Name: Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Naucz się mikroiniekcji kwasów nukleinowych do zarodków Ceratitis capitata, światowego szkodnika rolniczego. Ta metoda umożliwia tworzenie linii transgenicznych i badanie funkcji genów w celu rozwoju nowych strategii zwalczania szkodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom Laboratorium "Genetyki i Genomiki Owadów", w szczególności Lorenzo Ghiringhelliemu, który przez ostatnie trzydzieści lat pracował nad rozwojem, adaptacją i utrzymaniem hodowli medfly. Część reprezentatywnych wyników tej pracy została przedrukowana z N. Biotechnology, 25(1) przez Scolari F. et al., Fluorescencyjne znakowanie nasienia w celu poprawy walki ze szkodnikiem owada Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, za zgodą Elsevier (numer licencji 3796240759880). Prace te otrzymały wsparcie ze strony Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Wymagania owadowe
	<ol>
		<li>Utrzymuj wszystkie etapy życia C. capitata w temperaturze 25 °C, wilgotności 65% i 12/12 godzin światła/ciemności fotoperiodu.</li>
		<li>Umieść około 1,500-2,000 poczwarek medfly w klatce o pojemności 6 litrów. Użyj klatki z mosiężną siatką z jednej strony z otworami wystarczająco małymi, aby stymulować składanie jaj42. Włóż pasek gąbki przez mały otwór w podstawie klatki, aby zapewnić muchom wodę za pomocą działania kapilarnego. Użyj mieszanki drożdży i cukru (1:10) jako źródła pożywienia dla dorosłych (ryc. 1A). Zwiększ ilość drożdży (do 1:3, drożdże:cukier), jeśli samice nie złożą jaj.</li>
		<li>Umieść talerz wypełniony wodą pod klatką, aby zebrać jaja złożone przez siatkę. Ponieważ dziewicze samice mogą składać jaja, poczekaj, aż muchy osiągną wiek co najmniej 6-7 dni, zanim zbierzesz jaja do eksperymentów z mikroiniekcją. Zapewni to, że samice zostaną sparowane, a jaja zostaną zapłodnione.</li>
		<li>Zbierz jajka, filtrując wodę za pomocą drobnego sitka siatkowego. Przenieść jaja z sitka do plastikowego pojemnika zawierającego standardowy pokarm dla larw (1,5 l H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g środka przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania rozpuszczonego w 50 ml etanolu, 400 g cukru, 175 g demineralizowanych drożdży piwnych, 1 kg miękkich otrębów pszennych) za pomocą pipety Pasteura.</li>
		<li>Umieść każde pudełko w przezroczystym pojemniku zamkniętym siatkową pokrywką, aby umożliwić cyrkulację powietrza i zawierającym warstwę otrębów sprzyjających przepoczwarzeniu (Rysunek 1B).</li>
		<li>Po około 10 dniach sprawdź, czy nie ma larw w 3. stadium rozwojowym, które wyłaniają się z pokarmu dla larw i zeskakują do warstwy otrębów w celu przepoczwarzenia.</li>
		<li>24 godziny później zbierz poczwarki do małego kubka za pomocą miękkiej szczoteczki i przenieś je do nowej klatki dla dorosłych. Dorosłe osobniki pojawiają się zwykle 10 dni po przepoczwarzeniu. Wyłaniająca się mucha wykorzystuje ptilinum, nadmuchiwaną kieszeń umieszczoną na głowie nad podstawą czułków, aby wypchnąć koniec poczwarki. Po wynurzeniu ptilinum trwale zapada się z powrotem w głowie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 1 l pokarmu dla larw z mikroiniekcją
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2,5 g agaru w 300 ml H2O.</li>
		<li>Podgrzej 500 ml H2O na gorącej płycie mieszającej i rozpuść 4 g benzoesanu sodu, 4,5 ml 37% HCl, 42 g ekstraktu drożdżowego i 115 g suszonej marchwi w proszku</li>.
