Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Ogólnym celem tego protokołu wychwytywania powinowactwa jest wyizolowanie endogennych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórkowej i molekularnej, takie jak to, które białka tworzą się razem w fizycznie połączone moduły funkcjonalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że można jednocześnie zaobserwować liczne interakcje fizyczne związane z białkiem docelowym, które jest przedmiotem zainteresowania.

Wyhoduj od jednego do ośmiu gramów komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odlej pożywkę do dużej zlewki. Następnie umieść naczynie hodowlane na lodzie w dużej prostokątnej patelni.

Dodaj 20 mililitrów lodowatej soli fizjologicznej 1x buforowanej fosforanem lub PBS do naczynia hodowlanego i uwolnij komórki z naczynia za pomocą dużego skrobaka do komórek. Przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki wstępnie schłodzonej na lodzie. Dodaj dodatkowe 10 mililitrów lodowatego 1x PBS do tego samego naczynia.

Zbierz pozostałe komórki i przenieś je do 50-mililitrowej probówki. Powtórz ten proces dla każdego dania. Zawiesiny komórek z różnych naczyń można łączyć w celu zmniejszenia liczby próbek i ilości odpadów z tworzyw sztucznych.

Następnie odwirować próbki przez pięć minut w temperaturze 1 000 x g w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie odlać supernatant. Ponownie zawieś każdą granulkę w dziesięciu mililitrach lodowatego 1x PBS.

Skonsoliduj zawieszone granulki w ilości do pięciu na probówkę o pojemności 50 mililitrów. Umyj puste probówki 10 mililitrami PBS. Dodać roztwór do skonsolidowanych próbek i odwirować jak poprzednio.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach lodowatego 1x PBS. Wyjąć tłok z 20-mililitrowej strzykawki i odłożyć go na bok. Zakryj dyszę strzykawki, umieść strzykawkę w probówce o pojemności 50 mililitrów i przenieś tam zawiesinę komórek.

Wirować przez pięć minut w temperaturze 1000 x g, cztery stopnie Celsjusza. Odessać supernatant pipetą z cienką końcówką podłączoną do systemu pułapki próżniowej, aż górna warstwa komórek zacznie być zasysana. W ten sposób powstaje osad o mokrych komórkach.

Odkręcić strzykawkę, włożyć tłok i wlać komórki bezpośrednio do dużej plastikowej zlewki wypełnionej ciekłym azotem, umieszczonej w kąpieli z ciekłym azotem w styropianowym pudełku. Na siłę zanurz pozostałe komórki ze strzykawki. Następnie wlej zamrożone komórki do 50-mililitrowych probówek.

Luźno przykryj rurki, aby umożliwić odparowanie nadmiaru ciekłego azotu. Trzymaj je przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Następnego dnia całkowicie dokręć nakrętki.

Zamrożone komórki mogą być przechowywane w ten sposób w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu kriomielenia. Wyjmij kulki komórkowe z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza i umieść je w 50-mililitrowym uchwycie na probówkę w kąpieli ciekłego azotu. Wstępnie schłodź 50-mililitrowy słoik, dwie 20-milimetrowe kulki i pokrywkę słoika w czystym prostokątnym wiaderku na lód zawierającym ciekły azot.

Wstępnie schłodzić również izolator PTFE. Użyj zestawu krążków lub rękawa i krążka. Ustaw odpowiednią przeciwwagę na frezarce.

Za pomocą kleszczy umieść dwie wstępnie schłodzone 20-milimetrowe kule mielące i zamrożone komórki we wstępnie schłodzonym słoiku do mielenia. Dodaj ciekły azot do słoika do połowy pełnego, umieść pokrywkę na słoiku i przenieś zestaw do młynka. Zamocuj zespół na miejscu i wykonaj trzy cykle frezowania, używając programu 400 obr./min, trzy minuty, odwrotne obroty co minutę i bez przerwy w interwale.

Bardzo ważne jest, aby podczas mielenia słyszeć grzechotanie kulek, co oznacza, że kulki zderzają się i mielą materiał. Niesłyszenie tego dźwięku oznacza, że frezowanie nie występuje. Po zakończeniu trzech cykli mielenia przenieś słoik z powrotem do ciekłego azotu i pozwól mu na chwilę odpocząć do ostygnięcia.

Ostrożnie zdejmij pokrywę. Usuń kulki za pomocą kleszczy i przenieś proszek do wstępnie schłodzonej rurki o pojemności 50 mililitrów za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki. Należy pamiętać, że dodanie ciekłego azotu do słoika może pomóc w usunięciu proszku, który zbryla się na kulkach.

W celu przygotowania ekstraktu komórkowego odważ 100 miligramów proszku komórkowego do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 lub dwóch mililitrów. Wytaruj wagę analityczną za pomocą pustej probówki do mikrofuge. Dozuj proszek komórkowy do probówki za pomocą łyżki lub szpatułki chłodzonej ciekłym azotem.

