Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie przeprowadzenia eksperymentów ratujących zubożenie w warunkach, które zachowują integralność komórkową i homeostazę białek. Do analiz funkcjonalnych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji białek i wymagań dotyczących struktury w dynamice komórek, takich jak mitoza i różnicowanie komórek.

Główną zaletą tej techniki jest wyczerpanie interesującego białka i jednoczesne ponowne wprowadzenie wariantu tego białka na poziomie neo fizjologicznym do pomiaru populacji komórek. Zacznij od pokrycia szklanych naczyń dolnych frybronektyną. Aby to zrobić, rozcieńczyć jeden miligram na mililitr firbronektyny od jednego do 100 sterylnym PBS.

Dodaj jeden mililitr do każdego 35-mililitrowego naczynia, aby pokryć całą powierzchnię. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Podczas inkubacji wstępnie ogrzany alfa MEM uzupełniony 10% FBS i podwielokrotnością 0,05% trypsyny EDTA do 37 stopni Celsjusza.

Po 45 minutach inkubacji zacznij przygotowywać roztwór komórkowy. Odessać pożywkę z 10-centymetrowej płytki komórek HeLa RFP H2B. I delikatnie spłucz dwukrotnie 1,5 mililitra 0,05% trypsyny EDTA.

Pozostaw 0,5 mililitra trypsyny EDTA na płytce po ostatnim zasysaniu. I inkubuj komórki przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. I 5% dwutlenku węgla.

Delikatnie postukaj w talerz. I obserwuj warstwę komórkową pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy wszystkie komórki zostały odłączone. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki i delikatnie odpipetuj kilka razy, aby oddzielić komórki i przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Policz 10 mikrolitrów próbki zawiesiny komórek za pomocą hemocytometru. Następnie odessać roztwór fibronektyny z naczyń ze szklanym dnem. Nie pozwól, aby fibronektyna wyschła przed posiewem komórek.

Przygotuj roztwór zawiesiny komórkowej do płytki 1,5 razy dziesięć do piątych komórek na 35 milimetrowe naczynie w dwóch mililitrach pożywki. Umieść jedną 35-milimetrową płytkę dodatkowo do liczby warunków, aby policzyć liczbę komórek przed transdukcją wirusa. Inkubować przez 30 do 45 minut.

Po upływie czasu inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są dobrze oddzielone. Jak widać tutaj. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze i hoduj komórki do następnego dnia.

Następnego dnia po posiewie upewnij się, że komórki osiągnęły gęstość co najmniej 50%Gęstość komórek mniejsza niż 50% powoduje zmniejszenie wydajności transdukcji wirusa. Zwiększona zmienność ekspresji białek na komórkę i zwiększona toksyczność komórkowa. Następnie zbierz komórki z dodatkowego naczynia platerowanego, jak poprzednio.

I policz liczbę komórek. Oblicz objętość wirusów potrzebną do efektywnej transdukcji komórek. Oznacz 1.5 mililitrową probówkę wirówkową dla każdego warunku.

I dodaj 400 mikrolitrów ciepłego alfa MEM minus. Po powolnym rozmrożeniu porcji wirusów na lodzie, dodać wymaganą objętość każdego wirusa do probówek i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Następnie, po zaessaniu pożywki z komórek, delikatnie dodaj kroplami mieszankę wirusów.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Co 15 minut przez okres jednej godziny ostrożnie mieszać płytki pod sterylnym kapturem, aby pokryć komórki wirusem. Użycie niewielkiej ilości pożywki ułatwia kontakt wirusa z komórkami.

Po inkubacji delikatnie odpipetować 1,6 mililitra alfa MEM minus do każdej płytki, aby uzyskać całkowitą objętość dwóch mililitrów. Następnie rozpocznij synchronizację komórek, dodając dwie milimolowe tymidyny przed inkubacją komórek przez kolejne dwie godziny. W międzyczasie przygotuj mieszankę transfekcji siRNA, dodając do mikroprobówki 139 mikrolitrów sterylnej wody, 50 mikrolitrów jednego molowego chlorku wapnia i 11 mikrolitrów 20 mikromolowych siRNA.

Jeśli siRNA nie jest konieczne, zastąp ilość siRNA sterylną wodą, aby wykonać pustą transfekcję. Powoli dodawać roztwór HBSS2X kroplami do mieszaniny siRNA z chlorkiem wapnia. Delikatnie wymieszać dwa razy przez wstrzyknięcie powietrza za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Ponieważ mniejsze osady skutkują lepszą wydajnością transfekcji. Następnie inkubuj mieszankę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji powoli dodaj 200 mikrolitrów kropli do każdej płytki i zamieszaj, aby wymieszać.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 16 godzin. Następnego dnia wyjmij szalki z inkubatora i przetransportuj je do okapu do hodowli tkankowych. Po dwukrotnym przepłukaniu komórek dwoma mililitrami ciepłego hipisu, dodaj dwa mililitry alfa MEM minus przed powrotem do inkubatora.

