Name: Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metody izolacji, hodowli i charakterystyki miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy. Technika ta umożliwia badania elektrofizjologiczne i obrazowanie komórek serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Christianowi Rickertowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez grant z National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) dla CP. EJS był wspierany przez 5T32-AG000279 z National Institute on Aging. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kampusu Medycznego Anschutz Uniwersytetu Kolorado. Poniższy standardowy protokół został zoptymalizowany przy użyciu samców myszy C57BL/6J w wieku 2-3 miesięcy.
1. Przygotuj zapasy roztworów i zapasy przed eksperymentami
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat niezbędnego sprzętu i materiałów.
<ol>
	<li>Przygotować po 1 litrze każdego z następujących roztworów, jak wskazano w Tabeli 1: kompletny tyród, tyród o niskiej zawartości Ca2+/Mg2+, zmodyfikowany roztwór Krafta-Brühe'a (KB) i roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Do wszystkich roztworów używaj ultraczystej, filtrowanej wody dejonizowanej. Podzielić każdy roztwór na 50 ml porcji i przechowywać w temperaturze 20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Rozmrozić poszczególne porcje bezpośrednio przed eksperymentami i przechowywać przez okres do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 50 ml 10 mM roztworu adaptacyjnego NaCl i 1,8 mM CaCl2, rozpuszczając NaCl i CaCl2 w ultraczystej przefiltrowanej wodzie dejonizowanej (Tabela 1). Przechowywać w temperaturze pokojowej do sześciu miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 4,75 porcji elastazy w jednostce aktywności enzymatycznej (U), pipetując do probówek do mikrofuge. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.</li>
	<li>Przygotować 375 μg podwielokrotności (w ultraczystymH2O) mieszaniny enzymów kolagenazy i proteazy, pipetując do probówek do mikrofuge. Przechowywać w temperaturze -20 °C do trzech miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj dwie wypolerowane na ogniowo pipety Pasteura, jedną do transferu tkanek (~1,5 mm końcowa średnica otworu; Rysunek 1Aiv i Rysunek 1C) i jeden do dysocjacji (średnica ~2 mm; Rysunek 1Aiii i Rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Naciąć pipety Pasteura nożem do szkła i zatrzasnąć wzdłuż nacięcia, aby uzyskać otwór nieco większy niż pożądany rozmiar. Wypoleruj odciętą końcówkę każdej pipety przez ~ 30-60 sekund na małym ogniu na palniku Bunsena, aby uzyskać grubą wypolerowaną ściankę i otwór o pożądanej średnicy. Upewnij się, że wypolerowany ogniowo otwór jest wolny od pęknięć lub ostrych krawędzi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować dwie szalki rozwarstwiające, dodając ~25 ml elastomeru silikonowego zmieszanego zgodnie ze wskazówkami producenta do każdej szalki Petriego o średnicy 100 mm (Rysunek 1Ai i Rysunek 1B). Pozostawić do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.</li>
	<li>Wyłącznie w przypadku hodowli: przygotować po 25–50 ml pożywki galwanicznej i pożywki hodowlanej zgodnie z tabelą 2. Przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotuj roztwory do użycia w dniu izolacji komórek
UWAGA: Poniższe ilości służą do izolacji miocytów zatokowo-przedsionkowych od jednej myszy.
<ol>
	<li>Dodaj 2,5 ml Low Ca2+/Mg2+ Tyrode (pH 6,9) do każdej z trzech małych, okrągłodennych probówek hodowlanych. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml Low Ca2+/Mg2+ Tyrode do jednej dużej probówki hodowlanej z okrągłym dnem. Do tej probówki dodać 1 podwielokrotność (4,75 U) elastazy i jedną podwielokrotność (375 μg) mieszanki enzymów kolagenazy i proteazy. Zamieszaj, aby wymieszać. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml KB Medium do trzech dodatkowych małych, okrągłodennych probówek hodowlanych i jednej dodatkowej dużej, okrągłodennej probówki hodowlanej. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.</li>
	<li>Dodać ~7 ml roztworu BSA do jednej dużej probówki hodowlanej z dnem. Trzymaj tę probówkę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić 20-40 ml roztworu Complete Tyrode w zlewce o pojemności 50 ml (Rycina 1Aii). Dodać 10 USP/ml heparyny, zamieszać do wymieszania i umieścić zlewkę w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C.</li>
</ol>
3. Przygotuj dodatkowe roztwory i materiały dla hodowanych komórek (pomiń te kroki dla komórek ostro izolowanych)
<ol>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkankowych umieścić dwa okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na mysz w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki. 
