Name: Przygotowanie limfocytów T CD4 + do analizy ekspresji błony gangliozydowej GD3 i GD2 za pomocą mikroskopii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę barwienia przeciwciałami do wizualizacji gangliozydów GD3 i GD2 na powierzchni ludzkich limfocytów T CD4+. Technika ta umożliwia analizę ekspresji przy niskiej liczbie komórek, co jest kluczowe w badaniach nad białaczką.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr José Luisowi Daniottiemu za komentarze. Dziękujemy za pomoc dr J. Arturo Pimentelowi i Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM za pozyskanie obrazów konfokalnych. I.M.-D. i T.M.V.C. były wspierane przez granty 157634 i 253596 z Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. jest stypendystą (245192) CONACYT. Dziękujemy również za wsparcie organizacji Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

Krew obwodowa od zdrowych dawców płci męskiej została uzyskana za świadomą zgodą i aprobatą Komisji Bioetycznej Centro de Investigaciòn en Dinámica Celular- Universidad Autònoma del Estado de Morelos.
1. Izolacja i aktywacja ludzkich naiwnych limfocytów T CD4+
<ol>
	<li>Pobrać 2 ml krwi obwodowej pochodzącej od zdrowych dawców ludzkich za świadomą zgodą i rozcieńczyć 2 ml sterylnego PBS-EDTA (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Powoli dodawać rozcieńczoną krew do 3 ml roztworu sacharozy o gęstości 1,077, jak opisano wcześniej8, 
	Uwaga: Zróżnicowana migracja podczas wirowania spowodowana różnicami w gęstości spowoduje całkowite osadzenie się erytrocytów i utworzy się powyżej warstwa mniej gęstych komórek jednojądrzastych. 2 ml krwi obwodowej spowoduje około 0,5 x 106 naiwnych limfocytów T CD4 + po etapach oczyszczania.</li>
	<li>Wirować przez 30 minut przy 250 x g w temperaturze 21 °C (użyć wirnika do probówek okrągłodennych o stałym kącie 30 mm) bez przerwy w celu wytworzenia gradientu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po odwirowaniu PBMC można wyraźnie zaobserwować jako biały pierścień. Zebrać PBMC za pomocą pipety i przenieść do sterylnej probówki w celu umycia.</li>
	<li>Po trzech płukaniach roztworem PBS-EDTA o sile 250 x g przez 10 minut przystąp do oczyszczania z naiwnych limfocytów T CD4+. W tym celu dostępne są metody sortowania lub kilka rodzajów zestawów do oczyszczania. Najlepiej użyć >1 x 107 PBMC do oczyszczania.
	<ol>
		<li>Oczyść naiwne limfocyty T CD4 + przez selekcję negatywną za pomocą kulek magnetycznych. Wykonaj selekcję negatywną za pomocą przeciwciał anty CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anty-TCRγ/δ, anty-HLA-DR i CD235a (glikoforyna A). Ocenić procent czystości, oznaczając komórki CD4 + CD45RA+ za pomocą cytometrii przepływowej. 
		Uwaga: Opcjonalnie należy przystąpić do inkubacji PBMC przez noc w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 o gęstości 1 x 106 komórek/ml w 10 ml uzupełnionej pożywki w celu pobudzenia przylegania monocytów i kontynuować pierwotne oczyszczanie limfocytów T CD4 +. Skuteczne odzyskiwanie naiwnych limfocytów T CD4+ z krwi obwodowej zależy w dużej mierze od systemu oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, dodając 250 μl PBS na basenik z 5 μg/ml przeciwciała monoklonalnego anty CD3 i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Płytki z 96 dołkami mogą być używane, gdy używana jest mniejsza liczba z naiwnych limfocytów T CD4 + (np. 2 x104-1 x 105).</li>
	<li>Usunąć rozcieńczenie przeciwciała anty CD3 z płytek 24-dołkowych lub 96-dołkowych i umyć płytki dwukrotnie przy użyciu sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć naiwne limfocyty T CD4+ >95% czystości (CD4+CD45RA+) do gęstości 1 x 106 komórek/ml w zaawansowanej pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 3 % płodowej surowicy bydlęcej (lub RPMI uzupełnionej 10 % surowicy), 2 mM glutaminy i antybiotyków (1 U/ml penicyliny, 1 μg/ml streptomycyny). 
	Uwaga: Jeśli lokalizacja gangliozydów jest wymagana w PBMC, postępuj zgodnie z tym samym protokołem rozcieńczania i stymulacji, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Dodać 500 μl rozcieńczenia komórek do studzienek pokrytych anty CD3 i do studzienek niepowlekanych (komórek kontrolnych) w płytce 24-dołkowej. Alternatywnie, dodać 100 μl rozcieńczenia komórek do studzienek płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Uzupełnij warunki stymulacji naiwnych limfocytów T CD4 + w studzienkach pokrytych anty CD3, dodając 1 μg / ml przeciwciała anty CD28.</li>
	<li>Utrzymuj spoczynkowe limfocyty T CD4 + jako kontrolę w niepowlekanych studzienkach bez dodatku przeciwciał anty CD28. Inkubować spoczynkowe i aktywowane limfocyty T CD4 + przez 0 do 72 godzin w standardowych warunkach 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W celu sprawdzenia odpowiedniej aktywacji należy ocenić za pomocą cytometrii przepływowej ekspresję markera wczesnej aktywacji CD69 (16 godzin po aktywacji) lub markera późnej aktywacji CD25 (48 godzin po aktywacji) w spoczynkowych i aktywowanych naiwnych limfocytach T CD4 + inkubowanych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy braku lub obecności przeciwciał anty CD3 / CD289,10.</li>
</ol>
2. Przyleganie spoczynkowych i aktywowanych naiwnych limfocytów T CD4+
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy sterylizować w autoklawie i naświetlać światłem UV przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w sterylnych 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych. 
	Uwaga: W przypadku hodowli o wymiarach mniejszych niż 1 x 105 komórek zaleca się stosowanie komór szkiełkowych z przystosowanymi małymi studzienkami, aby zapobiec dyspersji komórek w szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Pokryć szkiełka nakrywkowe (lub komorę szkiełkową) 200 μl 0,1% (m.w. 150-300 KDa) 0,1% (w/v) roztworu poli-L-lizyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), usunąć i suszyć przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj i zbierz spoczynkowe i aktywowane naiwne limfocyty T CD4 + z 24-dołkowych płytek. Policz komórki i w razie potrzeby dostosuj je świeżą pożywką, aby przenieść 1 x 105 komórek do szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną. Inkubować komórki przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 37 oC i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Zbieranie i utrwalanie spoczynkowych i aktywowanych naiwnych limfocytów T CD4+
<ol>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę z hodowanych, spoczynkowych i aktywowanych naiwnych limfocytów T CD4 +.</li>
	<li>Powoli dodawać 500 μl sterylnego PBS RT. 
	Uwaga: Ostrożne dodawanie i usuwanie roztworów ze studzienek zapobiega odrywaniu się komórek od szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Wyrzucić PBS i dodać kolejne 500 μl PBS, aby dokładnie usunąć pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Utrwalić komórki przez dodanie 500 μl przefiltrowanego 4% paraformaldehydu (filtracja usuwa mikrocząsteczki, które mogą zakłócać analizę mikroskopową) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (preferowane) lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest związkiem toksycznym i lotnym. Wiadomo, że jest czynnikiem rakotwórczym dla ludzi. Używaj ostrożnie, przestrzegając odpowiedniego protokołu bezpieczeństwa.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć co najmniej dwa razy PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przejdź do następnego kroku lub utrzymuj studzienki płytkowe z 500 μl PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni aż do zabarwienia. 
