Obrazowanie chemotaksji sprzężonej z białkiem G i jej zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilowych komórkach HL60

Wizualne testy chemotaksji są niezbędne do lepszego zrozumienia, w jaki sposób komórki eukariotyczne kontrolują kierunkową migrację komórek za pośrednictwem chemoatraktantu. W tym miejscu opisujemy szczegółowe metody dla: 1) monitorowania w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości wielu testów chemotaksji oraz 2) jednoczesnej wizualizacji gradientu chemoatraktantu i czasoprzestrzennej dynamiki zdarzeń sygnalizacyjnych w neutrofilopodobnych komórkach HL60.

Ogólnym celem tego modelu jest umożliwienie jednoczesnego monitorowania wielu testów chemotaksji lub wizualizacji wielu zdarzeń sygnalizacyjnych pojedynczej komórki chemopodatkowej. Biolodzy komórkowi z Overdeck opracowali kilka różnych podejść do ilościowego określania zachowania komórek w chemotaksji. Do niedawna byliśmy w stanie odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chemotaksji, takie jak to, jak jednocześnie monitorować wiele testów chemotaksji.

Główną zaletą tej technologii jest zastosowanie zasady mikrofluidyki do generowania wysoce powtarzalnych i niezawodnych składników do wielu jednoczesnych testów chemotaksji z wysoką rozdzielczością w czasie rzeczywistym. Procedurę zademonstruje dr Xi Wen, doktor habilitowany z naszego laboratorium. Aby zmontować uchwyt, najpierw użyj dźwigni, aby ustawić podstawę w pozycji pionowej, tak aby dźwignie mogły przechylić się w kierunku użytkownika.

Następnie krótko pokryj powierzchnię 41-milimetrowego szkła 70% etanolem i użyj chusteczki, aby ostrożnie usunąć etanol. Włóż szklankę do podstawy uchwytu i umieść na niej szkiełko nakrywkowe o grubości 2 milimetrów z powłoką BSA. Następnie włóż mały O-ring do dolnej części obudowy wafla i zamontuj obudowę płytki w podstawie uchwytu, z eliptycznym otworem z tyłu instrumentu.

Pociągnij wewnętrzny poziom podstawy uchwytu do przodu do pozycji poziomej, aby zablokować obudowę wafla na miejscu. Użyj miotełki do kurzu, aby zdmuchnąć wszelkie zanieczyszczenia z wnętrza obudowy płytki. Następnie dodaj do obudowy 4 mililitry pożywki RPMI 1640, uzupełnionej o 0,1% BSA.

Teraz zamontuj chip urządzenia do analizy mobilności komórek z powłoką BSA w środku obudowy płytki tak, aby powierzchnia konstrukcyjna stykała się ze szkłem i ze znacznikiem pozycjonowania z tyłu. Dopasuj dwa występy na gumowej uszczelce do otworów, aby przymocować uszczelkę do dolnej części płytki clamp i zamontuj duży O-ring na górze obudowy płytki. Następnie zamontuj zacisk waflowy z otworem czujnika z tyłu i pociągnij zewnętrzną dźwignię podstawy obudowy do przodu do pozycji poziomej, aby zablokować zacisk płytki na miejscu.

Po zmontowaniu uchwytu umieść dolną część uchwytu na kasetonie, aby upewnić się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie zdejmij pokrywę, przenieś zespół na płytkę na górze urządzenia do analizy mobilności komórek i przymocuj blok czujnika do uchwytu. Aby przeprowadzić test mobilności komórek, najpierw zawieszamy zróżnicowane komórki HL60 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej BSA, a następnie dwa razy dziesięć do szóstych komórek na mililitr

Następnie podłącz urządzenie do analizy mobilności komórek do komputera w celu uzyskania obrazu i włącz oba urządzenia. Następnie otwórz oprogramowanie urządzenia do analizy mobilności komórek. Na panelu sterowania obrazem kamery użyj linii poziomych i pionowych, aby dostosować pozycję uchwytu w czasie rzeczywistym i wyśrodkuj urządzenie w panelu obrazu kamery.