	UWAGA: Płytka 24-dołkowa jest używana, ponieważ studzienki mają wygodny rozmiar, co służy do ograniczania objętości dla kolejnych infekcji wirusowych.</li>
	<li>Na każde szkiełko nakrywkowe pobrać pipetą około 200 μl roztworu mysiej lamininy o stężeniu 100 ng/ml rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe inkubować z lamininą przez cały czas izolacji (co najmniej 1 godzinę) w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wstępnie podgrzać pożywkę galwaniczną i pożywkę hodowlaną (z kroku 1.7 i tabeli 3) do temperatury 37 °C.</li>
</ol>
4. Izolacja węzła zatokowo-przedsionkowego
<ol>
	<li>W dygestorium chemicznym umieść mysz w jednej komorze dwukomorowego pudełka i znieczulenie ~200 μl płynnego izofluranu wprowadzonego za pomocą wacika do drugiej komory. Potwierdź znieczulenie (zwykle w ciągu ~30-60 sekund) szczyptą palca u nogi. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. 
	UWAGA: Do utworzenia pudełka dwukomorowego można użyć pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1 ml; Odwróć stojak do góry nogami w pudełku, aby utworzyć oddzielną komorę na izofluran, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z nim.</li>
	<li>Usuń sierść z klatki piersiowej za pomocą nożyczek i klatki piersiowej przez transekt, aby odsłonić klatkę piersiową za pomocą zewnętrznych kleszczy tkankowych (ryc. 1Aviii) i nożyczek do preparowania (ryc. 1Avix). Umyj klatkę piersiową w ~2 ml ogrzanego Complete Tyrode's z heparyną za pomocą pipety transferowej. 
	UWAGA: W razie potrzeby kontynuować kąpiel klatki piersiowej, nie dopuścić do wyschnięcia preparatu.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń płuca i grasicę za pomocą wewnętrznych nożyczek (ryc. 1Avi) i kleszczy preparacyjnych (ryc. 1Avii).</li>
	<li>Delikatnie przytrzymując wierzchołek serca wewnętrznymi kleszczami preparacyjnymi, ostrożnie przeciąć żyłę główną dolną i aortę nożyczkami wewnętrznymi, aby usunąć serce z jamy klatki piersiowej. Przenieś serce do jednej z silikonowych naczyń rozwarstwiających i wykąp się w ~4 ml podgrzanego heparynizowanego Complete Tyrode's za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Ustaw serce tak, aby tylne naczynia były widoczne i skierowane do góry, z prawym przedsionkiem zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora i lewym przedsionkiem po lewej stronie eksperymentatora. Po orientacji unieruchom serce należy unieruchomić, przypinając wierzchołek do silikonowego naczynia preparacyjnego.</li>
	<li>Zlokalizuj rowek między komorami a przedsionkami (przezroczysty pierścień nad komorami). </li>
	<li>Za pomocą wewnętrznych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w rowku, trzymając się bliżej komór niż przedsionków. W razie potrzeby przepłukać rowek i nacięcie dodatkowymi rozgrzanymi heparynizowanymi Complete Tyrode, aby zapewnić wyraźny widok przedsionków i zastawek. Kontynuuj cięcie wzdłuż rowka, aby oddzielić przedsionki od komór.</li>
	<li>Przenieś tkankę przedsionkową do drugiego silikonowego naczynia rozwarstwiającego i wykąp się w ~ 3 ml podgrzanego heparynizowanego Complete Tyrode's.</li>
	<li>Ustaw tkankę tak, aby prawy przedsionek zwierzęcia znajdował się teraz po lewej stronie eksperymentatora, a lewe przedsionek po prawej. 
	UWAGA: Prawe przedsionek jest bardziej przezroczysty, podczas gdy lewe przedsionek ma bardziej ciemnoczerwony odcień.</li>
	<li>Przypiąć tkankę przez żyłę główną dolną i górną oraz przydatki prawego i lewego przedsionka, delikatnie rozciągając preparat. Usuń resztki tłuszczu lub innej tkanki, aby zapewnić wyraźny widok preparatu (należy uważać, aby nie przeciąć ściany przedsionka, ponieważ węzeł zatokowo-przedsionkowy jest dość delikatny i może łatwo ulec uszkodzeniu).</li>
	<li>Otwórz przednią ścianę przedsionków, przecinając żyły główne. W razie potrzeby zmień położenie szpilek, aby uwidocznić przegrodę międzyprzedsionkową.</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć lewy przedsionek. Ponownie przypnij preparat, delikatnie rozciągając.</li>
	<li>Usuń wyrostek prawego przedsionka i uwolnij węzeł zatokowo-przedsionkowy, przecinając wzdłuż cristae terminalis, który pojawia się jako ciemnopomarańczowa smuga granicząca z uszkiem przedsionka.</li>
	<li>Ponownie przypnij tkankę węzłową i przetnij ją bocznie (prostopadle do crista terminalis), aby uzyskać trzy paski o jednakowej wielkości.</li>
