz to jako eksperyment 2D. Zapisz i wyjdź (Rysunek 1).</li>
		<li>Typ powtórzenie 1 w wierszu poleceń, aby przejść do PROCNO 1.</li>
		<li>W wierszu poleceń wpisz efp oraz przetworzyć FID nr 2 (spektrum „poza rezonansem”) w PROCNO = 3 (Rycina 12).</li>
		<li>W wierszu poleceń wpisz .md a następnie powtórzenie 2 aby wyświetlić okno z wieloma widokami zawierające oba przetworzone widma: 2 (to z nasyconym sygnałem w środku) oraz 3 (to, w którym zastosowano pociąg impulsów nasycających przy 40 ppm) (Rycina 13).</li>
		<li>Kliknij przycisk z symbolem delta (Rycina 13) w celu obliczenia widm różnicowych i zapisania ich w PROCNO 4. Zamknij okno wielokrotnego wyświetlania.</li>
		<li>Wybierz zakres całkowania dla sygnału po lewej stronie (sygnału, w którym zostanie zaobserwowany transfer nasycenia wynikający z procesu wymiany chemicznej). Zawsze całkowaj ten sam obszar w PROCNO 3 i PROCNO 4. 
		UWAGA: Zakres całkowania zastosowany w tym eksperymencie wynosił 2,5–2,67 ppm.</li>
		<li>Po przeprowadzeniu integracji przejdź do karty „Integrals” w każdym z doświadczeń i skopiuj wartość „Integral [abs]” (Rysunek 14).</li>
		<li>Podziel całkę z PROCEDURY 4 przez całkę z PROCEDURY 3. Jest to wartość η.SSTD dla czasu nasycenia wynoszącego 40 s (ηSSTD =Spin Saturation Transfer Difference parametr).21</li>
		<li>Powtórz procedurę dla pozostałych doświadczeń z różnymi czasami nasycenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych30
<ol>
	<li>Analiza danych w celu wyznaczenia parametrów kinetycznych
	<ol>
		<li>Nanieś na wykres otrzymaną wartość ηSSTD wartości w funkcji czasu nasycania.21</li>
		<li>Wykonaj dopasowanie wykładnicze, aby dostosować otrzymane krzywe do równania 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej η_STD; wzór matematyczny; proces wykładniczego zaniku." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
		<img alt="δ odpowiada równaniu stałej dynamicznej." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"> 
		<img alt="wzór η_SSTD^MAX; optymalizacja wydajności; słowo kluczowe badania; zastosowanie symboli edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3">= <img alt="symbol η&lt;sub&gt;SSTD&lt;/sub&gt; dla analizy efektywności statycznej lub dynamicznej w równaniach naukowych." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 4"> przy bardzo długim czasie nasycenia 
		t = czas</li>
		<li>Oblicz wartości ηSSTDMAKS oraz δ i wykorzystaj je do obliczenia wartości stałych szybkości (k) oraz czasy relaksacji (T1A) zgodnie z następującymi równaniami: 
		<img alt="Maksymalna sprawność i wzór delta; równania; zastosowanie edukacyjne; analiza matematyczna." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 5"> 
		T1A = stała czasowa relaksacji podłużnej spinu A 
		k = stała szybkości kinetycznej wymiany miejsc wspólnych
		<ol>
			<li>Wyznaczyć stałą szybkości kinetycznej poprzez: <img alt="Równanie k = ηSSTD (MAX) · δ do analizy naukowej i badań." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 6"></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykres Eyringa w celu wyznaczenia parametrów termodynamicznych
	<ol>
		<li>Narysuj wykres ln(k/T) w funkcji 1/T (T = temperatura bezwzględna), z wykorzystaniem wartości stałych szybkości kinetycznej w różnych temperaturach.</li>
		<li>Wykonaj dopasowanie liniowe, aby dostosować uzyskane dane do równania Eyringa: 
		<img alt="równanie Arrheniusa, ln(k/T)=ln(kB/h)-ΔH‡/RT+ΔS‡/R, termodynamika, wzór kinetyczny." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 7"> 
		<img alt="Wzór na entalpię aktywacji, ΔH‡, w równaniu kinetyki chemicznej." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 8"> 
		<img alt="Entropia aktywacji, ΔS‡, symbol definicyjny, pojęcie termodynamiczne." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 9"> 
		<img alt="Równanie stałej Plancka, h=stała Plancka, fizyka kwantowa, koncepcja naukowa." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 10"> 
		R = stała gazowa 
		kB = stała Boltzmanna 
		T = temperatura bezwzględna</li>
		<li>Oblicz parametry termodynamiczne ΔH≠ i ΔS≠.</li>
		<li>Oblicz wartości dla EA(298) i ΔG≠(298) stosując następujące równania: 
		<img alt="Równanie energii aktywacji: \(E_A(298)=\Delta H^\ddagger+RT\), termodynamika, wzór." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
		<img alt="Równanie energii swobodnej Gibbsa w temperaturze 298 K, ΔG‡ = ΔH‡ - TΔS‡, wzór termodynamiczny." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 12"> 
		<img alt="Równanie energii aktywacji, \(E_{A(298)}\), temperatura 298 K, pojęcie kinetyki chemicznej." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 13"> 
		<img alt="Wzór stanu równowagi statycznej ΔG°(298) dla energii swobodnej Gibbsa w temperaturze 298 K, kluczowe pojęcie równania." src="/files/ftp_upload/54499/54499eq14.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 14"> 
		 </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bain, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Exchange+in+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nuc.+Mag.+Res.+Spect%22%5BJournal%5D)">Chemical Exchange in NMR.</a> Prog. Nuc. Mag. Res. Spect. 43, 63-103 (2003).</li>
<li>Bain, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Chemical Exchange.</a> Modern Magnetic Resonance. , 421-427 (2006).</li>
<li>Bain, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2+-+Chemical+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rep.+NMR+Spect%22%5BJournal%5D)">Chapter 2 - Chemical Exchange.</a> Ann. Rep. NMR Spect. 63, 23-48 (2008).</li>
<li>Reeves, L., Shaddick, R., Shaw, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+Studies+of+Multi-site+Chemical+Exchange.+III.+Hindered+Rotation+in+Dimethylacetamide%2C+Dimethyl+Trifluoro-acetamide%2C+and+Dimethyl+Benzamide%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance Studies of Multi-site Chemical Exchange. III. Hindered Rotation in Dimethylacetamide, Dimethyl Trifluoro-acetamide, and Dimethyl Benzamide.</a> Can. J. Chem. 49, 3683-3691 (1971).</li>
<li>Drakenberg, T., Dahlqvist, K., Forsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+to+Internal+Rotation+in+Amides.+IV.+N%2CN-Dimethylamides.+Substituent+and+Solvent+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Barrier to Internal Rotation in Amides. IV. N,N-Dimethylamides. Substituent and Solvent Effects.</a> J. Phys. Chem. 76, 2178-2183 (1972).</li>