		<li>Dodać do mieszaniny roztwór 2,86 g środka przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania, rozpuszczony w 10 ml absolutnego alkoholu etylowego.</li>
		<li>Rozprowadź podłoże na okrągłych szalkach Petriego o średnicy 15 cm i pozostaw do ostygnięcia. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Umieść 2 cm pasek taśmy dwustronnej na szkiełku mikroskopowym (75 x 26mm2) i zaznacz krawędzie markerem porcelanym, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się oleju i w konsekwencji wysuszeniu wstrzykniętych zarodków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kwasów nukleinowych
	<ol>
		<li>Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów34. Wytrącić plazmid za pomocą etanolu i ponownie zawiesić w buforze do wstrzykiwań (0,1 mM buforu fosforanowego, pH 7,4, 5 mM KCl) w żądanym stężeniu.</li>
		<li>Oczyść zsyntetyzowane in vitro długie dsRNA za pomocą fenolu-chloroformu, wytrącić za pomocą izopropanolu i ponownie zawiesić w buforze iniekcyjnym43.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Umieść tacę wypełnioną wodą pod klatką zawierającą 6-7 dniowe dorosłe osoby.</li>
	<li>Pozwól samicom złożyć jaja przez 30 minut, a następnie zbierz zarodki, filtrując wodę za pomocą drobnego sitka. Zawsze przechowuj sitko w wodzie, aby uniknąć wysuszenia zarodków.</li>
	<li>Usuń zarodki, przetaczając sitko przez 5 sekund w komercyjnym 50% roztworze wybielacza.</li>
	<li>Dokładnie umyj zarodki, kilkakrotnie zanurzając sitko w czystej, ultraczystej wodzie (co najmniej 4-5 razy). Na koniec umieść sitko w czystej, ultraczystej wodzie. Zarodki należy zużyć maksymalnie w ciągu 2 godzin. 
	UWAGA: Czas mikroiniekcji jest związany z koniecznością wstrzyknięcia do zarodków przed blastodermą, w fazie podziałów jądrowych przed komórkowaniem. Pozwala to na wchłonięcie wstrzykniętego DNA do jąder, a konkretnie do pierwotnych jąder komórek rozrodczych, z których wywodzą się gamety. U Drosophila celularyzacja w komórkach biegunowych rozpoczyna się po około 90 minutach od zapłodnienia (w temperaturze 25 °C), przy czym tworzenie blastodermy następuje około 30 minut później44, podczas gdy u muchówki komórkowanie następuje między 9 a 12 godziną45,46.</li>
	<li>Orientacja zarodka w rzędach
	<ol>
		<li>Za pomocą cienkiego pędzla zbierz około 50 zarodków i umieść je na krążku z czarnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą.</li>
		<li>Pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym ułóż zarodki w rzędzie na górnej powierzchni dwustronnej taśmy na szkiełku mikroskopowym za pomocą cienkiego pędzla (000) (Rysunek 1C). 
		UWAGA: Ustaw wszystkie zarodki w tej samej orientacji, ponieważ wstrzyknięcie jest wykonywane w tylnym biegunie, skąd będzie pochodziła linia zarodkowa; Tylny biegun znajduje się naprzeciwko obszaru mikropylowego.</li>
		<li>Przykryj zarodki warstwą oleju chlorotrifluoroetylenowego, upewniając się, że olej nie rozleje się na obramowania znaczników porcelany (patrz 1.3). 
		UWAGA: Przed pokryciem zarodków olejem można wykonać kolejny krok: zarodki można wysuszyć przez kilka minut, aby zmniejszyć ich płynną zawartość i w ten sposób ułatwić przedostanie się wstrzykniętego roztworu DNA. Może to pomóc w uniknięciu pękania zarodków podczas wstrzykiwania lub nadmiernego wycieku wstrzykniętego roztworu, w wyniku wysokiego ciśnienia cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja zarodka
<ol>
	<li>Napełnić igłę (1-2 μl) plazmidowym roztworem DNA lub dsRNA (1-2 μg/μl) za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Podłączyć igłę do aparatu do mikroiniekcji, który kontroluje czas iniekcji (0,5 sekundy), ciśnienie (800 hPa) i ciśnienie zwrotne (150 hPa).</li>
	<li>Wykonać mikroiniekcję pod mikroskopem stereoskopowym, używając mikromanipulatora do kontrolowania ruchów igły (ryc. 1D). Użyj stolika mikroskopu, aby przesunąć szkiełko.
