Name: Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Odkryj metodę ISSA do analizy genów i promotorów w tworzeniu drewna drzew. Ta technika umożliwia szybką, wydajną charakteryzację funkcjonalną w tkance łodygi wtórnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe dla tego aspektu pracy poprzez Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) i LP0211919 (GB) oraz partnerów przemysłowych Sappi i Mondi, a także Australian Postgraduate Award (EM) od Australian Research Council oraz Young Innovators and Scientist Award przez Australijski Departament Rolnictwa (LT). Chcielibyśmy również podziękować Zanderowi Myburgowi, Qing Wangowi, Colleen MacMillan i Simonowi Southertonowi za wiele dyskusji i pomysłów, które przedstawili podczas opracowywania tego protokołu, a także Martinowi Ranikowi, Minique De Castro, Julio Najerze, Valerie Frassiant, Angelique Manuel i Noemie Defaix za pomoc w pracach związanych z laboratorium.

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ISSA jest stosunkowo prostą i skuteczną metodą tworzenia transgenicznych tkanek pni u gatunków drzew w ciągu kilku miesięcy w celu analizy genów i promotorów zainteresowania zaangażowanych w tworzenie drewna i pni. Niewielki wysiłek, poza utrzymaniem roślin przy życiu, jest wymagany do wyhodowania transgenicznej tkanki łodygi po zaszczepieniu, co kontrastuje z metodami in vitro , w których wymagana jest intensywna hodowla w celu utrzymania tkanek lub roślin, gdzie rozpoczęcie produkcji drewna może trwać...

