Name: Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę patch-clamp do analizy fizjologicznej neuronów czuciowych w ostrych wycinkach mysiego narządu lemieszowo-nosowego. Technika ta pozwala badać mechanizmy chemorecepcji w natywnym środowisku komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Ivanowi Rodriguezowi i Benoit von der Weidowi za stworzenie linii myszy FPR-rs3-i-venus, ich konstruktywną krytykę i owocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana z grantów Fundacji Volkswagena (I/83533), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) oraz z Inicjatywy Doskonałości rządu federalnego i krajów związkowych Niemiec. MS jest profesorem Fundacji Volkswagena w Lichtenbergu.

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z lokalnymi i europejskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych (Dyrektywa 86/609/EWG) oraz z zaleceniami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Zarówno myszy C57BL/6, jak i myszy Fpr-rs3-i-Venus trzymano w grupach obu płci w temperaturze pokojowej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum. Do eksperymentów wykorzystano młodych dorosłych (6-20 tygodni) obu płci. Nie zaobserwowano oczywistych różnic zależnych od płci.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy S1: 4-(2-hydroksy-etylo)piperazyno-1-etanosulfonowy roztwór (HEPES) buforowany roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający (w mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (skorygowane NaOH); osmolarność = 300 mOsm (skorygowana glukozą).</li>
	<li>Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy S2: Natleniony karbogenem (95% O2, 5% CO2 ) roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający (w mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3,5 KCl, 1 CaCl2, 1MgSO4, 5 BES; pH = 7,3; osmolarność = 300 mOsm (skorygowana glukozą).</li>
	<li>Przygotować 4% roztwór agarozy o niskiej temperaturze żelowania (S3) do zatapiania w tkankach: 4% agaroza o niskiej temperaturze żelowania. Rozpuścić 2 g agarozy o niskiej żelacji w 50 ml S1 w szklanej butelce laboratoryjnej o pojemności 100 ml razem z mieszadłem magnetycznym. Aby stopić agarozę, należy umieścić butelkę w łaźni wodnej (z nieszczelnie zamkniętą pokrywką) w temperaturze 70 °C na około 20 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się przezroczysty, mieszając. Ostudzić i przechowywać rozpuszczoną agarozę w drugiej łaźni wodnej w temperaturze 42 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy S4: Roztwór pipetowany zawierający (w mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (wolny Ca2+ = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP; pH = 7,1 (skorygowany KOH); osmolarność = 290 mOsm.</li>
	<li>Modyfikować/dostosowywać skład S1, S2 i S4 zgodnie z indywidualnym planem doświadczalnym (np. blokery farmakologiczne w celu wyizolowania niektórych rodzajów prądów aktywowanych napięciem).</li>
</ol>
2. Przygotowanie miejsca pracy
<ol>
	<li>Napełnij komorę do przechowywania plastrów natleniających S2 co najmniej 30 minut przed rozbieraniem, umieść na lodzie w celu dostosowania temperatury i pH i stale natleniaj roztwór.</li>
	<li>Napełnij zbiornik do superfuzji plastrowej w konfiguracji nagrywania za pomocą S2 i natleniaj w sposób ciągły.</li>
	<li>Przed preparacją napełnij komorę wibratomu S2 i ułóż pokruszony lód wokół komory. Alternatywnie, przenieś zapasowy lodowaty roztwór natleniony z komory natleniającej do komory wibratomu i kontynuuj ciągłe natlenianie.</li>
	<li>Ułóż narzędzia chirurgiczne i materiały eksploatacyjne.</li>
	<li>Umieść okład z żelem lodowym pod mikroskopem preparacyjnym, przykryj ręcznikiem papierowym, aby zapobiec zamarzaniu tkanki VNO na dnie naczynia.</li>