Sprawdzić masę proszku dozowanego w probówce na wadze analitycznej przed ponownym zainstalowaniem probówki w ciekłym azocie. Otwórz probówkę z proszkiem komórkowym i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na jedną minutę, aby uwolnić ciśnienie w probówce i zapobiec natychmiastowemu zamarznięciu buforu ekstrakcyjnego po dodaniu do proszku. Do probówki dodać 400 mikrolitrów ekstrahentu uzupełnionego inhibitorami proteazy.

Krótko zawiruj rurkę, a następnie przytrzymaj lód. Użyj ultrasonografu z mikrokońcówką, aby nadać próbce krótki impuls o niskiej energii i rozproszyć wszelkie agregaty. Sklarować ekstrakt przez odwirowanie.

Na koniec usuń supernatant i przejdź do przechwytywania powinowactwa. Aby wstępnie umyć pożywkę powinowactwa, umieść probówki zawierające kulki paramagnetyczne sprzężone z przeciwciałami na magnesie. Koraliki zgromadzą się z boku rurki w ciągu kilku sekund, umożliwiając usunięcie roztworu do przechowywania.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do kulek. Krótko zmieszaj ze średnią prędkością, aby wymieszać. Dodatkowo zakręć probówkami w mini wirówce, aby zebrać całą zawartość na dno probówki.

Następnie umieść rurki na magnesie i odessaj roztwór. Rozpocznij wychwytywanie powinowactwa, przenosząc sklarowany ekstrakt komórkowy do probówek zawierających wstępnie umyte podłoże powinowactwa i krótko zawirować. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ciągłe, delikatnie mieszając na kole rotatora.

Koraliki powinny pozostać zawieszone przez cały okres inkubacji. Odessać supernatant i przemyć kulki trzykrotnie jednym mililitrem zimnego buforu ekstrakcyjnego. Aby wymyć białka, dodaj bufor próbki strony SDS bez środka redukującego, aby złagodzić uwalnianie łańcuchów przeciwciał z kulek.

Inkubować przez pięć do dziesięciu minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Zbierz i zapisz supernatant, a następnie poddaj próbki stronie SDS, a następnie wybarwić białka przy użyciu standardowych technik. Poszczególne prążki białkowe mogą być wycięte w celu identyfikacji lub cała próbka może być scharakteryzowana w jednej analizie poprzez elektroforezowanie próbki tylko przez krótki czas.

Materiał składający się z nierozpuszczalnego podłoża użytego do wychwytywania powinowactwa może wpływać na odzyskany proteom. Pokazane tutaj są koraliki magnetyczne, agaroza impregnowana żelazem i agaroza tradycyjna. Każde podłoże sprzężono z przeciwciałami anty-FLAG M2 i wykorzystano do wychwytywania znakowanej FLAG bakteryjnej fosfatazy alkalicznej wzbogaconej o ekstrakty wytwarzane z kriomielonych komórek HEK 293.

Kulki magnetyczne w skali mikronowej wykazały najczystszy profil, wskazując na stosunkowo niski poziom niespecyficznej adsorpcji białek. Metoda lizy komórek może również wpływać na odzyskany proteom. W tym przypadku endogenny kompleks białkowy poddano wychwytywaniu powinowactwa z kriomielonych lub sonikowanych ekstraktów komórkowych.

Mniej zanieczyszczeń o dużej masie zaobserwowano, gdy ekstrakt komórkowy został wyprodukowany z kriomielonego proszku komórkowego. Mimo że pożywki magnetyczne mogą wykazywać niższe tło niż inne pożywki, samo przeciwciało może ułatwiać adsorpcję fałszywie dodatniego zanieczyszczenia, zwłaszcza w przypadku braku docelowego antygenu. Aby określić wiązanie tła przez ośrodek magnetyczny anty-FLAG, gdy paratopy przeciwciał są lub nie są zajęte, przeprowadzono eksperymenty z symulowanym wychwytywaniem powinowactwa przy użyciu ekstraktów komórek HEK 293T w obecności lub braku 3-krotnego kolca peptydu FLAG.

W przypadku braku pokrewnego epitopu, pożywka alfa FLAG wychwytuje wykrywalny poziom białek tła, które mogą być konkurencyjnie unikane z peptydem 3x FLAG i w większym stopniu wymykane przez bufor próbki strony SDS. Dominujący gatunek zanieczyszczenia zaobserwowano na poziomie od 37 do 50 kilodaltonów. W obecności konkurencyjnego epitopu, zarówno elucjacje oparte na 3x FLAG, jak i SDS są porównywalnie wolne od wiązania białek tła.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pracować ostrożnie, szybko i precyzyjnie. Śledź swoje procedury i wszelkie zaobserwowane zmiany, aby dowiedzieć się, które kroki są najbardziej krytyczne dla Twoich wyników. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak spektrometria mas, wirowanie strefowe i mikroskopia elektronowa w celu analizy składu mieszaniny, jej poziomu jednorodności oraz wielkości i kształtu składowych kompleksów makromolekularnych.

Po jego opracowaniu, wychwytywanie powinowactwa utorowało drogę naukowcom zajmującym się proteomiką do badania składu fizjologicznych kompleksów białkowych z niezrównaną szczegółowością, co pozostaje nieustającym globalnym wysiłkiem badawczym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki sutkowe do kriomielenia i jak wykonać przechwytywanie powinowactwa interesującego Cię białka.