Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie elektrofizjologicznej analizy pojedynczych komórek z określonej populacji neuronów sensorycznych w ostrych skrawkach tkankowych narządu vomeronasal myszy. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu kluczowych pytań w dziedzinie chemosensoryki, takich jak mechanizmy detekcji substancji chemicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki rejestracji aktywności neuronów sensorycznych w ostrych skrawkach tkankowych, komórki te mogą być badane w ich naturalnym środowisku.

Aby rozpocząć tę procedurę, po uśmierceniu zwierzęcia należy usunąć jego dolną szczękę, wprowadzając duże nożyce chirurgiczne przez jamę ustną i przecinając osobno kości żuchwy oraz mięśnie po każdej stronie. Następnie za pomocą pęsety średniej należy usunąć skórę górnej szczęki oraz okolic czubka nosa, aby uzyskać lepszy dostęp do siekaczy. Po tym użyć nożyc do kości, aby odciąć największą część siekaczy pod kątem 45 stopni w kierunku rostralnym, co ułatwi usunięcie torebki VNO z jamy nosowej.

Nie należy przecinać korzenia zęba, aby uniknąć uszkodzenia końcówki torebki VNO. Następnie chwyć sztywną część podniebienia twardego w jego części rostralnej za pomocą pęsety średniej i ostrożnie odwarstw ją w jednym kawałku pod płaskim kątem. Wielokrotnie przemyj jamę nosową lodowatym roztworem S2. Następnie użyj mikro-nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wysięk kostny między końcówką kości lemurskiej a żuchwą.

Wprowadź końcówki nożyczek tak, aby zakrzywiona część była skierowana w stronę przeciwną do VNO. Następnie ostrożnie przetnij kość małymi krokami po obu stronach, po lewej i prawej stronie, bocznie w stosunku do torebki VNO. Aby usunąć torebkę VNO, przetnij kość lemiesza w części ogonowej i ostrożnie wyjmij kość lemiesza z jamy nosowej za pomocą pęsety średniej.

Natychmiast przenieś VNO do małej szalki Petriego pod mikroskopem stereoskopowym na żelowym wkładzie chłodzącym, gdzie należy przeprowadzić pozostałe etapy sekcji. Następnie przepłucz VNO niewielką ilością lodowatego S2, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Potem, chwytając tył kości lemieszowej za pomocą pęsety średniej, oddziel torebki chrzęstne zawierające tkanki miękkie VNO.

W tym celu ustaw kapsułę w widoku grzbietowym, tak aby widoczny stał się podział między oba VNO. Za pomocą końcówki precyzyjnej pęsety oddziel obie chrzęstne kapsuły VNO od centralnej kości, utrzymując kość lemieszową unieruchomioną szpilką w tylnej części. Upewnij się, że przyśrodkowa ściana chrzęstna, która była wcześniej przytwierdzona do kości lemieszowej, została usunięta.

Podczas usuwania chrząstki wokół VNO należy używać pęsety wyłącznie na krawędzi torebki chrzęstnej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić delikatnego nabłonka sensorycznego. Aby usunąć pozostałą chrząstkę, należy obrócić VNO tak, aby jego zakrzywiona strona boczna znajdowała się na dnie naczynia, a następnie pewnie przytrzymać chrząstkę z jednej strony za pomocą pęsety.

Następnie ostrożnie przesuń drugą pęsetę precyzyjną od strony tylnej pod bardzo płaskim kątem między chrząstką a VNO, aby poluzować połączenie między tkanką a chrząstką. Aby uniknąć uszkodzenia nabłonka sensorycznego, powoli oddziel VNO od chrząstki, trzymając go za końcówkę guzową. Po podważeniu VNO z torebki, usuń wszystkie pozostałe małe fragmenty chrząstki, ponieważ jakiekolwiek pozostałe kawałki chrząstki spowodują oddzielenie się tkanki od otaczającej agarozy podczas procesu krojenia.

Następnie nanieś małą kroplę schłodzonego do temperatury lodowej roztworu S2 na pierwszy wypreparowany VNO, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki. W celu zatopienia VNO, napełnij obie małe szalki Petriego stopionym agarem S3 aż po brzegi. Po tym zanurz każdy VNO w agarozie i przemieszczaj go poziomo kilka razy w przód i w tył, aby usunąć warstwę roztworu zewnątrzkomórkowego oraz wszelkie pęcherzyki powietrza z jego powierzchni. Ustaw VNO pionowo, tak aby koniec rostralny był skierowany w stronę dna szalki.

Następnie umieść obie szalki na wkładzie chłodzącym z żelem i poczekaj, aż agaroza stężeje. Nie zmieniaj orientacji VNO po rozpoczęciu krzepnięcia agarozy, ponieważ spowoduje to oddzielenie tkanki od otaczającej ją agarozy. W tej procedurze użyj małej szpatułki, aby przenieść blok agarozy z małej szalki do pokrywy dużej szalki Petriego, a następnie odwróć agarozę do góry nogami, tak aby rostralny koniec VNO był skierowany ku górze.