<li>Fujiwara, F., Airoldi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-13+NMR+Study+of+the+Barrier+to+Internal+Rotation+of+N%2CN-Dimethylacetamide+in+the+Adduct+with+Antimony%28III%29+Chloride%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbon-13 NMR Study of the Barrier to Internal Rotation of N,N-Dimethylacetamide in the Adduct with Antimony(III) Chloride.</a> J. Phys. Chem. 88, 1640-1642 (1984).</li>
<li>Gutowsky, H. S., Holm, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+Processes+and+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectra.+II.+Hindered+Internal+Rotation+of+Amides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Rate Processes and Nuclear Magnetic Resonance Spectra. II. Hindered Internal Rotation of Amides.</a> J. Chem. Phys. 25, 1228-1234 (1956).</li>
<li>Forsen, S., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Method+for+the+Study+of+Moderately+Rapid+Chemical+Exchange+Rates+Employing+Nuclear+Magnetic+Double+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chem.+Scand%22%5BJournal%5D)">A New Method for the Study of Moderately Rapid Chemical Exchange Rates Employing Nuclear Magnetic Double Resonance.</a> Acta Chem. Scand. 17, 1787-1788 (1963).</li>
<li>Forsen, S., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Moderately+Rapid+Chemical+Exchange+Reactions+by+Means+of+Nuclear+Magnetic+Double+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Study of Moderately Rapid Chemical Exchange Reactions by Means of Nuclear Magnetic Double Resonance.</a> J. Chem. Phys. 39, 2892-2901 (1963).</li>
<li>Williams, T. J., Kershaw, A. D., Li, V., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inversion+Recovery+NMR+Kinetics+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Educ%22%5BJournal%5D)">An Inversion Recovery NMR Kinetics Experiment.</a> J. Chem. Educ. 88, 665-669 (2011).</li>
<li>Bain, A. D., Cramer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Chemical+Exchange+in+an+Eight-Coordinated+Bicentered+Ruthenium+Complex+Studied+by+One-Dimensional+Methods.+Data+Fitting+and+Error+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Res.%2C+Series+A%22%5BJournal%5D)">Slow Chemical Exchange in an Eight-Coordinated Bicentered Ruthenium Complex Studied by One-Dimensional Methods. Data Fitting and Error Analysis.</a> J. Magn. Res., Series A. 118, 21-27 (1996).</li>
<li>Sandstrom, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSandstrom%2C+J+%22Dynamic+NMR+Spectroscopy%22">Dynamic NMR Spectroscopy</a>. , Academic. New York. ISBN: 0126186200 9780126186208 (1982).</li>
<li>Castanar, L., Nolis, P., Virgili, A., Parella, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+T1%2FT2+Relaxation+Times+in+Overlapped+Regions+from+Homodecoupled+1H+Singlet+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Measurement of T1/T2 Relaxation Times in Overlapped Regions from Homodecoupled 1H Singlet Signals.</a> J. Magn. Reson. 244, 30-35 (2014).</li>
<li>Muñoz, M. P., de la Torre, M. C., Sierra, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Platinum-Catalysed+Dihydroalkoxylation+of+Allenes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Synth.+Catal%22%5BJournal%5D)">New Platinum-Catalysed Dihydroalkoxylation of Allenes.</a> Adv. Synth. Catal. 352, 2189-2194 (2010).</li>
<li>Muñoz, M. P., de la Torre, M. C., Sierra, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum-Catalysed+Bisindolylation+of+Allenes%3A+A+Complementary+Alternative+to+Gold+Catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Platinum-Catalysed Bisindolylation of Allenes: A Complementary Alternative to Gold Catalysis.</a> Chem. Eur. J. 18, 4499-4504 (2012).</li>
<li>Hurtado-Rodrigo, C., Hoehne, S., Muñoz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Gold-Catalysed+Azidation+of+Allenes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">A New Gold-Catalysed Azidation of Allenes.</a> Chem. Comm. 50, 1494-1496 (2014).</li>
<li>Vrieze, K., Volger, H. C., Gronert, M., Praat, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Rearrangements+in+Platinum--Tetramethylallene+Compounds+as+Influenced+by+Ligands+Trans+to+the+Allene+Group%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Organometal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Rearrangements in Platinum--Tetramethylallene Compounds as Influenced by Ligands Trans to the Allene Group.</a> J. Organometal. Chem. 16, 19-22 (1969).</li>
<li>Vrieze, K., Volger, H. C., Praat, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+of+Allenes+with+Platinum+%28II%29+and+Rhodium+%28I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Organometal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Complexes of Allenes with Platinum (II) and Rhodium (I).</a> J. Organometal. Chem. 21, 467-475 (1970).</li>
<li>Brown, T. J., Sugie, A., Leed, M. G. D., Widenhoefer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+Dynamic+Solution+Behavior+of+Cationic%2C+Two-Coordinate+Gold%28I%29-%CF%80-Allene+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Structures and Dynamic Solution Behavior of Cationic, Two-Coordinate Gold(I)-π-Allene Complexes.</a> Chem. Eur. J. 18, 6959-6971 (2012).</li>
<li>Yang, W., Hashmi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insights+into+the+Gold+Chemistry+of+Allenes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insights into the Gold Chemistry of Allenes.</a> Chem. Soc. Rev. 43, 2941-2955 (2014).</li>
<li>Quiros, M. T., Angulo, J., Munoz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Intramolecular+Chemical+Exchange+by+Initial+Growth+Rates+of+Spin+Saturation+Transfer+Difference+Experiments+%28SSTD+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Intramolecular Chemical Exchange by Initial Growth Rates of Spin Saturation Transfer Difference Experiments (SSTD NMR).</a> Chem. Commun. 51, 10222-10225 (2015).</li>
<li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ligand+Binding+by+Saturation+Transfer+Difference+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ligand Binding by Saturation Transfer Difference NMR Spectroscopy.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 38, 1784-1788 (1999).</li>
