Name: Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę wychwytywania powinowactwa do izolacji kompleksów białkowych z komórek ssaków przy użyciu mielenia kriogenicznego. Ta technika umożliwia badanie interakcji białkowych w biologii komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy profesorowi Brianowi T. Chaitowi za jego nieocenione rady, wsparcie i dostęp do aparatury do stwardnienia rozsianego, a także pani Kelly R. Molloy za doskonałe wsparcie techniczne. Dziękujemy Pani Kelly Bare za wsparcie w redagowaniu tekstów. Praca ta była częściowo wspierana przez granty NIH P41GM109824, P41GM103314 i P50GM107632.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Te trzy protokoły działają w tandemie, aby (1) przygotować komórki do uszkodzenia w stanie stałym przez kriomielenie, (2) osiągnąć pęknięcie w planetarnym młynie kulowym i (3) wyprodukować ekstrakty z proszku komórkowego do wychwytywania białka będącego przedmiotem zainteresowania kompleksem z jego fizjologicznymi interaktorami. Istnieje wiele różnych technik lizy komórek, w tym podejścia mechaniczno-fizyczne wykorzystujące zgniatanie, ścinanie i/lub nacisk, a także podejścia chemiczne/enzymatyczne, z których każda ma inne zalety i wady49,50. Każdy badacz jest zachęcany do zbadania metod najbardziej odpowiednich dla jego analiz, mając na uwadze, że każde wybrane podejście do rozbijania komórek i ekstrakcji białek prawdopodobnie wprowadzi błędy51,52 wymagające optymalizacji empirycznej (omówione poniżej). Metody mechaniczne mogą wytwarzać wysokie temperatury i/lub siły ścinające, które mogą rozbijać kompleksy białkowe. Kriomielenie pozwala uniknąć efektów ogrzewania dzięki zastosowaniu chłodzenia próbek LN2 na czas trwania procesu. Uważa się, że planetarne młyny kulowe opierają się na siłach uderzenia i tarcia, w tym naprężeniach ścinających, jako składnikach redukcji wielkości cząstek53,54. W opisanych ustawieniach nie zaobserwowano degeneracji kompleksów białkowych. Rzeczywiście, wyekstrahowaliśmy i odzyskaliśmy pozornie nienaruszone kompleksy porów jądrowych ~50 MDa11 i enzymatycznie aktywne retrotranspozony wykazujące wyższą aktywność właściwą niż preparaty wykorzystujące "delikatną" lizę na bazie detergentów7. Chemiczne/enzymatyczne metody lizy komórek mają to do siebie, że zawartość komórki jest uwalniana do środowiska in vitro , które wspomaga rozerwanie błon komórkowych i makrocząsteczek strukturalnych, ale może nie być odpowiednie do utrzymania integralności kompleksu białkowego (kompleksów) białkowego(-ych) będącego przedmiotem zainteresowania. Często ani składniki kompleksów utworzonych z białka będącego przedmiotem zainteresowania, ani warunki potrzebne do stabilizacji docelowych kompleksów nie są znane z góry. Główną zaletą mielenia w stanie stałym jest to, że pękanie i ekstrakcja są rozłączone, co pozwala na przygotowanie materiału źródłowego bez dodatku cieczy, przechowywanie (w temperaturze -80 °C lub niższej), gromadzenie i wygodne pobieranie do eksperymentów na żądanie; Na przykład w celu zbadania zoptymalizowanych warunków in vitro do wychwytywania powinowactwa. Interakcje białkowe są najbardziej stabilne przy wysokim stężeniu55,56, dlatego minimalizacja objętości ekstrahentu może być korzystna dla zachowania interakcji fizjologicznych. Z drugiej strony istnieją względy praktyczne - kompleksy białkowe muszą zostać wydzielone z komórek i trafić do nielepkiej fazy wodnej, wolnej od nierozpuszczalnych agregatów, w celu wymieszania docelowych kompleksów z pożywką powinowactwa. Ponadto do usystematyzowania i odtwarzalności potrzebna jest pewna standaryzacja i kontrola środowiska in vitro (pH, stężenie soli itp.). Stwierdzamy, że ekstrakty wytwarzane w zakresie rozcieńczeń 1:4-1:9 (w:v) spełniają wymagania praktyczne i teoretyczne, dając wyniki wysokiej jakości. Dodatkowo należy określić optymalną proporcję ekstraktu komórkowego do pożywki powinowactwa. Odbywa się to empirycznie poprzez miareczkowanie ekstraktów o różnej ilości pożywki o powinowactwie i może mieć wykrywalny wpływ na stosunek sygnału do szumu w eksperymencie, omówiony poniżej. Doskonałe zubożenie białka docelowego wynosi zwykle ≥70% rozpuszczalnej frakcji białka docelowego, ale >90% jest pożądane i może być osiągalne przy starannej parametryzacji warunków ekstrakcji. Wiele takich praktycznych rozważań omówiono w odnośniku1. Kulki paramagnetyczne są manipulowane za pomocą magnesów neodymowych w specjalistycznym uchwycie probówki do mikrowirówki, chociaż opłacalne są domowe alternatywy. Po umieszczeniu w uchwycie koraliki zbierają się z boku rurki pod wpływem pola magnetycznego. Roztwory można następnie usunąć bez naruszania kulek.