</ol>
5. Trawienie węzłów zatokowo-przedsionkowych
<ol>
	<li>Za pomocą wąskiej, wypolerowanej ogniowo pipety (ryc. 1Aiv) przenieś trzy paski tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego do pierwszej z trzech małych, okrągłodennych probówek zawierających 2,5 ml tyrode o niskiej zawartości Ca2+/Mg2+ w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C. Inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść paski tkanek do drugiej małej, okrągłej probówki zawierającej 2,5 ml Tyrode o niskiej zawartości Ca2+/Mg2+ w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C, używając tej samej wąskiej pipety. Umyj paski chusteczek, delikatnie obracając rurkę lub delikatnie pipetując wąską pipetą. Nie odwracaj rurki.</li>
	<li>Przenieść paski tkanek do trzeciej małej, okrągłej probówki zawierającej 2,5 ml Tyrode o niskiej zawartościCa2+/Mg2+ i powtórzyć etap płukania opisany w kroku 5.2.</li>
	<li>Przenieść paski do dużej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml Tyrode o niskiej zawartościCa2+/Mg2+ z enzymami (elastaza plus mieszanina kolagenazy i proteazy) w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C. Upewnij się, że wszystkie trzy paski tkanek są obecne. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 35 ± 1 °C. Mieszać co 5 minut, delikatnie obracając probówkę. Nie odwracaj rurki.</li>
</ol>
6. Dysocjacja miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego
<ol>
	<li>Po roztrawieniu enzymatycznym za pomocą wąskiej, wypolerowanej ogniowo pipety delikatnie przenieść paski tkanek do pierwszej małej, okrągłodennej probówki zawierającej 2,5 ml roztworu KB w temperaturze 35 ± 1 °C. Umyć chusteczkę, delikatnie obracając probówkę. 
	Uwaga: Paski tkanek będą wydawać się nieco przezroczyste i mogą w tym momencie zbijać się ze sobą. Po trawieniu enzymatycznym należy obchodzić się bardzo delikatnie, aby uniknąć utraty komórek.</li>
	<li>Przenieść chusteczkę do drugiej małej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml KB w temperaturze 35 ± 1 °C. Delikatnie zamieszać do przemycia.</li>
	<li>Przenieść chusteczkę do trzeciej małej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml KB w temperaturze 35 ± 1 °C. Delikatnie zamieszać do przemycia.</li>
	<li>Przenieść tkankę do dużej probówki okrągłodennej zawierającej 2,5 ml KB w temperaturze 35 ± 1 °C.</li>
	<li>Używając większej, polerowanej ogniowo pipety (Rysunek 1Aiii i Rysunek 1C), rozdzielić komórki w dużej probówce z okrągłym dnem poprzez ciągłe wycieranie z częstotliwością około 0,5-1 Hz przez 5-10 minut, uważając, aby rurka dysocjująca była zanurzona w łaźni wodnej o temperaturze 35 ± 1 °C i aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków do roztworu. 
Uwaga: Czas rozcierania różni się w zależności od średnicy pipety dysocjacyjnej i siły pipetowania. Czas należy dostosować tak, aby fragmenty tkanki pozostałe na końcu dysocjacji wydawały się cienkie, przezroczyste i delikatne. Jeśli tkanka zachowa jakikolwiek kolor, dysocjacja prawdopodobnie będzie niepełna. Częstotliwość (0,5-1 Hz) jest określana ręcznie.</li>
	<li>Wyjąć okrągłodenną probówkę zawierającą zdysocjowane SAM z łaźni wodnej i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
</ol>
7. Readaptacja wapnia w węźle zatokowo-przedsionkowym (przeprowadzona w temperaturze pokojowej)
UWAGA: Dla SAM-ów przeznaczonych do eksperymentów hodowlanych, procedury opisane w następnej sekcji powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej. Jeśli SAM mają być używane do ostrych eksperymentów, nie ma potrzeby wykonywania tych kroków w sterylnym środowisku.
<ol>
	<li>Dodać 75 μl roztworu adaptacyjnego NaCl/CaCl2 (Tabela 2). Delikatnie mieszaj i inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 160 μl roztworu adaptacyjnego NaCl/CaCl2. Delikatnie mieszaj i inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 390 μl roztworu BSA (tabela 2). Delikatnie zamieszać i inkubować przez 4 minuty.</li>
	<li>Dodać 1,25 ml roztworu BSA. Delikatnie zamieszać i inkubować przez 4 minuty.</li>
	<li>Dodać 4,37 ml roztworu BSA. Delikatnie mieszać i inkubować przez 4 min. 
	Uwaga: Końcowe stężenie wapnia wyniesie 1,8 mM.</li>
	<li>Po readaptacji wapnia zebrać SAM, pozostawiając do osiadania grawitacyjnie przez ~10 minut lub przez wirowanie przy ~2,000 x g przez 3 minuty.