Siedem godzin później dodaj dwie milimolowe tymidyny do płytek przed powrotem do inkubatora. Pracuj z nie więcej niż czterema płytkami komórkowymi na raz, ponieważ zmiany temperatury wpływają na długość cyklu komórkowego. Następnego dnia, 48 godzin po transfekcji siRNA i zakażeniu wirusem, przepłucz komórki dwukrotnie dwoma mililitrami ciepłego PBS, a następnie dodaj dwa mililitry alfa MEM bez czerwieni fenolowej do obrazowania żywych komórek.

Inkubować przez siedem godzin. Wykonuj krótkoterminowe eksperymenty obrazowania żywych komórek na komórkach mitotycznych za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w nawilżoną komorę termoregulowaną 5% dwutlenku węgla. Przed akwizycją sprawdź, czy komora osiągnęła odpowiednią temperaturę 37 stopni Celsjusza.

Umieść szalki hodowlane w komorze mikroskopu na godzinę przed pobraniem, aby umożliwić prawidłową równowagę pożywki i uniknąć dryftu ostrości z powodu zmian temperatury. Zbadaj status mitotyczny komórek. W tym momencie.

10 do 15% komórek powinno znajdować się we wczesnych stadiach mitozy. W czasie równowagi ustaw parametry akwizycji określone we wcześniejszych eksperymentach. Ważne jest, aby osiągnąć odpowiednią rozdzielczość bez wybielania zdjęć.

Ponieważ powoduje to uszkodzenie komórek i zaburza progresję mitotyczną. Wybierz kilka pól zawierających komórki, które znajdują się w początkowym okresie mitotycznym dla danego warunku, aby uzyskać znaczną liczbę komórek do analizy bez przekraczania interwału pozyskiwania. Po wybraniu wszystkich pól zresetuj fokus i rozpocznij pobieranie tak szybko, jak to możliwe.

Za pomocą obracającego się dysku można ustawić ostrość systemu. Typowa konfiguracja obejmowałaby cztery różne warunki. Siedem pól na talerz.

I dwa kanały kolorów z interwałem od 1,5 do dwóch minut w okresie 75 minut. Określ dobrze zdefiniowane kryteria analizy mitotycznych typów fenotycznych w komórkach, które będą zależeć od stosowanych markerów fluorescencyjnych. W przeciwieństwie do transfekcji BAG3 GFP, plazmowe DNA, jak widać po lewej stronie, adenofekcja z rekompetentnymi adenowirusami pokazanymi tutaj po prawej umożliwia bardziej jednorodną i wydajną ekspresję BAG3 GFP.

W większości populacji komórek przy niskiej wielokrotności infekcji. Ten reprezentatywny western blot pokazuje, że adenofekcja z siRNA specyficznymi dla BAG3 i rekompotentnym adenowirusem BAG3 GFP umożliwia skuteczne zubożenie endogennego BAG3 i ponowne wprowadzenie białka BAG3 GFP na poziomie zbliżonym do endogennego. Jak pokazano tutaj, adenofekcja może zachować homeostazę białek, ponieważ nie ma wykrywalnego wzrostu poziomu białek szoku cieplnego wywołanych stresem w komórkach HeLa, które zostały poddane adenofekcji.

W przeciwieństwie do komórek HeLa traktowanych proteotoksycznym induktorem stresu, MG132. Tutaj widzimy, że postęp komórek przez mitozę nie jest znacząco zaburzony przez adenofekcję, jak pokazano na tych konfokalnych obrazach poklatkowych z komórek HeLa z dodatkiem kontrolnego siRNA i alfa tubuliny BacMam GFP. oraz BacMam FRP Actin.

Wykres przedstawia odsetek komórek z nieprawidłową mitozą. Komórki z adenofekcją samego siRNA specyficznego dla BAG3 wykazywały około dwukrotny wzrost poziomu defektów mitotycznych. Jak pokazano na czerwonym pasku.

Który został przywrócony do poziomu zbliżonego do komórki kontrolnej poprzez ponowne wprowadzenie BAG3 GFP pokazanego przez pasek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty ratunkowe z powodu wyczerpania za pomocą adenofection. Metoda ta zapewnia szybki i prosty system do tworzenia hipomorficznych knock-downów do analizy funkcji struktury w wielu tłach komórkowych.

Stosując tę metodę, można określić kluczowe wymagania strukturalne dotyczące białka będącego przedmiotem zainteresowania dla danej funkcji. Inne podejścia do edycji genomu mogą być następnie wykorzystane do pogłębienia zachodzącej w tym mechanice.