	<li>Wyczyść żyletkę, krótko spłukując ją w 70% etanolu i wodzie destylowanej, a następnie zamontuj na wibratomie. Wymień przy każdej sesji krojenia.</li>
</ol>
3. Sekcja i osadzanie VNO
<ol>
	<li>Uśmierc zwierzę przez krótką ekspozycję na CO2 i odetnij głowę ostrymi nożyczkami chirurgicznymi. Uwaga: Ponieważ czas od złożenia zwierzęcia w ofierze do umieszczenia kapsuły VNO na lodzie jest krytyczny, należy zminimalizować czas do mniej niż 2 minut. Aby utrzymać żywotność tkanek, należy zanurzyć oba w pełni wypreparowane VNO w agarozie w czasie krótszym niż 30 minut.</li>
	<li>Usuń dolną szczękę dużymi nożyczkami chirurgicznymi. Wejdź przez jamę ustną i przetnij osobno kości żuchwy i mięśnie z każdej strony.</li>
	<li>Pozostałą część głowy umieść do góry nogami na dużej szalce Petriego.</li>
	<li>Odciągnij skórę górnej szczęki i wokół czubka nosa średnimi kleszczami, aby uzyskać lepszy dostęp do siekaczy.</li>
	<li>Użyj nożyczek do kości, aby odciąć największą część siekaczy pod kątem ~45° w kierunku rostralnym (ryc. 1A). Ułatwi to wyjęcie kapsułki VNO z jamy nosowej. 
	Uwaga: Nie ciąć do korzenia zęba, aby zapobiec uszkodzeniu końcówki kapsułki VNO.</li>
	<li>Chwyć sztywne górne podniebienie za jego rostralną część za pomocą średnich kleszczy i ostrożnie oderwij z powrotem w jednym kawałku pod płaskim kątem (ryc. 1B). 
	Uwaga: Kilkakrotnie spłukać lodowatym S2.</li>
	<li>Użyj nożyczek z mikrosprężyną, aby przeciąć zespolenie kostne między czubkiem kości lemieszowej a szczęką. Włóż końcówki nożyczek tak, aby zakrzywiona część końcówki była skierowana na zewnątrz od VNO i ostrożnie przeciąć kość małymi krokami zarówno po lewej, jak i prawej stronie po stronie kapsuły VNO.</li>
	<li>Aby usunąć kapsułkę VNO, za pomocą mikronożyczek sprężynowych przeciąć kość lemieszową w części ogonowej i ostrożnie wyjąć kość lemieszową z jamy nosowej za pomocą średnich kleszczy. Natychmiast przenieś VNO na małą szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym na opakowaniu z żelu lodowego, gdzie zostaną wykonane pozostałe etapy sekcji.</li>
	<li>Opłucz VNO w niewielkiej ilości lodowatego S2, aby zapobiec wyschnięciu chusteczki.</li>
	<li>Oddziel chrzęstne kapsułki, które zawierają tkanki miękkie VNO, chwytając tylną część kości lemieszowej średnimi kleszczami. Ustaw kapsułę tak, aby uzyskać widok grzbietowy, tak aby widoczna była przerwa między oboma VNO (Rysunek 1Di).</li>
	<li>Użyj końcówki cienkich kleszczy, aby oddzielić obie chrzęstne kapsułki VNO od kości środkowej, jednocześnie utrzymując kość lemieszową przygwożdżoną w tylnej części. 
	Uwaga: Używaj kleszczyków tylko na brzegu torebki chrzęstnej i bardzo uważaj, aby nie przebić chrząstki, ponieważ delikatny nabłonek czuciowy łatwo ulega uszkodzeniu.</li>
	<li>Po rozdzieleniu dwóch VNO zacznij usuwać chrząstkę otaczającą pierwszy VNO.</li>
	<li>Chwyć górną krawędź kapsułki jednym cienkim kleszkiem i odłup ścianę chrząstki, która wcześniej była przymocowana do kości lemieszowej (strona przyśrodkowa).</li>
	<li>Aby usunąć pozostałą chrząstkę, obróć VNO zakrzywioną boczną stroną do dna naczynia i bezpiecznie przyciśnij chrząstkę z jednej strony za pomocą kleszczy. Ostrożnie przesuń drugie cienkie kleszcze od tyłu pod bardzo płaskim kątem między chrząstką a VNO, aby poluzować połączenie między tkanką a chrząstką.</li>
	<li>Powoli odklej VNO od chrząstki, trzymając ją za końcówkę ogonową, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego.</li>
	<li>Po wyjęciu VNO z kapsułki należy usunąć wszystkie pozostałe małe części chrząstki, ponieważ wszelkie pozostałe kawałki chrząstki oderwą tkankę od otaczającej agarozy podczas procesu krojenia.</li>
