Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata
October 1st, 2016
Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.
Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie kwasów nukleinowych do zarodków Ceratitis Capitata, ważnego szkodnika rolniczego, aby ostatecznie rozszerzyć zestaw narzędzi do jego zwalczania. Metoda ta pomaga funkcjonalnie korygować geny w unieruchomionym organizmie, a także generować szczepy transgeniczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że w celu osiągnięcia pożądanych efektów wstrzykiwana jest bardzo mała ilość kwasów nukleinowych.
Utrzymuj wszystkie etapy życia kolonii medfly w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 65% i 12-godzinnym fotookresie światła/ciemności z fotofazą rozpoczynającą się o 8 rano. Włóż pasek gąbki przez mały otwór w podstawie klatki, aby zapewnić muszkom wodę za pomocą działania kapilarnego. Zakładasz sześciolitrową klatkę, ładujesz jedną z nich od 1 500 do 2 000 poczwarek.
W przypadku jedzenia załaduj klatkę około 45 gramami mieszanki drożdży i cukru od jednego do 10. Aby zebrać jaja, umieść talerz wypełniony wodą pod klatką. Samice składają jaja przez siatkę, które następnie gromadzą się w wodzie.
Ze względu na to, że dziewicze samice mogą składać jaja, upewnij się, że wszystkie jaja są zapłodnione, czekając, aż muchy osiągną wiek co najmniej tygodnia, przed zebraniem jaj. Aby zebrać jajka, przefiltruj wodę za pomocą drobnego sitka. Następnie za pomocą pipety pasteralnej przenieś jaja do plastikowego pudełka wypełnionego około 0,5 litra standardowego pokarmu dla larw.
Jeśli nie złożono wystarczającej ilości jaj, zwiększ zawartość drożdży w pożywieniu dorosłego do 25%Umieść każde pudełko w przezroczystym pojemniku zawierającym warstwę otrębów, aby sprzyjać przepoczwarzeniu. Przykryj pojemnik pokrywką z siatki, aby umożliwić cyrkulację powietrza. Po około 10 dniach sprawdź, czy nie ma larw w trzecim stadium rozwojowym, które zeskoczyły do warstwy otrębów w celu przepoczwarzenia.
Po znalezieniu przygotuj się do sprawdzenia poczwarek w następnych dniach. Aby zebrać poczwarki, użyj miękkiej szczotki, aby zmieść je z pojemnika. Początkowo zbierz poczwarki do małego kubka.
Po zakończeniu kolekcji przenieś poczwarki do nowej klatki dla dorosłych. Dorosłe osobniki powinny pojawić się za około 10 dni. Do mikroiniekcji należy wcześniej przygotować preparaty.
Przymocuj dwucentymetrowy pasek podwójnie powlekanej taśmy do szkiełka i zaznacz krawędzie markerem porcelanowym, aby utworzyć ścianę dla warstwy oleju, która utrzymuje nawodnienie zarodków. Aby zebrać świeżo złożone zarodki, pozwól młodym zapłodnionym samicom na ułożenie jaj na nowej tacy, a następnie zbierz zarodki. Aby usunąć kosmówkę z zarodków, zanurz sitko i jaja w dostępnym w handlu 50% roztworze wybielacza na pięć sekund.
Bardzo ważne jest, aby nie wybielać zarodków zbyt mocno. Natychmiast umyj wybielone zarodki, ostrożnie zanurzając sitko w czystej, ultraczystej wodzie. Zrób to co najmniej cztery razy.
Następnie trzymaj sitko w czystej, ultraczystej wodzie i wstrzyknij zarodki w ciągu dwóch godzin. Następnie za pomocą cienkiego pędzla zbierz około 50 zarodków i umieść je na krążku z czarnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą. Pod mikroskopem stereoskopowym ułóż zarodki na podwójnie powlekanej taśmie przygotowanego szkiełka mikroskopowego.
Ustaw wszystkie zarodki w tym samym kierunku. Ważne jest, aby ostrożnie manipulować zarodkami, ponieważ przekłucie błony zarodka pędzlem może spowodować uszkodzenia, które zmniejszą przeżywalność zarodka. Teraz przykryj zarodki warstwą oleju chloro-trifloro etholene.