<li>Angulo, J., Nieto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STD-NMR%3A+Application+to+Transient+Interactions+Between+Biomolecules+-+A+Quantitative+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STD-NMR: Application to Transient Interactions Between Biomolecules - A Quantitative Approach.</a> Eur. Biophys. J. 40, 1357-1369 (2011).</li>
<li>Kemper, S., Patel, M. K., Errey, J. C., Davis, B. G., Jones, J. A., Claridge, T. D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+Epitope+Mapping+Considering+Relaxation+of+the+Ligand+%28GEM-CRL%29%3A+Including+Longitudinal+Relaxation+Rates+in+the+Analysis+of+Saturation+Transfer+Difference+%28STD%29+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Group Epitope Mapping Considering Relaxation of the Ligand (GEM-CRL): Including Longitudinal Relaxation Rates in the Analysis of Saturation Transfer Difference (STD) Experiments.</a> J. Magn. Reson. 203, 1-10 (2010).</li>
<li>TopSpin program. , Bruker Corp. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/</a> (2015).</li>
<li>Berger, S., Braun, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerger%2C+S+%22200+and+More+NMR+Experiments%3A+A+Practical+Course%22">200 and More NMR Experiments: A Practical Course</a>. , Wiley. ISBN. ISBN: 978-3-527-31067-8 (2004).</li>
<li>Cutting, B., Shelke, S. V., Dragic, Z., Wagner, B., Gathje, H., Kelm, S., Ernst, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+Enhancement+in+Saturation+Transfer+Difference+%28STD%29+Experiments+Through+Optimized+Excitation+Schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitivity Enhancement in Saturation Transfer Difference (STD) Experiments Through Optimized Excitation Schemes.</a> Magn Reson Chem. 45, 720-724 (2007).</li>
<li>Ley, N. B., Rowe, M. L., Williamson, R. A., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+Selective+Excitation+Pulses+To+Maximize+Saturation+Transfer+Difference+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Optimising Selective Excitation Pulses To Maximize Saturation Transfer Difference NMR Spectroscopy.</a> RSC Adv. 4, 7347-7351 (2014).</li>
<li>Antanasijevic, A., Ramirez, B., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Sensitivities+of+WaterLOGSY+and+Saturation+Transfer+Difference+NMR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Sensitivities of WaterLOGSY and Saturation Transfer Difference NMR Experiments.</a> J. Biomol. NMR. 60 (1), 37-44 (2014).</li>
<li>Origin 6.0 software. , OriginLab Corp. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://originlab.com">http://originlab.com</a> (2016).</li>
<li>Jarek, R. L., Flesher, R. J., Shin, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Internal+Rotation+of+N%2CN-Dimethylacetamide%3A+A+Spin-Saturation+Transfer+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ed%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Internal Rotation of N,N-Dimethylacetamide: A Spin-Saturation Transfer Experiment.</a> J. Chem. Ed. 74, 978-982 (1997).</li>
<li>Forsen, S., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+Rates+by+Nuclear+Magnetic+Multiple+Resonance.+III.+Exchange+Reactions+in+Systems+with+Several+Nonequivalent+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Exchange Rates by Nuclear Magnetic Multiple Resonance. III. Exchange Reactions in Systems with Several Nonequivalent Sites.</a> J. Chem. Phys. 40, 1189-1196 (1964).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jedną z bardziej oczywistych zalet tej metodologii jest to, że stałe szybkości i czas relaksacji dla danej temperatury można uzyskać za pomocą jednego zestawu eksperymentów, z solidną sekwencją impulsów (tą samą, która jest używana w eksperymentach STD do badania interakcji białko-ligand, która zwykle znajduje się w dostępnym zestawie eksperymentów producenta spektrometru). Upraszcza to konfigurację eksperymentalną, ponieważ nie ma potrzeby mierzenia T1 ani osiągania nasycenia w stanie ustalonym. Poza tym godne uwagi jest to, że metoda ta nie zależy od siły magnesu, jak metody koalescencyjne. Z drugiej strony głównym ograniczeniem jest to, że technika ta nie może być stosowana do procesów wymiany chemicznej zbyt szybko lub zbyt wolno, co zależałoby od zakresu temperatur maszyny NMR lub użytych rozpuszczalników.
Ta nowa technika obliczania parametrów kinetycznych może być stosowana do wielu różnych podłoży, a jej przydatność została już zademonstrowana na kilku interesujących cząsteczkach. 21 Parametry kinetyczne 4-N,N-dimetyloamido[2.2]paracyklofanu, trudnego substratu, w którym sygnał jednej z grup metylowych będących przedmiotem zainteresowania nakłada się na inne sygnały z cząsteczki, udało się obliczyć za pomocą SSTD NMR. Co ciekawe, metodologia ta może być stosowana tak długo, jak długo jeden z sygnałów badania jest wyizolowany. SSTD NMR jest również użytecznym protokołem do obliczania parametrów kinetycznych w cząsteczkach, w których temperatura koalescencji jest tak wysoka, że cząsteczka rozkłada się przed jej osiągnięciem. Tak jest w przypadku PtCl2(dimetyloanlen)(pirydyna), w którym metodyka została z powodzeniem zastosowana bez konieczności osiągania koalescencji. Wybór rozpuszczalników i temperatur ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników, ponieważ kursy wymiany substancji chemicznych mogą się znacznie różnić w zależności od tych parametrów. Ponadto, oprócz kryteriów w normalnym eksperymencie NMR, kluczowymi etapami w eksperymencie SSTD NMR są selektywność napromieniowania, a także kontrola temperatury. Oba czynniki muszą być precyzyjne, aby zagwarantować powodzenie eksperymentu.
Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki dotyczą kinetyki wewnątrzcząsteczkowej wymiany chemicznej, ale technika ta może być również stosowana do badania kinetyki międzycząsteczkowej wymiany chemicznej, a także wymiany ligandów, powszechnych procesów w dynamicznym zachowaniu kompleksów metali przejściowych. 
W końcu, pod warunkiem dokonania odpowiedniej modyfikacji równań,32 metoda ta może zostać rozszerzona o radzenie sobie z wymianą wielomiejscową i nierównymi populacjami, tak jak to miało miejsce w poprzednich eksperymentach z podwójnym rezonansem,8-9 zwiększając użyteczność tej techniki do badania procesów wymiany chemicznej w trudnych związkach.