	<li>Umieść małą kroplę lodowatego S2 na pierwszym wypreparowanym VNO, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki. Duże naczynie krwionośne po bocznej stronie stanie się widoczne, co wskazuje, że narząd jest nadal nienaruszony i nie został poważnie uszkodzony podczas sekcji (ryc. 2Aii). W przypadku, gdy naczynie krwionośne zostanie uszkodzone, nadal warto będzie kontynuować krojenie VNO, o ile ogólna morfologia nie została wyraźnie naruszona.</li>
	<li>Natychmiast przeanalizuj drugi VNO.</li>
	<li>Aby osadzić VNO, należy napełnić obie małe szalki Petriego aż do brzegu stopionym S3 (przechowywanym w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C; patrz 1.3).</li>
	<li>Przytrzymaj VNO na szerszym końcu ogonowym za pomocą cienkich kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego.</li>
	<li>Zanurz VNO w agarozie i kilkakrotnie przesuń go poziomo do przodu iz powrotem, aby usunąć film roztworu zewnątrzkomórkowego, a także wszelkie pęcherzyki powietrza z jego powierzchni.</li>
	<li>Ustaw VNO pionowo z końcówką ogonową skierowaną w stronę dna naczynia. Zamiast ściskać VNO bezpośrednio kleszczami, dostosuj orientację, przesuwając końcówkę kleszczy w bliskiej odległości od VNO. 
	Uwaga: Orientacja podczas osadzania jest kluczowa, ponieważ określa płaszczyznę przekroju i dostępność dla neuronów czuciowych podczas eksperymentu.</li>
	<li>Umieść naczynia na żelowym woreczku z lodu i poczekaj, aż agaroza stężeje. 
	Uwaga: Nie zmieniaj orientacji VNO, gdy agaroza zacznie krzepnąć, ponieważ spowoduje to oderwanie tkanki od otaczającej agarozy.</li>
</ol>
4. Krojenie tkanek koronalnych VNO
<ol>
	<li>Użyj małej szpatułki, aby usunąć blok agarozy z małego naczynia do pokrywki dużej szalki Petriego, odwróć agarozę do góry nogami, pozostawiając ogonowy koniec VNO skierowany do góry.</li>
	<li>Pokrój blok w kształt piramidy za pomocą skalpela chirurgicznego (3-4 mm na końcu, 8-10 mm na dole). Uważaj, aby nie uszkodzić osadzonej tkanki.</li>
	<li>Użyj super kleju, aby przymocować blok w kształcie piramidy do środka płytki próbki wibratomu i poczekaj ~ 1 minutę, aż klej całkowicie wyschnie.</li>
	<li>Przenieść płytkę z próbką do komory krojenia i odpowiednio przygotować drugi VNO. Przechowywać płytkę z drugą próbką w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Użyj mikrotomu z wibrującymi ostrzami o następujących ustawieniach: grubość: 150-200 μm; prędkość: 3,5 a.u. = 0,15 mm/s; częstotliwość: 7,5 a.u. = 75 Hz. Przenieś plastry do komory natleniającej do czasu użycia po krótkim sprawdzeniu morfologii plastrów pod mikroskopem preparacyjnym. Plastry można przechowywać przez kilka godzin.</li>
</ol>
5. Jednokomórkowe zapisy elektrofizjologiczne
<ol>
	<li>Do nagrań należy używać pionowego mikroskopu stałopozycyjnego wyposażonego w obiektywy zanurzeniowe w wodzie, Dodt lub kontrast różnicowy w podczerwieni (IR-DIC) i epi-fluorescencję, a także chłodzoną kamerę CCD. Do akwizycji danych należy użyć wzmacniacza patch-clamp, stopnia głównego, karty interfejsu AD/DA i komputera PC (w tym oprogramowania do nagrywania).</li>
	<li>Przygotuj zapas 10-20 pipet z wsadkami (4-7 MΩ). Wyciągnąć pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego (1,50 mm OD/0,86 mm ID) za pomocą ściągacza do mikropipet i wypolerować ogniowo za pomocą microforge. 
	Uwaga: Polerowanie ogniowe końcówek pipet ma kluczowe znaczenie podczas łatania raczej małych VSN. Pomoże to zapobiec pękaniu błony komórkowej podczas stosowania podciśnienia w celu uzyskania uszczelnienia o wysokiej wytrzymałości. Po wypolerowaniu otwór pipety powinien wynosić około 1 μm.</li>
