Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie kwasów nukleinowych do embrionów Ceratitis capitata, istotnego szkodnika rolniczego, aby ostatecznie rozszerzyć zestaw narzędzi służących do jego zwalczania. Metoda ta pomaga w funkcjonalnej charakterystyce genów w organizmie nieruchomym, a także w generowaniu szczepów transgenicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że do osiągnięcia pożądanych efektów wstrzykuje się bardzo małą ilość kwasów nukleinowych.

Wszystkie stadia rozwojowe kolonii muchówki medfly należy utrzymywać w temperaturze 25 °C przy wilgotności 65% oraz w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z fazą świetlną rozpoczynającą się o godzinie 8:00. Przez mały otwór w podstawie klatki należy wsunąć pasek gąbki, aby zapewnić muchom dostęp do wody poprzez działanie kapilarne. Należy przygotować klatkę o pojemności sześciu litrów i wprowadzić do niej od 1 500 do 2 000 poczwarek.

W celu zapewnienia pożywienia, do klatki należy wsypać około 45 g mieszaniny drożdży i cukru w proporcji od 1:10. Aby zebrać jaja, pod klatką należy umieścić płytkę wypełnioną wodą. Samice będą składać jaja przez siatkę, po czym opadną one do wody.

Z uwagi na to, że dziewicze samice mogą składać niezapłodnione jaja, należy upewnić się, że wszystkie jaja są zapłodnione, odczekując do momentu, aż muchy będą miały co najmniej tydzień, przed przystąpieniem do ich zbierania. Aby zebrać jaja, przefiltruj wodę za pomocą gęstego sita. Następnie, używając pipety Pasteura, przenieś jaja do plastikowego pudełka zawierającego około 0,5 litra standardowej pożywki larwalnej.

Jeśli złożono zbyt mało jaj, należy zwiększyć zawartość drożdży w pożywce dla osobników dorosłych do 25%. Każde pudełko należy umieścić w przezroczystym pojemniku zawierającym warstwę otrębów, aby sprzyjać przepoczwarczeniu. Pojemnik należy przykryć siatkową pokrywą w celu zapewnienia cyrkulacji powietrza. Po około 10 dniach należy sprawdzić, czy larwy trzeciego stadium przeskoczyły do warstwy otrębów w celu przepoczwarczenia.

Po ich odnalezieniu należy przygotować się do sprawdzania obecności poczwarek w kolejnych dniach. Aby zebrać poczwarki, należy użyć miękkiego pędzla, by wymieść je z pojemnika. Początkowo poczwarki należy zbierać do małego kubeczka.

Po zakończeniu zbiorów przenieś poczwarki do nowej klatki dla osobników dorosłych. Imago powinny wykluć się w ciągu około 10 dni. Przed przystąpieniem do mikroiniekcji przygotuj wcześniej odpowiednie szkiełka.

Przyklej dwucentymetrowy pasek taśmy dwustronnej do szkiełka przedmiotowego i zaznacz krawędzie markerem do porcelany, aby stworzyć barierę dla warstwy oleju, która zapobiegnie wysychaniu embrionów. Aby zebrać świeżo złożone embriony, pozwól młodym zapłodnionym samicom składać jaja przez 30 minut na nowej tacy, a następnie zbierz embriony. Aby usunąć chorion z embrionów, zanurz sitko z jajami w komercyjnym 50% roztworze wybielacza na pięć sekund.

Kluczowe jest, aby nie przedawkować odbarwiania embrionów. Natychmiast przemyj odbarwione embriony, ostrożnie zanurzając sitko w czystej wodzie ultra-czystej. Powtórz tę czynność co najmniej cztery razy.

Następnie pozostawić sitko w czystej wodzie ultrapure i przeprowadzić iniekcję zarodków w ciągu dwóch godzin. Następnie, używając cienkiego pędzla, zebrać około 50 zarodków i umieścić je na krążku czarnego papieru filtrowanego nasączonego wodą. Pod stereomikroskopem sekcyjnym ułożyć zarodki w rzędzie na taśmie dwustronnej przygotowanego szkiełka przedmiotowego.

Ustaw wszystkie embriony w tym samym kierunku. Ważne jest, aby manipulować embrionami ostrożnie, ponieważ przebicie błony embrionalnej pędzlem może spowodować uszkodzenia zmniejszające przeżywalność embrionów. Następnie przykryj embriony warstwą oleju chlorotrifluoroetylenowego.