Jednym z ograniczeń przedstawionego protokołu kriomielenia, opracowanego z użyciem planetarnego młyna kulowego (patrz tabela materiałów), jest to, że do skutecznego mielenia i odzyskiwania proszku komórkowego za pomocą tego urządzenia wymagana jest minimalna ilość materiału (>1 g). Takie ilości można łatwo uzyskać za pomocą wielu drobnoustrojów, linii komórkowych i organizmów modelowych, a często można je również uzyskać za pomocą tkanek wyciętych ze zwierząt laboratoryjnych. Jednak niektóre linie komórkowe mogą być bardzo trudne do wyhodowania w obfitości, a tkanki zwierzęce mogą być rzadkie. Mniejsze ilości materiału można w porównywalny sposób zmielić za pomocą innych urządzeń wykorzystujących mniejsze pojemniki, choć potencjalnie kosztem osiągniętego rozdrobnienia proszku. Ponadto koszt mechanicznych urządzeń do mielenia może być zbyt wysoki dla niektórych laboratoriów. Kriomielenie można osiągnąć przy użyciu wielu alternatywnych konfiguracji14-19, w tym, najtańszego, ręcznego przy użyciu tłuczka i moździerza, chociaż wydajność pękania znacznie spada. Protokoły wychwytywania powinowactwa zazwyczaj mają na celu wysoką wydajność lizy komórek, aby ułatwić maksymalną ekstrakcję białka do roztworu, a tym samym maksymalny potencjał wychwytywania docelowych kompleksów białkowych. Z drugiej strony, w przypadku ekstraktów z drożdży do splicingu in vitro , wykazano, że maksymalna liza może nie być równoznaczna z maksymalną aktywnością biochemiczną in vitro 57,58. Nie zaobserwowaliśmy takich problemów w testowanych przez nas do tej pory systemach, dlatego nie ograniczamy celowo pękania naszych komórek podczas kriomielenia. Niemniej jednak należy pamiętać o tej możliwości przy optymalizacji testów enzymatycznych in vitro . Chociaż kriomielenie jest wysoce skuteczną metodą rozbijania komórek, ograniczona ilość sonikacji często korzystnie wpływa na produkcję jednorodnych ekstraktów z całych komórek z tkanek ssaków, ponieważ niejednorodne agregaty można czasami zaobserwować podczas oględzin: zwykle w warunkach ekstrakcji przy użyciu niskich lub umiarkowanych stężeń soli (100-300 mM) i niejonowego detergentu (0,1-1% v/v). Ponieważ zaobserwowaliśmy, że obecność tych agregatów może zmniejszyć wydajność i/lub jakość późniejszego wychwytywania powinowactwa, rutynowo wdrażamy sonikację w celu ich rozproszenia (nawet jeśli nie są one obserwowane gołym okiem). Agregaty są zgodne ze zglomerowanymi fragmentami błony, porównywalnymi do tych wcześniej opisywanych w ekstraktach ze zmielonych komórek drożdży58. Sonikacja jest również stosowana w niektórych protokołach do ścinania DNA i uwalniania fragmentów chromatyny do roztworu, jednak stopień sonikacji zastosowany w tym protokole nie powoduje znacznej fragmentacji DNA. Kolejną przeszkodą może być ograniczona dostępność (lub wysoki koszt) doskonałego liganda lub przeciwciała o powinowactwie przeciwko konkretnemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Szeroka gama dostępnych na rynku odczynników powinowactwa może być wykorzystana, gdy organizm modelowy jest podatny na znakowanie genomowe lub transfekcję z ektopowymi wektorami ekspresyjnymi, co pozwala na ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania jako fuzje znakowane powinowactwem. Jednak produkcja niestandardowych przeciwciał staje się coraz bardziej wykonalna, a zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne mogą doskonale sprawdzać się w zastosowaniach związanych z wychwytywaniem powinowactwa. Te liczne rozważania są również omówione bardziej szczegółowo w odnośniku1.
Przykłady tego, w jaki sposób metoda lizy komórek i wybór pożywki o powinowactwie mogą wpływać na wyniki, przedstawiono na rysunku 1. Przykłady efektów wywieranych przez różne ekstraktory można zobaczyć w piśmiennictwie1,11,24. Ponieważ te i inne parametry eksperymentalne wpływają na jakość wychwytywania powinowactwa, co utrudnia rozróżnienie FP, opracowano repozytoria "proteomów koralików" i podejścia obliczeniowe do eliminacji niespecyficznych zanieczyszczeń, aby pomóc w identyfikacji FP40-43. Niemniej jednak takie podejścia jedynie w ograniczonym stopniu zastępują optymalne przygotowanie próbki59. Przestrzeganie najlepszych praktyk i empiryczna optymalizacja eksperymentu z przechwytywaniem powinowactwa zapewni najwyższej jakości próbki do dalszych analiz, które zostaną omówione poniżej. Łatwą do wdrożenia praktyką, która może poprawić czystość próbki, jest elucja natywna. Elucja natywna jest najczęściej stosowana w celu uzyskania izolowanego kompleksu białkowego powinowactwa, w stanie nienaruszonym, do dalszych eksperymentów; Ponieważ jednak często zwiększa czystość próbki, może być również stosowany tylko z tego powodu. Jednak, jak wykazano na rysunku 1, panel II, zdolność natywnej elucji do poprawy czystości próbki może zależeć od dokładnego miareczkowania ilości pożywki o powinowactwie do obfitości białka docelowego w ekstrakcie komórkowym - gdy pożywka jest w nadmiarze, niezajęte paratopy mogą pozwolić na akumulację białek FP poza celem obserwowanych we frakcjach natywnie eluowanych. Korzystając z opisanych tutaj odczynników i procedur, z naszego doświadczenia wynika, że największym pojedynczym czynnikiem przyczyniającym się do FP w naszych eksperymentach jest samo oznakowane białko po usunięciu z kontekstu żywej komórki. (Rys. 1.II i Rys. S1). W takich przypadkach kontrole rodzicielskiej linii komórkowej, które dają nieistotne proteomy przy braku antygenu, nie mają praktycznej wartości; Podobnie jest w przypadku kontroli tylko znaczników lub skoków, które są pozbawione czegokolwiek poza antygenem docelowym. Dlatego tam, gdzie jest to możliwe, wdrażamy I-DIRT7,38, który bezpośrednio mierzy akumulację interakcji białek po lizie za pomocą ilościowego MS. Jak wspomniano w kroku 3.2.7 protokołu, procedury elucji natywnej będą się różnić w zależności od szczegółów zastosowanego systemu powinowactwa. Elucja natywna jest najczęściej osiągana przez konkurencyjne przemieszczenie znakowanego kompleksu białkowego lub proteolityczne rozszczepienie znacznika, uwalniając kompleks z pożywki powinowactwa. Istnieje kilka systemów powinowactwa składających się z małych znaczników epitopów, dla których sam epitop jest dostępny jako peptyd przydatny do konkurencyjnej elucji znakowanych kompleksów białkowych60. Podobnie, dostępnych jest kilka proteaz, które specyficznie rozszczepiają pokrewne miejsca strategicznie umieszczone w białkach fuzyjnych oznaczonych powinowactwem61. W zależności od specyfiki wybranych systemów powinowactwa można przyjąć odpowiedni schemat elucji.
Ogólnie rzecz biorąc, jakość uzyskanych wyników będzie miała znaczący wpływ na jakość przygotowania próbki. Ważne jest, aby pracować ostrożnie i precyzyjnie na każdym etapie tych protokołów i tak szybko, jak to możliwe, zachowując ostrożność i precyzję. Wskazane jest śledzenie partycjonowania białka będącego przedmiotem zainteresowania na każdym etapie, aby zrozumieć skuteczność każdej manipulacji. Na przykład: jak obfite jest białko będące przedmiotem zainteresowania w danej komórce lub tkance? Być może badane białko (i jego kompleksy) będzie trudne do scharakteryzowania za pomocą spektrometrii mas ze względu na niską liczebność. Jeśli oczyszczone kompleksy są wykrywalne przez ogólne barwienie białek (zakres około nanogramów), spektrometria mas prawdopodobnie zakończy się sukcesem. Jeśli wychwycone białko będące przedmiotem zainteresowania można wykryć tylko za pomocą czułego, wzmocnionego chemiluminescencyjnego western blot (w przybliżeniu zakres pikogramów), spektrometria mas jest mniej skuteczna. Nawet jeśli interesujące białko występuje obficie w komórce, jak obfite jest w wyprodukowanym ekstrakcie komórkowym? Czy białko dzieli się na roztwór, czy jest w osadzie? W tym drugim przypadku można opracować nowe rozwiązanie ekstrakcyjne, które może poprawić regenerację. Po połączeniu ekstraktu komórkowego z pożywką powinowactwa, jak skutecznie wychwytywane jest białko? Czy białko pozostaje związane przez kolejne płukania? A co z innymi białkami oczyszczającymi? Zapisując podwielokrotność każdej próbki na odpowiednich etapach protokołu, można łatwo odpowiedzieć na te pytania, zazwyczaj poprzez western blot na białku będącym przedmiotem zainteresowania lub ogólne barwienie białek, ale inne testy mogą być również odpowiednie. Optymalizacja każdego kroku zwiększy wydajność i czystość wychwytywanych kompleksów, chociaż może istnieć kompromis, który należy osiągnąć w maksymalizacji jednego lub drugiego atrybutu.
