Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy
23 października 2016
Metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAM) od dorosłych myszy do elektrofizjologii lub badań obrazowych. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą być utrzymywane w hodowli, aby umożliwić ekspresję interesujących białek, takich jak genetycznie kodowane reportery.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie spontanicznie aktywnych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego od myszy w celu przeprowadzenia krótko- lub średnioterminowych eksperymentów elektrofizjologicznych lub obrazowych. Izolowane miocyty węzła zatokowo-przedsionkowego są ważne dla badania mechanizmów rozrusznika serca, w szczególności badania określonych prądów jonowych lub czasu wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia. Jednak stosunkowo niewiele laboratoriów wykorzystuje izolowane miocyty zatokowo-przedsionkowe od myszy, częściowo dlatego, że bardzo trudno jest nauczyć się tej procedury na podstawie samych metod pisanych.
Po przygotowaniu wszystkich wymaganych roztworów do izolacji usuń futro z klatki piersiowej zwierzęcia nożyczkami. Następnie przeciąć klatkę piersiową, aby odsłonić jamę klatki piersiowej za pomocą zewnętrznych kleszczy tkankowych i nożyczek preparacyjnych. Przepłukać klatkę piersiową dwoma mililitrami podgrzanego kompletnego Tyrode'a z heparyną.
Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń płuca i grasicę za pomocą wewnętrznych nożyczek i kleszczy preparacyjnych. Delikatnie trzymając wierzchołek serca, ostrożnie przeciąć żyłę główną dolną i aortę, aby usunąć serce z jamy klatki piersiowej. Następnie przenieś serce do jednej z silikonowych naczyń do preparacji, a następnie opłucz je dwoma do czterech mililitrów podgrzanego heparynizowanego kompletnego Tyrode's.
Ustaw serce tak, aby tylne naczynia były widoczne i skierowane do góry. Następnie unieruchomij serce, przypinając je przez wierzchołek do silikonowego naczynia preparacyjnego. Następnie zlokalizuj rowek między komorami a przedsionkami.
Za pomocą wewnętrznych nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w rowku, trzymając go blisko komór. W razie potrzeby przepłukać rowek i nacięcie dodatkowym ogrzewanym heparynizowanym kompletnym tyrkodem, aby zapewnić wyraźny widok przedsionków i zastawek. Następnie kontynuuj cięcie wzdłuż rowka, aby oddzielić przedsionki od komór.
Następnie przenieś tkankę przedsionkową do drugiego silikonowego naczynia preparacyjnego i przepłucz ją trzema mililitrami podgrzanego heparynizowanego kompletnego Tyrode'a. Następnie, delikatnie rozciągając preparat, należy przebić tkankę przez żyłę główną dolną. Następnie odwróć tkankę tak, aby prawy przedsionek zwierzęcia znajdował się teraz po lewej stronie eksperymentatora, a lewe przedsionek po prawej stronie eksperymentatora.
Bardzo ważne jest uzyskanie i rozpoznanie orientacji w celu wyizolowania właściwej tkanki. Przystąp do przypinania tkanki przez żyłę główną górną, a następnie prawy i lewy przyrostek przedsionka. Usunąć pozostały tłuszcz lub inną tkankę, aby zapewnić wyraźny widok preparatu.
Następnie otwórz przednią ścianę przedsionków, przecinając żyły główne. W razie potrzeby obróć naczynie, aby wyciąć zarówno górne, jak i dolne żyły główne. W razie potrzeby zmień położenie szpilek, aby uwidocznić przegrodę międzyprzedsionkową.
Następnie przetnij wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć lewy przedsionek. Ponownie przypiąć preparat, delikatnie go rozciągnąć i usunąć tłuszcz zza węzła zatokowo-przedsionkowego. Następnie usuń wyrostek prawego przedsionka, a następnie uwolnij węzeł zatokowo-przedsionkowy, przecinając wzdłuż crista terminalis, który pojawia się jako ciemnopomarańczowa smuga granicząca z uszkiem przedsionkowym.
Ponownie przypnij lub odepnij tkankę węzłową i przetnij ją na boki, aby uzyskać trzy paski o równej wielkości. W tej procedurze, za pomocą wąskiej, polerowanej ogniowo pipety, przenieś trzy paski tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego do pierwszej z trzech małych probówek o okrągłym dnie zawierających 2,5 mililitra Tyrode o niskiej zawartości wapnia i magnezu i inkubuj przez pięć minut. Po pięciu minutach przenieś paski tkanek do drugiej małej rurki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 mililitra Tyrode o niskiej zawartości wapnia i magnezu.
