Wykorzystanie indukowanej analizy sektora somatycznego (ISSA) do badania genów i promotorów zaangażowanych w tworzenie drewna i wtórny rozwój łodyg

Ogólnym celem analizy indukowanych sektorów somatycznych jest zapewnienie techniki o średniej lub wysokiej przepustowości do funkcjonalnej charakterystyki konstruktów genowych i promotorowych w tkankach wtórnych pędów drzew w stosunkowo krótkim czasie. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, gdzie i kiedy dochodzi do ekspresji genów, a także ich roli w istotnych biologicznie procesach, takich jak drewnienie i wtórny wzrost pędów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to procedura wydajna, łatwa i stosunkowo szybka, którą można zastosować w odniesieniu do szerokiego zakresu gatunków drzew.

Na początek należy przygotować czystą probówkę z nakrętką o pojemności 50 ml, zawierającą 19 ml świeżego podłoża LB w temperaturze 28 °C z odpowiednimi antybiotykami do selekcji bakterii. Dodać jeden ml hodowli A.tumefaciens i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Jeśli OD przekracza 0,1, należy ją dodatkowo rozcieńczyć ciepłym podłożem LB. Hodowlę A.tumefaciens należy umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem do momentu, aż OD 600 osiągnie wartość od 0,4 do 0,6.

Po osiągnięciu tego etapu odwiruj komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy 1 000 × g. Odlej ciecz z probówki i natychmiast zawieś osad komórkowy w 1 mL schłodzonej pożywki MS. Przenieś zawiesinę do czystej mikroprobówki o pojemności 2 mL i przechowuj na lodzie do momentu użycia.

Eksperyment należy rozpocząć wiosną lub wczesnym latem, wybierając rośliny z aktywnym i szybko rosnącym kambium. Można to potwierdzić, jeśli łyko daje się łatwo oddzielić od drewna. Należy zidentyfikować prosty odcinek łodygi w pobliżu podstawy rośliny i usunąć z niego wszelkie liście lub gałązki.

Za pomocą ostrego skalpela wykonaj kambialne okno o powierzchni jednego centymetra kwadratowego, wykonując dwa równoległe, 20 milimetrowe nacięcia w floemie w odstępie pięciu milimetrów, a następnie pojedyncze, poziome cięcie przecinające oba nacięcia pionowe u podstawy. Oddziel pasek floemu w górę, odsłaniając rozwijającą się tkankę ksylemu. Następnie, używając pipety, dodaj odpowiednią ilość podłoża inokulacyjnego, aby całkowicie zwilżyć powierzchnię odsłoniętego ksylemu.

Następnie niezwłocznie ponownie wprowadź pasek łyka do łodygi i mocno zabezpiecz go w tym miejscu parafilmem. Powtórz te etapy inokulacji dla wszystkich interesujących genów lub promotorów, tworząc nowe okna kambialne co najmniej jeden centymetr powyżej lub poniżej istniejących okien i z przesunięciem o 90 stopni. Dodatkowo, w taki sam sposób jak w przypadku inokulatów eksperymentalnych, zaszczep okna wektorami kontrolnymi pozytywnymi i negatywnymi na tej samej łodydze lub łodygach.

Okresowo monitoruj wzrost łodygi, a po zaobserwowaniu przyrostu radialnego wynoszącego co najmniej pięć milimetrów, pobierz tkankę do analizy beta-glukuronidazy lub testu GUS. Aby pobrać materiał badawczy, najpierw wycięcie okno kambialne z łodygi, usuwając wszelką tkankę, która nie jest częścią nowego przyrostu. W badaniach dotyczących morfologii dojrzałych komórek lub tkanek ksylemu i floemu, oddziel floem od ksylemu.

Alternatywnie, w przypadku badań wymagających zachowania nienaruszonej strefy kambialnej lub oceny wzorców ekspresji promotora, należy przekroić okno kambialne w poprzek za pomocą żyletki, aby utworzyć krążki o grubości od 0,5 do 1 mm. Zebrane tkanki okna kambialnego należy umieścić w oddzielnych probówkach z okrągłym dnem o pojemności 14 ml i dwukrotnie przepłukać w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7 przez pięć minut za każdym razem, upewniając się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Po zakończeniu drugiego płukania należy starannie usunąć nadmiar roztworu.

