Name: Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę pomiaru prędkości fagosomów w żywych makrofagach zakażonych HIV-1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ta technika umożliwia śledzenie ruchu fagosomów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jamilowi Jubrailowi za przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez granty z CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 w tym stypendium doktoranckie dla GLB) oraz Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, w tym stypendium podoktorskie dla CD) dla FN. A. Dumas był wspierany przez stypendia doktoranckie z Université Paris Descartes i Sidaction.

Protokół musi być przeprowadzony w ścisłej zgodności z krajowym i międzynarodowym ustawodawstwem oraz lokalnymi przepisami. Krew od zdrowych dawców, którzy wyrazili zgodę na jej przekazanie do celów badawczych, została pozyskana z Centrów Krwiodawstwa, z którymi Instytucje podpisały stosowne umowy. Podczas pracy z ludzką krwią należy zachować szczególne środki ostrożności. Eksperymenty z HIV-1 muszą być przeprowadzane w laboratorium o 3. lub 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3 lub 2) zgodnie z lokalnym prawem.
1. Przygotowanie ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów (hMDMs) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i selekcji poprzez adhezję
<ol>
	<li>Zacznij od świeżej krwi od zdrowych dawców (9 ml). Rozcieńcz całą objętość świeżej krwi sterylnym 1x roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) bez Ca2+ i Mg2+ do uzyskania objętości końcowej 70 ml, a następnie ostrożnie przenieś rozcieńczoną krew do dwóch probówek stożkowych 50 ml (po 35 ml na probówkę), nakładając ją na 15 ml neutralnego, silnie rozgałęzionego, wysokocząsteczkowego polisacharydu hydrofilowego w roztworze, który znajduje się już w każdej probówce.</li>
	<li>Wirować obie probówki z krwią przy 537 x g przez 20 min w temperaturze 20 °C bez hamowania. Następnie zebrać mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) znajdujące się w mętnej pierścieniu komórkowym na granicy faz i przenieść je do nowej probówki 50 ml zawierającej 15 ml 1x PBS bez Ca2+ i Mg2+.</li>
	<li>Wirować komórki przy 218 x g przez 5 min w temperaturze 20 °C i resuspender osad w 45 ml 1x PBS bez Ca2+ i Mg2+.</li>
	<li>Wirować komórki przy 218 x g przez 5 min w temperaturze 20 °C, resuspender osad w 10 ml 1x PBS bez Ca2+ i Mg2+, a następnie policzyć komórki, wykonując rozcieńczenie końcowe 1/200 w błękicie trypanu.</li>
	<li>Wirować komórki przy 218 x g przez 5 min w temperaturze 20 °C i resuspender osad w pożywce RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 uzupełnionej o 2 mM L-glutaminy oraz 100 µg/ml penicyliny-streptomycyny, tak aby w każdym dołku płytki 6-dołkowej znajdowało się 7 x 106 PBMCs w 2 ml pożywki.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 2 h. Po 2 h monocyty przywrą do plastiku.</li>
	<li>Aby umożliwić świeżo wyizolowanym monocytom różnicowanie w hMDMs, odessać pożywkę i zastąpić ją 2 ml pożywki hMDM (RPMI 1640, 10% dopplementowanej płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny) uzupełnionej rekombinowanym ludzkim czynnikiem stymulującym kolonie makrofagów (rhM-CSF) w stężeniu końcowym 10 ng/ml.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 11 dni (Rysunek 1).</li>
	<li>W 11. dniu usunąć pożywkę i przemyć 2 razy 2 ml zimnej pożywki hMDM na dołek. Następnie przemyć każdy dołek 2 razy 1 ml zimnego 1x PBS.</li>
	<li>Aby odłączyć w pełni zróżnicowane hMDMs, przemyć każdy dołek 1 raz 1 ml zimnego 1x PBS z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i inkubować komórki w 2 ml zimnego 1x PBS z 2 mM EDTA na dołek przez 15-60 min w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Istnieją alternatywne metody odłączania komórek (np. trypsyna lub aktywności trypsynopodobne), które mogą dawać dobre rezultaty 11.</li>
	<li>Po odłączeniu (zakończonym delikatnym pipetowaniem w górę i w dół w dołku), zebrać komórki i umieścić je w probówce 50 ml w lodzie zawierającej 10 ml zimnej pożywki hMDM.</li>
	<li>Wirować komórki przy 218 x g przez 5 min w temperaturze 20 °C, resuspender osad w 10 ml zimnej pożywki hMDM i policzyć komórki, wykonując rozcieńczenie 1/20 w błękicie trypanu.</li>
	<li>Wysiać komórki w zagęszczeniu 1 x 106 hMDMs na szalkę z dnem szklanym klasy mikroskopowej 35 mm i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 1 dzień.</li>
</ol>
2. Produkcja i oznaczanie ilości zapasów wirusa HIV-1
UWAGA: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (Green Fluorescent Protein) z otoczką o tropizmie R5, dar od M. Schindlera 10, jest wykorzystywany do zakażania makrofagów oraz do obserwacji zakażonych komórek w czasie rzeczywistym.