Łodygi drzew stanowią znaczną część biomasy planety i mają ogromne znaczenie biologiczne, kulturowe i handlowe. Wtórne łodygi tworzą siedlisko, zapewniając zasoby i schronienie wielu innym formom życia. Świadczą one wiele innych usług na rzecz ekosystemów, które zamieszkują, i działają jako zasoby odnawialne do produkcji drewna, masy celulozowej i papieru oraz innych produktów drzewnych i niedrzewnych. Wtórny rozwój łodygi, a dokładniej tworzenie drewna, jest regulowany przez złożony system molekularny, który reguluje rozwój określonych typów komórek, skład biochemiczny ich ścian komórkowych oraz sposób ich ułożenia w celu utworzenia tkanek i narządów. Analiza molekularnych podstaw wtórnego rozwoju pni i formowania się drewna jest zakłócona przez wiele czynników, w tym zmienność właściwości drewna i pnia w obrębie pni i między nimi, długi czas generacji, krzyżujące się systemy kojarzenia, wysoką heterozygotyczność, wysokie obciążenie genetyczne, spoczynek sezonowy, długie okresy tworzenia się dojrzałych cech i sam rozmiar fizyczny dojrzałych drzew. W rezultacie, zrozumienie wtórnego rozwoju łodygi w stosunku do szczegółowej wiedzy na temat większości innych aspektów molekularnej kontroli rozwoju roślin jest wciąż w powijakach.
Do badania i zrozumienia wtórnego rozwoju łodyg użyto wielu technik in vitro, w szczególności tworzenia się drewna i wtórnych ścian komórkowych. Protokoły te obejmują wykorzystanie całych systemów roślin lub części roślin, w których tworzone są rośliny transgeniczne lub określone wtórne komórki lub tkanki są przekształcane w celu zbadania określonych aspektów rozwoju drewna i/lub wtórnego pnia1. Rośliny transgeniczne można odzyskać po transformacji genetycznej z szerokiej gamy tkanek roślinnych i typów komórek, jednak postęp jest powolny, szczególnie podczas analizy cech włókien drzewnych ze względu na długi czas regeneracji i dojrzewania łodygi (w ciągu lat), wysokie wymagania techniczne i pracochłonne, niską przepustowość genów kandydujących, a także trudności w rozmnażaniu niektórych gatunków roślin drzewiastych. Podobne techniki zostały opracowane w modelach niezdrewniałych, takich jak Arabidopsis, które z powodzeniem przezwyciężają niektóre z tych ograniczeń, ale nie wszystkie wtórne typy komórek macierzystych obecne w tych łodygach i cechy związane z sezonowością lub długowiecznością nie mogą być badane u takich gatunków2. Alternatywnie, systemy części roślin, takie jak kultury kalusa Pinus radiata 3 skracają związane z tym ramy czasowe. Metody te są jednak ograniczone do badania pojedynczego typu komórek i podlegają podobnym ograniczeniom, jak w przypadku eksperymentów in vitro. Podobnie, wierzchołkowe kultury łodyg4 obejmujące eksplantaty całych łodyg okazały się obiecujące, ale jak dotąd nie zostały zastosowane do badania konkretnych genów lub promotorów zainteresowania. Niedawno opracowano alternatywny protokół obejmujący owłosione kultury korzeniowe dla eukaliptusów i został on z powodzeniem zastosowany5, jednak metoda ta nadal wymaga uprawy in vitro, obejmuje korzenie wtórne, a nie łodygi i do tej pory ogranicza się do jednego gatunku drzewa.
Indukowana analiza sektorów somatycznych (ISSA), opisana tutaj, została opracowana w celu przezwyciężenia niektórych z tych problemów, dostarczając narzędzie do badań funkcjonalnych o średniej i wysokiej przepustowości dla genów i promotorów z podejrzeniem roli w tworzeniu drewna i rozwoju wtórnych tkanek macierzystych. ISSA to system transformacji i badań przesiewowych in vivo, który został opracowany w celu skrócenia czasu potrzebnego do wytworzenia transgenicznych komórek i tkanek w nienaruszonym wtórnym trzonie, przy jednoczesnym przezwyciężeniu ograniczeń związanych z pracą, technologią i przepustowością rutynowo stosowanych metod in vitro. Opisane tutaj protokoły pozwalają na jednoczesne tworzenie setek niezależnie przekształconych sektorów tkanek i komórek w wtórnych łodygach w krótkim czasie, w interesujących gatunkach drzew i tkankach bez zmienności genetycznej i/lub środowiskowej w stosunkowo krótkich ramach czasowych i przy niskich kosztach pracy. Techniki ISSA in vivo zostały po raz pierwszy opisane dla drugorzędowych tkanek pnia6 i pąków7, a następnie zostały udoskonalone w drugorzędowej tkance macierzystej poprzez badania genów i / lub promotorów zaangażowanych w różnicowanie kambium i obejmują: tubulinę (TUB)8, arabinogalaktan faszywopodobny (FLA)9, syntazę celulozy (CESA)10, drugorzędową domenę nac związaną ze ścianą komórkową (SND2)11, ARBORKNOX (ARK1)12 i bardzo interesujący nowy gen (RING) białko H213. Badania te przeprowadzono na drugorzędowych łodygach topoli i eukaliptusa i dostarczyły informacji na temat morfologii komórek, chemii ściany komórkowej i ekspresji genów.
Opisane tutaj protokoły mają na celu zebranie doświadczenia i wiedzy zdobytej dzięki rozwojowi i zastosowaniu ISSA z szeregu opublikowanych i niepublikowanych badań w ciągu ostatniej dekady. Koncentrują się one na transformacji in vivo wtórnych tkanek macierzystych6 i koncentrują się na badaniach z udziałem klonu Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, a także 11 klonów Eucalyptus globulus x camaldulensis. Dokument ten prowadzi badaczy przez protokół od uprawy roślin i bakterii, transformacji tkanek macierzystych, wzrostu i pobierania tkanek, identyfikacji komórek i tkanek transgenicznych, przygotowania do oceny fenotypowej oraz metod gromadzenia i analizy danych. Chociaż techniki zostały z powodzeniem zastosowane do pomiaru składu monosacharydów ściany komórkowejrównież 9,11, ze względu na ograniczenia przestrzenne, niniejszy dokument koncentruje się na technikach stosowanych do pomiaru morfologii komórek i tkanek oraz zrozumienia wzorców ekspresji genów tylko w drugorzędowych łodygach. W związku z tym przedstawiony protokół jest odpowiedni dla tych, którzy chcą uzyskać więcej informacji na temat roli i/lub ekspresji genów związanych z wtórnymi łodygami przy użyciu taniej, technicznie łatwej i średnio lub wysokoprzepustowej metody.