	Uwaga: Sterylność podczas tego procesu pomaga uniknąć rozwoju mikroorganizmów.</li>
</ol>
4. Barwienie, montaż i wizualizacja za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Wyjmij PBS ze studzienek. Dodać 500 μl buforu blokującego zimno (1x PBS, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej o standardowym stopniu czystości, 1% płodowej surowicy bydlęcej pH 7,4). Inkubować przez 20 minut na lodzie.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć bufor blokujący i dodać pierwszorzędowe przeciwciała (antygangliozydy GD3 klon R24, GD2 klon 14G2a), anty CD25 sprzężone z PE i anty TCR sprzężone z APC oraz kontrole izotypów rozcieńczone w buforze blokującym do 2,5 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować 2 godziny na lodzie lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Preferowane jest powolne mieszanie orbitalne.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć przeciwciało i powoli dodawać 500 μl PBS. Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Dodać przeciwciała drugorzędowe (anty IgG3 sprzężone z FITC dla R24 anty GD3, anty IgG2 sprzężone z Alexa Fluor 488 lub Alexa Fluor 647 sprzężone z anty GD2 dla 14G2a anty GD2) rozcieńczone w buforze blokującym do 0,1 μg / ml.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę na lodzie w ciemności bez wstrząsania.</li>
	<li>Umyć trzykrotnie w PBS, jak opisano w ppkt 4.4). Utrzymuj studzienki z wystarczającą ilością PBS, aby uniknąć odwodnienia próbek.</li>
	<li>Dodać Hoechst 333258 barwie rozcieńczonej w PBS do 0,1 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej i usunąć. Umyj trzy razy w PBS.</li>
	<li>Umieść szkiełka na ręczniku papierowym i dodaj 20 μl roztworu montażowego (50% glicerolu w PBS) lub dostępnych w handlu roztworów montażowych, aby uniknąć blaknięcia i wygaszania próbek.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe delikatną pęsetą i umieść je na roztworze montażowym. Upewnij się, że strona szkiełka nakrywkowego, do której przymocowane są komórki, styka się z roztworem. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci i przeanalizuj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA
<ol>
	<li>Przygotować 96-dołkowe płytki pokryte przeciwciałem anty CD3 (5 μg/ml). Inkubować 4 x 104 naiwne limfocyty T CD4 + / basenik w 100 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej z przeciwciałem anty CD28 (1 μg / ml), aby zakończyć bodziec. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 0 do 72 godzin.</li>
	<li>Po różnych czasach po aktywacji umieść komórki w probówce mikrowirówkowej.</li>
	<li>Dodać 500 μl PBS i wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 1 ml odczynnika Trizol.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i utrzymywać próbkę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny. W razie potrzeby przystąpić do izolacji RNA. 
	Uwaga: Pozostawienie próbki w temperaturze -80 °C na co najmniej 24 godziny poprawia wydajność RNA. Stosowanie rękawiczek ręcznych jest również niezbędne, aby uniknąć degradacji RNA przez RNazy.</li>
	<li>Rozmrażać próbkę przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 2 minuty w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodać 200 μl chloroformu i energicznie wstrząsać ręcznie przez 30 sekund (aby uniknąć agresywnego mieszania RNA przez wirowanie). Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odzyskać fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 500 μl izopropanolu i trzykrotnie odwrócić probówkę.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez inwersję.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego 75% etanolu i odwirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Całkowicie wyrzucić supernatant i wysuszyć osad RNA, pozostawiając otwartą nakrętkę probówki. 
	Uwaga: W tym momencie granulka nie jest wyraźnie widoczna. Kontynuuj mimo to.</li>
	<li>Zawiesić osad w 20 μl wody o czystości cząsteczkowej. Oblicz stężenie i czystość kwasów nukleinowych, mierząc absorbancję 260 nm i 280 nm za pomocą nanokropli.</li>
	<li>Postępuj ostrożnie do syntezy cDNA, używając dowolnego konwencjonalnego zestawu do odwrotnej transkryptazy i postępując zgodnie z protokołem producenta. 
	Uwaga: Około 0,5-2 μg RNA uzyskuje się z 4 x 104 naiwnych limfocytów T CD4 +. cDNA może być syntetyzowane ze 100 ng RNA i wykorzystywane w reakcjach PCR w czasie rzeczywistym bez konieczności stosowania zestawów wejściowych o niskiej zawartości RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tango+to+quadrilla%3A+current+views+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li>
<li>Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+human+CD4%2B+T-cell+population%3A+two+distinct+CD4%2B+T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li>
<li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSOM+%2F+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+%2F+CD3+Mediated+T-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498(2013).</li>
<li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li>
<li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+the+brain%3A+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development%2C+stability%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li>
<li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+na%C3%AFve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li>
<li>Müthing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li>
<li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li>
<li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li>
<li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li>
<li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li>
<li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming%3A+implications+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li>
<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
<li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+%28CD60b%29+and+7-O-acetyl-GD3+%28CD60c%29+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li>
<li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD3%2C+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół może być stosowany do lokalizacji gangliozydów lub białek w zawiesinach komórkowych limfocytów T CD4 + lub innych komórek odpornościowych (np. PMBC, Figura 5), zaczynając od niewielkiej liczby komórek. Ze względu na mały rozmiar limfocytów T i nieprzylegające właściwości, pozyskiwanie mikroskopowych obrazów fluorescencyjnych skutkuje słabymi informacjami lub niską jakością, jeśli komórki nie są prawidłowo przylegające.
Protokół ten w połącz...