	<li>Pipety należy przechowywać w pojemniku do przechowywania pipet, aby zapobiec uszkodzeniom i gromadzeniu się kurzu do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj system perfuzyjny, napełniając zbiorniki roztworu i rurki zgodnie z projektem eksperymentalnym. 
	Uwaga: Całkowicie usuń pęcherzyki powietrza z przewodów, ponieważ będą one silnie zakłócać zapisy elektrofizjologiczne.</li>
	<li>Dostosuj ciśnienie, aby osiągnąć przepływ ~3 ml / min. 
	Uwaga: Wysokie ciśnienie spowoduje ruch wycinka tkanki, a także zakończenie zapisów elektrofizjologicznych.</li>
	<li>Przenieś plasterek VNO do komory obrazowania i ustal pozycję plastra za pomocą kotwy ze stali nierdzewnej okablowanej włóknami syntetycznymi o grubości 0,1 mm (Rysunek 2B-C). 
	Uwaga: Nie przykrywaj plastra tkanki jedną z nici z włókien syntetycznych, ale raczej agarozą otaczającą plasterek.</li>
	<li>Przenieś komorę obrazowania do zestawu rejestrującego i w sposób ciągły przetapiaj plaster z natlenionym S2 w temperaturze pokojowej za pomocą aplikacji kąpielowej.</li>
	<li>Dopasuj kapilę ssącą do powierzchni roztworu, aby uzyskać powolne ssanie w celu ciągłej wymiany roztworu kąpieli. Wyreguluj wielolufowy "ołówek perfuzyjny" 8 w 1 powyżej i blisko nieczuciowej części wycinka VNO, który zawiera naczynie krwionośne (Rysunek 2C, 3A)50. Korzystne będzie ustawienie ołówka perfuzyjnego i pipety rejestrującej tak, aby były skierowane w stronę plasterka z przeciwnych kierunków.</li>
	<li>Połączyć elektrodę referencyjną i roztwór do kąpieli za pomocą mostka agarowego w kształcie litery L (wypełnionego 150 mM KCl).</li>
	<li>Napełnij pipetę z plastrem roztworem pipety S4.</li>
	<li>Zamontuj pipetę na elektrodzie krosowej pokrytej chlorkiem srebra podłączonej do stopnia głowicy bez zeskrobywania powłoki i mocno zamocuj.</li>
	<li>Przed wejściem do kąpieli należy zastosować lekkie nadciśnienie (około 1 ml na plastikowej strzykawce o pojemności 10 ml) w pipecie z plastrem.</li>
	<li>Opuść pipetę do kąpieli za pomocą mikromanipulatorów na tyle daleko, aby móc zanurzyć obiektyw bez uderzania w niego (Rysunek 2D).</li>
	<li>Monitorowanie rezystancji pipet (R, w zakresie 4-7 MΩ) za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii podłączonego do stopnia głowicy. 
	Uwaga: Jeśli R wynosi <4 MΩ, szklana końcówka jest pęknięta. Jeśli R wynosi >10 MΩ, końcówka jest najprawdopodobniej zatkana i pipetę należy wymienić.</li>
	<li>Wizualizuj wycinek VNO za pomocą kamery CCD, wykorzystując zoptymalizowany pod kątem podczerwieni różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) i zidentyfikuj komórki eksprymujące FPR-rs3-i-Venus (lub podobnie oznakowane neurony) za pomocą oświetlenia fluorescencyjnego i odpowiedniej kostki filtrującej.</li>
	<li>Skoncentruj się i celuj w ogniwa fluorescencyjne lub niefluorescencyjne w zależności od projektu eksperymentalnego.</li>
	<li>Aby zbliżyć się do korpusu komórki, użyj pokręteł ręcznych, aby uzyskać maksymalną czułość. Ze względu na nadciśnienie niewielkie wgniecenie w błonie soma komórkowej staje się widoczne, gdy końcówka pipety znajdzie się w bliskiej odległości.</li>
	<li>Zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby zassać błonę komórkową w celu uzyskania uszczelnienia o wysokiej rezystancji (1-20 GΩ). Zastosuj krótkie i delikatne ssanie, aby przerwać błonę komórkową i ustalić konfigurację całej komórki.</li>
	<li>Stale monitoruj opór dostępu podczas eksperymentu. 
	Uwaga: Do analizy należy uwzględnić tylko neurony wykazujące mały i stabilny opór dostępu (≤3%danych wejściowych R; zmiana <20% w trakcie eksperymentu).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