Następnie, używając skalpela chirurgicznego, dociąć blok do kształtu piramidy, uważając, aby nie uszkodzić zatopionej tkanki. Następnie za pomocą superkleju przytwierdzić blok w kształcie piramidy do środka płytki na próbki w wibrotomie. Odczekać około jednej minuty, aż klej całkowicie wyschnie.

Przetnij preparat na sekcje o grubości od 150 do 200 mikrometrów. Krótko obejrzy morfologię skrawka pod mikroskopem dissectingowym. Następnie przenieś wszystkie sekcje do komory natleniającej do momentu użycia.

W tym kroku przenieś wycinek VNO do komory obrazowania i utrwal jego położenie, używając stalowych kotwic przymocowanych syntetycznymi włóknami o grubości 0,1 mm. Nie przykrywaj wycinka tkanki żadną z nici syntetycznych włókien. Następnie przenieś komorę obrazowania do zestawu rejestracyjnego i stale perfunduj wycinek natlenionym roztworem S2 w temperaturze pokojowej.

Ustaw kapilarę ssącą na powierzchni roztworu, aby zapewnić stałą wymianę roztworu w komorze. Następnie ustaw ośmiokanałowy pisak do perfuzji nad nieczuciową częścią skrawka VNO zawierającą naczynie krwionośne i w bliskiej odległości od niej. Po tym czasie połącz elektrodę odniesienia z roztworem w komorze, używając L-kształtnego mostka agarowego wypełnionego 150 mM chlorkiem potasu.

Następnie napełnij pipetę patch odpowiednim roztworem S4. Zamocuj pipetę nad elektrodą powleczoną chlorkiem srebra, podłączoną do wzmacniacza przedwzmacniacza, uważając, aby nie zetrzeć powłoki, i przytwierdź ją mocno. Przed wprowadzeniem do kąpieli przyłóż do pipety patch niewielkie nadciśnienie. Monitoruj pipetę i upewnij się, że jej oporność wynosi od 4 MΩ do 10 MΩ.

Wizualizuj przekrój VNO za pomocą kamery CCD, stosując zoptymalizowany dla podczerwieni kontrast DIC, a następnie zidentyfikuj komórki wykazujące ekspresję FPR-rs3 i-Venus lub analogicznie znakowane neurony, wykorzystując oświetlenie fluorescencyjne i odpowiednią kostkę filtrującą. Przybliż się do ciała komórki, korzystając z pokręteł ręcznych, aby uzyskać maksymalną czułość. Ze względu na nadciśnienie, niewielkie wgniecenie błony somy komórki stanie się widoczne, gdy końcówka pipety znajdzie się w bezpośrednim sąsiedztwie.

Następnie zwolnij ciśnienie dodatnie i zastosuj lekkie ciśnienie ujemne, aby wciągnąć błonę komórkową w celu uzyskania szczelności o wysokiej oporności od 1 do 20 gigaohms. Następnie zastosuj krótkie i delikatne ssanie, aby przerwać ciągłość błony komórkowej i ustanowić konfigurację whole cell. Na tej rycinie obraz konfokalny koronalnego skrawka tkanki VNO pokazuje rozmieszczenie fluorescencyjnych neuronów FPR-rs3 Tau Venus positive w nabłonku sensorycznym narządu Jacobsona.

Neurony FPR-rs3 Tau Venus dodatnie wykazują pojedyncze dendryty apikalne kończące się strukturą przypominającą guzek przy brzegu luminalnym. Przedstawiono tutaj rejestracje metodą patch clamp z całej komórki wykonane z somy VSN. Poniżej znajdują się reprezentatywne przebiegi z rejestracji patch clamp z całej komórki dla szybkooktywującego prądu sodowego wrażliwego na TTX w VSN dodatnich dla FPR-rs3.

Rejestracje skokowe napięcia w warunkach kontrolnych wykazują szybki i przejściowy prąd wewnątrzkomórkowy zależny od napięcia. Traktowanie TTX w stężeniu 1 µM znacznie zmniejsza ten prąd. Przedstawiony tutaj cyfrowo odjęty ślad ujawnia wrażliwy na TTX napięciowo zależny prąd sodowy.

Reprezentatywne zapisy w trybie clampy prądowej pokazują depolaryzację i hiperpolaryzację oraz serie potencjałów czynnościowych generowanych po skokowym wstrzyknięciu prądu dodatniego i ujemnego. Po opanowaniu techniki, cały proces sekcji i krojenia tkanek dla obu VNO może zostać wykonany w ciągu około jednej godziny. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak pozakomórkowe rejestracje metodą loose-patch lub obrazowanie wapnia, aby zwiększyć przepustowość podczas analizy większych populacji neuronów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przygotowywania ostrych przekrojów tkankowych narządu Jacobsona (vomeronasal organ) oraz sposobu przeprowadzania jednokomórkowych pomiarów elektrofizjologicznych z neuronów sensorycznych narządu Jacobsona.