Limfocyty T CD4+ koordynują odpowiedź immunologiczną poprzez swoje funkcje efektorowe po aktywacji przez komórki prezentujące antygen1. Badanie mechanizmów komórkowych, które są modulowane podczas aktywacji, pozwala na wgląd w podstawowy proces funkcjonowania układu odpornościowego. Jednak badanie naiwnych limfocytów T CD4 + może być skomplikowane, ponieważ reprezentują one bardzo małą populację komórek na obrzeżach krwi2.
Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej kilka raportów badało lokalizację różnych cząsteczek zaangażowanych w aktywację limfocytów T CD4+, głównie białek związanych z błoną plazmatyczną3. Gangliozydy są glikosfingolipidami zawierającymi kwas sjalowy i chociaż były szeroko badane w komórkach nerwowych, gdzie są obfite, inne komórki, takie jak komórki odpornościowe, również wyrażają gangliozydy o biologicznie istotnych funkcjach4,5. Wcześniej informowaliśmy, że podczas aktywacji ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 + następuje regulacja w górę α2,8 sjalilotransferazy ST8Sia 1 (syntazy GD3) i syntazy GM2 / GD2, które indukują znaczną powierzchniową neoekspresję GD2 i regulację w górę gangliozydu GD36. Dalsze badania GD3, GD2 i innych gangliozydów w komórkach odpornościowych są konieczne, aby uzupełnić częściowy obraz funkcji immunologicznej oparty na białkach.
Zazwyczaj badanie ekspresji gangliozydów opiera się na technikach takich jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC)7, ale ta technika nie pozwala na przestrzenną lokalizację gangliozydów na błonie plazmatycznej lub w subkomórkowych kompartmentach, co ogranicza analizę biologiczną.
W tej pracy opisujemy protokół identyfikacji i lokalizacji gangliozydów GD3 i GD2 za pośrednictwem przeciwciał w ludzkich naiwnych limfocytach T CD4+ i PBMC po aktywacji anty-CD3/anty-CD28. Dzięki temu protokołowi możliwa jest również analiza genu i ekspresji molekularnej gangliozydów w niewielkiej liczbie komórek w zawiesinie, z uzyskaniem wysokiej jakości obrazów6, biorąc pod uwagę mały rozmiar limfocytów (9 μm).