Typowym zastosowaniem wychwytywania powinowactwa dla wielu badaczy jest identyfikacja potencjalnych interaktorów in vivo dla niewielkiej liczby białek będących przedmiotem zainteresowania; Kandydaci ci są zwykle poddawani walidacji za pomocą podejść ortogonalnych in vivo w celu wykazania biologicznego znaczenia interakcji fizycznych. Wychwytywanie powinowactwa jest również wykorzystywane w badaniach wysokoprzepustowych do generowania list białek kooczyszczających obserwowanych na podstawie (prawie) całego proteomu, ułatwiając wnioskowanie obliczeniowe dotyczące przypuszczalnych kompleksów in vivo . W literaturze można znaleźć liczne przykłady takich badań. W tym podejściu rezygnuje się z optymalizacji warunków chwytania dla danego celu na rzecz eksploracji wielu celów; W związku z tym same wywnioskowane kompleksy rzadko są odzyskiwane w pełni nienaruszone i wysoce czyste w danej próbce. Częściowe nakładanie się kompozycji obserwowane między wieloma odrębnymi próbkami uchwyconymi pod względem powinowactwa jest raczej wykorzystywane jako podstawa wniosków42. Oba podejścia wnoszą cenne dane do naszego zrozumienia interaktomii. Niemniej jednak jedną z głównych zalet wychwytywania powinowactwa jest to, że często daje ono możliwość uzyskania kompleksów w stanie nienaruszonym i wysoce oczyszczonym, pod warunkiem, że dołoży się starań w celu optymalizacji procedury. Wierzymy, że przyszłość tego podejścia leży w zwiększeniu łatwości i efektywności optymalizacji wychwytywania endogennych kompleksów białkowych11, w celu dokładniejszej oceny gamy fizjologicznych interaktorów i częstszego stosowania w dalszych badaniach biochemicznych, enzymologicznych i strukturalnych, np. Piśmiennictwo 7,9,23.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Typowym zastosowaniem prezentowanych procedur jest stabilizacja i uzyskanie wysokiej wydajności i czystości endogennych kompleksów białkowych, które są przedmiotem zainteresowania dla charakterystyki interaktomicznej1. Przyjmuje się, że dynamiczne sieci zarówno stabilnie, jak i przejściowo powiązanych kompleksów makromolekularnych, składające się głównie z białek, koordynują procesy komórkowe2,3. Chociaż istnieje wiele eksperymentalnych podejść do identyfikacji interakcji białko-białko, wychwytywanie powinowactwa jest jedną z najczęściej stosowanych metod izolowania i preparowania fizjologicznych kompleksów białkowych4-6. Co więcej, technika ta ma tę zaletę, że daje kompleksy makromolekularne jako jednostki fizyczne, a nie tylko jako punkty danych w odczycie; Korzystne jest to, że otrzymane kompleksy mogą być zatem wykorzystane w wielu dodatkowych dalszych testach biochemicznych, enzymatycznych i strukturalnych7-9. Przedstawione protokoły zostały opracowane w odpowiedzi na potrzebę mapowania sieci interakcji białko-białko oraz scharakteryzowania kompleksów makromolekularnych w ich rolach jako cząsteczek efektorowych biologii komórki. Są one szczegółowo opisane w odniesieniu do ich zastosowania do komórek ssaków hodowanych w hodowli tkankowej, ale mają również zastosowanie do szerokiego zakresu próbek biologicznych, po odpowiednich poprawkach specyficznych dla systemu.
Historia przechwytywania powinowactwa sięga początku XX wieku, kiedy to pierwsze eksperymenty chromatograficzne immunopowinowactwa — przypominające to, co obecnie powszechnie określa się mianem immunoprecypitacji (IP) — pojawiły się w literaturze na początku lat 50. Główny nurt techniki rozwijał się przez przełom tego stulecia do chwili obecnej10-13. Różnorodne badania komórkowe i biologii molekularnej wykorzystywały mechaniczne pękanie komórek przez mielenie w temperaturach kriogenicznych przez co najmniej ostatnie czterdzieści lat14-19; a separacje molekularne z wykorzystaniem (super)paramagnetycznych kulek stają się coraz bardziej powszechne w ciągu ostatnich dwóch dekad20. Połączenie tych różnych technologii posłużyło do synergistycznego ulepszenia wyników, które można uzyskać w eksperymentach z wychwytywaniem powinowactwa kompleksów białkowych1, o czym świadczy obszerny dorobek opracowany przez nas i szerszą społeczność badawczą7,9,11,18,19,21-23. Wyniki potwierdzające przedstawiono na rysunku 1.
Zbiór zastrzeżeń i uwag dotyczących przeprowadzania skutecznych eksperymentów z przechwytywaniem powinowactwa można znaleźć w odnośniku1. Zazwyczaj podejście to jest najbardziej odpowiednie do: (I) skatalogowania interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania, tj. wykorzystania spektrometrii mas białek (MS) do identyfikacji nieznanych dotąd białek oczyszczających (analiza eksploracyjna); (II) test na obecność określonego partnera oddziałującego, tj. użycie MS lub western blot w celu wykrycia określonego białka lub ograniczonego zestawu białek, co do których istnieje podejrzenie, że wchodzą w interakcje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (badanie hipotezy); lub (III) przygotować endogennie złożone kompleksy białkowe zawierające białko będące przedmiotem zainteresowania do dalszych badań za pomocą dodatkowych technik (praca przygotowawcza). Przed rozpoczęciem eksperymentalnego reżimu wychwytywania powinowactwa absolutnie niezbędne jest posiadanie wysokiej jakości odczynnika powinowactwa, który wiąże się z białkiem docelowym, zazwyczaj przeciwciałem kompetentnym w zakresie IP przeciwko natywnemu białku docelowemu będącemu przedmiotem zainteresowania lub przeciwko znacznikowi dołączonemu do białka fuzyjnego. Bardzo ważne jest również posiadanie odpowiednich metod eksperymentalnego odczytu: ogólne barwienie białek (takie jak Coomassie blue, Sypro Ruby lub srebro, zgodnie z SDS-PAGE), western blotting i białkowe MS są powszechnie stosowane w połączeniu z wychwytywaniem powinowactwa1. Przedstawione protokoły wykorzystują sprzężone z przeciwciałami kulki magnetyczne jako pożywkę powinowactwa. Podczas gdy funkcja pożywki powinowactwa może być początkowo zwalidowana w testach, które wykorzystują niewiele parametrów eksperymentalnych, aby uzyskać najlepsze wyniki, każdy eksperyment powinien być empirycznie zoptymalizowany1,11,24. Protokoły są podzielone na trzy odrębne fazy: (1) przygotowanie materiału z zamrożonych komórek; (2) pękanie komórek przez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej; oraz (3) ekstrakcja białek i wychwytywanie powinowactwa za pomocą kulek paramagnetycznych sprzężonych z przeciwciałami.