	<ol>
		<li>W przypadku ostro wyizolowanych komórek delikatnie usuń i wyrzuć około 5 ml supernatantu za pomocą szklanej pipety Pasteura, pozostawiając komórki w objętości ~2 ml. Przechowuj te komórki w temperaturze pokojowej do ~8 godzin w celu nagrań patch clamp.</li>
		<li>W przypadku komórek hodowlanych należy usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża galwanicznego (tabela 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Posiew i hodowla miocytów zatokowo-przedsionkowych (pomiń dla komórek ostro izolowanych)
<ol>
	<li>Usunąć roztwór lamininy z szkiełek nakrywkowych z kroku 3.3 za pomocą pipety Pasteura. Natychmiast wysiewać 500 μl (~50-100 komórek) na każde szkiełko nakrywkowe pokryte lamininą (od kroku 3). 
	UWAGA: Inhibitor kurczliwości monoksymu 2,3-butanodionu (BDM) jest zawarty w pożywce posiewnej i hodowlanej, aby zapobiec skurczowi, który powoduje ścieranie komórek9.</li>
	<li>Włożyć 24-dołkową płytkę zawierającą nowo wysiane SAM do inkubatora i utrzymywać w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza/5% CO2 . Pozostawić komórki do przylegania do szkiełek nakrywkowych przez 4-6 godzin w podłożu galwanicznym (Tabela 2).</li>
	<li>Delikatnie usunąć podłoże galwaniczne za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zastąp 500 μl na studzienkę wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża hodowlanego (tabela 2).</li>
</ol>
9. Transdukcja adenowirusowa kultur dorosłych miocytów zatokowo-przedsionkowych (pomiń dla komórek ostro izolowanych)
<ol>
	<li>Oszacuj liczbę komórek w szkiełku nakrywkowym bezpośrednio przed nałożeniem adenowirusa, licząc komórki w polu widzenia pod mikroskopem, dostosowując do powiększenia. Policz wszystkie komórki, nie tylko SAM.</li>
	<li>Rozcieńczyć adenowirusa w pożywce 199 i dostosować rozcieńczenie do miana wirusa tak, aby wymagane było zastosowanie 1-10 μl w celu uzyskania końcowej wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100 jednostek wirusowych na komórkę. Roztwór adenowirusowy dodawać kroplami bezpośrednio na posiane SAM.</li>
	<li>Inkubuj komórki z pożywką zawierającą wirusa przez noc (~12-14 godzin). Następnie wymień ze świeżą pożywką hodowlaną. Utrzymuj komórki w inkubatorze, zmieniając pożywkę hodowlaną co 48 godzin, aż do uzyskania pożądanej ekspresji białka.</li>
</ol>
10. Ocena funkcjonalna ostro izolowanych lub hodowanych SAM
UWAGA: Poniższy protokół jest przykładem oceny funkcjonalnej izolowanych SAM przy użyciu techniki perforowanej łaty amfoterycyny do rejestrowania zarówno spontanicznych AP, jak i If z tej samej komórki (patrz odniesienie9).
<ol>
	<li>Przygotować roztwory do nagrywania zgodnie z opisem w tabeli 3.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 20 mg/ml amfoterycyny-B w DMSO świeży w dniu rejestracji. Przechowywać bulion w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. Rozcieńczyć zapas amfoterycyny-B w roztworze wewnątrzkomórkowym do końcowego stężenia 200 ug/ml bezpośrednio przed użyciem. Końcowy roztwór pipet należy utrzymywać na lodzie i chronić przed światłem. 
	UWAGA: Roztwór pipety zawierający amfoterycynę do doświadczeń powinien być przygotowywany świeży co godzinę, rozcieńczając podwielokrotność roztworu podstawowego do roztworu wewnątrzkomórkowego i wirując przez co najmniej 1 minutę.</li>
	<li>Przenieść podwielokrotność ostro zdysocjowanej zawiesiny komórek SAM lub fragment szklanego szkiełka nakrywkowego zawierającego wyhodowane SAM do komory rejestracyjnej zawierającej roztwór Tyrode'a w temperaturze 35 ± 1 °C. Perfuzję komórek roztworem Tyrode'a przez co najmniej 2 minuty przed zapisami elektrofizjologicznymi w celu usunięcia wszelkich pozostałości BDM z pożywki hodowlanej. 
UWAGA: Spontaniczne skurcze powinny być widoczne natychmiast po przeniesieniu do roztworu Tyrode. SAM do rejestracji można zidentyfikować na podstawie kombinacji cech, w tym spontanicznej aktywności skurczowej, charakterystycznej morfologii (np. Ryc. 2), braku prążków, ekspresji białka HCN4, obecności prądu IF, pojemności błony <50 pF i spontanicznych AP z przebiegami, które obejmują rozkurczową fazę depolaryzacji i powolny ruch w górę.</li>
	<li>Za pomocą pipet ze szkła borokrzemianowego o rezystancji 1,5-3,0 MΩ napełnij końcówkę roztworem wewnątrzkomórkowym pozbawionym amfoterycyny, zanurzając ją na 10-30 sekund. Następnie napełnić pipetę roztworem zawierającym amfoterycynę. Plombę dołączoną do ogniwa GΩ należy uzyskać tak szybko, jak to możliwe. Jeśli formowanie uszczelki jest trudne, należy wydłużyć czas napełniania końcówki. 