VNO to struktura chemosensoryczna, która wykrywa substancje semiochemiczne. Do tej pory większość receptorów lemieszowo-nosowych pozostaje do desierotyzacji, ponieważ zidentyfikowano tylko kilka par receptor-ligand. Wśród nich V1rb2 został opisany jako specyficznie aktywowany przez męski feromon moczowy 2-heptanon30, V2rp5 aktywowany przez męski feromon specyficzny dla mężczyzn ESP157 , a także V2r1b i V2rf2 aktywowane odpowiednio przez peptydy MHC SYFPEITHI48 i SEIDLILGY58. Wa...

Większość zwierząt polega głównie na swoich zmysłach chemicznych, aby komunikować się z otoczeniem. Zmysł węchu odgrywa zasadniczą rolę w znajdowaniu i ocenie pożywienia, unikaniu drapieżników i lokalizowaniu odpowiednich partnerów do godów. U większości ssaków układ węchowy składa się z co najmniej czterech anatomicznie i funkcjonalnie odrębnych podsystemów obwodowych: głównego nabłonka węchowego1,2, zwoju Grueneberga3,4, narządu przegrody Masera5,6 i narządu lemieszowo-nosowego. VNO obejmuje obwodową strukturę czuciową dodatkowego układu węchowego (AOS), która odgrywa główną rolę w wykrywaniu sygnałów chemicznych, które przekazują informacje o tożsamości, płci, randze społecznej i stanie seksualnym7-10. VNO znajduje się u podstawy przegrody nosowej, tuż nad podniebieniem. U myszy jest to obustronna rurka z ślepym zakończeniem zamknięta w chrzęstnej kapsułce11-13. Narząd składa się zarówno z przyśrodkowego nabłonka czuciowego w kształcie półksiężyca, w którym znajdują się VSN, jak i z części nieczuciowej po stronie bocznej. Pomiędzy obydwoma nabłonkami znajduje się wypełnione śluzem światło, które jest połączone z jamą nosową przez wąski przewód lemieszowo-nosowy14. Duże boczne naczynie krwionośne w tkance nieczuciowej zapewnia mechanizm pompowania naczyniowego, aby ułatwić wnikanie stosunkowo dużych, przeważnie nielotnych cząsteczek, takich jak peptydy lub małe białka, do światła VNO przez podciśnienie15,16. Elementy strukturalne VNO są obecne przy urodzeniu, a narząd osiąga dorosłe rozmiary na krótko przed dojrzewaniem17. Jednak to, czy AOS gryzoni jest już funkcjonalny u młodych osobników, jest nadal przedmiotem dyskusji18-20.
VSN różnią się zarówno lokalizacją nabłonka, jak i typem receptora, który wyrażają. VSN wykazują dwubiegunową morfologię z niezmielinizowanym aksonem i pojedynczym dendrytem wierzchołkowym, który wystaje w kierunku światła i kończy się guzkiem dendrytycznym z mikrokosmkami. Aksony VSN fascykulują się, tworząc nerw lemieszowo-nosowy, który opuszcza torebkę chrzęstną na końcu grzbietowo-ogonowym, wznosi się wzdłuż przegrody, przechodzi przez płytkę grzebienianą i wystaje do dodatkowej opuszki węchowej (AOB)21,22. Nabłonek czuciowy lemieszowo-nosowy składa się z dwóch warstw: warstwa wierzchołkowa znajduje się bliżej strony światła i zawiera zarówno V1R, jak i wszystkie oprócz jednego typu neuronów eksprymujących FPR-rs. Neurony te wykazują koekspresję białka G α-podjednostki Gαi2 i rzutują do przedniej części AOB23-25. Neurony czuciowe znajdujące się w bardziej podstawowej warstwie wyrażają V2R lub FPR-rs1 wraz z Gαo i wysyłają swoje aksony do tylnego obszaru AOB26-28.
Neurony lemieszowo-nosowe są prawdopodobnie aktywowane przez raczej małe semiochemikalia29-33 (V1R) lub związki białkowe34-38 (V2R), które są wydzielane do różnych płynów ustrojowych, takich jak mocz, ślina i płyn łzowy37,39-41. Eksperymenty in situ wykazały, że VSN są również aktywowane przez sformylowane peptydy i różne związki przeciwbakteryjne/związane ze stanem zapalnym25,42. Co więcej, heterologicznie eksprymowane białka FPR-rs dzielą widma agonistyczne z FPR ulegającymi ekspresji w układzie odpornościowym, co wskazuje na potencjalną rolę jako detektorów chorób u przedstawicieli tego samego gatunku lub zepsutych źródeł żywności25 (patrz odniesienie43).
Fundamentalne dla zrozumienia relacji receptor-ligand i kaskad sygnałowych w określonych populacjach VSN jest szczegółowa ocena ich podstawowych cech biofizycznych w rodzimym środowisku. W przeszłości analiza sygnalizacji komórkowej przyniosła ogromne korzyści ze zwierząt modyfikowanych genetycznie, które oznaczają określoną populację neuronów poprzez koekspresję białka markera fluorescencyjnego30,44-49. W tym protokole stosuje się transgeniczną linię myszy, która wyraża FPR-rs3 wraz z markerem fluorescencyjnym (Fpr-rs3-i-Venus). Podejście to ilustruje, w jaki sposób można wykorzystać taki genetycznie zmodyfikowany szczep myszy do przeprowadzenia analizy elektrofizjologicznej optycznie identyfikowalnej populacji komórek przy użyciu nagrań z pojedynczym neuronem w ostrych koronalnych wycinkach tkanki VNO. Napędzany ciśnieniem powietrza wielolufowy system perfuzyjny dla bodźców czuciowych i środków farmakologicznych umożliwia szybką, odwracalną i ogniskową stymulację neuronów lub hamowanie podczas nagrań. Zapisy całych komórek w preparatach warstwowych pozwalają na szczegółową analizę właściwości wewnętrznych, przewodności aktywowanych napięciem, a także wzorców wyładowań potencjału czynnościowego w natywnym środowisku ogniwa.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (niska temperatura żelowania)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Kwas bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Kwas Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Narzędzia i materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duża szalka Petriego, 90 mm</td><td>Dekapitacja VWR</td><td></td>, <td>sekcja kapsułki VNO</td></tr><tr><td>Mała szalka Petriego, 35 mm</td> pokrywka VWR do sekcji <td>VNO</td><td></td><td>, szalka do zatopienia w agarozie</td></tr><tr><td>Ostre duże nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>dekapitacja, usuwanie żuchwy</td></tr><tr><td>Mocne nożyczki do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>siekacze tnące</td></tr><tr><td>Średnie kleszcze, pęseta Dumont #2</td><td>Narzędzia Fine Science Tools</td><td></td><td>do usuwania skóry i podniebienia</td></tr><tr><td>Nożyczki mikrosprężynowe, 8,5 cm, zakrzywione, ostrza 7 mm&nbsp;</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>, wycinanie VNO&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dwie pary cienkich kleszczy, pęseta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>preparowanie VNO z torebki chrzęstnej</td></tr><tr><td>Mała szpatułka ze stali nierdzewnej</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>obsługująca blok agarozy i plastry tkanek</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td></td><td></td> chirurgiczny <td>do cięcia bloku agarozy w kształt piramidy</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego (1,50 mm OD/0,86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD-Leica</td><td>Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna, wzbudzenie: BP 450-490, tłumienie: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Lampa fluorescencyjna</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z płytą grzejną</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td>Mikromanipulator <td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Luigs & Ściągacz do</td> mikropipet Neumann <td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>, pionowy dwustopniowy</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Eliminator szumów 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Cel naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Oscyloskop Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr&nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny 8-w-1</td> Naukowy pH-metr <td>AutoMate pięć</td><td></td><td></td></tr> łatwych <tr><td>w obsłudze Słoik do przechowywania pipet</td><td></td><td></td> Mettler Toledo World Precision Instruments e212 <td></td></tr><tr><td></td><td></td> Komora nagrywająca&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & </td><td>Mini komora</td><td></td>Neumann Slice</tr><tr><td>Żyletki</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Komora do przechowywania plastrów dotleniających; alternatywnymi komorami komercyjnymi są: np. , BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) lub komora wstępna (BSC-PC; Warner Instruments)</td> <td>wykonany</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs spustu&nbsp;</td><td>Wibratom HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Kąpiel wodna <td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

U większości ssaków narząd lemieszowo-nosowy (VNO) jest strukturą chemosensoryczną, która wykrywa zarówno hetero-, jak i współgatunkowe sygnały społeczne. Neurony czuciowe lemieszowo-nosowe (VSN) wyrażają specyficzny typ receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) z co najmniej trzech różnych rodzin genów chemoreceptorów, umożliwiając czułe i specyficzne wykrywanie sygnałów chemosensorycznych. Rodziny te obejmują rodziny genów V1r i V2r, a także rodzinę przypuszczalnych genów chemoreceptorów związanych z sekwencją receptora peptydu formylowego (FPR) (Fpr-rs). Aby zrozumieć fizjologię interakcji receptor-ligand lemieszowo-nosowy i sygnalizacji końcowej, konieczne jest zidentyfikowanie właściwości biofizycznych właściwych dla każdej określonej klasy VSN.
Opisane tutaj podejście fizjologiczne pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych za pomocą transgenicznej linii myszy (Fpr-rs3-i-Venus). Stosowanie tego protokołu nie jest jednak ograniczone do tej konkretnej linii, a zatem może być łatwo rozszerzone na inne linie genetycznie zmodyfikowane lub zwierzęta typu dzikiego.

Aby uzyskać wgląd w właściwości biofizyczne i fizjologiczne określonych populacji komórek, wykonujemy ostre koronalne przekroje tkanki VNO myszy (Rysunek 1-2). Po wycięciu przekroje można przechowywać w lodowatym, natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym (S2) przez kilka godzin. W układzie rejestracyjnym stała wymiana na świeży, natleniony roztwór (Rysunek 2D) zapewnia żywotność tkanki przez cały czas trwania eksperymentu. Stos...