<table><tbody><tr><td>Pożywki wzrostowe i przyrządy do hodowli komórek Do</td><td></td><td></td><td>produkcji zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>500 cm2 naczyń</td><td>hodowlanych Corning</td><td>431110</td><td>Do produkcji zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>Duża zlewka (1-2 L)</td><td></td><td></td>Do <td>produkcji zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>Prostokątna miska lodowa&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>13-900-747</td><td>Do produkcji zamrożonych komórek (I) i kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td>Do produkcji zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>Skrobaki do dużych komórek</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-100-242</td><td>Do wytwarzania zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>Ciekły azot&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do wytwarzania zamrożonych komórek (I), kriomielenia (II) i wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td>Do wytwarzania zamrożonych komórek (I) i kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>Strzykawka typu Luer lock 20 ml Do</td><td></td><td></td><td>produkcji zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>Nasadki do strzykawek Leur lock</td><td>www.dymax.com</td><td>T11182</td><td>Do produkcji komórek zamrożonych (I)</td></tr><tr><td>Chłodzone Wirówka</td><td></td><td></td><td>Do produkcji zamrożonych komórek (I)</td></tr><tr><td>Stojak na probówki 50 ml, 4 pozycje</td><td></td><td></td><td>Do wytwarzania zamrożonych komórek (I), kriomielenie (II) i wychwytywanie powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Pudełko</td><td></td><td></td> styropianowe <td>Do produkcji zamrożonych komórek (I), kriomielenia (II) i wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Planetarny młyn kulowy, PM 100&nbsp;</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001&nbsp;</td><td>Do kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>Słoik do mielenia ze stali nierdzewnej, 50 ml&nbsp;</td><td>Retsch</td><td>01.462.0149</td><td>Do kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>Kule do mielenia ze stali nierdzewnej, 20 mm i Oslash; &nbsp;</td><td>Retsch</td><td>05.368.0062</td><td>Do kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>Uszczelka pokrywy: Uszczelka sprężynowa w obudowie PFA, 2,62 mm 44,63 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>www.marcorubber.com</td><td>T1044-2,62x44,63</td><td>Do kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>karafka mini-LN2</td><td>domowej roboty</td>, <td>patrz nr ref. 19</td><td>Do kriomielenia (II)</td></tr><tr><td>Izolator słoików z PTFE o pojemności 250 ml (opcjonalnie)</td><td>domowej roboty</td><td>Uniwersytet Rockefellera</td><td>Do kriomielenia (II); może być wyprodukowany przez The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop lub dostarczone plany projektowe, na życzenie</td></tr><tr><td>Izolator krążka PTFE (opcjonalnie)</td> <td>domowej roboty</td><td>Uniwersytet Rockefellera</td><td>Do kriofrezowania (II); może być wyprodukowany przez The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop lub dostarczone plany projektowe na życzenie.</td></tr><tr><td>Zawór bezpieczeństwa 5 bar/500 kPa (opcjonalnie)</td> <td>Zawór zwrotny serii http://www.leeimh.com/ 558</td><td>Do kriomielenia (II)</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofugi 1,5-2 ml Do</td><td></td><td></td><td>wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Ekstrahent</td><td></td><td></td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA</td> Roche <td>Applied Science</td><td>11873580001</td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td><td></td> wirowy <td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Wiadro</td><td></td><td></td> na lód <td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Sonikator z mikrokońcówką, Q700</td><td>Qsonica</td><td>Q700</td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Sonda mikrokońcówkowa 1/16" o niskiej intensywności</td><td>Qsonica</td><td>4717</td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td> <td>stołowa z chłodzeniem</td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Epoxy</td><td>Thermo Fisher</td><td>14302D</td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Przeciwciało lub ligand powinowactwa sprzężony z Dynabeads</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III); patrz odniesienie 19</td></tr><tr><td>Rotator próbek&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Magnes neodymowy</td><td>Life Technologies</td><td>123-21D&nbsp;</td><td>Do przejmowania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Bufor do próbek SDS-PAGE (bez środka redukującego)</td><td></td><td></td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>System</td><td></td><td></td> SDS-PAGE <td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Żel</td><td></td><td></td> poliakrylamidowy SDS <td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr><tr><td>Barwnik</td><td></td><td></td> białkowy <td>Do wychwytywania powinowactwa (III)</td></tr></tbody></table>

wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Przechwytywanie powinowactwa jest skuteczną techniką izolowania endogennych kompleksów białkowych do dalszych badań. W połączeniu z przeciwciałem technika ta jest również często określana jako immunoprecypitacja. Przechwytywanie koligacji można zastosować w skali laboratoryjnej i w kontekście wysokiej przepływności. W połączeniu ze spektrometrią mas białek, wychwytywanie powinowactwa okazało się być koniem pociągowym analizy interaktomowej. Chociaż istnieje potencjalnie wiele sposobów wykonania wielu wymaganych kroków, poniższe protokoły implementują nasze preferowane metody. Charakterystyczne są dwie cechy: zastosowanie kriomielonego proszku komórkowego do produkcji ekstraktów komórkowych oraz kulki paramagnetyczne sprzężone z przeciwciałami jako pożywka powinowactwa. W wielu przypadkach uzyskaliśmy lepsze wyniki niż te uzyskane przy użyciu bardziej konwencjonalnych praktyk przechwytywania powinowactwa. Kriomielenie pozwala uniknąć wielu problemów związanych z innymi formami pękania komórek. Zapewnia skuteczne łamanie materiału, jednocześnie unikając problemów z denaturacją związanych z nagrzewaniem lub pienieniem. Zachowuje natywne stężenie białka aż do momentu ekstrakcji, łagodząc dysocjację makromolekularną. Skraca czas spędzany przez wyekstrahowane białka w roztworze, ograniczając szkodliwe działania enzymatyczne i może zmniejszać niespecyficzną adsorpcję białek przez pożywkę o powinowactwie. W ciągu ostatnich kilku lat pożywki o powinowactwie magnetycznym w skali mikronowej stały się bardziej powszechne, coraz częściej zastępując tradycyjne podłoża na bazie agarozy i sefarozy. Podstawowe zalety nośników magnetycznych obejmują zazwyczaj niższą niespecyficzną adsorpcję białek; brak limitu wykluczenia wielkości, ponieważ wiązanie kompleksu białkowego zachodzi na powierzchni kulki, a nie w porach; oraz łatwość manipulacji i obsługi za pomocą magnesów.