	<ol>
		<li>Umieść slajd na stoliku lunety.</li>
		<li>Wprowadzić końcówkę igły do tylnego bieguna zarodka ( Rysunek 1E ).</li>
		<li>Wstrzyknąć roztwór, aktywując system mikroiniekcji za pomocą pedału. Wstrzyknięty płyn wywołuje wzrost ciśnienia wewnętrznego, co skutkuje lekkim ruchem zarodka.</li>
		<li>Zwolnij pedał i natychmiast, ale delikatnie, wyjmij igłę z zarodka.</li>
		<li>Zauważyć niewielki wyciek cytoplazmatyczny w miejscu wstrzyknięcia. 
		UWAGA: Aby odróżnić potencjalne śmiertelne skutki DNA/dsRNA/siRNA od śmiertelności z powodu samej procedury mikroiniekcji, należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne. Obejmują one wstrzyknięcie samego buforu lub, w przypadku eksperymentów z genetyką odwrotną, dwuniciowego RNA pochodzącego z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) (dsRNA-GFP) lub siRNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wstrzyknięciu inkubować zarodki w temperaturze 25 °C.</li>
</ol>
4. Procedury po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Dwa dni po wstrzyknięciu należy sprawdzić szkiełka pod kątem wyklutych larw (ryc. 1F) pod mikroskopem stereoskopowym. Larwy mogą poruszać się w oleju, ale muszą zostać jak najszybciej przeniesione do pokarmu dla larw. Z tego powodu sprawdzaj slajdy kilka razy dziennie.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla (000) delikatnie przenieś wyklute larwy do pokarmu dla larw na bazie marchwi. Przenieść maksymalnie 200 larw na każdą szalkę Petriego.</li>
	<li>Wysiadywać larwy w temperaturze 65% wilgotności (25 °C). Upewnij się, że pokrywka nie przykleja się do naczynia, utrudniając wymianę powietrza.</li>
	<li>Utrzymuj szalki Petriego z pokrywką w większości zamkniętą, tak aby larwy nadal miały dopływ powietrza. Aby uniknąć nadmiernego wysuszenia, codziennie sprawdzaj naczynia i, jeśli to konieczne, dodaj wodę, aby skompensować parowanie.</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego w przezroczystym pojemniku zamkniętym pokrywką z siatki i zawierającym warstwę otrębów, aby ułatwić przepoczwarzenie. Jeśli chodzi o rutynowy odchów owadów, larwy w trzecim stadium wyskakują z pokarmu larwalnego i przepoczwarzają się w otrębach.</li>
	<li>Zbierz poczwarki i umieść je w małej klatce do odchowu dorosłych osobników i badań przesiewowych (to jest pokolenie 0, G0). Wychowuj potomstwo na standardowym pokarmie dla larw.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z transformacją linii zarodkowej należy sprawdzić, czy w następnym pokoleniu (G1) nie ma możliwych przekształconych osobników, ponieważ wstrzyknięte osobniki są zwykle chimerami. Zdarzenia transpozycji mogły rzeczywiście wystąpić w którymkolwiek z jąder embrionalnego syncytium, które utworzą albo linię zarodkową, albo somę.
	<ol>
		<li>Wkrótce po pojawieniu się znieczulij osoby z G1 za pomocą CO2 i sprawdź zdarzenia transformacji pod stereomikroskopem epifluorescencyjnym. Aby wykryć obecność czerwonej fluorescencji, należy użyć filtra DsRedwide (wew. 546/12; Emm. 605/75), natomiast do badania przesiewowego zielonej fluorescencji należy użyć filtra EYFP (wew. 500/20; Emm. 535/30).</li>
		<li>Umieść przekształcone osobniki w małej klatce z dorosłymi osobnikami płci przeciwnej typu dzikiego i zapoczątkuj nowy, początkowo heterozygotyczny szczep.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mikroiniekcja kwasów nukleinowych w zarodkach owadów jest uniwersalną techniką, która ułatwia zarówno analizę funkcji genów, jak i zastosowania biotechnologiczne.