<table><tbody><tr><td>Rośliny</td><td>NA</td><td>NA</td><td>W razie potrzeby skonsultuj się z lokalnymi dostawcami szkółek roślin</td></tr><tr><td>Szczep Agrobacterium</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Istnieje wiele możliwych sposobów uzyskania szczepów Agrobactrium. Sugerujemy skontaktowanie się z lokalną społecznością badawczą, ponieważ mogą istnieć ograniczenia w pozyskiwaniu bakterii w Twoim kraju i regionie.</td></tr><tr><td>Wektor binarny (gen i promotor)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Opracowaliśmy szereg wektorów pasujących do protokołu ISSA przy użyciu systemu rekombinazy bramy. Obejmuje to nadekspresję, nokauty RNAi i wektory fuzji promotorów oparte na zmodyfikowanych wektorach pCAMBIA i chętnie dostarczymy je w razie potrzeby. Ponadto istnieje wiele wektorów, które są dostępne dla społeczności naukowej.</td></tr><tr><td>Pożywka LB</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy</td></tr><tr><td>Pożywka LB z agarem</td><td>Sigma</td><td>L2897</td><td>Podobny produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Sigma</td><td>NA</td><td>Numer katalogowy będzie zależał od antybiotyku, którego potrzebujesz, ponieważ szereg antybiotyków jest używanych do selekcji bakteryjnej w wektorach binarnych. Ten produkt może pochodzić z&nbsp; Zakres firm</td></tr><tr><td>50 ml Rurki zakręcane</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>2 ml Mikroprobówka</td><td>Watson Bio Lab</td><td>132-620C</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>Sigma</td><td>M9274</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 11</td><td>Sigma</td><td>S2771</td><td>Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Jest to najlepszy produkt do użycia do wiązania kambialnego słupka okiennego&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki okrągłe 14 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>X-Gluc X-GLUC</td><td>direct</td><td></td><td>Aby złożyć zamówienie, musisz wejść na stronę internetową - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu(III)</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu(II)</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td>Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy</td></tr><tr><td>Papierek lakmusowy</td><td>Sigma</td><td>WHA10360300</td><td>Ten sam produkt może pochodzić z innej firmy</td></tr><tr><td>Żyletka z pojedynczą krawędzią</td><td>ProSciTech</td><td>L055</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Żyletka z podwójną krawędzią</td><td>ProSciTech</td><td>L056</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>SEM Pin Stub</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Fiolka na próbkę z nakrętką</td><td>ProSciTech</td><td>L6204</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>sigma</td><td>E7023</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>LR biały</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>Ten sam produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>Polecamy tę odmianę, jednak dostępnych jest wiele opcji</td></tr><tr><td>Nośniki montażowe Water Soulable</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td><td>Jeden przykład nośnika montażowego, który może być użyty, jednak istnieją inne opcje i można je zbadać.</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>Produkt podobny może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td>Produkt podobny może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>Podobny produkt może pochodzić od innej firmy</td></tr><tr><td>Quanta Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td></td><td>Jest to instrument używany w części tego badania, ale każdy inny SEM, który ma tryb niskiej próżni, może być wykorzystany Oprogramowanie</td></tr><tr><td></td><td></td> do<td>obrazowania ImageJ</td><td>można pobrać z następującego adresu URL http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (issa) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Wtórny wzrost pni drzew i związane z tym formowanie drewna są istotne zarówno z biologicznego, jak i komercyjnego punktu widzenia. Jednak stosunkowo niewiele wiadomo na temat kontroli molekularnej, która rządzi ich rozwojem. Wynika to częściowo z ograniczeń fizycznych, zasobowych i czasowych, często związanych z badaniem wtórnych procesów wzrostu. Zastosowano szereg technik in vitro, obejmujących część lub cały system roślinny zarówno u gatunków roślin drzewiastych, jak i niedrzewiastych. Jednak pytania o ich przydatność do badania wtórnych procesów wzrostu łodyg, krnąbrności niektórych gatunków i pracochłonności są często zaporowe w przypadku zastosowań o średniej i wysokiej przepustowości. Ponadto, jeśli chodzi o wtórny rozwój pnia i formowanie się drewna, konkretne badane cechy mogą stać się mierzalne dopiero pod koniec cyklu życia drzewa, po kilku latach wzrostu. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano alternatywne protokoły in vivo, zwane Indukowaną Analizą Sektorów Somatycznych, które polegają na tworzeniu transgenicznych sektorów tkanki somatycznej bezpośrednio w wtórnej łodydze rośliny. Celem tego protokołu jest zapewnienie skutecznego, łatwego i stosunkowo szybkiego sposobu tworzenia transgenicznej wtórnej tkanki roślinnej do charakterystyki funkcjonalnej genów i promotorów, która może być wykorzystana w wielu gatunkach drzew. Zaprezentowane tutaj wyniki pokazują, że transgeniczne wtórne sektory łodyg mogą być tworzone we wszystkich żywych tkankach i typach komórek w wtórnych pniach różnych gatunków drzew oraz że cechy morfologiczne drewna, a także wzorce ekspresji promotorów w pędach wtórnych mogą być łatwo oceniane, co ułatwia charakterystykę funkcjonalną o średniej i wysokiej przepustowości.