Rycina 1, panel I ilustruje, że kriomielenie i kulki magnetyczne mogą wspólnie poprawić jakość próbki. Panele IA-C demonstrują, że materiał tworzący nierozpuszczalne podłoże stosowane do wychwytu powinowactwa może wpływać na odzyskany proteom19. Białko docelowe, oczyszczona bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) z tagiem FLAG, zostało dodane do ekstraktów z ludzkich komórek. Nie oczekuje się, aby BAP specyficznie oddziaływało z ludzkimi białkami i współoczyszczało je. Sygnatura współoczyszczanych białek, oceniana za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie, różniła się w zależności od zastosowanego podłoża. Magnetyczne kulki w skali mikronowej wykazały najczystszy profil, co wskazuje na względnie niski poziom niespecyficznej adsorpcji białek. Panele ID i IE ilustrują, że metoda lizy komórek również może wpływać na odzyskany proteom. W przedstawionym przykładzie endogenny kompleks białkowy (kompleks NEXT37) poddano wychwytowi powinowactwa z ekstraktów komórkowych uzyskanych drogą kriomielenia lub sonikacji19. W przypadku ekstraktu komórkowego przygotowanego z kriomielonego proszku komórkowego zaobserwowano mniej zanieczyszczeń o wysokiej masie.
Wyzwanie podczas stosowania wychwytu powinowactwa do badania endogennych kompleksów białkowych polega na tym, że może być trudno odróżnić rzeczywiste fizjologiczne interaktory białka docelowego od wyników fałszywie dodatnich (FP). FP mogą pochodzić z wielu źródeł, w tym z nieswoistej adsorpcji do probówek i naczyń, nośnika powinowactwa, przeciwciała lub ligandu powinowactwa i/lub do samego białka docelowego. W rezultacie znaczny wysiłek musi zostać poświęcony optymalizacji procesu wychwytu. Wykrywanie FP pozostaje kluczowym wyzwaniem, dla którego opracowano liczne, różne narzędzia, w tym podejścia eksperymentalne38-40 i obliczeniowe41-43, z których każde ma swoje zalety i wady. W naszych własnych eksperymentach zauważyliśmy wcześniej wzór wiązania białek FP, otrzymany po inkubacji magnetycznego nośnika α-FLAG z kontrolnymi ekstraktami komórkowymi, który różnił się od wzoru uzyskanego w obecności białek znakowanych 3xFLAG. Co więcej, FP te mogły zostać uwolnione z nośnika poprzez inkubację z peptydem 3xFLAG7. Obserwacja ta jest zgodna z oportunistycznym wiązaniem FP do paratopu α-FLAG w przypadku braku cognatywnego epitopu. Zrozumienie natury tego tła FP jest istotne, ponieważ w wielu badaniach jako kontrola pozorowana (mock control) do wychwytu powinowactwa wykorzystuje się nieznakowaną „linię komórkową macierzystą”; kontrole te mogą zatem być nieodpowiednie do określenia swoistości oddziaływań z białkiem znakowanym. Aby określić wiązanie tła generowane przez nasz nośnik powinowactwa w sytuacji, gdy paratopy przeciwciał są zajęte lub nie, przeprowadziliśmy eksperymenty pozorowanego wychwytu powinowactwa z użyciem magnetycznego nośnika α-FLAG i ekstraktów komórek HEK 293T (bez ekspresji białka znakowanego) w obecności lub braku dodatku peptydu 3xFLAG. Wyniki przedstawiono na Rysunku 1, panel II. W skrócie, magnetyczny nośnik α-FLAG inkubowano w ekstraktach komórkowych (zawierających ≳10 mg/ml całkowitego białka) z dodatkiem 500 mM NaCl i 1% v/v Triton X-100 w 20 mM HEPES-Na pH 7,4 przez 30 min. Następnie nośnik inkubowano z 1 mg/ml peptydu 3xFLAG, aby konkurencyjnie wyprzeć białka związane z paratopem α-FLAG w sposób natywny, lub z buforem do próbek SDS-PAGE, aby przeprowadzić elucję denaturującą. Dodatkowo ten sam eksperyment przeprowadzono, gdy do ekstraktów komórkowych dodano 1 µg/ml i 10 µg/ml peptydu 3xFLAG. Wszystkie eluaty poddano analizie SDS-PAGE i barwieniu srebrem. Zaobserwowaliśmy, że w przypadku braku cognatywnego epitopu, nośnik α-FLAG rzeczywiście wychwytuje wykrywalny poziom białek tła, które mogą zostać eluowane peptydem 3xFLAG — w przykładzie przedstawionym na Rysunku 1-II zaobserwowano dominujący gatunek o masie między 37 a 50 kDa. Wzór otrzymany po elucji buforem do próbek SDS-PAGE był porównywalny, z dodatkowymi wyraźnymi gatunkami. Jednak w obecności 1 µg/ml peptydu 3xFLAG wiązanie FP do nośnika powinowactwa zostało wyeliminowane poniżej poziomu detekcji i nie zaobserwowano go ani w frakcjach elucji natywnej, ani denaturującej. Wynik ten sugeruje, że nieobsadzone paratopy przeciwciał mogą wykazywać nieswoistość w przypadku braku ich cognatywnego epitopu i mogą znacząco przyczyniać się do proteomu uzyskanego podczas wychwytu powinowactwa nawet w przypadku przeciwciał, które wiążą swój epitop z wysokim powinowactwem, jak ma to miejsce w parze 3xFLAG/α-FLAG M2. Sugeruje to również, że bardzo rygorystyczne warunki z użyciem wysokiego stężenia soli, często wybierane w celu ograniczenia nieswoistego wiązania, mogą być nieskuteczne w przypadku braku oddziaływania antygen-przeciwciało. W ramach kontynuacji przeprowadziliśmy podobny eksperyment, obejmujący analizę SDS-PAGE oraz ilościową spektrometrię mas (MS) (Rys. S1). Spośród 347 skwantyfikowanych białek zaobserwowaliśmy, że każde białko z wyjątkiem jednego (false discovery rate = 1%; Tabela S1) było powiązane z białkiem przynętą znakowanym 3xFLAG w porównaniu z próbką kontrolną z dodatkiem peptydu 3xFLAG. Wyniki te wskazują, że w naszych eksperymentach zdecydowana większość obserwowanych białek prawdopodobnie współoczyszcza się z białkiem znakowanym lub są produktami ubocznymi wynikającymi z nieobsadzonych paratopów α-FLAG. W naszym doświadczeniu wyniki wychwytu powinowactwa o wysokim stosunku sygnału do szumu są obrazowane w SDS-PAGE i barwieniu białek przez dyskretny wzór ostrych, obfitych i w przybliżeniu stechiometrycznych pręg oraz niedobór barwienia tła z innych, słabszych pręg; liczne przykłady tej zasady można znaleźć w literaturze11.
