Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Ogólnym celem niniejszej analizy jest ilościowe określenie prędkości fagosomów w makrofagach zakażonych HIV-1 przy użyciu prostej metody śledzenia manualnego. Zaletą tego protokołu jest zapewnienie łatwej metody obliczania względnych ruchów grup obiektów wewnątrz komórki, które mogą się poruszać lub ulegać odkształceniom. Metoda ta pozwala na wgląd w ruch fagosomów w zakażonych makrofagach wykazujących pozytywny sygnał GFP, lecz może być również stosowana w przypadku innych przedziałów wewnątrzkomórkowych w komórkach znakowanych fluorescencyjnie.

Po zainfekowaniu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów oraz opsonizacji komórek krwi owczej zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować test fagocytozy przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak mikroskop z dyskiem wirującym, wyposażonego w komorę grzewczą z utrzymaniem temperatury 37 °C oraz dopływem dwutlenku węgla. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy włączyć komorę grzewczą, aby rozgrzać stolik mikroskopu do 37 °C. Następnie należy włączyć mikroskop i komputer, a potem uruchomić oprogramowanie do obrazowania.

Zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak prędkość skanowania, powiększenie, rozdzielczość itp., aby w każdym polu widzenia znajdowała się co najmniej jedna komórka, a klatki obrazu były rejestrowane co minutę w przedziale od 60 do 120 minut. Umieść naczynie do obrazowania na stole mikroskopu. Dostosuj ostrość i położenie, aby w polu widzenia znajdował się tylko jeden cały makrofag zainfekowany HIV-1.

Należy zastosować odpowiednie ustawienia wzbudzenia i emisji, w zależności od używanego systemu obrazowania oraz sondy. Należy uwzględnić kanał w świetle przechodzącym. Jego wygląd należy zoptymalizować poprzez regulację czasu ekspozycji.

Następnie wyjmij szalkę do obrazowania i dodaj do niej jeden mililitr zawiesiny erytrocytów owczych (SRBC) o stężeniu 0,7 × 10⁶ SRBCs/mL. Wirowarkę ustaw na 500 ×g i wiruj szalkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby zsynchronizować fagocytozę, następnie zapisz czas zakończenia wirowania i umieść szalkę z powrotem na stoliku. Zoptymalizuj ostrość i ustaw górną oraz dolną granicę stosu z krokiem 0,3 µm.

Rozpocznij akwizycję stosów Z obrazów GFP i BF przez całą grubość komórki, a następnie zapisz film time-lapse w natywnym formacie pliku systemu obrazowania. Aby przeprowadzić edycję wideo, w oprogramowaniu do edycji wideo kliknij menu rozwijane Apps, a następnie zakładkę Review Multidimensional Data. Aby otworzyć plik, kliknij Select Base File, a następnie Select Directory.

W polu Zestawy danych (Data Sets) wybierz akwizycję do analizy i kliknij Podgląd (View). Aby przedstawić infekcję w projekcji Z, w polu Długości fal (Wavelengths) wybierz długość fali 491 nanometr i kliknij kartę Projekcja Z (Z projection) z opcją wszystkich płaszczyzn. Następnie, aby przeanalizować sekwencję czasową, w polu Długości fal wybierz długość fali BF i wybierz optymalną płaszczyznę na osi Z, aby rozróżnić zewnętrzne SRBC, wewnętrzne SRBC oraz jądro.

Zapisz montaże wideo, klikając kartę Selection Xs, a następnie Load Images. Na koniec zapisz załadowane obrazy w formacie tif. Po pobraniu wtyczki Image J manual tracking, uruchom ją w programie Image J, a następnie otwórz sekwencję obrazów przeznaczoną do analizy.

Wprowadź ustawienia, takie jak odstęp czasowy, który określa czas pomiędzy sąsiednimi klatkami, oraz kalibrację XY, która określa odległość na jeden piksel. Aby rozpocząć śledzenie, kliknij Add Track, a następnie kliknij środek SRBC w pierwszym momencie, w którym zostanie on zinternalizowany. Kolejna klatka pojawi się automatycznie.

Dla ułatwienia, aby widzieć SRBC w kanale BF, podczas śledzenia należy korzystać z okna jasności i kontrastu. Należy kontynuować klikanie w środek SRBC we wszystkich klatkach, aby zaznaczyć różne pozycje w czasie. Po zakończeniu śledzenia każdego SRBC należy kliknąć End Track, a następnie Add Track, aby rozpocząć nowy proces śledzenia.

Numer śledzenia zmieni się w drugiej kolumnie tabeli wyników. Rozpocznij śledzenie jądra, aby uzyskać jego pozycję we wszystkich klatkach, klikając w jego środek, tak jak zrobiono to wcześniej. Zapisz dane w arkuszu, a następnie otwórz go w oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych i utwórz nowy plik arkusza.

Przenieś do tego nowego pliku czas oraz współrzędne X i Y SRBC i jądra komórkowego. Na koniec, za pomocą oprogramowania arkusz kalkulacyjny, oblicz dystans przebyty przez fagozymy zawierające SRBC w kierunku jądra oraz prędkość fagozyomów w ciągu pierwszych pięciu minut po internalizacji SRBC zgodnie z protokołem tekstowym. Tutaj przedstawiono analizę ruchu fagozyomów w żywych makrofagach zakażonych HIV w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii dyskowej (spinning disc).

Ustawienia kanału w jasnym polu są kluczowe dla widoczności jądra oraz rozróżnienia SRBC zewnętrznych od tych zinternalizowanych. Wykres ten przedstawia dystans przebyty przez fagosom w niezinfekowanych HMDM w ciągu pierwszych pięciu minut po internalizacji SRBC w funkcji czasu. Prędkość fagosomu odpowiada nachyleniu przedstawionej tutaj krzywej regresji liniowej.

Wreszcie, w niniejszym badaniu zaobserwowano, że prędkość fagosomu w ciągu pierwszych pięciu minut po internalizacji w zakażonych HIV HMDM jest niższa w porównaniu do niezakażonych HMDM. Metody te wykazały, że ruch fagosomów w kierunku centrum komórki, a tym samym dojrzewanie fagosomów do fagolizosomów, było upośledzone w makrofagach zakażonych HIV. Po jego przeprowadzeniu komórkę można poddać dalszej obróbce w celu wykonania korelacyjnej mikroskopii elektronowej lub można utrwalić całą populację komórek do klasycznej mikroskopii immunofluorescencyjnej i analizy statystycznej.

Fagocytoza jest bardzo wrażliwa na temperaturę, dlatego temperatura w komorze grzewczej oraz w pożywce w naczyniu hodowlanym powinna być utrzymywana na stałym poziomie 37 °C przez cały czas trwania procedury. Należy pamiętać, że praca z patogenami może być niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w pomieszczeniu z odpowiednim poziomem bezpieczeństwa biologicznego oraz stosowanie środków ochrony osobistej zgodnie z lokalnymi przepisami.