Olej powinien znajdować się na obramowaniach znacznika porcelany. Nie przekraczaj granic. Za pomocą mikropipety napełnić igłę iniekcyjną kilkoma mikrolitrami roztworu kwasu nukleinowego w ilości od jednego do dwóch mikrogramów na mikrolitr.
Następnie podłączyć igłę do aparatu do mikroiniekcji i ustawić ją tak, aby zapewniała półsekundowe wstrzyknięcie z prędkością 800 hektopaskali przy przeciwciśnieniu 150 hektopaskalach. Aby wykonać wstrzyknięcie, należy użyć spustu za pomocą pedału nożnego i użyć mikromanipulatora do sterowania igłą, jednocześnie używając elementów sterujących stolika do przesuwania suwaka. Upewnij się, że bolus do wstrzyknięcia jest prawidłowo wyrzucany, a następnie wyrównaj igłę z tylnym biegunem pierwszego zarodka w rzędzie.
Przesuwając stolik, włóż igłę do zarodka i wstrzyknij bolus kwasów nukleinowych. Wstrzyknięty płyn wywoła wzrost ciśnienia wewnętrznego, co spowoduje lekki ruch zarodka. Zwolnij pedał i natychmiast, ale delikatnie, wyjmij igłę z zarodka.
Niewielka ilość cytoplazmy wycieknie w miejscu wstrzyknięcia. To normalne. Jeśli zarodki pękają po wstrzyknięciu, pozwól im wyschnąć przez kilka minut, a następnie pokryj je olejem.
Po wstrzyknięciu należy przenieść szkiełko na szalkę Petriego. Umieść krążek bibuły filtracyjnej w pokrywie naczynia. Namocz filtr w wodzie i zamknij szalkę Petriego folią parafinową.
Inkubować komorę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dwa dni po wstrzyknięciu należy kilkakrotnie w ciągu dnia sprawdzać, czy na szkiełkach nie wykluły się larwy. Poszukaj larw oleju i za pomocą cienkiego pędzla przenieś je na szalkę Petriego z pokarmem dla larw na bazie marchwi.
Załaduj każde naczynie maksymalnie 200 larwami. Larwa nie może długo przetrwać w oleju, więc szukaj często. Wysiaduj larwy z całkowicie zamkniętą pokrywą, aby larwy nadal miały przepływ powietrza.
Codziennie sprawdzaj naczynia, a po tygodniu przygotuj się do zbierania larw, umieszczając naczynia w pojemniku z otrębami. Zbierz poczwarki i wkrótce spodziewaj się, że się pojawią. Później znieczulenie wyklutych dorosłych osobników za pomocą dwutlenku węgla i sprawdzenie ich pod kątem transformacji.
Podczas odsiewania ta metoda mobilizacji może mieć kluczowe znaczenie. Dorosłe osobniki Medfly mogą być znieczulone za pomocą lodu lub CO2, ale długotrwałe narażenie może zmniejszyć przeżywalność innych. Sprawdź, czy nie ma czerwonej fluorescencji za pomocą czerwonego filtra szerokokątnego DS.
Lub sprawdź zieloną fluorescencję za pomocą filtra EYFP. Przenieś przekształcone osobniki do małej klatki z dorosłymi osobnikami płci przeciwnej typu dzikiego, aby ustalić szczep heterozygotyczny. W jednym eksperymencie podwójnie odkształcone RNA użyto do wyciszenia ekspresji genu inx5.
Dorosła linia zarodkowa niewstrzykniętych osób kontrolnych wydaje się być normalna zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy leczone osoby wykazywały słabo rozwinięte jądra i jajniki. Kwantyfikacja obfitości transkryptu inx5 w jamie brzusznej osobników obu płci potwierdziła znacznie niższą ekspresję genu w porównaniu z grupą kontrolną. W drugim eksperymencie wygenerowano dwa szczepy ze znakowanymi plemnikami przy użyciu promotora tubuliny beta-2 do napędzania różnych markerów fluorescencyjnych.