Motywem stosowania izolatora z PTFE (który jest zalecany) podczas kriosiekaniu jest zmniejszenie szybkości nagrzewania się naczynia podczas mielenia, ograniczenie konieczności wielokrotnego chłodzenia LN2 w trakcie procesu oraz redukcja stopnia tworzenia się lodu w naczyniu. Ułatwia to uzyskanie spójnej wydajności mielenia i usprawnia manipulację proszkiem komórkowym. Przykładowe izolatory można znaleźć w referencji27 (krążki) oraz na poniższej Rysunce 2 (tuleja i krążek).
<img alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE wykazująca wyniki znakowania i rozdzielania białek dla RBM7 oraz BAP-FLAG." src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wybrane reprezentatywne wyniki. (I) Ten panel został zmodyfikowany z referencji19. Żel SDS-poliakrylamidowy barwiony błękitem Coomassie. (LEWO) Magnetyczne kuleczki w skali mikronowej wykazują niższe wiązanie poza docelowe niż nośniki na bazie agarozy. (A) kuleczki magnetyczne; (B) tradycyjna agaroza; (C) agaroza impregnowana żelazem (magnetyczna); każdy z nośników sprzężony z przeciwciałami anty-FLAG M2 i użyty do wychwycenia znakowanej FLAG bakteryjnej fosfatazy alkalicznej (BAP; oznaczone), dodanej do ekstraktów otrzymanych z kriomielonych komórek HEK-293. Oczyszczanie na bazie agarozy wykazało wyższe poziomy niespecyficznej adsorpcji (nieoznaczone prążki). (PRAWO) Ekstrakty otrzymane z kriomielonych komórek HeLa wykazują niższą adsorpcję poza docelową przy użyciu kuleczek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami niż ekstrakty otrzymane przez sonikację, gdy są one używane do oczyszczania endogennego kompleksu białkowego. RBM7 znakowane LAP44 zostało wychwycone powinowactwem przy użyciu kuleczek magnetycznych sprzężonych z poliklonalnymi przeciwciałami anty-GFP w celu oczyszczenia kompleksu NEXT19,37 (D) ekstrakt otrzymany z proszku kriomielonego; (E) ekstrakty otrzymane przez sonikację nienaruszonych komórek. Pionowy czarny pasek zaznacza obszar żelu, w którym zaobserwowano wzbogacenie wysokocząsteczkowych interaktorów niespecyficznych w próbce przygotowanej przez sonikację. Czarne strzałki wskazują oczekiwane specyficzne interaktory (oznaczone). Prążki obserwowane przy ~ 50 kDa w ścieżkach D i E są przypisywalne ciężkim łańcuchom IgG lamy. (II) Żel SDS-poliakrylamidowy barwiony srebrem. (Std.) Pozorne wychwycenie powinowactwa przeprowadzone na ekstraktach z komórek HEK-293T w sposób standardowy. Po wychwyceniu elucję związanego materiału osiągnięto poprzez (N) elucję niedenaturującą z użyciem 1 mg/ml peptydy 3xFLAG lub (D) elucję denaturującą w buforze do próbek SDS-PAGE; (PB 1) jak Std., ale peptyd 3xFLAG został włączony do roztworu ekstrakcyjnego w stężeniu 1 µg/ml w celu zablokowania paratopów α-FLAG na nośniku powinowactwa; (PB 10) jak PB 1, ale w obecności 10 µg/ml peptydy 3xFLAG. Prążki związane z IgG oraz peptyd 3xFLAG są oznaczone. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ naczynia do wysokociśnieniowego ograniczania; konstrukcja mechaniczna zabezpieczająca próbki do testów naprężeń materiałowych." src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Izolator PTFE w formie tulei i krążka. Przedstawiono słoik PTFE o pojemności 250 ml (1). Stalowy słoik do mielenia o pojemności 50 ml (2) mieści się wewnątrz słoika PTFE (3), co umożliwia pozostawienie słoika do mielenia w młynie pomiędzy cyklami. Górny izolacyjny krążek PTFE (2) jest stosowany pomiędzy zestawem zaciskowym a pokrywą słoika. Aby schłodzić zainstalowany słoik i zestaw izolatora (3), LN2 dodaje się bezpośrednio do korpusu izolatora, otaczając słoik. Następnie można rozpocząć kolejny cykl mielenia. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Sugerowane stężenie</td>
			<td>Uwagi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorek sodu</td>
			<td>0,1-0,5 M</td>
			<td>Wysokie stężenia (&gt;(300 mM) mają tendencję do poprawy ekstrakcji białka całkowitego i utrzymywania niskiego tła, lecz mogą usuwać niektóre w innym przypadku stabilne interaktory. Stężenia poniżej 150 mM zazwyczaj nie są skuteczne w redukcji tła nieswoistego.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octan amonu</td>
			<td>0,2-2 M</td>
			<td>Sól składająca się z dwóch buforów, która tworzy roztwór o neutralnym pH57Wyższe stężenia stabilizują niektóre kompleksy białkowe. Roztwory kwasowe mogą powstawać w wyniku utraty amoniaku z przestarzałych, niewłaściwie przechowywanych zapasów krystalicznych. W ekstraktach zawierających octan amonu nie są wymagane dodatkowe bufory pH ani sole. Można je łączyć z NaCl w celu modulacji otrzymanych wyników.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>0,1% v/v</td>
			<td>Detergent niejonowy58; zazwyczaj w połączeniu z NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>0,5-1% obj./obj.</td>
			<td>Detergent niejonowy58; zazwyczaj w połączeniu z NaCl lub NH4Cl4CH3Tlenek węgla2H  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>detergent zwitterionowy58; zazwyczaj w połączeniu z NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Detergent anionowy58 co redukuje tło i pozwala na usunięcie stabilnych komponentów kompleksów, potencjalnie ujawniając łączność binarną; zazwyczaj stosowane w połączeniu z NaCl. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tris-Cl </td>
			<td>20 mM</td>
			<td rowspan="2">pKa wynoszącej 8,8 przy 4 °C, 8,1 przy 25 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(pH 8,0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">HEPES-Na </td>
			<td>20 mM</td>
			<td rowspan="2">pKa o wartości 7,8 przy 4 °C, 7,5 at 25 °CNaOH lub KOH stosowane do wyrównania pH w zależności od rodzaju soli (np. NaCl, KCl lub CH3CO2K) zastosowane w ekstrahencie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(pH 7,4)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wybrane sugerowane odczynniki przydatne do oczyszczania kompleksów białkowych.W poniższej tabeli wymieniono niektóre odczynniki, które okazały się przydatne w oczyszczaniu kompleksów białkowych z ludzkich linii komórkowych, wraz z sugerowanymi stężeniami roboczymi. Typowa formuła ekstraktu zawiera bufor pH, sól oraz detergent1,11,24,45-48. Najlepszą praktyką jest zidentyfikowanie najprostszej kombinacji odczynników, która pozwala uzyskać pożądany wynik.