Umyj paski chusteczek, delikatnie obracając probówkę lub delikatnie pipetując wąską pipetą. Nie odwracaj rurki. Następnie przenieś paski tkanek do trzeciej małej rurki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 mililitra Tyrode'a o niskiej zawartości wapnia i magnezu i powtórz etap mycia.
Następnie przenieś paski do dużej rurki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 mililitra Tyrode's o niskiej zawartości wapnia i magnezu z enzymami. Mieszaj co pięć minut, delikatnie obracając probówkę. Po trawieniu enzymatycznym użyj wąskiej, wypolerowanej ogniowo pipety, aby delikatnie przenieść paski tkanek do pierwszej z trzech małych probówek o okrągłym dnie zawierających zmodyfikowany roztwór KB.
Następnie przenieś paski przez drugą i trzecią małą probówkę z okrągłym dnem, aby umyć tkankę przed przeniesieniem do dużej probówki z okrągłym dnem, która zawiera roztwór KB. Używając większej, polerowanej ogniowo pipety, rozdziel komórki w dużej rurce z okrągłym dnem przez ciągłe rozcieranie, uważając, aby rurka dysocjująca była zanurzona w łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni Celsjusza i aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków do roztworu. Odkryliśmy, że najlepsze jest silne wydalenie roztworu z częstotliwością około jednego na sekundę lub jednego herca.
Teraz dodaj 75 mikrolitrów roztworu adaptacyjnego chlorku sodu i chlorku wapnia do tkanek. Delikatnie mieszaj, aby je wymieszać i inkubować przez pięć minut. Kontynuuj dodawanie wapnia stopniowo, zgodnie z opisem w pisemnym protokole.
Po readaptacji wapnia należy zebrać miocyty zatokowo-przedsionkowe, pozwalając im osiąść na około 10 minut lub przez odwirowanie w ilości 2 000 g przez trzy minuty. W przypadku ostro izolowanych komórek delikatnie usunąć i wyrzucić około pięciu mililitrów supernatantu za pomocą pipety transferowej. Następnie przechowuj ogniwa w temperaturze pokojowej przez maksymalnie osiem godzin w celu przeprowadzenia eksperymentów z zaciskiem krosowym.
Następnie można przeprowadzić ocenę funkcjonalną izolowanych miocytów zatokowo-przedsionkowych za pomocą nagrań z klamrami krosowymi dla spontanicznych potencjałów czynnościowych i prądów błonowych. Spontanicznie aktywne miocyty zatokowo-przedsionkowe mogą być utrzymywane w hodowli przez okres do sześciu dni. Hodowane komórki zachowują ogólną morfologię, która jest bardzo podobna do ostrej izolacji miocytów zatokowo-przedsionkowych, bez znaczących zmian w średniej długości, szerokości, polu przekroju poprzecznego lub pojemności błony hodowanych komórek w porównaniu z ostro izolowanymi komórkami.
Ogniwa nadają się do szeregu badań eksperymentalnych, takich jak zapisy cęgów prądowych i napięciowych. Jako przykłady pokazane są spontaniczne potencjały czynnościowe i zabawny prąd. Po opanowaniu, rozwarstwienie węzła zatokowo-przedsionkowego, izolacja i ponowne wprowadzenie wapnia może zostać zakończone w ciągu około dwóch godzin, dzięki czemu możesz mieć komórki gotowe do eksperymentów.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że orientacja tkanki ma kluczowe znaczenie dla dobrego rozwarstwienia i że etapy dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej powinny być zoptymalizowane zgodnie z opisem w tekście. Po tej procedurze izolowane miocyty węzła zatokowo-przedsionkowego można wykorzystać do różnych eksperymentów, w tym elektrofizjologii pojedynczych komórek, obrazowania wapnia i immunocytochemii. Komórki mogą być również utrzymywane w hodowli do eksperymentów, które wymagają manipulacji genami lub ekspresji cząsteczek reporterowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować miocyty zatokowo-przedsionkowe od dorosłych myszy. Powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAMs) od dorosłych myszy, które są kluczowe dla badań elektrofizjologicznych i obrazowania. Izolowane komórki mogą być wykorzystane bezpośrednio lub hodowane w celu ekspresji białek zainteresowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia serca
- Elektrofizjologia
- Techniki hodowli komórkowej
Wstęp
- Kardiomiocyty węzła zatokowo-przedsionkowego są niezbędne do badania mechanizmów rozrusznikowych serca.