Wymiana chemiczna zwykle odnosi się do dowolnego procesu międzycząsteczkowego lub wewnątrzcząsteczkowego, w którym jądro przemieszcza się z jednego środowiska do drugiego, w którym jego parametry NMR (przesunięcie chemiczne, sprzężenie skalarne, sprzężenie dipolarne, szybkość relaksacji) są różne. Istnieje wiele przykładów wymiany chemicznej w cząsteczkach organicznych i metaloorganicznych (np. bariery rotacyjne w biarylu, bariery odwracania pierścieni i równowaga konformacyjna, inwersja azotu, wiązanie ligandów, zdegenerowana wymiana ligandów i tautomeryzacja). 1-3 Chemiczny kurs wymiany jest związany z termodynamiką bariery procesu wymiany, dlatego jego badanie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki molekularnej tych układów.
Klasycznym znakiem dynamicznej wymiany w NMR jest dramatyczna zmiana kształtu linii sygnałów NMR wraz ze zmianą temperatury. W niskich temperaturach proces ten jest powolny i obserwuje się dwie wyraźne zmiany chemiczne. W wysokich temperaturach oba sygnały łączą się w jeden sygnał, który jest znany jako "koalescencja". W temperaturach pośrednich sygnały stają się bardzo szerokie. Ta wrażliwość widma NMR na wymianę chemiczną sprawia, że NMR jest bardzo skuteczną metodą badania dynamiki cząsteczek w roztworze. Do badania dynamicznych procesów zachodzących w roztworze zastosowano głównie dwie metody: analizę liniową4-7 oraz eksperymenty z przeniesieniem nasycenia spinowego. 8-9 Poza tym warto również wspomnieć o metodzie transferu inwersyjnego10 i programie CIFIT11 do bezpośredniego wyodrębniania stałych szybkości, które są stosunkowo skutecznym podejściem do pomiarów wymiany w prostych systemach. Chociaż metody te w większości przypadków dają bardzo dobre rezultaty, to jednak mają szereg wad. Główną wadą analizy kształtu linii są wysokie temperatury potrzebne do osiągnięcia koalescencji w niektórych próbkach. 12 Głównymi kwestiami, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania eksperymentów z transferem nasycenia spinu, są: bardzo długie czasy nasycenia wymagane do osiągnięcia transferu nasycenia w stanie ustalonym między miejscami wymiany oraz potrzeba wyznaczenia stałej czasu relaksacji podłużnej, T1, co może być trudne, jeśli w badanym regionie dochodzi do nakładania się różnych sygnałów. 13
W ramach naszych badań nad mechanizmami metaloorganicznymi,14-16 nasza grupa bada zachowanie topnikowe kompleksów platynowo-alen w roztworze. Jest to złożone zadanie, które obejmuje co najmniej trzy różne procesy, z których jednym jest wymiana π-powierzchnia lub obrót metalu wokół jednej z osi allenu. Zauważyliśmy, że normalne eksperymenty VT i techniki analizy kształtu linii, które były stosowane wcześniej w podobnych systemach, nie były odpowiednie w naszym badaniu, ze względu na bardzo powolną rotację w naszym kompleksie platynowo-allenowym, która sprawiała, że temperatura koalescencji sygnałów będących przedmiotem zainteresowania była wyższa niż temperatura rozkładu kompleksu.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy i niedawno ogłosiliśmy nowy protokół NMR (SSTD NMR) do badania procesów wzajemnej wymiany chemicznej. 20 Jak sama nazwa wskazuje, metoda ta łączy metodę transferu nasycenia spinowego stosowaną do małych cząsteczek z metodą NMR różnicy nasycenia stosowaną do badania oddziaływań białko-ligand,21-24 poprzez pomiar przejściowego transferu nasycenia spinem wzdłuż rosnących czasów nasycenia (krzywych narastania) w małych cząsteczkach podlegających wymianie chemicznej.
Dzięki tej nowej metodzie (SSTD NMR) pokazaliśmy, że możemy uzyskać parametry kinetyczne wewnątrzcząsteczkowej wymiany chemicznej w małych cząsteczkach organicznych i metaloorganicznych z pewnymi dodatkowymi zaletami w porównaniu z tradycyjnymi podejściami: koalescencja sygnałów nie jest potrzebna, więc bardziej elastyczny zakres temperatur może być użyty w badaniu; nakładanie się sygnałów nie zakłóca, chociaż co najmniej jeden z wymieniających się rezonansów powinien być odizolowany; nie ma potrzeby mierzenia T1 ani osiągania nasycenia w stanie ustalonym; Wartości stałej szybkości są mierzone bezpośrednio, a wartości T1 uzyskuje się w tym samym doświadczeniu, przy użyciu tylko jednego zestawu doświadczeń. Kolejną niezwykłą zaletą metodologii SSTD NMR jest to, że w przeciwieństwie do analizy kształtu linii, wyznaczenie stałych szybkości kinetyki nie jest ograniczone wzrostem temperatur koalescencji związanym z wysokimi polami magnetycznymi. W związku z tym nasza metodologia jest bardzo dobrze dostosowana zarówno do niskich, jak i wysokich pól magnetycznych. Ten artykuł ma na celu pomóc nowym użytkownikom zastosować tę nową metodę do ich własnych systemów poddanych wymianie chemicznej i opisuje przygotowanie próbki, konfigurację eksperymentalną, akwizycję danych oraz przykład przetwarzania i analizy danych w prostej cząsteczce organicznej.