	UWAGA: Rezystancja dostępu powinna być stale monitorowana po utworzeniu plomby przymocowanej do ogniwa, a zapisy należy rozpocząć dopiero po uzyskaniu stabilnej rezystancji dostępu <10 MΩ.</li>
	<li>Aby nagrywać spontaniczne punkty dostępowe, przełącz wzmacniacz w tryb szybkich cęgów prądowych bez wstrzykiwania prądu. 
	UWAGA: Izoproterenol 1 nM jest zawarty w zewnątrzkomórkowym roztworze Tyrode'a podczas nagrywania AP w celu ustabilizowania szybkości wypalania, jak wcześniej zgłoszono10.</li>
</ol>

<ol><li>Irisawa, H., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+currents+in+mammalian+nodal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Pacemaker currents in mammalian nodal cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).</li>
<li>DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+mechanisms+in+cardiac+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pacemaker mechanisms in cardiac tissue.</a> Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).</li>
<li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).</li>
<li>Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+keeps+us+ticking%3A+a+funny+current%2C+a+calcium+clock%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).</li>
<li>Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+modulation+of+hyperpolarization-activated+HCN4+channels+by+protein+kinase+A+in+the+mouse+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node.</a> J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).</li>
<li>Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myristoylated+peptides+potentiate+the+funny+current+%28I%28f%29%29+in+sinoatrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes.</a> Channels. 5 (2), 115-119 (2011).</li>
<li>Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+pacemaker+activity+of+sinoatrial+node+myocytes+contributes+to+the+age-dependent+decline+in+maximum+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate.</a> Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).</li>
<li>St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA-independent+activation+of+I%28f%29+by+cAMP+in+mouse+sinoatrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes.</a> Channels. 7 (4), 318-321 (2013).</li>
<li>St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+sinoatrial+node+myocytes+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).</li>
<li>Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+activating+delayed+rectifier+K%2B+current+regulates+pacemaker+activity+in+adult+mouse+sinoatrial+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).</li>
<li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+hyperpolarization-activated+current+%28I%28f%29%29+in+isolated+mouse+sino-atrial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).</li>
<li>Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+properties+of+spontaneously+beating+pacemaker+cells+isolated+from+mouse+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).</li>
<li>Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+C-type+natriuretic+peptide+on+ionic+currents+in+mouse+sinoatrial+node%3A+a+role+for+the+NPR-C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).</li>
<li>Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Heart+Rate+and+Sinoatrial+Node+Function+in+Mice+Lacking+the+cAMP+Regulator+Phosphoinositide+3-Kinase-%5Cgamma%5C%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\.</a> Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).</li>
<li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PloS ONE. 7 (10), e47652(2012).</li>
<li>Groenke, S., Larson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+atrial-specific+knockout+of+sodium-calcium+exchange+eliminates+sinoatrial+node+pacemaker+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity.</a> PloS ONE. 8 (11), e81633(2013).</li>
<li>Torrente, A. G., Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Denyer, J. C., Brown, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+sino-atrial+node+cells%3A+isolation+and+electrophysiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties.</a> J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).</li>
<li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Borlak, J., Zwadlo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+ATPase+inhibitor+2%2C3-butanedione+monoxime+dictates+transcriptional+activation+of+ion+channels+and+Ca%282%2B%29-handling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molec+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins.</a> Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).</li>
</ol>

W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły izolacji i hodowli w pełni zróżnicowanych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego od dorosłych myszy. Protokół izolacji niezawodnie wytwarza spontanicznie aktywne mysie SAM-y nadające się do natychmiastowej analizy elektrofizjologicznej lub późniejszej hodowli. Podobne protokoły zostały zgłoszone przez wiele innych grup (na przykład patrz odnośniki11,12,10,13-17). Jednak nasz protokół utrzymywania dorosłych myszy SAM in vitro zachowuje charakterystyczną morf...