Transgeniczni mężczyźni wykazywali wyraźny wzór fluorescencji w ciele i jądrach. W tym filmie przedstawiamy nasze zoptymalizowane protokoły hodowli i mikroiniekcji kwasów nukleinowych do zarodków muchówek. Po opanowaniu można wstrzyknąć do 1000 zarodków w ciągu ośmiogodzinnego dnia pracy.
Po tej procedurze można wykonać inne metale, takie jak thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine, aby uzyskać nową generację szczepów medfly.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Owocówka śródziemnomorska (medfly), Ceratitis capitata, jest istotnym szkodnikiem rolniczym. Ten artykuł omawia metodę dostarczania kwasów nukleinowych do zarodków owocówkowej w celu poprawy strategii kontroli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia rolnicza
Tło
- Owocówka jest globalnym szkodnikiem o wpływie na rolnictwo.
- Rozumienie jej biologii jest kluczowe dla kontroli populacji.
- Mikroiniekcja zarodków jest kluczowa dla badań genetycznych.
- Ta metoda umożliwia transformację linii zarodkowej i genetykę odwrotną.
Cel badania
- Dostarczyć kwasy nukleinowe do zarodków owocówkowej.
- Poszerzyć zestaw narzędzi genetycznych do kontroli populacji owocówkowej.
- Stworzyć szczepy transgeniczne dla badań i zarządzania szkodnikami.
Stosowane metody
- Utrzymuj kolonie owocówkowej w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 65%.
- Używaj 12-godzinnego cyklu światło/ciemność dla optymalnych warunków.
- Wstrzykuj niewielkie ilości kwasów nukleinowych do zarodków.
- Ustaw sześciolitrową klatkę z 1 500 do 2 000 poczwarek na eksperymenty.
Główne wyniki
- Skuteczne dostarczenie kwasów nukleinowych do zarodków owocówkowej.
- Utworzenie szczepów transgenicznych do dalszych badań.
- Wykazana skuteczność wstrzykiwania niewielkich ilości kwasów nukleinowych.
- Dostarczenie wglądu w techniki manipulacji genetycznej.
Konkluzje
- Metoda poprawia zdolność do badania genetyki owocówkowej.
- Oferuje potencjalne strategie kontroli szkodników.
- Dalsze badania mogą budować na tych odkryciach dla zastosowań rolniczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Embryo microinjection of nucleic acids in Ceratitis capitata enables direct genetic manipulation for functional gene interrogation and transgenic strain development. This capability is pivotal for de-risking biological targets and accelerating the creation of genetically modified lines for pest control strategies. The method supports translational continuity from discovery biology to applied agricultural biotechnology, impacting both research and field deployment pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of gene targets by direct gene silencing or overexpression in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by linking gene perturbation to phenotypic outcomes in a relevant organism.
- Facilitates rapid hypothesis testing for genes implicated in pest invasiveness or reproductive biology.
Screening & Assay Development
- Generates validated transgenic lines for downstream phenotypic or molecular screening workflows.
- Standardizes genetic backgrounds for reproducible assay development and comparative studies.
- Provides quantitative readouts such as fluorescence markers for efficient screening of transformants.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with translational goals for population control and trait introduction.
- Enables continuity from gene discovery to preclinical validation of engineered strains for field application.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate genetic modifications based on in vivo performance.
Pipeline & Workflow Integration
This embryo microinjection method bridges early discovery, target validation, and translational research in agricultural biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven gene function studies and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for transformant identification and trait validation.
- Analytics: Enables measurement of gene expression changes and phenotypic effects post-injection.
- Translational Research: Connects laboratory genetic modifications to field-relevant strain development.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for ongoing genetic tool development in pest species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target validation for pest control.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing genetic modifications to field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic strategies for population management.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in embryo handling and microinjection instrumentation.
- Demands access to fluorescence microscopy and molecular analysis infrastructure for screening.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible genetic manipulation and phenotypic assessment.
- Adaptation may be needed for different pest species or genetic backgrounds.
- Survival rates and transformation efficiency are practical limitations that must be optimized.