<img alt="Wykres żelu SDS-PAGE z elucją białek oznakowanych ciężko/lekko poprzez powinowactwo 3xFLAG, analiza LC-MS/MS." src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek S1"> 
Rysunek S1: Analiza SILAC metodą Mix After Purification (MAP-) w celu identyfikacji wyników fałszywie dodatnich. I. Schemat: W tym doświadczeniu kompleksy białka ORF2p z tagiem 3xFLAG (ekspresjonowane z pLD401) zostały oczyszczone odpowiednio z komórek HEK-293T oznakowanych ciężko i lekko7. Do ekstraktu komórkowego oznakowanego lekko dodano peptyd 3xFLAG, aby zapobiec wychwytowi powinowactwa białka ORF2p z tagiem 3xFLAG poprzez inhibicję konkurencyjną; nie oczekuje się, aby blokowało to wiązanie białek, które może zachodzić niespecyficznie z nośnikiem magnetycznym lub strukturami nieparatopowymi przeciwciała. Po elucji z kulek magnetycznych próbki ciężkie i lekkie zmieszano po oczyszczeniu i poddano analizie ilościowej MS (MAP-SILAC39), aby określić frakcję białek związanych z każdą z próbek; dalsze szczegóły metodologiczne znajdują się w Tabeli S1. II. Żel barwiony srebrem ilustrujący, że materiały oznakowane lekko i ciężko dają porównywalne wyniki (porównaj L z H) oraz że oczyszczanie prowadzone w obecności dodatku 3xFLAG (LI) było inhibowane konkurencyjnie. Poniżej fragment żelu barwionego Coomassie Blue G-250 składający się z wymieszanych frakcji H i LI, przed analizą proteomiczną opartą na żelu, zgodnie z opisem w Tabeli S1. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela S1: MAP-SILAC. Arkusz ten zawiera dane uzyskane po przeprowadzeniu eksperymentu MAP-SILAC opisanego na Rysunku S1. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu wychwytu powinowactwa (Affinity Capture Protocol) jest izolacja endogennych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki i biologii molekularnej, takie jak określenie, które białka łączą się w fizycznie powiązane moduły funkcjonalne. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnej obserwacji licznych interakcji fizycznych związanych z badanym białkiem docelowym.Wyhodować od jednego do ośmiu gramów komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odlać pożywkę hodowlaną do dużego zlewka. Następnie umieścić naczynie hodowlane na lodzie w dużej prostokątnej kuwecie z lodem.Do naczynia hodowlanego należy dodać 20 mililitrów schłodzonego do temperatury lodowej 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), a następnie oddzielić komórki od dna naczynia za pomocą dużego skrobaka do komórek. Komórki należy przenieść do probówki o pojemności 50 mililitrów, uprzednio schłodzonej na lodzie. Do naczynia hodowlanego należy dodać kolejne 10 mililitrów schłodzonego do temperatury lodowej 1x PBS.Zebrać pozostałe komórki i przenieść je do probówki o pojemności 50 ml. Powtórzyć ten proces dla każdej płytki. Zawiesiny komórkowe z różnych płytek można połączyć, aby zmniejszyć liczbę próbek oraz ilość odpadów z tworzyw sztucznych.Następnie odwiruj próbki przez pięć minut przy 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu ostrożnie odlej supernatant. Resuspenduj każdy osad w dziesięciu mililitrach lodowatego 1x PBS.Połącz resuspendowane osady, umieszczając do pięciu z nich w jednej probówce o pojemności 50 ml. Przepłucz puste probówki 10 ml PBS. Dodaj roztwór do skonsolidowanych próbek i odwiruj w sposób opisany wcześniej.Po usunięciu supernatantu, zawiesić osad w 10 mililitrach lodowatego 1x PBS. Wyjąć tłok z 20-mililitrowej strzykawki i odłożyć go na bok. Zamknąć końcówkę strzykawki, umieścić strzykawkę wewnątrz 50-mililitrowej probówki i przenieść tam zawiesinę komórkową.Odwiruj próbki przez pięć minut przy 1000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessij supernatant za pomocą pipety z cienką końcówką podłączonej do systemu pułapki próżniowej, aż do momentu, gdy zacznie być wciągana górna warstwa komórek. W wyniku tego procesu powstanie mokry osad komórkowy.Zdejmij nasadkę ze strzykawki, włóż tłok i wkropl komórki bezpośrednio do dużego plastikowego zlewka wypełnionego ciekłym azotem, umieszczonego w kąpieli z ciekłego azotu w styropianowym pudełku. Wymuś wypchnięcie pozostałych komórek ze strzykawki. Następnie przelej zamrożone komórki do probówek o pojemności 50 ml.Niedociśnięte zakrętki probówek pozwolą na odparowanie nadmiaru ciekłego azotu. Przechowywać je przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnego dnia dokładnie dokręcić zakrętki.Zamrożone komórki można w ten sposób przechowywać w temperaturze -80°C do momentu kriomielenia. Wyjmij kule z komórkami z zamrażarki -80°C i umieść je w uchwycie do probówek 50 ml w kąpieli z ciekłym azotem. Wychłodź wcześniej naczynie 50 ml, dwie kule 20 mm oraz pokrywę naczynia w czystym prostokątnym pojemniku z lodem zawierającym ciekły azot.Należy również schłodzić wcześniej izolator z PTFE. Można użyć zestawu krążków lub zestawu rękaw-krążek. Ustaw odpowiedni przeciwobciążenie na młynku.Używając pęsety, umieść dwie schłodzone wcześniej kule mielące o średnicy 20 milimetrów oraz zamrożone komórki w schłodzonym wcześniej słoiku do mielenia. Dolej do słoika ciekły azot do połowy jego wysokości, załóż pokrywkę i przenieś całość do młyna. Zaciśnij uchwyt i przeprowadź trzy cykle mielenia, stosując program: 400rpm, trzy minuty, zmiana kierunku obrotów co minutę, bez przerw między cyklami.Kluczowe jest słyszenie grzechotania kulek podczas mielenia, co wskazuje na ich zderzenia i rozdrabnianie materiału. Brak tego dźwięku oznacza, że mielenie nie zachodzi. Po zakończeniu trzech cykli mielenia przenieś naczynie z powrotem do ciekłego azotu i pozostaw je na chwilę w celu schłodzenia.Ostrożnie zdejmij pokrywkę. Wyjmij kulki za pomocą pęsety i przenieś proszek do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml, używając schłodzonej szpatułki. Należy pamiętać, że dodanie ciekłego azotu do słoika może pomóc w usunięciu proszku przywierającego do kulek.W celu przygotowania ekstraktu komórkowego, odważ 100 mg proszku komórkowego do schłodzonej wcześniej probówki do wirówki o pojemności 1,5 lub 2 ml. Wytaruj wagę analityczną z pustą probówką. Przenieś proszek komórkowy do probówki, używając łyżeczki lub szpatułki schłodzonej w ciekłym azocie.Przed ponownym umieszczeniem probówki w ciekłym azocie, sprawdź na wadze analitycznej masę proszku odmierzonego do probówki. Otwórz probówkę z proszkiem komórkowym i pozostaw ją w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, aby wyrównać ciśnienie wewnątrz probówki i zapobiec natychmiastowemu zamrożeniu buforu do ekstrakcji po jego dodaniu do proszku. Do probówki dodaj 400 µl ekstraktanta uzupełnionego o inhibitory proteaz.Krótko wymieszaj zawartość probówki w wirułce (vortex), a następnie pozostaw na lodzie. Użyj mikrokońcówki sonikatora, aby poddać próbkę krótkiemu impulsowi o niskiej energii w celu rozproszenia wszelkich agregatów. Oczyszć ekstrakt poprzez wirowanie.Na koniec usunąć nadsącz i przystąpić do wychwytu powinowactwa. Aby wstępnie przemyć medium powinowactwa, umieścić probówki zawierające paramagnetyczne kulki sprzężone z przeciwciałami na magnesie. Kulki zgromadzą się przy ściance probówki w ciągu kilku sekund, co umożliwi usunięcie roztworu do przechowywania.Następnie do kulek dodaj 500 µL buforu do ekstrakcji. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex z prędkością średnią. Przecentryfuguj próbki w miniwirówce, aby zebrać całą zawartość na dnie probówki.Następnie należy umieścić probówki na magnesie i odessać roztwór. Rozpocznij wychwyt powinowactwa, przenosząc klarowny ekstrakt komórkowy do probówek zawierających uprzednio przemyte medium powinowactwa, a następnie krótko wymieszaj na wortexie. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsius z ciągłym, delikatnym mieszaniem na rotatorze.Kuleczki powinny pozostać w zawiesinie przez cały czas inkubacji. Odessać nadsącz i trzykrotnie przemyć kuleczki jednym mililitrem zimnego buforu do ekstrakcji. Aby eluować białka, dodać bufor do próbek SDS-PAGE bez reduktora, aby ograniczyć uwalnianie łańcuchów przeciwciał z kuleczek.Inkubować od pięciu do dziesięciu minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. Zebrać i zachować nadsącz, a następnie poddać próbki elektroforezie SDS-PAGE, po czym przeprowadzić barwienie białek przy użyciu standardowych technik. Poszczególne prążki białkowe można wyciąć w celu identyfikacji lub można scharakteryzować całą próbkę w ramach jednej analizy, przeprowadzając elektroforezę jedynie przez krótki czas.Materiał stanowiący nierozpuszczalne medium zastosowane do wychwytu powinowactwa może wpływać na odzyskany proteom. Przedstawiono tutaj kulki magnetyczne, agarozę nasyconą żelazem oraz tradycyjną agarozę. Każde z mediów sprzęgnięto z przeciwciałami anty-FLAG M2 i wykorzystano do wychwytu bakteryjnej fosfatazy alkalicznej z tagiem FLAG, dodanej do ekstraktów otrzymanych z kriomielonych komórek HEK 293.Kuleczki magnetyczne o skali mikrometrycznej wykazały najczystszy profil, co wskazuje na stosunkowo niski poziom niespecyficznej adsorpcji białek. Metoda lizy komórek może również wpływać na odzyskany proteom. W niniejszym przypadku endogenny kompleks białkowy poddano wychwytowi powinowactwa z ekstraktów komórkowych poddanych kriomieleniu lub sonikacji.Zaobserwowano mniej zanieczyszczeń o wysokiej masie, gdy ekstrakt komórkowy był przygotowywany z proszku komórkowego uzyskanego w procesie kriomielenia. Mimo że nośniki magnetyczne mogą wykazywać niższe tło niż inne nośniki, samo przeciwciało może ułatwiać adsorpcję fałszywie dodatnich zanieczyszczeń, zwłaszcza w przypadku braku docelowego antygenu. Aby określić wiązanie tła generowane przez magnetyczny nośnik anty-FLAG w sytuacji, gdy paratopy przeciwciał są zajęte lub wolne, przeprowadzono eksperymenty pozornego wychwytu powinowactwa z użyciem ekstraktów komórkowych HEK 293T w obecności lub w przypadku braku dodatku peptydu 3x FLAG.W przypadku braku cognatywnego epitopu, medium alpha FLAG wychwytuje wykrywalny poziom białek tła, które można usunąć poprzez elucję konkurencyjną z wykorzystaniem peptydu 3x FLAG lub w większym stopniu za pomocą buforu do próbek SDS-PAGE. Dominujący gatunek zanieczyszczeń zaobserwowano w zakresie od 37 do 50 kilodaltonów. W obecności konkurującego epitopu, zarówno elucje oparte na 3x FLAG, jak i na SDS, są w podobnym stopniu wolne od wiązania białek tła.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować starannie, szybko i precyzyjnie. Należy monitorować przebieg procedur oraz wszelkie zaobserwowane odstępstwa, aby zidentyfikować kroki najbardziej krytyczne dla uzyskanych wyników. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak spektrometria mas, wirowanie strefowe oraz mikroskopia elektronowa, w celu analizy składu mieszaniny, stopnia jej homogeniczności oraz rozmiaru i kształtu tworzących ją kompleksów makromolekularnych.Po opracowaniu metoda wychwytu powinowactwa otworzyła przed badaczami z dziedziny proteomiki drogę do badania składu fizjologicznych kompleksów białkowych z niespotykaną dotąd szczegółowością, co pozostaje przedmiotem ciągłych wysiłków badawczych na całym świecie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować komórki ssacze do kriomielenia oraz jak przeprowadzić wychwyt powinowactwa białka będącego przedmiotem zainteresowania.

protein-complex-affinity-capture-from-cryomilled-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Tutaj opisujemy protokół ekstrakcji endogennej tubuliny z komórek ssaków, które mogą nie mieć lub zawierać specyficzne enzymy modyfikujące mikrotubule, w celu uzyskania mikrotubul wzbogaconych o określoną modyfikację. Następnie opisujemy, w jaki sposób wyekstrahowane mikrotubule można ozdobić oczyszczonymi białkami wiążącymi mikrotubule w celu przygotowania siatek do mikroskopii krioelektronowej.

Ekstrakcja zmodyfikowanych mikrotubul z komórek ssaków w celu badania kompleksów mikrotubula-białko za pomocą mikroskopii krioelektronowej

Poznaj metodę wychwytywania powinowactwa do izolacji kompleksów białkowych z komórek ssaków przy użyciu mielenia kriogenicznego. Ta technika umożliwia badanie interakcji białkowych w biologii komórki.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Przeglądaj więcej filmów