Następnie wybierz Kanał pierwszy, aby przesunąć kamerę do wybranego kanału, i użyj opcji Przesuń w lewo od Przesuń w prawo, aby dostosować współrzędną X kamery, aby wyśrodkować pole widzenia w poziomie. Aby ustawić obraz w pionie do środka ekranu, obróć pokrętło pozycji na przednim panelu urządzenia do analizy mobilności komórek. Na panelu sterowania grzałki ustaw temperaturę uchwytu na 37 stopni Celsjusza, a temperaturę płyty na 39 stopni Celsjusza.

Aby kontrolować temperaturę za pomocą czujnika termicznego podłączonego do uchwytu, kliknij Ogrzewanie, aby rozpocząć ogrzewanie, a następnie Uchwyt. Na panelu strzelania wprowadź 15 sekund dla interwału i 30 minut dla czasu, aby ustawić odpowiednio interwały i czas trwania testu chemotaksji. Ze względów bezpieczeństwa wybierz opcję Grzejnik wyłączony na końcu pola strzelania.

Następnie zapisz plik, wprowadź szczegóły eksperymentu do panelu notatek i potwierdź, że urządzenie zostało wyśrodkowane we wszystkich kanałach. Teraz usuń cały bufor z uchwytu i osiem mikrolitrów buforu z trzeciej studzienki od góry pierwszego kanału. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć dwa mikrolitry komórek do drugiego dołka w tym samym kanale, jednocześnie monitorując ekran w czasie rzeczywistym, aby kontrolować liczbę komórek i przepływ podczas wstrzyknięcia.

Gdy komórki są wyrównane, natychmiast dodaj z powrotem osiem mikrolitrów buforu do studzienki i powtórz wstrzykiwanie komórek w kanałach od drugiego do szóstego, jak właśnie pokazano. Po dodaniu wszystkich komórek dodaj dwa mililitry buforu z powrotem do uchwytu i dodaj jeden mikrolitr chemoatraktantu do trzeciej studzienki od góry w odpowiednich kanałach. Na koniec rozpocznij akwizycję obrazu.

W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki HL60 rozpoczynają chemotaksację prostą ścieżką natychmiast po wstrzyknięciu chemoatraktantu i kontynuują przez całe 60 minut testu, zgodnie z wynikami symulacji stabilności gradientu. Śledzenie ścieżki podróży i morfologii komórek umożliwia ilościowy pomiar, a następnie porównanie zachowań chemotaksji przy użyciu wskaźnika chemotaksji, który obejmuje całkowitą długość ścieżki, kierunkowość, prędkość i okrągłość komórek. Zastosowanie barwnika fluorescencyjnego w połączeniu z chemoatraktantem pozwala na ustalenie liniowej zależności pomiędzy stężeniem chemoatraktantu, a monitorowaną intensywnością barwnika fluorescencyjnego.

Ponadto, w odpowiedzi na równomiernie zastosowaną stymulację chemoatraktantem, komórki HL60 pośredniczą w silnej translokacji błonowej kinazy białkowej taktu GFP D1.In gradientu chemoatraktantu, komórki HL60 aktywnie rekrutują kinazę do tyłu krawędzi natarcia. Po opanowaniu proces ten można zakończyć w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ściśle przestrzegać instrukcji producenta dotyczących montażu uchwytu i monitorować wstrzykiwanie ogniw.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chemotaksją do zbadania możliwości wielu testów chemotaksji, takich jak monogenizm dictyostilium lub inne typy systemów komórkowych ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak złożyć urządzenie, wykonać jednoczesne testy chemotaksji lub jednocześnie wizualizować wiele zdarzeń sygnalizacyjnych w komórkach chemopodatkowych.