- Kluczowe jest zrozumienie prądów jonowych oraz czasu uwalniania wapnia wewnątrzkomórkowego.
- Techniki izolacji są często trudne do opanowania wyłącznie na podstawie metod opisanych w literaturze.
- Pomyślna izolacja umożliwia prowadzenie zaawansowanych badań eksperymentalnych.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę izolacji SAM z dorosłych myszy.
- Aby ułatwić badania nad rozrusznikową czynnością serca i dynamiką prądów jonowych.
- Aby zwiększyć dostępność tych technik dla badaczy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów do izolacji.
- Usunięcie futra z klatki piersiowej zwierzęcia.
- Przecięcie klatki piersiowej w celu uzyskania dostępu do jamy klatki piersiowej.
- Płukanie jamy klatki piersiowej podgrzanym pełnym roztworem Tyrode'a.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja spontanicznie aktywnych miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego.
- Izolowane komórki mogą być wykorzystywane w eksperymentach krótkoterminowych lub średnioterminowych.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów rozrusznikowych serca.
- Potencjał do dalszych badań nad prądami jonowymi i dynamiką wapnia.
Wnioski
- Opisane metody umożliwiają skuteczną izolację SAMs.
- Techniki te mogą poszerzyć zakres badań kardiologicznych.
- Zwiększenie dostępności tych metod może przyczynić się do częstszego ich stosowania w laboratoriach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna izolacja i hodowla miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAMs) z dorosłych myszy umożliwia bezpośrednie badanie mechanizmów rozrusznikowych serca na poziomie komórkowym. Możliwość ta wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów dla modulatorów kanałów jonowych i terapii zaburzeń rytmu serca. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w procesach wczesnego odkrywania leków oraz w przedklinicznych badaniach kardiologicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację celów rozrusznikowych serca poprzez bezpośrednią ocenę elektrofizjologiczną.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację efektów specyficznych prądów jonowych i cyklu wapnia.
- Ułatwia prowadzenie badań opartych na hipotezach dotyczących molekularnych podstaw zaburzeń rytmu serca.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system komórek pierwotnych do ilościowych analiz obrazowania oraz metodą patch clamp.
- Umożliwia powtarzalny pomiar spontanicznych potencjałów czynnościowych i prądów błonowych.
- Wspiera standaryzację testów w badaniach przesiewowych związków ukierunkowanych na rozrusznik serca.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia modelowanie funkcji rozrusznika serca in vitro w kontekście istotnym dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć molekularnych po walidację przedkliniczną celów kardiologicznych.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez bezpośredni pomiar parametrów elektrofizjologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta pozycjonuje izolację i hodowlę SAM jako fundamentalny krok łączący wczesne etapy odkryć, walidację celu oraz przedkliniczne badania kardiologiczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów rozrusznika oraz funkcji kanałów jonowych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy komórek pierwotnych, zapewniając powtarzalne wyniki elektrofizjologiczne i obrazowe.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie parametrów potencjału czynnościowego i amplitud prądu w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia platformę do oceny manipulacji genetycznych i ekspresji białek istotnych w zaburzeniach rytmu serca.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat izolacji komórek serca, który można zastosować w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów kardiologicznych i badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły izolacji i hodowli w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dla portfeli odkrywania leków kardiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na terapie zaburzeń rytmu serca z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrodysekcji serca oraz enzymatycznej dysocjacji tkanek.
- Wymaga dostępu do aparatury elektrofizjologicznej i obrazowania w celu charakterystyki funkcjonalnej.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja warunków izolacji i hodowli pomiędzy zespołami badawczymi.
- Możlizna jest konieczność adaptacji protokołu dla różnych szczepów myszy lub modeli chorób serca.
- Wydajność i żywotność komórek są zależne od optymalizacji procedur oraz orientacji tkanki.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Sinoatrial Node Isolation
4:25
Sinoatrial Node Digestion and Sinoatrial Node Myocyte Dissociation
6:29
Sinoatrial Node Calcium Re-adaptation
7:36
Results: Electrophysiological Characterization of Cultured Sinoatrial Myocytes
8:27
Conclusion