<ol>
	<li>Przygotować zapasy wirusa poprzez transfekcję ludzkich komórek embrionalnych nerki 293T (2 x 106 w szalce 100 mm) 6 µg odpowiedniego prowiralnego DNA przy użyciu komercyjnego odczynnika do transfekcji.</li>
	<li>Ilościowo określić zakaźność zapasów wirusa, wykorzystując komórki wskaźnikowe HeLa TZM-bl (zawierające gen ß-galaktozydazy pod kontrolą LTR HIV-1), poprzez seryjne rozcieńczenia zapasów wirusa, a następnie barwienie komórek na ß-galaktozydazę i zliczenie niebieskich komórek 12.</li>
</ol>
3. Zakażanie hMDM wirusem HIV-1
<ol>
	<li>Do hMDM (komórek wysianych w punkcie 1.13) dodać wirusa z wielokrotnością infekcji (MOI) 0,02-0,03 w 1 ml pożywki hMDM. Do studzienek kontrolnych dodać tylko 1 ml pożywki hMDM i inkubować szalki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 2 dni (Rysunek 1).</li>
	<li>W 2. dniu wypłukać komórki pożywką hMDM 3 razy i dodać 1 ml świeżej pożywki hMDM na szalkę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 6 dni (Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Opsonizacja owczych erytrocytów
<ol>
	<li>Aby przygotować 7 x 106 SRBC na płytkę, przemyć SRBC dwukrotnie w 100 µl roztworu zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS, wirując przy 600 x g przez 4 min.</li>
	<li>Resuspendować przemyte SRBC w 500 µl 1x PBS/BSA 0,1% z przeciwciałami króliczymi IgG przeciwko SRBC w stężeniu poniżej progu aglutynacji na każde 5 µl SRBC i inkubować w rotacji w temperaturze RT przez 30 min. 
	UWAGA: Aby określić stężenie IgG przeciwko SRBC poniżej progu aglutynacji, przygotować rozcieńczenia seryjne IgG (stężenie zapasu 13,1 mg/ml) od 1/50 do 1/25 600 w objętości 20 µl na płytce 96-dołkowej. Do każdego dołka dodać 2 x 106 SRBC w 20 µl i pozostawić płytkę w ciemni przez kilka godzin. Stężeniem poniżej progu aglutynacji jest rozcieńczenie w dołku bezpośrednio poprzedzającym dołek, w którym wystąpiła aglutynacja (tworzenie sieci przez IgG+SRBC).</li>
	<li>Po rotacji odwirować opsonizowane IgG-SRBC przy 600 x g przez 4 min i przemyć 100 µl 1x PBS/BSA 0,1%, wirując przy 600 x g przez 4 min.</li>
	<li>Resuspendować opsonizowane IgG-SRBC w uprzednio ogrzanym medium RPMI bez czerwieni fenolowej, uzupełnionym o 2 mM L-glutaminy oraz 1% penicyliny-streptomycyny (1 ml/płytkę).</li>
</ol>
5. Test fagocytozy z wykorzystaniem wideomikroskopii żywych komórek
<ol>
	<li>Należy użyć konfokalnego systemu obrazowania, np. systemu z dyskiem obrotowym (spinning disk), wyposażonego w komorę grzewczą ustawioną na 37°C, z przepływem CO2 przez butelkę z wodą w celu nawilżenia.</li>
	<li>Włączyć komorę grzewczą przed eksperymentem, aby stolik mikroskopu osiągnął temperaturę 37 °C przed rozpoczęciem testu fagocytozy. Włączyć mikroskop oraz komputer i uruchomić oprogramowanie do obrazowania.</li>
	<li>Zoptymalizować ustawienia obrazowania, takie jak prędkość skanowania, powiększenie, rozdzielczość itp., aby w każdym polu widzenia znajdowała się co najmniej jedna komórka i aby rejestrować jedną klatkę co minutę w czasie od 60 do 120 min. 
	UWAGA: W tym przypadku próbkę obrazowano w jednej klatce co minutę przez 60 min przy użyciu obiektywu 63X.</li>
	<li>Umieścić szalkę do obrazowania na stoliku mikroskopu. Dostosować ostrość i położenie, aby w polu widzenia znalazł się tylko jeden cały makrofag zakażony HIV-1. Zastosować odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji w zależności od użytego systemu obrazowania i sondy. Dodać kanał w świetle przechodzącym (BF), aby obserwować fagosomy (Rycina 1ii). Zoptymalizować wygląd obrazów z różnych kanałów, regulując procent światła przechodzącego i czas ekspozycji. 
	UWAGA: W tym przypadku NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP wzbudzano laserem 491 nm z czasem ekspozycji 50 msec przy 20% mocy lasera (Rycina 1i).</li>
	<li>Zdjąć szalkę z obrazowania i dodać do niej 1 ml zawiesiny SRBC o stężeniu 7 x 106 SRBCs/ml (Rycina 1).</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 2 min w RT, aby zsynchronizować fagocytozę; zanotować czas zakończenia wirowania i ponownie umieścić szalkę na stoliku.</li>
	<li>Zoptymalizować ostrość i rejestrować obrazy GFP oraz BF w stosach Z (przez całą grubość komórki z krokiem 0,3 µm – zazwyczaj 20 płaszczyzn) co minutę przez co najmniej 1 h. Zapisać film time-lapse w natywnym formacie pliku użytego systemu obrazowania. 
	UWAGA: W tym przypadku filmy time-lapse zapisano w formacie natywnym, jako pliki *.stk.</li>
</ol>
6. Analiza filmów time-lapse
<ol>
	<li>W celu edycji wideo kliknij rozwijane menu „Apps”, a następnie kartę „Review Multi Dimensional Data” w oprogramowaniu do edycji wideo.
	<ol>
		<li>Aby otworzyć plik, kliknij „Select Base File”, a następnie „Select Directory”. W polu „Data sets” wybierz akwizycję do analizy (w formacie .nd) i kliknij „View”. Dane są przedstawione w tabeli, w której czas znajduje się w kolumnie, a plan Z w wierszu.</li>
		<li>Aby przedstawić infekcję w projekcji Z (Rycina 2, panele lewe), wybierz długość fali 491 nm w polu „Wavelengths” i kliknij kartę „Z projection” z opcją „all planes”.</li>
		<li>Aby przeanalizować sekwencję czasową, wybierz długość fali BF w polu „Wavelengths” i wybierz optymalny plan na osi Z, aby odróżnić zewnętrzne SRBC (Rycina 2, czerwona strzałka), wewnętrzne SRBC (Rycina 2, czerwone koło) oraz jądro komórkowe (Rycina 2, niebieskie koło).</li>
		<li>Aby zapisać montaże wideo, kliknij kartę „Selection [X's]”, a następnie „Load Image(s)”. Na koniec zapisz załadowane obrazy w formacie .tif i otwórz je następnie w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj wtyczki „Manual Tracking” w oprogramowaniu ImageJ, aby zmierzyć pozycję jądra komórkowego oraz różnych fagosomów zaobserwowanych w kanale BF (Rycina 3).
	<ol>
		<li>Pobierz wtyczkę „Manual Tracking” ze strony internetowej ImageJ. W programie ImageJ otwórz wtyczkę oraz sekwencję obrazów do analizy (Rycina 3, krok 1 i 2).</li>
		<li>Wprowadź ustawienia, takie jak „Time Interval”, który reprezentuje odstęp czasu między sąsiednimi klatkami, oraz „x/y calibration”, który reprezentuje odległość na jeden piksel (Rycina 3, krok 3). 
		UWAGA: W tym przypadku zapisz sekwencję obrazów z odstępem czasu 1 min między klatkami i kalibracją x/y wynoszącą 0.205 µm, ponieważ zastosowano powiększenie 63X oraz kamerę o rozmiarze piksela 6.45 x 6.45 µm2.</li>
		<li>Aby rozpocząć śledzenie, kliknij „Add track” (Rycina 3, krok 4) i kliknij w środek SRBC w pierwszym momencie, w którym zostanie on zinternalizowany. Następna klatka pojawi się automatycznie.</li>
		<li>Kontynuuj klikanie w środek SRBC we wszystkich klatkach, aby uzyskać różne pozycje w czasie (Rycina 3, krok 6 w czerwonej ramce).
		<ol>
			<li>Rozpocznij śledzenie jądra komórkowego, klikając w jego środek, aby uzyskać jego pozycję we wszystkich klatkach. Następnie śledź fagosomy (klikając w ich środek) jeden po drugim w czasie (klatce) ich internalizacji, zależnie od poszczególnych SRBC. Dla ułatwienia obserwacji SRBC w kanale BF, podczas śledzenia korzystaj z okna „Brightness &amp; contrast” (Rycina 3, krok 5).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Między śledzeniem każdego SRBC kliknij „Add track” (Rycina 3, krok 4), aby utworzyć nowy ślad. Numer śledzenia zmieni się w drugiej kolumnie, „Track n°”, tabeli wyników (Rycina 3, krok 6).</li>
		<li>Zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym, aby przejść do następnego etapu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych, aby obliczyć przebytą odległość fagosomów zawierających SRBC w kierunku jądra oraz prędkość fagosomów w ciągu pierwszych 5 min po internalizacji SRBC (Rycina 4).
	<ol>
		<li>Otwórz tabelę w arkuszu kalkulacyjnym i nowy plik arkusza. Przenieś do tego nowego pliku tylko następujące parametry: czas oraz współrzędne x i y jądra komórkowego i wszystkich SRBC (Rycina 4A).</li>
		<li>Aby obliczyć odległość między SRBC a jądrem komórkowym wyłącznie na podstawie ich współrzędnych, rozważ jądro i SRBC w płaszczyźnie współrzędnych XY (Rycina 4B). 
		UWAGA: Odległość między dwoma punktami to długość ścieżki łączącej je. W płaszczyźnie odległość między SRBC a jądrem jest wyznaczana zgodnie z twierdzeniem Pitagorasa.
		<ol>
			<li>Jeśli c (odległość między jądrem a SRBC) oznacza długość przeciwprostokątnej, a a i b oznaczają długości pozostałych dwóch boków, zapisz twierdzenie Pitagorasa jako równanie pitagorejskie: 
			<img alt="Twierdzenie Pitagorasa, równanie \(c^2 = a^2 + b^2\), koncepcja matematyczna, geometria." src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
			UWAGA: Jednocześnie w układzie ortonormalnym odległość pozioma a to (xjądro-xSRBC), a odległość pionowa b to (yjądro-ySRBC).</li>
			<li>W ten sposób oblicz odległość między jądrem a SRBC (Rycina 4A, fioletowa ramka) za pomocą wzoru: 
			<img alt="Równania formuły odległości; obejmuje współrzędne (x, y); ważne dla analizy geometrycznej." src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"> 
			UWAGA: Pomnóż otrzymaną wartość odległości (w pikselach) przez kalibrację x/y, aby uzyskać odległość w µm. W tym przypadku kalibracja x/y wynosi 0.205 µm.</li>
			<li>Dla każdego punktu czasowego odejmij bieżącą odległość między jądrem a SRBC od odległości początkowej (Rycina 4C).</li>
			<li>Wykreśl pomiar w funkcji czasu dla pierwszych 5 min. Zastosuj do wykresu linię trendu liniowego (Rycina 5A) i wyznacz nachylenie tej linii, które reprezentuje prędkość fagosomu w kierunku jądra w ciągu pierwszych 5 min po internalizacji SRBC.</li>
			<li>Zestaw dane, aby obliczyć średnią i błąd statystyczny wartości prędkości i przedstaw je w odpowiedniej formie za pomocą właściwego oprogramowania (Rycina 5B).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microtubule+dynamics+in+phagosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for microtubule dynamics in phagosome movement.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).</li>
<li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+bi-directional+movement+of+phagosomes+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules.</a> J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+non-typhoidal+salmonella+disease%3A+an+emerging+and+neglected+tropical+disease+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa.</a> Lancet. 379, 2489-2499 (2012).</li>
<li>Mazzolini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytosis+in+HIV-1-infected+macrophages+relies+on+Nef-dependent+alteration+of+focal+delivery+of+recycling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments.</a> Blood. 115, 4226-4236 (2010).</li>
<li>Dumas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+protein+Vpr+impairs+phagosome+maturation+by+controlling+microtubule-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking.</a> J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).</li>
<li>Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+technique+to+distinguish+attached+from+ingested+erythrocytes+and+zymosan+particles+in+phagocytosing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages.</a> J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).</li>
<li>Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internal+HIV-1+is+protected+from+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies.</a> J Virol. 86, 2826-2836 (2012).</li>
<li>Gartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+HIV%3A+basic+concepts+and+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies.</a> Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+fuse+with+late+endosomes+and%2For+lysosomes+by+extension+of+membrane+protrusions+along+microtubules%3A+role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP.</a> Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Toyohara, A., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta technika składa się z kilku krytycznych etapów. Po pierwsze, przygotowanie komórek hMDM i ich zakażenie wirusem HIV-1 ma kluczowe znaczenie, ponieważ odsetek zakażeń jest zależny od dawcy. Warto zauważyć, że zdecydowaliśmy się na użycie makrofagów, które nie są spolaryzowane in vitro przed zakażeniem, ponieważ status makrofagów, z którymi wirus może się zetknąć in vivo , nie został do tej pory dobrze scharakteryzowany. Sprawdziliśmy ekspresję kilku markerów powierzchniowych, wskazujących, że makrofag...

Makrofagi odgrywają główną rolę we wrodzonym układzie odpornościowym i homeostazie. Są to profesjonalne fagocyty, które internalizują i eliminują patogeny i zanieczyszczenia w procesie zwanym fagocytozą 1,2. Fagosom, zamknięty przedział, który tworzy się po wchłonięciu materiału stałego, przechodzi serię zdarzeń fuzji i rozszczepienia z przedziałami endocytarnymi, co prowadzi do przedziału degradacyjnego zwanego fagolizosomem. Ten przedział ma kwaśne pH, ze względu na nabycie pompujących protony v-ATPaz, zawiera enzymy hydrolityczne i jest wzbogacony w białka błonowe związane z lizosomami (LAMP). Dojrzewaniu fagosomów towarzyszy ich migracja na mikrotubulach 3,4 w kierunku centrum komórki, aby dotrzeć do miejsca okołojądrowego, w którym gromadzą się lizosomy.
Wiele patogenów zostało zgłoszonych jako przejmujące kontrolę nad dojrzewaniem fagosomów, w tym bakterie prowadzące wewnątrzkomórkowy tryb życia, które modyfikują środowisko wakuolarne, w którym przebywają 5. Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV)-1 atakuje makrofagi oprócz limfocytów T. Ponieważ makrofagi są odporne na cytopatyczne działanie wirusa, w przeciwieństwie do limfocytów T, można je uznać za rezerwuar wirusa. Ponadto makrofagi zakażone wirusem HIV-1 wykazują wadliwe funkcje fagocytarne i przyczyniają się do powstawania chorób oportunistycznych. W szczególności ciężka, inwazyjna, nietyfusowa choroba Salmonelli wywoływana przez Salmonella Typhimurium ST313 jest powszechna od trzech dekad u dzieci i dorosłych zakażonych wirusem HIV 6 w Afryce Subsaharyjskiej. Szacuje się, że ryzyko zachorowania na gruźlicę jest ponad 20 razy większe u osób żyjących z HIV niż wśród osób bez zakażenia wirusem HIV. 