Niedawna publikacja sekwencji genomów coraz większej liczby gatunków owadów prowadzi do pilnego zapotrzebowania na narzędzia do funkcjonalnej charakterystyki genów o nieznanej jeszcze funkcji. Okazało się, że interferencja RNA jest jedną z najcenniejszych metod wnioskowania o funkcjach molekularnych49 , a mikroiniekcja zar...

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata to kosmopolityczny gatunek, który niszczy owoce i rośliny uprawne. Należy do rodziny Tephritidae, która obejmuje kilka gatunków szkodników, takich jak te należące do rodzajów Bactrocera i Anastrepha. Muchówka jest najlepiej przebadanym gatunkiem z tej rodziny i stała się modelem nie tylko do badania inwazji owadów1, ale także do optymalizacji strategii zwalczania szkodników2.
Muchówka to gatunek wielowoltowy, który może zaatakować ponad 300 gatunków dzikich i uprawianych roślin3,4. Uszkodzenia są powodowane zarówno przez dorosłe osobniki, jak i stadia larwalne: kryte samice przebijają powierzchnię owocu w celu złożenia jaj, pozwalając mikroorganizmom wpłynąć na ich jakość handlową, podczas gdy larwy żywią się miazgą owocową. Po trzech stadiach larwalnych larwy wyłaniają się z żywiciela i przepoczwarzają się do gleby. Ceratitis capitata występuje prawie na całym świecie, w tym w Afryce, na Bliskim Wschodzie, w Australii Zachodniej, Ameryce Środkowej i Południowej, Europie i obszarach Stanów Zjednoczonych5.
Najczęstsze strategie ograniczania inwazji muchówek obejmują stosowanie insektycydów (np. Malation, Spinosad) oraz przyjaznej dla środowiska Techniki Sterylnych Owadów (SIT)6. To ostatnie podejście polega na wypuszczeniu na wolność setek tysięcy samców, które stają się bezpłodne w wyniku narażenia na promieniowanie jonizujące. Krzyżowanie tak wysterylizowanych samców z dzikimi samicami skutkuje brakiem potomstwa, co powoduje zmniejszenie wielkości populacji, ostatecznie prowadząc do wytępienia. Chociaż SIT okazał się skuteczny w wielu kampaniach na całym świecie, jego główne wady obejmują wysokie koszty hodowli i sterylizacji milionów owadów, które mają zostać wypuszczone. Znakowanie wypuszczonych osobników jest niezbędne do odróżnienia owadów sterylnych od dzikich schwytanych w terenie podczas działań monitoringowych i obecnie odbywa się to za pomocą proszków fluorescencyjnych. Procedury te są kosztowne i mają niepożądane skutki uboczne7.
W celu optymalizacji i/lub opracowania bardziej efektywnych metod zwalczania tego szkodnika, biologia i genetyka medfly były szeroko badane przez wielu badaczy na całym świecie. Dostępność sekwencjigenomu muchówki 8,9 ułatwi prowadzenie nowatorskich badań nad funkcjami genów. Interferencja RNA jest potężnym narzędziem do takich badań i można ją osiągnąć poprzez mikroiniekcję dsRNA (dwuniciowego RNA) lub siRNA (małego interferującego RNA). Technika ta została wykorzystana na przykład do wykazania, że kaskada molekularna determinacji płci u C. capitata jest tylko częściowo zachowana w stosunku do kaskady Drosophila10.
