Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie przeprowadzenia eksperymentów z odzyskaniem po deplecji w warunkach zachowujących integralność komórkową i homeostazę białek w celu przeprowadzenia analiz funkcjonalnych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji białek oraz wymagań strukturalnych w dynamice komórkowej, takiej jak mitoza i różnicowanie komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość usunięcia białka docelowego i jednoczesnego wprowadzenia wariantu tego białka na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w większości populacji komórek.

Zacznij od pokrycia naczyń ze szklanym dnem fibronektyną. W tym celu rozcieńcz roztwór zapasowy fibronektyny o stężeniu 1 mg/mL w sterylnym PBS w stosunku 1:100.

Dodaj 1 ml do każdej szalki o objętości 35 ml, aby pokryć całą powierzchnię. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Podczas inkubacji podgrzej do 37 °C pożywkę alpha MEM uzupełnioną o 10% FBS oraz porcję 0,05% trypsyny EDTA.

Po 45 minutach inkubacji rozpocznij przygotowanie zawiesiny komórek. Odsącz pożywkę z płytki 10 centymetrów z komórkami HeLa-RFP-H2B, a następnie delikatnie przemyj ją dwukrotnie 1,5 mililitrami 0,05% trypsyny EDTA.

Po ostatnim odessaniu pozostaw na płytce 0,5 ml trypsyny z EDTA i inkubuj komórki przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.

Delikatnie opukaj płytkę i obserwuj warstwę komórek pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały ododerwane. Następnie dodaj 10 milliliters pożywki i kilkakrotnie delikatnie pipetuj w celu rozdzielenia komórek, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 milliliter.

Odlicz próbkę 10 µL zawiesiny komórkowej przy użyciu hemocytometru. Następnie odessaj roztwór fibronektyny z naczyń z szklanym dnem. Nie dopuść do wyschnięcia fibronektyny przed wysianiem komórek.

Przygotować zawiesinę komórkową, aby wysiać 1,5 × 10⁵ komórek na płytkę 35 mm w 2 mL pożywki. Wysiać jedną dodatkową płytkę 35 mm ponad liczbę warunków w celu policzenia liczby komórek przed transdukcją wirusem. Inkubować przez 30 do 45 minut. Po upływie czasu inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są one dobrze rozdzielone, tak jak pokazano tutaj. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora i hodować komórki do następnego dnia.

Dzień po wysianiu należy upewnić się, że komórki osiągnęły gęstość co najmniej 50%. Gęstość komórek niższa niż 50% skutkuje zmniejszoną wydajnością transdukcji wirusowej, zwiększoną zmiennością ekspresji białka na komórkę oraz zwiększoną toksycznością komórkową. Następnie należy zebrać komórki z dodatkowej wysianej szalki w sposób opisany wcześniej i policzyć liczbę komórek. Oblicz objętość wirusów wymaganą do wydajnej transdukcji komórek. Oznacz probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dla każdego wariantu i dodaj 400 µL ciepłego medium alpha MEM minus. Po powolnym rozmrożeniu alikwotów wirusów na lodzie, dodaj wymaganą objętość każdego wirusa do probówek i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety. Następnie, po odessaniu medium z komórek, ostrożnie dodaj mieszankę wirusową kroplami. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Co 15 minut przez okres jednej godziny ostrożnie potrząsaj szalkami w sterylnej komorze laminarnej, aby pokryć komórki wirusem. Zastosowanie niewielkiej ilości medium ułatwia kontakt wirusa z komórkami.

Po inkubacji ostrożnie pipetujemy 1,6 ml pożywki alpha MEM minus do każdej płytki, aby uzyskać objętość całkowitą 2 ml. Następnie rozpoczynamy synchronizację komórek poprzez dodanie 2 mM tymidyny przed inkubacją komórek przez kolejne dwie godziny.

W międzyczasie przygotować mieszaninę do transfekcji siRNA, dodając do mikroprobówki 139 µL sterylnej wody, 50 µL 1 M chlorku wapnia oraz 11 µL 20 µM siRNA. Jeśli siRNA nie jest wymagane, zastąpić jego objętość sterylną wodą w celu przeprowadzenia transfekcji kontrolnej (pustej). Roztwór HBSS-2X dodawać powoli, kroplami, do mieszaniny chlorku wapnia i siRNA. Delikatnie wymieszać dwukrotnie metodą pęcherzykową za pomocą pipety 200 µL, ponieważ mniejsze precypitaty zapewniają lepszą wydajność transfekcji. Następnie inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji powoli dodać po 200 µL kroplami do każdej płytki i wymieszać poprzez delikatne potrząsanie. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin.