Zgodnie z tym protokołem wszystkie żywe komórki macierzyste oraz typy tkanek wtórnych okazały się podatne na transformację przez A. tumefaciens i zostały sklasyfikowane do typów sektorów na podstawie pierwotnie przekształconego typu komórki oraz jej późniejszego wzorca wzrostu rozwojowego. Typy sektorów obejmują naskórek, floem, miazgię, miękisz rany i zatkania (tylozy) (Ryc. 1b, 1c, 1d) i występują w spójnych lokalizacjach opisa...

Tutaj prezentujemy protokół, który ułatwia funkcjonalną charakterystykę genów i konstruktów promotorowych w wtórnej tkance pnia drzewa w stosunkowo krótkim czasie. Jest wydajny, łatwy w użyciu i ma szerokie zastosowanie w przypadku wielu gatunków drzew.

Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Ogólnym celem analizy indukowanych sektorów somatycznych jest zapewnienie techniki o średniej lub wysokiej przepustowości do funkcjonalnej charakterystyki konstruktów genowych i promotorowych w tkankach wtórnych pędów drzew w stosunkowo krótkim czasie. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, gdzie i kiedy dochodzi do ekspresji genów, a także ich roli w istotnych biologicznie procesach, takich jak drewnienie i wtórny wzrost pędów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to procedura wydajna, łatwa i stosunkowo szybka, którą można zastosować w odniesieniu do szerokiego zakresu gatunków drzew.Na początek należy przygotować czystą probówkę z nakrętką o pojemności 50 ml, zawierającą 19 ml świeżego podłoża LB w temperaturze 28 °C z odpowiednimi antybiotykami do selekcji bakterii. Dodać jeden ml hodowli A.tumefaciens i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Jeśli OD przekracza 0,1, należy ją dodatkowo rozcieńczyć ciepłym podłożem LB. Hodowlę A.tumefaciens należy umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem do momentu, aż OD 600 osiągnie wartość od 0,4 do 0,6.Po osiągnięciu tego etapu odwiruj komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy 1 000 × g. Odlej ciecz z probówki i natychmiast zawieś osad komórkowy w 1 mL schłodzonej pożywki MS. Przenieś zawiesinę do czystej mikroprobówki o pojemności 2 mL i przechowuj na lodzie do momentu użycia.Eksperyment należy rozpocząć wiosną lub wczesnym latem, wybierając rośliny z aktywnym i szybko rosnącym kambium. Można to potwierdzić, jeśli łyko daje się łatwo oddzielić od drewna. Należy zidentyfikować prosty odcinek łodygi w pobliżu podstawy rośliny i usunąć z niego wszelkie liście lub gałązki.Za pomocą ostrego skalpela wykonaj kambialne okno o powierzchni jednego centymetra kwadratowego, wykonując dwa równoległe, 20 milimetrowe nacięcia w floemie w odstępie pięciu milimetrów, a następnie pojedyncze, poziome cięcie przecinające oba nacięcia pionowe u podstawy. Oddziel pasek floemu w górę, odsłaniając rozwijającą się tkankę ksylemu. Następnie, używając pipety, dodaj odpowiednią ilość podłoża inokulacyjnego, aby całkowicie zwilżyć powierzchnię odsłoniętego ksylemu.Następnie niezwłocznie ponownie wprowadź pasek łyka do łodygi i mocno zabezpiecz go w tym miejscu parafilmem. Powtórz te etapy inokulacji dla wszystkich interesujących genów lub promotorów, tworząc nowe okna kambialne co najmniej jeden centymetr powyżej lub poniżej istniejących okien i z przesunięciem o 90 stopni. Dodatkowo, w taki sam sposób jak w przypadku inokulatów eksperymentalnych, zaszczep okna wektorami kontrolnymi pozytywnymi i negatywnymi na tej samej łodydze lub łodygach.Okresowo monitoruj wzrost łodygi, a po zaobserwowaniu przyrostu radialnego wynoszącego co najmniej pięć milimetrów, pobierz tkankę do analizy beta-glukuronidazy lub testu GUS. Aby pobrać materiał badawczy, najpierw wycięcie okno kambialne z łodygi, usuwając wszelką tkankę, która nie jest częścią nowego przyrostu. W badaniach dotyczących morfologii dojrzałych komórek lub tkanek ksylemu i floemu, oddziel floem od ksylemu.Alternatywnie, w przypadku badań wymagających zachowania nienaruszonej strefy kambialnej lub oceny wzorców ekspresji promotora, należy przekroić okno kambialne w poprzek za pomocą żyletki, aby utworzyć krążki o grubości od 0,5 do 1 mm. Zebrane tkanki okna kambialnego należy umieścić w oddzielnych probówkach z okrągłym dnem o pojemności 14 ml i dwukrotnie przepłukać w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7 