Miocyty rozrusznika serca w węźle zatokowo-przedsionkowym serca (miocyty zatokowo-przedsionkowe, "SAM") generują spontaniczne, rytmiczne potencjały czynnościowe (AP), które rozchodzą się przez mięsień sercowy, inicjując każde uderzenie serca. Eksperymenty z użyciem ostro izolowanych SAM od wielu gatunków były niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów, które przyczyniają się do generowania aktywności rozrusznika serca. SAM to wysoce wyspecjalizowane kardiomiocyty, które znacznie różnią się od swoich odpowiedników w mięśniu sercowym przedsionkowym i komorowym pod względem morfologii, funkcji i ekspresji białek. Cechą charakterystyczną spontanicznych AP w SAM jest spontaniczna depolaryzacja podczas rozkurczu, która doprowadza potencjał błonowy do progu, aby wyzwolić następny AP1,2. Ten "potencjał rozrusznika" zależy od skoordynowanej aktywności wielu różnych prądów błonowych, w tym "prądu śmiesznego" (I f), prądów wapniowych typu T i L oraz prądu wymiennika sodowo-wapniowego (INCX), który jest napędzany przez uwalnianie Ca2+ z retikulum sarkoplazmatycznego3,4.
Podczas gdy dokładnie izolowane mysie SAM-y są niezbędnym eksperymentalnym przygotowaniem do badania rozruszników serca, izolacja SAM-ów od myszy może być trudna do przyjęcia, ponieważ niewyraźna anatomia i mały rozmiar mysiego SAN wymagają szczegółowej mikrodysekcji, a połączona enzymatyczna i mechaniczna dysocjacja komórek wymaga starannej optymalizacji.
Udostępniamy tutaj szczegółową demonstrację wideo protokołu, który został z powodzeniem wykorzystany do izolacji SAM od dorosłych myszy w celu nagrań z zaciskiem łaty5-8. O ile nam wiadomo, nie ma takiej wizualnej demonstracji dostępnej z żadnego innego źródła. Ponadto zademonstrowano nową metodę, w której wyizolowane SAM od dorosłych myszy mogą być utrzymywane in vitro przez kilka dni, umożliwiając w ten sposób wprowadzenie białek, genetycznie kodowanych cząsteczek reporterowych lub RNAi poprzez infekcję adenowirusową9.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Sylgruard/Elastomer Dow</td><td>Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>Pipety borokrzemianowe 9"</td><td>Pasteur Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Małe, okrągłodenne probówki hodowlane</td><td>Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Duże, okrągłodenne probówki hodowlane</td><td>Corning</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Worthington Biochemiczny</td><td>LS002279</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Roztwór do dysocjacji tkanek</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>SAGENT Pharmaceuticals&nbsp;</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Laminin</td><td>Corning</td><td>CB-354232</td><td></td></tr><tr><td>12 mm okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td></td></tr><tr><td>Ad-eGFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa, jednorazowa pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro nożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Kleszcze</td><td>Roboz Instruments</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek</td><td>Roboz Instruments</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do preparowania tęczówki</td><td>WPI, Inc.</td><td></td><td></td>501264</tr><tr><td>Szpilki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>60353</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>tauryna</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>K-glutaminian</td><td>Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>K-asparaginian</td><td>Sigma</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>kreatyna</td><td>Sigma</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna-B</td><td>Fisher Scientific</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Izoproterenol</td><td>Calbiochem</td><td>420355</td><td></td></tr><tr><td>Media199</td><td>Sigma</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Hyclon</td><td>SV30010</td><td></td></tr></tbody></table>

metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Miocyty węzłów zatokowo-przedsionkowych (SAM) działają jak naturalne rozruszniki serca, inicjując każde uderzenie serca poprzez generowanie spontanicznych potencjałów czynnościowych (AP). Te AP rozrusznika serca odzwierciedlają skoordynowaną aktywność licznych prądów błonowych i wewnątrzkomórkowy obieg wapnia. Jednak dokładne mechanizmy, które napędzają spontaniczną aktywność rozrusznika serca w SAM, pozostają nieuchwytne. Ostro izolowane SAM są niezbędnym przygotowaniem do eksperymentów mających na celu zbadanie molekularnych podstaw rozrusznika serca. Jednak niewyraźna anatomia, złożona mikrodysekcja i wybredne warunki trawienia enzymatycznego uniemożliwiły powszechne stosowanie ostro izolowanych SAM. Ponadto do niedawna nie były dostępne metody pozwalające na długoterminową hodowlę SAM do badań ekspresji białek. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku i demonstrację wideo dotyczącą izolacji SAM od dorosłych myszy. Zademonstrowano również metodę utrzymywania dorosłych myszy SAM in vitro oraz ekspresji białek egzogennych poprzez zakażenie adenowirusowe. Ostro wyizolowane i wyhodowane SAM przygotowane tymi metodami nadają się do różnych badań elektrofizjologicznych i obrazowych.

Protokoły opisane w niniejszym opracowaniu były wcześniej stosowane do izolacji spontanicznie aktywnych SAM z dorosłych myszy, które nadają się do różnych badań metodą patch clamp5-8. Ponadto protokoły te umożliwiają izolację SAM, które mogą być utrzymywane w hodowli przez maksymalnie jeden tydzień. Transfer genów do hodowanych komórek można przeprowadzić za pomocą infekcji adenowirusowej9. Wyniki przedstawione w tej sekcji pochodzą z naszych poprzednich prac i są tu...

Metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAM) od dorosłych myszy do elektrofizjologii lub badań obrazowych. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą być utrzymywane w hodowli, aby umożliwić ekspresję interesujących białek, takich jak genetycznie kodowane reportery.

Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja spontanicznie aktywnych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego od myszy na potrzeby krótko- lub średnioterminowych eksperymentów elektrofizjologicznych lub obrazowych. Izolowane miocyty węzła zatokowo-przedsionkowego są istotne dla badania mechanizmów rozrusznikowych serca, w szczególności w badaniach nad specyficznymi prądami jonowymi lub czasem uwalniania wapnia wewnątrzkomórkowego. Jednak stosunkowo niewiele laboratoriów wykorzystuje izolowane miocyty zatokowe od myszy, częściowo dlatego, że bardzo trudno jest opanować tę procedurę wyłącznie na podstawie opisów pisemnych.Po przygotowaniu wszystkich wymaganych roztworów do izolacji, usuń nożyczkami futro z klatki piersiowej zwierzęcia. Następnie, używając zewnętrznych pęset tkankowych i nożyczek do sekcji, przetnij klatkę piersiową, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Przepłucz jamę klatki piersiowej dwiema mililitrami podgrzanego pełnego roztworu Tyrode'a z heparyną.Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie usuń płuca i grasicę za pomocą nożyczek anatomicznych i pęsety do sekcji. Delikatnie trzymając wierzchołek serca, ostrożnie przetnij żyłę główną dolną oraz aortę, aby usunąć serce z jamy klatki piersiowej. Następnie przenieś serce do jednej z silikonowych szalek do sekcji i przepłucz je od dwiema do czterech mililitrów podgrzanego, heparynowanego pełnego roztworu Tyrode'a.Ustaw serce w taki sposób, aby naczynia tylne były widoczne i skierowane do góry. Następnie unieruchom serce, przypinając je przez wierzchołek do silikonowej korytka sekcyjnego. Po tym kroku zlokalizuj bruzdę między komorami a przedsionkami.Używając wewnętrznych nożyczek sekcyjnych, wykonaj nacięcie w bruździe, prowadząc je blisko komór. Przepłucz bruzdę i nacięcie dodatkowym, ogrzanym, heparynowanym pełnym roztworem Tyrode'a w razie potrzeby, aby uzyskać wyraźny widok na przedsionki i zastawki. Następnie kontynuuj cięcie wzdłuż bruzdy, aby oddzielić przedsionki od komór.Następnie przenieś tkankę przedsionków do drugiej silikonowej szalki do sekcji i przemyj ją trzema mililitrami ogrzanego, heparynowanego pełnego roztworu Tyrode'a. Następnie, delikatnie rozciągając preparat, przypnij tkankę przez żyłę główną dolną. Po tym odwróć tkankę tak, aby prawy przedsionek zwierzęcia znajdował się po lewej stronie eksperymentatora, a lewy przedsionek po prawej stronie eksperymentatora.Bardzo ważne jest uzyskanie i rozpoznanie orientacji anatomicznej w celu wyizolowania właściwej tkanki. Następnie należy przyszpilić tkankę przez żyłę główną górną, a potem przez prawe i lewe uszka przedsionków. Usunąć pozostałą tkankę tłuszczową lub inne tkanki, aby zapewnić przejrzystą widoczność preparatu.Następnie otwórz ścianę przednią przedsionków, przecinając żyły główne. Obracaj naczynie w razie potrzeby, aby przeprowadzić sekcję zarówno żyły głównej górnej, jak i dolnej. Przesuń szpilki w razie potrzeby, aby uwidocznić przegrodę międzyprzedsionkową.Następnie należy przeciąć preparat wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć lewy przedsionek. Ponownie przypnij preparat, delikatnie go rozciągnij i usuń tłuszcz znajdujący się za węzłem zatokowo-przedsionkowym. Po tym etapie usuń ucho prawego przedsionka, a następnie uwolnij węzeł zatokowo-przedsionkowy, przecinając grzebień końcowy (crista terminalis), który widoczny jest jako ciemnopomarańczowy pas graniczący z uchem przedsionka.Ponownie przypnij lub odepnij tkankę węzła i przetnij ją poprzecznie, aby uzyskać trzy paski o jednakowej wielkości. W tej procedurze, używając wąskiej pipety wypalanej ogniowo, przenieś trzy paski tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego do pierwszej z trzech małych probówek z okrągłym dnem zawierających 2,5 mililitrów roztworu Tyrode'a z niską zawartością wapnia i magnezu i inkubuj przez pięć minut. Po pięciu minutach przenieś paski tkanki do drugiej małej probówki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 mililitrów roztworu Tyrode'a z niską zawartością wapnia i magnezu.Przemyj paski tkanki, delikatnie obracając probówką lub ostrożnie pipetując za pomocą wąskiej pipety. Nie odwracaj probówki do góry dnem. Następnie przenieś paski tkanki do trzeciej małej probówki z dnem okrągłym zawierającej 2,5 milliliters