Następnie do każdej probówki dodaje się 5 ml odczynnika GUS. Jeśli nie pokrywa on całkowicie próbki tkanki, należy dodać więcej odczynnika. Probówki inkubuje się przez 10 minut w temperaturze 55 °C w ciemności.

Następnie inkubuj probówki przez kolejne 12 do 16 godzin w wytrząsarce w temperaturze 37 °C w ciemności, stosując łagodne mieszanie. Po wyjęciu z inkubatora pobierz losową podgrupę probówek i sprawdź pH odczynnika GUS za pomocą papierka lakmusowego o zakresie pH od 0 do 7. Jeśli w którejkolwiek z nich pH będzie niższe niż 6, oznakuj ją i sprawdź pozostałe probówki.

Oznakuj i odrzuć wszystkie probówki, w których pH jest niższe niż sześć. Odlej odczynnik GUS z probówek i zastąp go wystarczającą ilością 70% etanolu, aby przykryć tkankę. Przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.

Za pomocą czystej pęsety usuń całą tkankę okna kambialnego z probówki z próbką i umieść ją na małej tacy lub w szalce Petriego w celu wizualizacji mikroskopowej. Umieść próbkę pod obiektywem mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu od 1X do 4X, a następnie zidentyfikuj i podlicz liczbę komórek lub tkanek wykazujących intensywnie niebieskie barwienie. W przypadkach, w których łemka została usunięta, policz liczbę sektorów w tkance kambialnej znajdujących się na powierzchni rozwijającego się ksylemu.

W przypadku próbek wyciętych w postaci krążków, należy policzyć liczbę sektorów występujących w różnych typach komórek lub tkanek. Należy upewnić się, że obejrzano obie strony krążka oraz że sektory występujące na dwóch sąsiednich krążkach zostały dopasowane, aby uniknąć przeszacowania ich liczby. Tylko tkanki zawierające sektory należy umieścić z powrotem w probówce z 70% etanolem i przechowywać do czasu użycia.

Powtórz analizę dla wszystkich pozostałych pobranych okien kambialnych, w tym dla kontroli pozytywnej i negatywnej. Aby ułatwić dokładną identyfikację i klasyfikację sektorów, zalecamy zapoznanie się z anatomią i rozwojem wtórnym łodygi, w tym z reakcjami łodygi na zranienie. Na tej rycinie przedstawiono kilka udanych transformacji, widocznych tutaj jako regiony zabarwione na niebiesko.

Przykładowe okno z łuszczyną łyka prezentuje liczne sektory transformowane, a tarcze pobrane od dwóch gatunków drzew wykazują sektory transformacji i późniejszy wzrost radialny. Można również zaobserwować transformację w różnych typach tkanek. Tutaj w perydermie, łyku, parenchymie rany oraz w kilku innych regionach tkankowych topoli białej widoczne są sektory łodygi.

Na tym obrazie przedstawiono wyniki ekspresji promotorów genów w pochodnych kambium. W tym przykładzie widzimy proporcję barwienia w każdym typie tkanki w próbie obejmującej szereg promotorów CesA z eucalyptus grandis transformowanych do łodyg hybryd eukaliptusa. Ekspresja w floemie, ksylemie rozwijającym się i rozwiniętym jest przedstawiona jako wartość procentowa.

Dla każdego promotora lub badanego genu można również obliczyć średnią liczbę zdarzeń transformacji na centymetr zaszczepionego kambium. Niniejsza tabela przedstawia dane dla typowych sektorów zidentyfikowanych w osobnikach eukaliptusa i topoli przekształconych za pomocą kontroli pozytywnej lub badanego promotora, analizowanych z wykorzystaniem metody pobierania krążków. Po opanowaniu technika ta może zapewnić szybką, wydajną i szeroko stosowalną metodę analizy złożonej natury różnicowania kambium wraz z formowaniem w przebiegu wtórnego rozwoju pędu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania roślin i bakterii, przeprowadzania transformacji, hodowli i zbioru łodyg, a także identyfikacji i klasyfikacji tkanki transgenicznej w celu oceny fenotypowej.