Z tych wszystkich powodów, ważne jest lepsze zdefiniowanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw defektów fagocytarnych u makrofagów zakażonych wirusem HIV. Wykazaliśmy, że wychwyt cząstek stałych, opsonizowanych cząstek, bakterii lub grzybów, był zahamowany w makrofagach zakażonych wirusem HIV 7. Biorąc pod uwagę, że to hamowanie jest częściowe, postanowiliśmy następnie przeanalizować los zinternalizowanych fagosomów w ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV 8. Ponieważ dojrzewanie fagosomu jest ściśle związane z migracją do centrum komórki i fuzją z lizosomami, defekt dojrzewania fagosomalnego może być spowodowany modyfikacjami modalności transportu w zakażonej komórce. Opisana tutaj metoda wykorzystuje IgG-opsonizowane krwinki czerwone owiec (IgG-SRBC) jako model do celowania w fagocytozę, w której pośredniczy receptor, aw szczególności receptory dla części Fc immunoglobulin (FcR). Cząstki te są łatwiejsze do zobrazowania w jasnym polu (BF) niż kulki lateksowe, ponieważ zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe SRBC wykazują różne właściwości załamania światła9. Aby zmierzyć prędkość fagosomów poruszających się w kierunku jądra w makrofagach zakażonych wirusem HIV, użyliśmy wirusa fluorescencyjnego 10 i skonfigurowaliśmy prostą metodę ręcznego śledzenia, która jest opisana tutaj. Metoda nie wymaga zaawansowanego programowania i po prostu wykorzystuje ImageJ. Jest podatny na przylegające komórki i każdy rodzaj cząsteczki lub patogenu, który można uwidocznić za pomocą mikroskopii jasnego pola lub obrazowania fluorescencyjnego.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych Falcon 100 mm z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem 35 mm niepowlekane 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Do</td><td>akwizycji</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates 6-dołkowe</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>Dla ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>neutralny, silnie rozgałęziony, wysokomasowy, hydrofilowy polisacharyd w roztworze do wirowania gęstości</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, płynny (o wysokiej glukozie)</td><td>GIBCO, sondy molekularne</td><td>31966-021</td><td>Konserwowane w 4 & stopniach; C ; do hodowli komórek HEK</td></tr><tr><td>RPMI 1640 pożywka GLUTAMAX&nbsp; Suplement</td><td>Technologie trwałości</td><td>61870-010</td><td>Zachowany w 4 & stopniach; C; dla hodowli hMDM</td></tr><tr><td>F&oelig; Serum na łydki (FCS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>Zachowany w temperaturze -20 &deg; C ; dekomplementarna</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td>Konserwowany w temperaturze -20 &deg; C ; do hodowli hMDM</td></tr><tr><td>RPMI 1640 pożywka, bez czerwieni fenolowej (10x 500 ml)</td><td>Technologie życia</td><td>11835-105</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem; do oznaczania fagocytozy</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE6</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Konserwowany w temperaturze 4 & stopni; C ; do produkcji wirusa</td></tr><tr><td>Czerwone krwinki owiec (SRBC)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Konserwowane w buforze Alsever w temperaturze 4 & stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Anty-owcze krwinki czerwone IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Konserwowane w 4 & stopniach; C</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina Frakcja szoku cieplnego, pH 7, &ge; 98%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Zachowany przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony DMI600</td><td>Konfokalny</td> wirujący dysk Leica<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CSU-X1M1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW laser</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>Obiektyw ; Powiększenie 100X ; Przysłona numeryczna 1,40 ; Olejek immersyjny</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 (FireWire) Aparat</td><td>fotograficzny Fotometria</td><td></td><td>Rozmiar piksela 6,45 i mikro; m x 6,45 i mikro; m ; Definicja 1,392 x 1,040 ; Kodowanie obrazu w oprogramowaniu 14 Bit</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>Do sterowania mikroskopem</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>GraphPad Prism</td><td>Do analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem hiv-1

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Makrofagi to komórki fagocytarne, które odgrywają główną rolę na skrzyżowaniu odporności wrodzonej i specyficznej. Mogą być zakażone ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV)-1, a ze względu na ich odporność na jego działanie cytopatyczne można je uznać za trwałe rezerwuary wirusa. Ponadto makrofagi zakażone wirusem HIV wykazują wadliwe funkcje, które przyczyniają się do rozwoju chorób oportunistycznych.