roztworu Tyrode'a o niskiej zawartości wapnia i magnezu i powtórz etap płukania.Następnie przenieść paski do dużej probówki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 milliliters roztworu Tyrode'a z niską zawartością wapnia i magnezu z dodatkiem enzymów. Mieszać co pięć minut, delikatnie obracając probówkę. Po trawieniu enzymatycznym, za pomocą wąskiej pipety z wypalonemi końcami, delikatnie przenieść paski tkanek do pierwszej z trzech małych probówek z okrągłym dnem zawierających zmodyfikowany roztwór KB.Następnie przenieś paski przez drugą i trzecią małą probówkę z okrągłym dnem, aby wypłukać tkankę, a następnie przenieś je do dużej probówki z okrągłym dnem zawierającej roztwór KB. Używając większej pipety z polerowanymi ogniowo końcami, zdysocjuj komórki w dużej probówce z okrągłym dnem poprzez ciągłą tryturację, dbając o to, aby probówka do dysocjacji była zanurzona w kąpieli wodnej o temperaturze 35 °C i aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do roztworu. Stwierdziliśmy, że najlepiej sprawdza się energiczne wypychanie roztworu z częstotliwością około jednego razu na sekundę, czyli 1 Hz.Teraz dodaj 75 µL roztworu adaptacyjnego chlorku sodu i chlorku wapnia do tkanek. Delikatnie zamieszaj wirowym ruchem w celu wymieszania i inkubuj przez pięć minut. Kontynuuj dodawanie wapnia w odstępach określonych w protokole pisemnym.Po readaptacji do wapnia należy zebrać miocyty przedsionkowo-przedsionkowe, pozwalając im osiadać przez około 10 minut lub stosując wirowanie przy 2 000 ×g przez trzy minuty. W przypadku komórek izolowanych ostro, należy delikatnie usunąć i odrzucić około pięciu mililitrów nadsączu za pomocą pipety transferowej. Następnie komórki należy przechowywać w temperaturze pokojowej do ośmiu godzin przed przeprowadzeniem eksperymentów metodą patch clamp.Następnie można przeprowadzić oceny funkcjonalne wyizolowanych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego, wykorzystując metodę patch clamp do rejestracji spontanicznych potencjałów czynnościowych i prądów błonowych. Spontanicznie aktywne miocyty węzła zatokowo-przedsionkowego mogą być utrzymywane w hodowli do sześciu dni. Hodowane komórki zachowują ogólną morfologię bardzo zbliżoną do morfologii świeżo wyizolowanych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego, bez istotnych zmian w średniej długości, szerokości, polu przekroju poprzecznego lub pojemności błonowej komórek hodowanych w porównaniu z komórkami wyizolowanymi bezpośrednio.Komórki te nadają się do szeregu badań eksperymentalnych, takich jak rejestracja metodą clampingu prądowego i napięciowego. Przedstawiono tutaj jako przykłady spontaniczne potencjały czynnościowe oraz prąd funny. Po opanowaniu techniki, sekcja węzła zatokowo-przedsionkowego, izolacja oraz ponowne wprowadzenie wapnia mogą zostać wykonane w około dwie godziny, dzięki czemu komórki będą gotowe do przeprowadzenia eksperymentów.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że orientacja tkanki ma krytyczne znaczenie dla prawidłowej sekcji, a etapy dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej powinny zostać zoptymalizowane zgodnie z opisem w tekście. Po zastosowaniu tej procedury wyizolowane miocyty węzła zatokowo-przedsionkowego mogą być wykorzystane w wielu rodzajach eksperymentów, w tym w elektrofizjologii pojedynczych komórek, obrazowaniu wapnia oraz immunocytochemii. Komórki mogą być również utrzymywane w kulturze do eksperymentów wymagających manipulacji genetycznych lub ekspresji cząsteczek reporterowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować miocyty węzła zatokowo-przedsionkowego z dorosłych myszy. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje procedurę izolacji węzła zatokowo-przedsionkowego lub SAN od serca myszy. SAN mieści komórki zatokowo-przedsionkowe, które inicjują bicie serca poprzez generowanie spontanicznych potencjałów czynnościowych.

Izolacja węzła zatokowo-przedsionkowego z modelu mysiego: procedura zbierania węzła SA z mysiego serca

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Przedstawiony tutaj protokół krok po kroku pozwala na izolację makrofagów rezydujących w sercu z obszaru węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) w sercach myszy.

Izolacja i hodowla rezydentnych makrofagów sercowych z mysiego węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Poznaj metody izolacji, hodowli i charakterystyki miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy. Technika ta umożliwia badania elektrofizjologiczne i obrazowanie komórek serca.

Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów