Name: Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Poznaj metodę adenofekcji do badań depletion-rescue zachowującą integralność komórkową. Technika umożliwia analizę funkcji białek opiekuńczych w mitozie i myogenezie na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (Grant nr 7077) oraz przez Fundację Belliniego i Roby Fondazione.

<ol><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+Right+Tool+for+the+Job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+IL-8+expression+following+adenovirus+infection+is+mediated+by+c-Src+activation+in+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts.</a> J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).</li>
<li>Yousuf, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+associated+adenovirus+entry+into+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells.</a> PLoS One. 8 (10), e77462(2013).</li>
<li>Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+regulates+epithelial+cell+junction+stability+through+control+of+E-cadherin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking.</a> Sci Rep. 3, 2889(2013).</li>
<li>Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+chaperone+activity+toward+poly%28Q%29-containing+proteins+depends+on+its+association+with+Bag3%2C+a+stimulator+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy.</a> J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+key+structural+motifs+involved+in+HspB8%2FHspB6-Bag3+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction.</a> Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).</li>
<li>Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAG3%3A+a+multifaceted+protein+that+regulates+major+cell+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways.</a> Cell Death Dis. 2, e141(2011).</li>
<li>Guilbert, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuilbert%2C+SM+%22The+Big+Book+of+Small+Heat+Shock+Proteins%22">The Big Book of Small Heat Shock Proteins</a>. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexes+of+adenovirus+with+polycationic+polymers+and+cationic+lipids+increase+the+efficiency+of+gene+transfer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).</li>
<li>Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+polymer+and+lipids+enhance+adenovirus-mediated+gene+transfer+to+rabbit+carotid+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery.</a> Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).</li>
<li>Fasbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adenovirus+in+calcium+phosphate+precipitates+enhances+gene+transfer+to+airway+epithelia+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.</a> J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).</li>
<li>Fuchs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+the+Chaperone+Complex+BAG3-HSPB8+in+Actin+Dynamics%2C+Spindle+Orientation+and+Proper+Chromosome+Segregation+during+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).</li>
<li>Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adenovirus+type+2+early+region+4+ORF4+cytoplasmic+death+function+by+direct+binding+to+Src+kinase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain.</a> J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Akt+signaling+regulates+blood+vessel+recruitment+during+myofiber+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth.</a> Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).</li>
<li>Murray, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-apoptotic+role+for+caspase-9+in+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).</li>
<li>Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Wnt+Signaling+with+BMP%2FSmad+Signaling+during+the+Transition+from+Cell+Proliferation+to+Myogenic+Differentiation+in+Mouse+Myoblast-Derived+Cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells).</a> Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).</li>
<li>Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+in+mammalian+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion.</a> Sci Signal. 6 (272), re2(2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano metodę umożliwiającą przeprowadzenie eksperymentów depletion-rescue, która ma zastosowanie w analizach funkcjonalnych procesów biologicznych komórek, które są szczególnie wrażliwe na nadekspresję białek wpływających na stechiometrię i dynamikę kompleksów białkowych i struktur makromolekularnych. Podział komórki mitotycznej jest ekstremalnym przykładem precyzyjnie dostrojonej morfodynamiki komórki, która obejmuje najbardziej dramatyczne i spektakularne zmiany w ogólnej strukturze komórki. Stosując ad...

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków jest złotym standardem w analizie funkcji białek. Nowo opracowane technologie edycji genomu oparte na wykorzystaniu nukleaz specyficznych dla miejsca, takich jak nukleazy palców cynkowych i zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/CAS9, pozwalają obecnie na generowanie linii komórkowych z ukierunkowaną delecją genu i mutacją1,2. Te nowatorskie podejścia powinny zrewolucjonizować sposób, w jaki badamy funkcję białek i nasze zrozumienie genetyki chorób ludzkich. Jednak w niektórych przypadkach długotrwały lub całkowity nokaut genów nie jest pożądany i może wywołać wtórne mechanizmy kompensacji komórek. Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych może być również ograniczające, gdy mamy do czynienia z pierwotnymi hodowlami komórkowymi o ograniczonej zdolności proliferacji lub gdy dąży się do badań przesiewowych dużego zestawu mutacji w różnych typach komórek. Jest to często wymagane do określenia zależności procesu biologicznego komórki od wymagań strukturalnych białka. W tym celu, odwracalne knockdown przez interferencję RNA, który umożliwia przejściowe eksperymenty ratowania zubożenia w różnych tłach komórkowych, nadal pozostaje prostym i skutecznym podejściem do przeprowadzania analiz strukturalno-funkcjonalnych białka będącego przedmiotem zainteresowania3. Jednak główną wadą tego podejścia jest trudność w osiągnięciu skutecznego wyciszenia i ponownym wprowadzeniu interesującego białka lub jego wariantów na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w większości populacji komórek. Ma to kluczowe znaczenie dla umożliwienia kompleksowych badań, które próbują skorelować efekty funkcjonalne obserwowane na poziomie pojedynczych komórek (fenotyp hipomorficzny) z efektami obserwowanymi w testach opartych na populacji komórek, na przykład w zakresie interakcji białko-białko.
Korzystając z klasycznych metod transfekcji, trudno jest osiągnąć jednorodną i niską ekspresję białek egzogennych w dużej populacji komórek. Transdukcja komórek za pomocą rekombinowanych wirusów, takich jak adenowirusy, często umożliwia bardziej znormalizowaną ekspresję białek egzogennych. Jednak wychwyt adenowirusa jest ograniczony przez receptor CAR, który jest nieobecny w komórkach innych niż ludzkie lub ulega słabej ekspresji w niektórych typach komórek ludzkich. Ponadto wnikanie adenowirusów do komórek aktywuje szlaki sygnałowe, które regulują kształt i adhezję komórek4-6. Nie jest to oczywiście pożądane podczas badania mechanizmów regulacyjnych morfodynamiki komórki. Stanęliśmy przed tym problemem, gdy podjęliśmy analizy funkcjonalne kompleksu opiekuńczego, BAG3-HSPB8, w zakresie podziału komórek i dynamiki aktyny. Pionierskie prace opisały rolę tego kompleksu opiekuńczego w kontroli jakości białka i autofagii podczas stresu7,8. Większość z tych badań opierała się jednak na nadekspresji białek, zakładając, że białka opiekuńcze są normalnie regulowane w górę podczas stresu. Pozostawiło to otwarte pytanie, czy BAG3, w połączeniu z HSPB8, może przyczyniać się do normalnego działania dzielących się komórek wykazujących ekspresję tych białek opiekuńczych, jak wiele typów komórek rakowych9. W szczególności to, czy kompleks opiekuńczy przyczynia się do przebudowy struktur opartych na aktynie, które kontrolują progresję mitotyczną, było bardzo interesujące, biorąc pod uwagę pojawiające się powiązania między białkami opiekuńczymi HSPB a dynamiką cytoszkieletu10. Aby rozwiązać ten problem, staraliśmy się opracować skuteczną metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która nie zakłócałaby progresji mitotycznej ani morfologii komórkowej i która zachowałaby homeostazę białek, aby uniknąć wtórnych zaburzeń dynamiki kompleksów makromolekularnych regulujących zmiany kształtu komórki. W związku z tym idealnie byłoby, gdyby zubożenie-dodanie genu będącego przedmiotem zainteresowania było wykonywane jednocześnie.
Opisano użycie kompleksów adenowirusa z kationowym polimerem lub lipidami w celu promowania transferu genów in vitro i in vivo11,12. Na przykład wydaje się, że fosforan wapnia (CaPi) tworzy osad z adenowirusem, który zwiększa wiązanie wirusa przez niezależną od CAR ścieżkę13. Rzeczywiście, odkryliśmy, że połączenie transdukcji i transfekcji komórkowej opartej na adenowirusie ze związkami kationowymi może zwiększyć skuteczność eksperymentów ratowania zubożenia. Pozwoliło nam to obniżyć ilość wirusa od 3 do 20 razy, w zależności od linii komórkowej i genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także skorzystać z szerszego okna w celu dostosowania ekspresji białek egzogennych na poziomie zbliżonym do endogennego w większości populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania przy minimalnym wpływie na morfologię komórki. W takich warunkach udało nam się również osiągnąć wysoką skuteczność knockdown endogennej ekspresji białek (>75%). Niniejszym opisujemy metodę krok po kroku i przedstawiamy dowody na to, że homeostaza białek nie jest znacząco zaburzona, jak ocenia się na podstawie niezmienionych poziomów białek opiekuńczych wywołanych stresem z rodziny białek szoku cieplnego, co czyni metodę odpowiednią do funkcjonalnych analiz fizjologicznej roli molekularnych białek opiekuńczych za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Protokół jest podatny na procedury synchronizacji komórek i wykorzystanie dostępnych na rynku bakulowirusów do koekspresji niskich poziomów markerów fluorescencyjnych, przy minimalnej interferencji z normalną dynamiką opartą na aktynie i wrzecionie podczas progresji mitotycznej. Ponadto pokazujemy wszechstronność metody, która ma zastosowanie do "trudnych do transdukcji" mysich komórek C2C12, bez znaczącego wpływu na różnicowanie mioblastów do miotub in vitro.

<table><tbody><tr><td>C2C12 Mysie mioblasty</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus niestandardowy projekt</td><td>Welgen</td><td>Niestandardowy projekt</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Actin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&reg; Tubulin-RFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM), Termo Fisher o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem, 35 mm</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-20-C Case</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>Uprzejmy prezent od dr Sabine Elowe, Qu&eacute; bec, Kanada</td><td></td><td>Klebig C et al. 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni, Nowa Zelandia</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina&reg; Odczynnik do transfekcji RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha</td><td>Bisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez Desoxyribonuleosides/Rybonukleozydów</td><td>Thermo Fisher</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez Phenol Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Biobasic</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAVCMV-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>dupleksy siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Niestandardowy projekt</td><td></td></tr><tr><td>Tymidyna</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 2,5%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Procesy komórkowe, takie jak mitoza i różnicowanie komórek, są regulowane przez zmiany w kształcie komórki, które w dużej mierze polegają na prawidłowym przemodelowaniu struktur cytoszkieletu komórki. Wiąże się to z składaniem-demontażem struktur makromolekularnych wyższego rzędu w określonym czasie i miejscu, procesem, który jest szczególnie wrażliwy na zaburzenia spowodowane nadekspresją białek. Metody, które mogą zachować homeostazę białek i utrzymać prawie normalną morfologię komórkową, są wysoce pożądane w celu określenia funkcjonalnego wkładu białka będącego przedmiotem zainteresowania w szerokim zakresie procesów komórkowych. Eksperymenty ratowania w stanie przejściowym oparte na interferencji RNA są potężnymi metodami analizy funkcji białek i wymagań strukturalnych. Jednak ponowne wprowadzenie docelowego białka przy minimalnym odchyleniu od jego fizjologicznego poziomu jest prawdziwym wyzwaniem. Tutaj opisujemy metodę zwaną adenofekcją, która została opracowana w celu zbadania roli molekularnych białek opiekuńczych i partnerów w normalnym działaniu dzielących się komórek i związku z przebudową aktyny. Komórki HeLa zostały pozbawione BAG3 za pomocą dupleksów siRNA ukierunkowanych na region 3'UTR. Białka BAG3 znakowane GFP zostały ponownie wprowadzone jednocześnie do >75% komórek przy użyciu rekombinowanych adenowirusów sprzężonych z odczynnikami do transfekcji. Adenofekcja umożliwiła ekspresję białek BAG3-GFP na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w komórkach HeLa pozbawionych BAG3, przy braku reakcji na stres. Nie zaobserwowano wpływu na poziom endogennych białek opiekuńczych szoku cieplnego, głównych regulatorów homeostazy białek indukowanych stresem. Ponadto, dodając bakulowirusy napędzające ekspresję markerów fluorescencyjnych w czasie transdukcji-transfekcji komórek, mogliśmy przeanalizować dynamikę komórek mitotycznych za pomocą poklatkowych analiz mikroskopowych przy minimalnych zaburzeniach normalnej progresji mitotycznej. Adenofekcja ma również zastosowanie do trudnych do zakażenia komórek myszy i nadaje się do analiz funkcjonalnych różnicowania mioblastów w miotuby. W związku z tym adenofekcja zapewnia wszechstronną metodę przeprowadzania analiz strukturalno-funkcjonalnych białek zaangażowanych we wrażliwe procesy biologiczne, które opierają się na dynamice cytoszkieletu wyższego rzędu.

Transfekcja kationowymi lipidami plazmidowego DNA BAG3-GFP wiązała się z heterogenną ekspresją w komórkach HeLa, w których w niektórych komórkach poziomy białka były ledwo wykrywalne, natomiast w innych odnotowano bardzo wysokie poziomy BAG3 (Rysunek 2A). W tych komórkach utrata homeostazy białkowej objawiała się akumulacją BAG3-GFP w agregatach perinuklearnych (Rysunek 2A, strzałki). W przeciwieństwie do tego, transdukcja komórek adenowirusami niosącymi ...

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie przeprowadzenia eksperymentów z odzyskaniem po deplecji w warunkach zachowujących integralność komórkową i homeostazę białek w celu przeprowadzenia analiz funkcjonalnych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji białek oraz wymagań strukturalnych w dynamice komórkowej, takiej jak mitoza i różnicowanie komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość usunięcia białka docelowego i jednoczesnego wprowadzenia wariantu tego białka na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w większości populacji komórek.Zacznij od pokrycia naczyń ze szklanym dnem fibronektyną. W tym celu rozcieńcz roztwór zapasowy fibronektyny o stężeniu 1 mg/mL w sterylnym PBS w stosunku 1:100.Dodaj 1 ml do każdej szalki o objętości 35 ml, aby pokryć całą powierzchnię. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Podczas inkubacji podgrzej do 37 °C pożywkę alpha MEM uzupełnioną o 10% FBS oraz porcję 0,05% trypsyny EDTA.Po 45 minutach inkubacji rozpocznij przygotowanie zawiesiny komórek. Odsącz pożywkę z płytki 10 centymetrów z komórkami HeLa-RFP-H2B, a następnie delikatnie przemyj ją dwukrotnie 1,5 mililitrami 0,05% trypsyny EDTA.Po ostatnim odessaniu pozostaw na płytce 0,5 ml trypsyny z EDTA i inkubuj komórki przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.Delikatnie opukaj płytkę i obserwuj warstwę komórek pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały ododerwane. Następnie dodaj 10 milliliters pożywki i kilkakrotnie delikatnie pipetuj w celu rozdzielenia komórek, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 milliliter.Odlicz próbkę 10 µL zawiesiny komórkowej przy użyciu hemocytometru. Następnie odessaj roztwór fibronektyny z naczyń z szklanym dnem. Nie dopuść do wyschnięcia fibronektyny przed wysianiem komórek.Przygotować zawiesinę komórkową, aby wysiać 1,5 × 10⁵ komórek na płytkę 35 mm w 2 mL pożywki. Wysiać jedną dodatkową płytkę 35 mm ponad liczbę warunków w celu policzenia liczby komórek przed transdukcją wirusem. Inkubować przez 30 do 45 minut. Po upływie czasu inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są one dobrze rozdzielone, tak jak pokazano tutaj. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora i hodować komórki do następnego dnia.Dzień po wysianiu należy upewnić się, że komórki osiągnęły gęstość co najmniej 50%. Gęstość komórek niższa niż 50% skutkuje zmniejszoną wydajnością transdukcji wirusowej, zwiększoną zmiennością ekspresji białka na komórkę oraz zwiększoną toksycznością komórkową. Następnie należy zebrać komórki z dodatkowej wysianej szalki w sposób opisany wcześniej i policzyć liczbę komórek. Oblicz objętość wirusów wymaganą do wydajnej transdukcji komórek. Oznacz probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dla każdego wariantu i dodaj 400 µL ciepłego medium alpha MEM minus. Po powolnym rozmrożeniu alikwotów wirusów na lodzie, dodaj wymaganą objętość każdego wirusa do probówek i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety. Następnie, po odessaniu medium z komórek, ostrożnie dodaj mieszankę wirusową kroplami. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Co 15 minut przez okres jednej godziny ostrożnie potrząsaj szalkami w sterylnej komorze laminarnej, aby pokryć komórki wirusem. Zastosowanie niewielkiej ilości medium ułatwia kontakt wirusa z komórkami.Po inkubacji ostrożnie pipetujemy 1,6 ml pożywki alpha MEM minus do każdej płytki, aby uzyskać objętość całkowitą 2 ml. Następnie rozpoczynamy synchronizację komórek poprzez dodanie 2 mM tymidyny przed inkubacją komórek przez kolejne dwie godziny.W międzyczasie przygotować mieszaninę do transfekcji siRNA, dodając do mikroprobówki 139 µL sterylnej wody, 50 µL 1 M chlorku wapnia oraz 11 µL 20 µM siRNA. Jeśli siRNA nie jest wymagane, zastąpić jego objętość sterylną wodą w celu przeprowadzenia transfekcji kontrolnej (pustej). Roztwór HBSS-2X dodawać powoli, kroplami, do mieszaniny chlorku wapnia i siRNA. Delikatnie wymieszać dwukrotnie metodą pęcherzykową za pomocą pipety 200 µL, ponieważ mniejsze precypitaty zapewniają lepszą wydajność transfekcji. Następnie inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji powoli dodać po 200 µL kroplami do każdej płytki i wymieszać poprzez delikatne potrząsanie. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin.Następnego dnia należy wyjąć naczynia z inkubatora i przenieść je do komory z laminarnym przepływem powietrza. Po dwukrotnym wypłukaniu komórek 2 ml ciepłego roztworu HEPES, należy dodać 2 ml pożywki alpha MEM minus przed ponownym umieszczeniem naczyń w inkubatorze.Siedem godzin później, przed powrotem płytek do inkubatora, dodać do nich tymidynę w stężeniu 2 mM. Należy pracować z maksymalnie czterema płytkami z komórkami jednocześnie, ponieważ wahania temperatury wpływają na długość cyklu komórkowego. Następnego dnia, 48 godzin po transfekcji siRNA i infekcji wirusem, komórki należy dwukrotnie przemyć 2 ml ciepłego PBS, a następnie dodać 2 ml pożywki alpha MEM bez czerwieni fenolowej do obrazowania żywych komórek. Inkubować przez siedem godzin.Przeprowadź krótkoterminowe eksperymenty obrazowania żywych komórek w fazie mitozy przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w termoregulowaną komorę z nawilżaniem i 5% dwutlenkiem węgla. Przed rozpoczęciem akwizycji upewnij się, że komora osiągnęła odpowiednią temperaturę 37 °C.Umieść szalki z hodowlą w komorze mikroskopu na godzinę przed akwizycją, aby umożliwić właściwą stabilizację pożywki i uniknąć dryftu ostrości wynikającego ze zmian temperatury. Sprawdź stan mitotyczny komórek. Na tym etapie od 10 do 15% komórek powinno znajdować się we wczesnych fazach mitozy.W czasie równoważenia ustaw parametry akwizycji określone w poprzednich eksperymentach. Ważne jest uzyskanie odpowiedniej rozdzielczości bez powodowania fotowybielania, ponieważ prowadzi ono do uszkodzeń komórek i zaburza przebieg mitozy. Dla każdego wariantu wybierz kilka pól zawierających komórki w fazie wejścia w mitozę, aby uzyskać istotną liczbę komórek do analizy bez przekraczania odstępu między akwizycjami. Po wybraniu wszystkich pól ponownie ustaw ostrość i jak najszybciej rozpocznij akwizycję.W przypadku zastosowania konfokalnego systemu ze skanującym dyskiem typowa konfiguracja obejmowałaby cztery różne warunki, siedem pól na płytkę oraz dwa kanały kolorystyczne z odstępami od 1,5 do dwóch minut w ciągu 75 minut. Należy określić precyzyjne kryteria analizy fenotypów mitotycznych w komórkach, które będą zależne od stosowanych markerów fluorescencyjnych.W przeciwieństwie do transfekcji plazmidowym DNA BAG3-GFP, widocznej po lewej stronie, adenofekcja rekombinowanymi adenowirusami pokazana tutaj po prawej stronie umożliwia bardziej jednorodną i wydajną ekspresję BAG3-GFP w większości populacji komórek przy niskiej wielokrotności zakażenia. Ten reprezentatywny western blot pokazuje, że adenofekcja specyficznymi siRNA przeciwko BAG3 oraz rekombinowanym adenowirusem BAG3-GFP pozwala na wydajne usunięcie endogennego BAG3 i ponowne wprowadzenie białka BAG3-GFP na poziomach zbliżonych do endogennych. Jak tu pokazano, adenofekcja może zachować homeostazę białkową, ponieważ w komórkach HeLa poddanych adenofekcji nie stwierdzono wzrostu poziomu białek szoku cieplnego indukowanych stresem, w przeciwieństwie do komórek HeLa traktowanych induktorem stresu proteotoksycznego, MG132. Tutaj widzimy, że przebieg mitozy w komórkach nie jest znacząco zaburzony przez adenofekcję, co obrazują te zdjęcia z mikroskopii konfokalnej w trybie time-lapse wykonane z komórek HeLa poddanych adenofekcji kontrolnym siRNA oraz BacMam-GFP alpha Tubulin i BacMam-RFP Actin.Wykres przedstawia proporcję komórek z nieprawidłową mitozą. Komórki przetransfekowane samym specyficznym siRNA przeciwko BAG3 wykazywały około dwukrotny wzrost poziomu defektów mitotycznych, co przedstawiono czerwonym słupkiem; poziom ten został przywrócony do poziomu zbliżonego do komórek kontrolnych poprzez ponowne wprowadzenie BAG3-GFP, co pokazano czarnym słupkiem.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentów ratunkowych po deplecji z wykorzystaniem adenofekcji. Metoda ta stanowi szybki i prosty system tworzenia hypomorficznych knock-downów do analizy strukturalno-funkcjonalnej w wielu liniach komórkowych. Stosując tę metodę, można zidentyfikować kluczowe wymagania strukturalne białka zainteresowania dla danej funkcji. Następnie można wykorzystać inne podejścia do edycji genomu, aby pogłębić analizę zaangażowanych mechanizmów.

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Adenoinfekcja: Metoda do badania roli chaperonów molekularnych w morfodynamice komórkowej poprzez eksperymenty z wyczerpaniem i ratunkiem

W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Źródło: Dahl, J. i in. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test oparty na spektrofotometrze fluorescencyjnym, który pozwala ocenić aktywność chaperonów na białku substratu pod wpływem stresu kwasowego i cieplnego. Opisuje on kroki monitorowania rozwijającego się i agregującego się podłoża poprzez rozpraszanie światła, porównując warunki z i bez chaperone.

Ocena aktywności bakteryjnego chaperonów poprzez termiczne rozwijanie białka modelowego

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Ten protokół opisuje zestaw metod, które obejmują analityczną chromatografię wykluczającą wielkość do badania oligomeryzacji i stabilności histonów opiekuńczych, test pull-down do rozwikłania interakcji chaperon-histon histon, AUC do analizy stechiometrii kompleksów białkowych oraz test opiekuńczy histonów do funkcjonalnego scharakteryzowania domniemanego chaperonu histonów in vitro.

In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Poznaj metodę adenofekcji do badań depletion-rescue zachowującą integralność komórkową. Technika umożliwia analizę funkcji białek opiekuńczych w mitozie i myogenezie na poziomie pojedynczych komórek.

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue (Wideo) | JoVE Journal

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Przeglądaj więcej filmów