<table><tbody><tr><td>N,N-dimetyloacetamid</td><td>Aldrich</td><td>38840</td><td>Toksyczność ostra</td></tr><tr><td>Toluen-d8</td><td>Fluorochem</td><td>D-005</td><td>Łatwopalny i toksyczny</td></tr><tr><td>500 MHz 7" Wybierz serię Lampy NMR</td><td>GPE LTD</td><td>S-5-500-7</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 2.1</td><td>Program TopSpin, Bruker Corp., http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/ (2015).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.0</td><td>Oprogramowanie Origin 6.0, OriginLab Corp., http://originlab.com.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 500 MHz wyposażony w 5-milimetrową sondę BBFOplus SmartProbe™ z gradientem Z</td><td>&nbsp; Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR 500 MHz Bruker Avance I 500 MHz wyposażony w sondę gradientu Z 5 mm TXI</td><td>&nbsp; Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne podkładki regulacyjne o standardowym otworze (5 mm)</td><td>&nbsp; Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td>H00804</td><td></td></tr></tbody></table>

różnica transferu nasycenia spinu nmr (sstd nmr): nowe narzędzie do uzyskiwania parametrów kinetycznych procesów wymiany chemicznej

Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

Ten szczegółowy protokół opisuje nowy protokół magnetycznego rezonansu jądrowego (SSTD NMR), niedawno opracowany w naszej grupie do badania procesów wzajemnej wymiany chemicznej, które są trudne do analizy tradycyjnymi metodami. Jak sama nazwa wskazuje, metoda ta łączy metodę transferu nasycenia spinowego stosowaną dla małych cząsteczek z metodą NMR różnicy nasycenia (STD) stosowaną do badania oddziaływań białko-ligand, poprzez pomiar przejściowego transferu nasycenia spinem wzdłuż rosnących czasów nasycenia (krzywych narastania) w małych cząsteczkach organicznych i metaloorganicznych podlegających wymianie chemicznej.
Zalety tej metody w stosunku do istniejących to: nie ma potrzeby osiągania koalescencji wymienianych sygnałów; metoda może być stosowana tak długo, jak długo jeden sygnał wymienianych miejsc jest odizolowany; nie ma potrzeby mierzenia T1 ani osiągania stanu ustalonego nasycenia; wartości stałe szybkości są mierzone bezpośrednio, a wartości T1 są uzyskiwane w tym samym eksperymencie, przy użyciu tylko jednego zestawu eksperymentów.
Aby przetestować tę metodę, zbadaliśmy dynamikę utrudnionej rotacji N,N-dimetyloamidów, dla których dostępnych jest wiele danych do porównania. Parametry termodynamiczne uzyskane za pomocą SSTD są bardzo zbliżone do raportowanych (techniki transferu spinowo-nasyconego i analiza liniowa). Metoda może być stosowana do bardziej wymagających podłoży, których nie można było zbadać wcześniejszymi metodami.
Przewidujemy, że prosta konfiguracja eksperymentalna i szerokie zastosowanie metody do wielu różnych substratów sprawi, że stanie się to powszechną techniką wśród chemików organicznych i metaloorganicznych bez rozległej wiedzy na temat NMR.

Szczegółowy protokół opisujący metodę SSTD NMR jest tutaj przedstawiony, aby pomóc nowym użytkownikom zastosować tę nową metodę do uzyskania parametrów kinetycznych ich własnych systemów podlegających wymianie chemicznej.

Różnica transferu nasycenia spinu NMR (SSTD NMR): Nowe narzędzie do uzyskiwania parametrów kinetycznych procesów wymiany chemicznej

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyznaczenie parametrów kinetycznych i procesów wzajemnej wymiany chemicznej w małych cząsteczkach organicznych i metaloorganicznych, które są trudne do zmierzenia za pomocą tradycyjnych metod. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu dynamiki cząsteczek organicznych i metaloorganicznych podlegających wymianie chemicznej, na przykład zmienności rotacyjnej, równowagi konformacyjnej, inwersji azotu, wymiany ligandów oraz tautomerii.Głównymi zaletami tej techniki są brak konieczności koalescencji sygnałów wymiany oraz możliwość uzyskania stałej szybkości i czasu relaksacji w ramach jednego eksperymentu. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania zachowania funkcjonalnego kompleksów jonów platyny w roztworze, kiedy zdaliśmy sobie sprawę, że techniki analizy przesunięć chemicznych w funkcji temperatury nie są odpowiednie. Wykorzystując nasze doświadczenie w badaniu oddziaływań białko-lignina metodą NMR, uznaliśmy, że podobne podejścia NMR mogą zostać zastosowane do badania procesów wymiany w cząsteczkach organicznych, co okazało się prawdą.Dodaj pięć miligramów nn dimetyloacetamidu do probówki NMR odpowiedniej do niskich temperatur i rozpuść w 0,6 ml deuterowanego toluenu. Aby przygotować eksperymenty SSTD NMR, najpierw wprowadź próbkę do magnesu. Jednym z kluczowych etapów wspomagających eksperyment NMR jest kontrola temperatury, dlatego należy upewnić się, że próbka stabilizowała się w wybranej temperaturze przez co najmniej 20 minut.Po umieszczeniu próbki w magnesie wpisz EDTE w wierszu poleceń. Zmień temperaturę na pierwszą wybraną wartość, aby przeprowadzić eksperyment. Pozostaw próbkę w celu stabilizacji w wybranej temperaturze przez co najmniej 20 minut.Przeprowadź jednowymiarowy eksperyment NMR protonów na próbce zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie utwórz nowy zestaw danych eksperymentu NMR protonów, klikając Plik, nowy i nadając nazwę nowemu eksperymentowi. W nowym zestawie danych wpisz RPAR w wierszu poleceń. Wybierz jeden z zestawów parametrów STDDIFF z listy.Aby wybrać sekwencję impulsów STDDIFF, kliknij przycisk z trzema kropkami w linii programu impulsów. Przed przeprowadzeniem eksperymentu SSTD NMR skalibruj twardy impuls protonowy o kącie 90 stopni P1. Wpisz polecenie pulsecal w linii komend i skopiuj wartość impulsu 90 stopni przy wyższej mocy, która jest impulsem o najkrótszym czasie trwania.Wprowadź wartości dla skalibrowanego twardego impulsu w eksperymencie za pomocą polecenia getprosol. Następnie ustaw długość impulsu ustawczego, wpisz P13 i wprowadź wartość 50 000 mikrosekund. Ustaw kształt impulsu selektywnego, przechodząc do sekcji power i klikając przycisk edit obok parametru shape, następnie przejdź do kształtu pulsed 13 i wybierz impuls Gaussa.Ustaw moc impulsu selektywnego SP13 na 50 decybeli. Wpisz NS i ustaw wartość na osiem, a następnie wpisz DS i ustaw wartość na cztery. Aby przeprowadzić eksperyment SSTD NMR, otwórz eksperyment protonowego NMR, aby sprawdzić położenie sygnału, który zostanie naświetlony.Aby to zrobić, wyszukaj eksperyment w przeglądarce oprogramowania, kliknij prawym przyciskiem myszy w zestawie danych i wybierz opcję wyświetl w nowym oknie. Selektywność naświetlania musi być precyzyjna, aby zagwarantować sukces eksperymentu. Upewnij się, że nie użyto żadnych środków korygujących, w przeciwnym razie częstotliwość naświetlania może zostać ustawiona nieprawidłowo.Przesuń linię kursora na środek sygnału, który ma zostać napromieniowany, i zapisz przesunięcie chemiczne w częściach na milion. Wybierz szerokość widma, która zostanie zastosowana w eksperymencie. W tym przypadku sygnał do napromieniowania znajduje się przy 2,17 częściach na milion, a zastosowana szerokość widma wynosi 1,46 części na milion.Następnie przejdź do wcześniej utworzonego eksperymentu SSTD NMR, stwórz listę częstotliwości naświetlania, wpisując FQ2LIST w linii komend i wybierając istniejącą listę. Edytuj listę częstotliwości naświetlania zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zapisz listę pod nową nazwą.Następnie wpisz FQ2LIST w wierszu poleceń i wybierz nowo utworzoną listę. Aby wycentrować eksperyment na badanym sygnale, wpisz O1P i wybierz przesunięcie chemiczne sygnału, który będzie naświetlany, jako centrum eksperymentu. Wpisz SW, aby wybrać szerokość widma.Wybierz wartość opóźnienia relaksacji między skanami D1. Upewnij się, że jest ona od jednej do pięciu razy większa od wartości T1 najwolniej relaksującego protonu. Wpisz D1 i ustaw wartość na 40 sekund. Ustaw pierwszą wartość czasu saturacji, wpisując D20 i ustawiając ją na 40 sekund.Wyznacz wzmocnienie odbiornika automatycznie, wpisując RGA. Utwórz kolejny eksperyment, wpisując IEXPNO. Wpisz D20 i wybierz czas saturacji wynoszący 20 sekund.Następnie wpisz RGA, aby automatycznie wyznaczyć RG. Powtórz ostatni krok dla wartości D20 równych 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 oraz 0,3 sekundy. Po utworzeniu wszystkich eksperymentów otwórz pierwszy z nich i w wierszu poleceń wpisz multizg, określając liczbę eksperymentów. Aby przetworzyć dane, otwórz proces numer jeden z zestawu eksperymentów z wyższym czasem nasycenia.W wierszu poleceń wpisz LB i ustaw wartość na 1.5. W wierszu poleceń wpisz EFP i ustaw numer FID na jeden oraz numer procesowy na dwa. Skoryguj fazę eksperymentu, klikając interaktywny przycisk korekcji fazy, a następnie zapisz go jako eksperyment 2G, po czym zapisz zmiany i wyjdź.Wpisz REP 1 w wierszu poleceń, aby przejść do procesu numer jeden. W wierszu poleceń wpisz EFP i ustaw numer procesu FID na 2, a numer procesu na 3. Następnie w wierszu poleceń wpisz point MD, a potem REP 2, aby wyświetlić okno wielokrotnego podglądu ze spektrami obu procesów 2 i 3.Kliknij przycisk z symbolem delta, aby obliczyć widma różnicowe i zapisać je w procesie numer cztery. Następnie zamknij okno wielokrotnego wyświetlania. Wybierz zakres całkowania z sygnału po lewej stronie.Zawsze integruj ten sam obszar w procesie numer trzy oraz procesie numer cztery. Po przeprowadzeniu integracji przejdź do karty całek w każdym z eksperymentów i skopiuj wartość bezwzględną całki. Powtórz tę procedurę dla pozostałych eksperymentów z różnymi typami nasycenia.Aby uzyskać parametry kinetyczne, należy najpierw wyodrębnić uzyskane wartości parametru SSTD w funkcji czasu nasycenia. Następnie należy kontynuować analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Utrudniona rotacja wokół wiązania amidowego powoduje rozszczepienie obu grup metylowych na dwa sygnały w widmach protonowego NMR.Nasycenie spinowe grupy metylowej przy 2,17 ppm prowadzi do zaniku jej sygnału w widmie 1H NMR. Po nasyceniu grupy metylowej B przy 2,17 ppm można zaobserwować przeniesienie nasycenia na grupę metylową A przy 2,16 ppm wskutek rotacji wewnętrznej, co objawia się spadkiem intensywności protonów w sygnale przy 2,61 ppm. Współczynnik parametru SSTD oblicza się, dzieląc wartość całki grupy metylowej A w widmie różnicowym przez wartość całki grupy metylowej A w widmie oryginalnym.Dla określonej temperatury wykres wartości parametru SSTD w funkcji czasu nasycenia przedstawiał krzywe wykładnicze. Dopasowanie tych krzywych pozwoliło wyznaczyć stałą szybkości oraz czas relaksacji protonu mierzonego sygnału. Wykresy parametru SSTD w funkcji czasu nasycenia w różnych temperaturach pozwoliły na uzyskanie odpowiadających im stałych szybkości i czasów relaksacji.Do obliczenia parametrów termodynamicznych wykorzystano równanie Eyringa. Wartości uzyskane za pomocą SSTD NMR wykazują doskonałą zgodność z danymi raportowanymi przy użyciu innych technik. Po opanowaniu metody, zestaw eksperymentów w danej temperaturze w celu wyznaczenia wartości stałej szybkości i czasu relaksacji można przeprowadzić w około trzy godziny, pod warunkiem właściwego wykonania procedury.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wybór rozpuszczalników i temperatur ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrych wyników, ponieważ szybkości wymiany chemicznej mogą znacząco różnić się w zależności od tych parametrów. Po zastosowaniu tej procedury można badać również inne procesy, takie jak kinetyczna miękka międzycząsteczkowa wymiana chemiczna oraz wymiana ligniny; ponadto metodę tę można rozszerzyć na wymianę wielocentrową i nierówne populacje, pod warunkiem wprowadzenia odpowiedniej modyfikacji równania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów różnicy transferu nasycenia spinowego oraz wykorzystania transferu namagnesowania do wyznaczania parametrów kinetycznych i termodynamicznych w cząsteczkach podlegających wymianie chemicznej. Prosimy pamiętać, że praca z odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przygotowywania próbek zgodnie z tą procedurą należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne i rękawiczki.