Opracowanie protokołów mikroiniekcji zarodków muchówek pozwoliło C. capitata stać się pierwszym genetycznie zmodyfikowanym gatunkiem muchy nienależącym do Drosophilid. Ponieważ jego jaja są podobne do jaj Drosophila, zarówno pod względem morfologii, jak i odporności na wysuszenie11, protokół dostarczania plazmidowego DNA do zarodków sprzed blastodermy, opracowany po raz pierwszy dla D. melanogaster12,13, został początkowo przystosowany do stosowania u C. capitata. Te pierwsze eksperymenty pozwoliły na transformację linii zarodkowej muchówki w oparciu o element transpozycyjny Minos11. Następnie, pierwotny system został zmodyfikowany14 przy użyciu innych podejść opartych na transpozonach. Tak jest w przypadku piggyBac z Lepidoptera Trichoplusia ni15. Od tego czasu protokół został jeszcze bardziej zoptymalizowany, co pozwoliło na transformację innych gatunków tefrytów16-21, a także wielu innych muchówek22-31. Wszystkie te systemy opierają się na wykorzystaniu typowego binarnego systemu transformacji wektora/plazmidu pomocniczego: sztuczne, wadliwe transpozony zawierające pożądane geny są łączone w plazmidowe DNA i integrowane z genomem owada poprzez dostarczanie enzymu transpozazy32. Wygenerowano szereg transgenicznych linii muchówek, z wieloma cechami, w tym szczepami przenoszącymi warunkowo dominujący gen letalny, który indukuje śmiertelność, szczepami produkującymi potomstwo wyłącznie męskie, a zatem niewymagającymi dodatkowych strategii określania płci oraz szczepami z fluorescencyjnymi plemnikami, co może zwiększyć dokładność fazy monitorowania SIT33-37. Chociaż uwolnienie organizmów transgenicznych w środowisku naturalnym miało miejsce w testach pilotażowych przeciwko komarom tylko38,39, co najmniej jedna firma ocenia pewną liczbę transgenicznych szczepów muchówek pod kątem ich zastosowania w terenie40.
Mikroiniekcja zarodków może również sprzyjać rozwojowi nowych narzędzi do edycji genomu, takich jak nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENs), zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) / nukleaza 9 białka związanego z CRISPR (Cas9) i geny endonukleaz naprowadzających (HEG), które umożliwią nowatorskie badania ewolucyjne i rozwojowe, a także poszerzą dostępny zestaw narzędzi biotechnologicznych. Metody edycji genomu pozwoliły już na wygenerowanie systemów napędu genowego u komarów41, a ich transfer do muchówki jest nieuchronny. Tutaj opisujemy uniwersalny protokół mikroiniekcji kwasów nukleinowych w zarodkach muchówek, który może być przydatny we wszystkich wyżej wymienionych zastosowaniach.

<table><tbody><tr><td>1 x bufor</td><td></td><td></td> do wstrzykiwań <td>0,1 mM bufor fosforanowy pH 7,4, 5&nbsp; mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Oczyszczony fenol-chloroform</td></tr><tr><td>Standardowy pokarm</td><td></td><td></td> dla larw <td>1,5 l H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g środka przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania stosowanego w produktach farmaceutycznych rozpuszczony w 50&nbsp; ml etanolu, 400 g cukru, 175 g demineralizowanych drożdży piwnych, 1 kg miękkich otrębów pszennych</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2,5 g agar, 4 g benzoesanu sodu, 4,5 ml 37% HCl, 42 g ekstraktu drożdżowego, 115 g sproszkowanej marchwi, 2,86&nbsp; g środek przeciwdrobnoustrojowy o szerokim spektrum działania, woda do 1 l</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>Ekstrakt drożdżowy i cukier (1:10)</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Igły iniekcyjne&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroładowarki</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie przesuwana taśma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman okrągły papier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 przed użyciem</td></tr><tr><td>Pędzel (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Klatki</td><td></td><td></td><td></td>dla dorosłych</tr><tr><td>Olej chlorotrifluoroetylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Ceratitis capitata</td><td></td><td></td><td>Stosowany szczep to ISPRA</td></tr></tbody></table>

dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) jest gatunkiem szkodnika o niezwykle dużym znaczeniu dla rolnictwa. Wynika to z jego zachowań reprodukcyjnych: samice uszkadzają zewnętrzną powierzchnię owoców i warzyw, gdy składają jaja, a wyklute larwy żywią się ich miazgą. Dzikie populacje C. capitata są tradycyjnie kontrolowane za pomocą oprysków insektycydami i/lub podejść przyjaznych dla środowiska, z których najbardziej skuteczna jest technika sterylnych owadów (SIT). SIT opiera się na masowym chowu, sterylizacji opartej na promieniowaniu i wypuszczaniu w terenie samców, które zachowują zdolność do łączenia się w pary, ale nie są w stanie wydać płodnego potomstwa. Pojawienie się i następujący po nim szybki rozwój narzędzi biotechnologicznych, wraz z dostępnością sekwencji genomu muchówki, znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat biologii tego gatunku. Sprzyjało to rozprzestrzenianiu się nowych strategii manipulacji genomem, które można zastosować do kontroli populacji.
W tym kontekście, mikroiniekcja zarodków odgrywa podwójną rolę w rozszerzaniu zestawu narzędzi do zwalczania muchówek. Zdolność do ingerowania w funkcję genów, które regulują kluczowe procesy biologiczne, rzeczywiście poszerza naszą wiedzę na temat molekularnej maszynerii leżącej u podstaw inwazyjności muchówek. Co więcej, zdolność do transformacji linii zarodkowej ułatwia produkcję wielu szczepów transgenicznych, które mogą być testowane pod kątem przyszłych zastosowań terenowych w nowatorskich warunkach SIT. Rzeczywiście, manipulacja genetyczna może być wykorzystana do nadania pożądanych cech, które mogą być na przykład wykorzystane do monitorowania bezpłodnej męskiej wydajności w terenie lub które mogą skutkować śmiertelnością we wczesnym etapie życia. Tutaj opisujemy metodę mikrowstrzykiwania kwasów nukleinowych do zarodków muchówek, aby osiągnąć te dwa główne cele.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy dwa zastosowania mikroiniekcji embrionalnych, skierowane odpowiednio na charakterystykę funkcjonalną genu zainteresowania (Przypadek 1) oraz na generowanie szczepów transgenicznych (Przypadek 2).
Dostarczanie dsRNA do zarodków w celu wyjaśnienia funkcji genów.
Gen innexin-5 koduje białko połączeń szczelinowych, które u ow...

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie kwasów nukleinowych do embrionów Ceratitis capitata, istotnego szkodnika rolniczego, aby ostatecznie rozszerzyć zestaw narzędzi służących do jego zwalczania. Metoda ta pomaga w funkcjonalnej charakterystyce genów w organizmie nieruchomym, a także w generowaniu szczepów transgenicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że do osiągnięcia pożądanych efektów wstrzykuje się bardzo małą ilość kwasów nukleinowych.Wszystkie stadia rozwojowe kolonii muchówki medfly należy utrzymywać w temperaturze 25 °C przy wilgotności 65% oraz w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z fazą świetlną rozpoczynającą się o godzinie 8:00. Przez mały otwór w podstawie klatki należy wsunąć pasek gąbki, aby zapewnić muchom dostęp do wody poprzez działanie kapilarne. Należy przygotować klatkę o pojemności sześciu litrów i wprowadzić do niej od 1 500 do 2 000 poczwarek.W celu zapewnienia pożywienia, do klatki należy wsypać około 45 g mieszaniny drożdży i cukru w proporcji od 1:10. Aby zebrać jaja, pod klatką należy umieścić płytkę wypełnioną wodą. Samice będą składać jaja przez siatkę, po czym opadną one do wody.Z uwagi na to, że dziewicze samice mogą składać n

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Naucz się mikroiniekcji kwasów nukleinowych do zarodków Ceratitis capitata, światowego szkodnika rolniczego. Ta metoda umożliwia tworzenie linii transgenicznych i badanie funkcji genów w celu rozwoju nowych strategii zwalczania szkodników.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Przeglądaj więcej filmów