Tutaj opisujemy fizjologiczne podejście, które pozwala na identyfikację i dogłębną analizę zdefiniowanej populacji neuronów czuciowych w ostrych wycinkach tkanki koronalnej mysiego narządu lemieszowo-nosowego za pomocą nagrań z całych komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie elektrofizjologicznej analizy pojedynczych komórek z określonej populacji neuronów sensorycznych w ostrych skrawkach tkankowych narządu vomeronasal myszy. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu kluczowych pytań w dziedzinie chemosensoryki, takich jak mechanizmy detekcji substancji chemicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki rejestracji aktywności neuronów sensorycznych w ostrych skrawkach tkankowych, komórki te mogą być badane w ich naturalnym środowisku.Aby rozpocząć tę procedurę, po uśmierceniu zwierzęcia należy usunąć jego dolną szczękę, wprowadzając duże nożyce chirurgiczne przez jamę ustną i przecinając osobno kości żuchwy oraz mięśnie po każdej stronie. Następnie za pomocą pęsety średniej należy usunąć skórę górnej szczęki oraz okolic czubka nosa, aby uzyskać lepszy dostęp do siekaczy. Po tym użyć nożyc do kości, aby odciąć największą część siekaczy pod kątem 45 stopni w kierunku rostralnym, co ułatwi usunięcie torebki VNO z jamy nosowej.Nie należy przecinać korzenia zęba, aby uniknąć uszkodzenia końcówki torebki VNO. Następnie chwyć sztywną część podniebienia twardego w jego części rostralnej za pomocą pęsety średni

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

U myszy zdolność wykrywania feromonów jest zapośredniczona głównie przez narząd vomeronasalny (VNO). W niniejszej pracy opisano przygotowanie ostrych skrawków tkanki VNO do obrazowania wapnia. To podejście fizjologiczne umożliwia obserwację subpopulacji i/lub pojedynczych neuronów w żywej tkance i jest wygodne w procesie identyfikacji receptorów i ligandów.

Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Narząd jamistnokaczkowy (VNO) wykrywa wewnątrzgatunkowe sygnały chemiczne, które przekazują informacje społeczne i rozrodcze. Przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania Ca2+ z wykorzystaniem myszy transgenicznych wykazujących ekspresję G-CaMP2 w tkance VNO. Podejście to pozwala nam analizować złożone wzorce odpowiedzi neuronów jamistnokaczkowych na liczne bodźce feromonowe.

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Ten film przedstawia izolację mysiego narządu lemieszowo-nosowego (VNO) i przygotowanie tkanek do cięcia wibratomem. Sekcje służą do scharakteryzowania biofizycznych i fizjologicznych atrybutów określonej grupy neuronów czuciowych.

Przygotowanie mysiego narządu lemieszowo-nosowego do przekroju wibratomu

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną

Dodatkowa opuszka węchowa myszy (AOB) była trudna do zbadania w kontekście kodowania sensorycznego. Tutaj demonstrujemy sekcję, w wyniku której powstaje preparat ex vivo, w którym neurony AOB pozostają funkcjonalnie połączone ze swoimi obwodowymi wejściami, ułatwiając badania nad przetwarzaniem informacji o mysich feromonach i kairomonach.

Ex vivo Preparaty nienaruszonego narządu lemieszowo-nosowego i dodatkowej opuszki węchowej

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Poznaj metodę patch-clamp do analizy fizjologicznej neuronów czuciowych w ostrych wycinkach mysiego narządu lemieszowo-nosowego. Technika ta pozwala badać mechanizmy chemorecepcji w natywnym środowisku komórek.

Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanek mysiego narządu lemieszowo-nosowego

Przeglądaj więcej filmów