spin-saturation-transfer-difference-nmr-sstd-nmr-new-tool-to-obtain

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Protokół wykorzystujący ulepszoną metodę QM/MM do zbadania wpływu izotopowego na proces podwójnego transferu protonów w porficenie jest przedstawiony tutaj.

Wpływ izotopowy porficenu w procesie podwójnego transferu protonów badany metodą Enhanced QM/MM

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Przedstawiamy protokoły dla metodologii NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) oraz CONdensate DEtectioN za pomocą SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), które umożliwiają bezoznakową, ilościową charakterystykę kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych, ujawniając podział molekularny, dynamikę wymiany, hydratację kondensatu oraz strukturę kropli bez osadu czy oznakowania.

Wykorzystanie roztworu NMR do charakteryzacji kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych

Poznaj metodę SSTD NMR do pomiaru parametrów kinetycznych wymiany chemicznej w małych cząsteczkach organicznych i metaloorganicznych. Technika ta pozwala jednocześnie uzyskać stałą szybkości i czas relaksacji bez konieczności koalescencji sygnałów.

Różnica transferu nasycenia spinu NMR (SSTD NMR): Nowe narzędzie do uzyskiwania parametrów kinetycznych procesów wymiany chemicznej (Wideo) | JoVE Journal

Różnica transferu nasycenia spinu NMR (SSTD NMR): Nowe narzędzie do uzyskiwania parametrów kinetycznych procesów wymiany chemicznej

Przeglądaj więcej filmów