Dokładny mechanizm, za pomocą którego HIV-1 upośledza odpowiedź fagocytarną makrofagów, był nieznany. Wcześniej wykazaliśmy, że wychwyt różnych cząstek stałych przez makrofagi był hamowany, gdy były one zakażone wirusem HIV-1. To zahamowanie było tylko częściowe, a fagosomy tworzyły się w makrofagach zakażonych wirusem HIV. Dlatego skupiliśmy się na analizie losów tych fagosomów. Dojrzewaniu fagosomu towarzyszy migracja tych przedziałów w kierunku centrum komórki, gdzie łączą się z lizosomami, tworząc fagolizosomy, odpowiedzialne za degradację spożytego materiału. Użyliśmy IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek owczych jako celu dla fagocytozy. Aby zmierzyć prędkość ruchu dośrodkowego fagosomów w poszczególnych makrofagach zakażonych wirusem HIV, zastosowaliśmy kombinację jasnego pola i fluorescencji mikroskopii konfokalnej. Opracowaliśmy metodę obliczania odległości fagosomów w stosunku do jądra, a następnie obliczania prędkości fagosomów. Komórki zakażone wirusem HIV zostały zidentyfikowane dzięki wirusowi wykazującemu ekspresję GFP, ale metoda ta ma zastosowanie do komórek niezakażonych lub każdego rodzaju infekcji lub leczenia.

W niniejszym opracowaniu opisano fagocytozę zależną od FcR prowadzoną przez zakażone HIV-1 i niezakażone hMDM z wykorzystaniem opsonizowanych IgG SRBC jako modelowych celów (Rycina 1). Krytycznymi etapami tego protokołu są przygotowanie hMDM oraz zakażenie HIV-1. W rzeczywistości wydajność i jakość zróżnicowanych makrofagów różnią się w zależności od dawcy, podobnie jak wskaźnik zakażeń, z wydajnością w zakresie 10-40%. Ponadto istotne jest prawidłowe przygotowanie opsoni...

Opisujemy metodę pomiaru prędkości fagosomów przemieszczających się w kierunku centrum komórki w żywych komórkach zakażonych lub bez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) typu 1, używając konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem do identyfikacji fluorescencyjnych zakażonych komórek i mikroskopii jasnego pola do wykrywania fagosomów.

Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Ogólnym celem niniejszej analizy jest ilościowe określenie prędkości fagosomów w makrofagach zakażonych HIV-1 przy użyciu prostej metody śledzenia manualnego. Zaletą tego protokołu jest zapewnienie łatwej metody obliczania względnych ruchów grup obiektów wewnątrz komórki, które mogą się poruszać lub ulegać odkształceniom. Metoda ta pozwala na wgląd w ruch fagosomów w zakażonych makrofagach wykazujących pozytywny sygnał GFP, lecz może być również stosowana w przypadku innych przedziałów wewnątrzkomórkowych w komórkach znakowanych fluorescencyjnie.Po zainfekowaniu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów oraz opsonizacji komórek krwi owczej zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować test fagocytozy przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego, takiego jak mikroskop z dyskiem wirującym, wyposażonego w komorę grzewczą z utrzymaniem temperatury 37 °C oraz dopływem dwutlenku węgla. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy włączyć komorę grzewczą, aby rozgrzać stolik mikroskopu do 37 °C. Następnie należy włączyć mikroskop i komputer, a potem uruchomić oprogramowanie do obrazowania.Zoptymalizuj ustawienia obrazowania, takie jak prędkość skanowania, powiększenie, rozdzielczość itp

phagosome-migration-velocity-measured-live-primary-human-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Test ścieżki motylości fagokinetycznej jest metodą stosowaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test ten mierzy w sposób ilościowy chemokinezę (losową motylość komórek) w czasie. Metoda ta wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem.

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę pomiaru prędkości fagosomów w żywych makrofagach zakażonych HIV-1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ta technika umożliwia śledzenie ruchu fagosomów w czasie rzeczywistym.

Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Przeglądaj więcej filmów