Następnego dnia należy wyjąć naczynia z inkubatora i przenieść je do komory z laminarnym przepływem powietrza. Po dwukrotnym wypłukaniu komórek 2 ml ciepłego roztworu HEPES, należy dodać 2 ml pożywki alpha MEM minus przed ponownym umieszczeniem naczyń w inkubatorze.

Siedem godzin później, przed powrotem płytek do inkubatora, dodać do nich tymidynę w stężeniu 2 mM. Należy pracować z maksymalnie czterema płytkami z komórkami jednocześnie, ponieważ wahania temperatury wpływają na długość cyklu komórkowego. Następnego dnia, 48 godzin po transfekcji siRNA i infekcji wirusem, komórki należy dwukrotnie przemyć 2 ml ciepłego PBS, a następnie dodać 2 ml pożywki alpha MEM bez czerwieni fenolowej do obrazowania żywych komórek. Inkubować przez siedem godzin.

Przeprowadź krótkoterminowe eksperymenty obrazowania żywych komórek w fazie mitozy przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w termoregulowaną komorę z nawilżaniem i 5% dwutlenkiem węgla. Przed rozpoczęciem akwizycji upewnij się, że komora osiągnęła odpowiednią temperaturę 37 °C.

Umieść szalki z hodowlą w komorze mikroskopu na godzinę przed akwizycją, aby umożliwić właściwą stabilizację pożywki i uniknąć dryftu ostrości wynikającego ze zmian temperatury. Sprawdź stan mitotyczny komórek. Na tym etapie od 10 do 15% komórek powinno znajdować się we wczesnych fazach mitozy.

W czasie równoważenia ustaw parametry akwizycji określone w poprzednich eksperymentach. Ważne jest uzyskanie odpowiedniej rozdzielczości bez powodowania fotowybielania, ponieważ prowadzi ono do uszkodzeń komórek i zaburza przebieg mitozy. Dla każdego wariantu wybierz kilka pól zawierających komórki w fazie wejścia w mitozę, aby uzyskać istotną liczbę komórek do analizy bez przekraczania odstępu między akwizycjami. Po wybraniu wszystkich pól ponownie ustaw ostrość i jak najszybciej rozpocznij akwizycję.

W przypadku zastosowania konfokalnego systemu ze skanującym dyskiem typowa konfiguracja obejmowałaby cztery różne warunki, siedem pól na płytkę oraz dwa kanały kolorystyczne z odstępami od 1,5 do dwóch minut w ciągu 75 minut. Należy określić precyzyjne kryteria analizy fenotypów mitotycznych w komórkach, które będą zależne od stosowanych markerów fluorescencyjnych.

W przeciwieństwie do transfekcji plazmidowym DNA BAG3-GFP, widocznej po lewej stronie, adenofekcja rekombinowanymi adenowirusami pokazana tutaj po prawej stronie umożliwia bardziej jednorodną i wydajną ekspresję BAG3-GFP w większości populacji komórek przy niskiej wielokrotności zakażenia. Ten reprezentatywny western blot pokazuje, że adenofekcja specyficznymi siRNA przeciwko BAG3 oraz rekombinowanym adenowirusem BAG3-GFP pozwala na wydajne usunięcie endogennego BAG3 i ponowne wprowadzenie białka BAG3-GFP na poziomach zbliżonych do endogennych. Jak tu pokazano, adenofekcja może zachować homeostazę białkową, ponieważ w komórkach HeLa poddanych adenofekcji nie stwierdzono wzrostu poziomu białek szoku cieplnego indukowanych stresem, w przeciwieństwie do komórek HeLa traktowanych induktorem stresu proteotoksycznego, MG132. Tutaj widzimy, że przebieg mitozy w komórkach nie jest znacząco zaburzony przez adenofekcję, co obrazują te zdjęcia z mikroskopii konfokalnej w trybie time-lapse wykonane z komórek HeLa poddanych adenofekcji kontrolnym siRNA oraz BacMam-GFP alpha Tubulin i BacMam-RFP Actin.

Wykres przedstawia proporcję komórek z nieprawidłową mitozą. Komórki przetransfekowane samym specyficznym siRNA przeciwko BAG3 wykazywały około dwukrotny wzrost poziomu defektów mitotycznych, co przedstawiono czerwonym słupkiem; poziom ten został przywrócony do poziomu zbliżonego do komórek kontrolnych poprzez ponowne wprowadzenie BAG3-GFP, co pokazano czarnym słupkiem.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów ratunkowych po deplecji z wykorzystaniem adenofekcji. Metoda ta stanowi szybki i prosty system tworzenia hypomorficznych knock-downów do analizy strukturalno-funkcjonalnej w wielu liniach komórkowych. Stosując tę metodę, można zidentyfikować kluczowe wymagania strukturalne białka zainteresowania dla danej funkcji. Następnie można wykorzystać inne podejścia do edycji genomu, aby pogłębić analizę zaangażowanych mechanizmów.