Olej powinien znajdować się w obrębie granic wyznaczonych markerem do porcelany. Należy nie dopuścić do przelania oleju poza te granice. Za pomocą mikropipety należy pobrać do igły iniekcyjnej kilka µL roztworu kwasu nukleinowego o stężeniu od 1 do 2 µg/µL.

Następnie podłącz igłę do aparatu do mikroiniekcji i ustaw go tak, aby czas iniekcji wynosił pół sekundy przy ciśnieniu 800 hPa i ciśnieniu wstecznym 150 hPa. W celu wykonania iniekcji użyj pedału sterującego, a do kontroli położenia igły mikromanipulatora, korzystając jednocześnie z elementów sterowania stolikiem do przesuwania szkiełka. Potwierdź, że bolus iniekcyjny jest prawidłowo wydzielany, a następnie ustaw igłę w linii z biegunem tylnym pierwszego zarodka w rzędzie.

Przesuwając stolik, wprowadź igłę do zarodka i wstrzyknij bolus kwasów nukleinowych. Wstrzyknięty płyn spowoduje wzrost ciśnienia wewnętrznego, co doprowadzi do lekkiego poruszenia się zarodka. Zwolnij pedał, a następnie niezwłocznie i delikatnie wyjmij igłę z zarodka.

W miejscu iniekcji może nastąpić niewielki wyciek cytoplazmy, co jest zjawiskiem normalnym. Jeśli zarodki pękają podczas iniekcji, należy pozostawić je do podeschnięcia przez kilka minut przed przykryciem olejem.

Po wstrzyknięciu przenieś preparat na szkiełku do szalki Petriego. Umieść krążek papieru filtrującego w pokrywie szalki. Nasącz filtr wodą i zamknij szalkę Petriego folią parafinową.

Inkubuj komorę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dwa dni po iniekcji sprawdzaj kilka razy w ciągu dnia szkiełka pod kątem wyklutych larw. Poszukuj larw w oleju, a następnie za pomocą cienkiego pędzla przenieś je do szalki Petriego z pożywką dla larw na bazie marchwi.

Do każdej szalki należy przenieść do 200 larw. Larwy nie przeżyją długo w oleju, dlatego należy prowadzić częste poszukiwania. Inkubować larwy przy w większości zamkniętej pokrywie, aby zapewnić im dopływ powietrza.

Codziennie sprawdzaj szalki, a po tygodniu przygotuj się do zebrania larw, umieszczając szalki w pojemniku z otrębami. Zbierz poczwarki i spodziewaj się ich rychłego przeobrażenia. Następnie znieczul wyklute osobniki dorosłe za pomocą dwutlenku węgla i sprawdź, czy doszło do transformacji.

Podczas przesiewania metoda mobilizacji może mieć krytyczne znaczenie. Dorosłe osobniki muszki owocówki mogą być znieczulane za pomocą lodu lub CO2, jednak przedłużona ekspozycja może obniżyć przeżywalność osobników. Obecność czerwonej fluorescencji należy sprawdzić, używając filtra szerokopasmowego DS red.

Lub należy sprawdzić obecność zielonej fluorescencji przy użyciu filtra EYFP. Przenosi się transformowane osobniki do małej klatki z osobnikami typu dzikiego przeciwnej płci w celu utworzenia szczepu heterozygotycznego. W jednym z eksperymentów zastosowano dwuniciowe RNA w celu wyciszenia ekspresji genu inx5.

Linia zarodkowa dorosłych osobników z grupy kontrolnej (niewstrzykniętych) wydaje się być prawidłowa, zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy u osobników poddanych działaniu preparatu stwierdzono niedorozwój jąder i jajników. Ilościowe oznaczenie poziomu transkrypcyjnego inx5 w odwłokach osobników obu płci potwierdziło znacznie niższą ekspresję tego genu w porównaniu z grupą kontrolną. W drugim eksperymencie wygenerowano dwa szczepy z oznakowanymi plemnikami, wykorzystując promotor beta-2 tubuliny do sterowania różnymi markerami fluorescencyjnymi.

Samce transgeniczne wykazały wyraźny wzór fluorescencji w ciele oraz w jądrach. W tym filmie przedstawiamy nasze zoptymalizowane protokoły hodowli oraz mikroiniekcji kwasów nukleinowych do embrionów muchy śródziemnomuchy. Po opanowaniu tej techniki, w ciągu ośmiogodzinnego dnia pracy można ziniekować do 1 000 embrionów.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić badania nad innymi metalami, takimi jak thy-lino-crisp-er czy cas-min-eta-geno-meta-tine, w celu opracowania nowej generacji szczepów muchy medfly.