przez pięć minut za każdym razem, upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Po zakończeniu drugiego płukania należy starannie usunąć nadmiar roztworu.Następnie do każdej probówki dodaje się 5 ml odczynnika GUS. Jeśli nie pokrywa on całkowicie próbki tkanki, należy dodać więcej odczynnika. Probówki inkubuje się przez 10 minut w temperaturze 55 °C w ciemności.Następnie inkubuj probówki przez kolejne 12 do 16 godzin w wytrząsarce w temperaturze 37 °C w ciemności, stosując łagodne mieszanie. Po wyjęciu z inkubatora pobierz losową podgrupę probówek i sprawdź pH odczynnika GUS za pomocą papierka lakmusowego o zakresie pH od 0 do 7. Jeśli w którejkolwiek z nich pH będzie niższe niż 6, oznakuj ją i sprawdź pozostałe probówki.Oznakuj i odrzuć wszystkie probówki, w których pH jest niższe niż sześć. Odlej odczynnik GUS z probówek i zastąp go wystarczającą ilością 70% etanolu, aby przykryć tkankę. Przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.Za pomocą czystej pęsety usuń całą tkankę okna kambialnego z probówki z próbką i umieść ją na małej tacy lub w szalce Petriego w celu wizualizacji mikroskopowej. Umieść próbkę pod obiektywem mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu od 1X do 4X, a następnie zidentyfikuj i podlicz liczbę komórek lub tkanek wykazujących intensywnie niebieskie barwienie. W przypadkach, w których łemka została usunięta, policz liczbę sektorów w tkance kambialnej znajdujących się na powierzchni rozwijającego się ksylemu.W przypadku próbek wyciętych w postaci krążków, należy policzyć liczbę sektorów występujących w różnych typach komórek lub tkanek. Należy upewnić się, że obejrzano obie strony krążka oraz że sektory występujące na dwóch sąsiednich krążkach zostały dopasowane, aby uniknąć przeszacowania ich liczby. Tylko tkanki zawierające sektory należy umieścić z powrotem w probówce z 70% etanolem i przechowywać do czasu użycia.Powtórz analizę dla wszystkich pozostałych pobranych okien kambialnych, w tym dla kontroli pozytywnej i negatywnej. Aby ułatwić dokładną identyfikację i klasyfikację sektorów, zalecamy zapoznanie się z anatomią i rozwojem wtórnym łodygi, w tym z reakcjami łodygi na zranienie. Na tej rycinie przedstawiono kilka udanych transformacji, widocznych tutaj jako regiony zabarwione na niebiesko.Przykładowe okno z łuszczyną łyka prezentuje liczne sektory transformowane, a tarcze pobrane od dwóch gatunków drzew wykazują sektory transformacji i późniejszy wzrost radialny. Można również zaobserwować transformację w różnych typach tkanek. Tutaj w perydermie, łyku, parenchymie rany oraz w kilku innych regionach tkankowych topoli białej widoczne są sektory łodygi.Na tym obrazie przedstawiono wyniki ekspresji promotorów genów w pochodnych kambium. W tym przykładzie widzimy proporcję barwienia w każdym typie tkanki w próbie obejmującej szereg promotorów CesA z eucalyptus grandis transformowanych do łodyg hybryd eukaliptusa. Ekspresja w floemie, ksylemie rozwijającym się i rozwiniętym jest przedstawiona jako wartość procentowa.Dla każdego promotora lub badanego genu można również obliczyć średnią liczbę zdarzeń transformacji na centymetr zaszczepionego kambium. Niniejsza tabela przedstawia dane dla typowych sektorów zidentyfikowanych w osobnikach eukaliptusa i topoli przekształconych za pomocą kontroli pozytywnej lub badanego promotora, analizowanych z wykorzystaniem metody pobierania krążków. Po opanowaniu technika ta może zapewnić szybką, wydajną i szeroko stosowalną metodę analizy złożonej natury różnicowania kambium wraz z formowaniem w przebiegu wtórnego rozwoju pędu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania roślin i bakterii, przeprowadzania transformacji, hodowli i zbioru łodyg, a także identyfikacji i klasyfikacji tkanki transgenicznej w celu oceny fenotypowej.

the-use-induced-somatic-sector-analysis-issa-for-studying-genes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.

Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Odkryj metodę ISSA do analizy genów i promotorów w tworzeniu drewna drzew. Ta technika umożliwia szybką, wydajną charakteryzację funkcjonalną w tkance łodygi wtórnej.

Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

Przeglądaj więcej filmów