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany RPMI 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Uzupełniony o 3%</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało FBS przeciwko ludzkiemu CD3</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 klon</td></tr><tr><td>myszy anty ludzkie przeciwciało CD28</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 klon</td></tr><tr><td>myszy anty ludzki GD3&nbsp; przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 klon</td></tr><tr><td>myszy anty ludzkie przeciwciało GD2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a klon</td></tr><tr><td>FITC-sprzężone przeciwciało anty-mysie IgG3 </td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 sprzężony antymysz</td><td>Thermo Fisher Scienie&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało IgG2a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 sprzężone przeciwciało przeciw myszom</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; Przeciwciało</td><td></td> A-21241 <td></td></tr><tr><td>IgG2a</td> Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Naiwny zestaw do izolacji komórek T CD4+ II, ludzki</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sortowanie&nbsp;</td></tr><tr><td>System szkiełek komorowych Nunc Lab-tek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop konfokalny Olympus FV 1000 (Olympus)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI i IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>Starter sekwencji do przodu GD3 syntaza</td><td>5&acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Starter odwrotnej sekwencji GD3 syntaza</td><td>5&acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Starter sekwencji do przodu GM2 / GD2 syntaza</td><td>5&acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Starter o odwrotnej sekwencji GM2 / GD2 syntaza</td><td>5&acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&acute;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr></tbody></table>

przygotowanie limfocytów t cd4 + do analizy ekspresji błony gangliozydowej gd3 i gd2 za pomocą mikroskopii

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Opisane tutaj metody aktywacji naiwnych limfocytów T CD4+ w zawiesinie i ich przylegania do szkiełek nakrywkowych do analizy mikroskopii konfokalnej pozwalają na przestrzenną lokalizację i wizualizację gangliozydów zaangażowanych w aktywację limfocytów T CD4+, które uzupełniają eksperymenty profilowania ekspresji, takie jak cytometria przepływowa, western blotting lub real-time PCR. Kwantyfikacja ekspresji gangliozydów za pomocą cytometrii przepływowej i ich lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii można uzyskać przy użyciu przeciwciał antygangliozydowych o wysokim powinowactwie i swoistości. Niemniej jednak, odpowiednie obchodzenie się z komórkami w zawiesinie obejmuje obróbkę płytek hodowlanych w celu promowania niezbędnego przylegania wymaganego do akwizycji fluorescencji lub mikroskopii konfokalnej. W tej pracy opisujemy protokół oznaczania ekspresji gangliozydów GD3 i GD2 oraz kolokalizacji z TCR podczas naiwnej aktywacji limfocytów T CD4 +. Opisano również eksperymenty PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem <40 000 komórek w celu określenia genów syntazy GD3 i GM2/GD2, co pokazuje, że eksperymenty z analizą genów można przeprowadzać na małej liczbie komórek i bez potrzeby stosowania dodatkowych zestawów RNA o niskim wkładzie wejściowym.

Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie pozwala na uzyskanie wysokiej jakości hodowli i adhezji spoczynkowych oraz aktywowanych naiwnych ludzkich limfocytów T CD4+ (Rycina 1). Aktywowane limfocyty T CD4+ wykazują charakterystyczny profil proliferacyjny (Rycina 1B) w porównaniu do stanu spoczynku (Rycina 1A). Marker późnej aktywacji CD25 jest przydatny do oceny wydajności aktywacji po 72 hr za pomocą mikroskopii k...

Opisujemy standardowy protokół barwienia przeciwciał do użycia w mikroskopii w celu określenia ekspresji błonowej i lokalizacji gangliozydów w spoczynku i aktywowanych ludzkich naiwnych limfocytach T CD4+. Opisano również eksperymenty PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem < 40 000 komórek, które nie wymagają dodatkowych zestawów RNA o niskim wkładzie wejściowym.

Przygotowanie limfocytów T CD4 + do analizy ekspresji błony gangliozydowej GD3 i GD2 za pomocą mikroskopii

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie przygotowania zawiesiny komórek T CD4+ do barwienia w celu wizualizacji lokalizacji gangliozydów GD3 i GD2 na powierzchni komórek przy użyciu niewielkiej liczby komórek. Metoda ta umożliwia wizualizację glikolipidów błonowych w małej liczbie małych komórek w zawiesinie, co ma miejsce w przypadku komórek mononuklearnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny ekspresji i lokalizacji gangliozydów w niewielkich ilościach komórek T CD4+ poprzez optymalizację wykorzystania próbek.Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na badania i diagnostykę niektórych typów białaczek z komórek T. Jak ustaliliśmy, niektóre linie komórkowe białaczki wykazują zwiększoną ekspresję gangliozydów GD3 i GD2. Rozpocznij od rozcieńczenia dwóch mililitrów krwi obwodowej od zdrowych dawców ludzkich w dwóch mililitrach sterylnego PBS EDTA.Powoli nanieś rozcieńczoną krew na trzy mililitry roztworu sacharozy o gęstości 1,077. Następnie wiruj przez 30 minut przy 250 ×g w temperaturze 21 °C bez hamowania, aby wytworzyć gradient mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Po wirowaniu PBMC można wyraźnie zaobserwować w postaci białego pierścienia.Pobrać PBMC za pomocą pipety i przenieść do sterylnej probówki w celu przemycia. Po przemyciu komórek w PBS EDTA, oczyścić naiwne limfocyty T CD4+ poprzez selekcję negatywną z użyciem kulek magnetycznych i komercyjnie dostępnego zestawu. Po uzyskaniu populacji limfocytów T CD4+ o czystości powyżej 95%, przygotować 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowej, dodając do każdego dołka 250 µL przeciwciała monoklonalnego anty-CD3 w stężeniu 5 µg/mL w PBS.Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez co najmniej dwie godziny. Po inkubacji usunąć z płytek rozcieńczenie przeciwciała anty-CD3 i przemyć dwukrotnie sterylnym 1x PBS. Następnie rozcieńczyć naiwne komórki CD4+T w uzupełnionym medium advanced RPMI 1640 do zagęszczenia 1×10⁶ komórek/ml.Następnie należy dodać 500 µL rozcieńczonych komórek do dołków płytki 24-dołkowej pokrytych przeciwciałem anty-CD3. Następnie stymulację naiwnych komórek CD4+T w dołkach pokrytych anty-CD3 należy zakończyć poprzez dodanie przeciwciała anty-CD28 w stężeniu 1 µg/mL. Komórki CD4+T w stanie spoczynku oraz aktywowane należy inkubować od 0 do 72 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Po upływie wyznaczonego czasu inkubacji zebrać spoczynkowe i aktywowane naiwne limfocyty T CD4+ z płytek 24-dołkowych. Wykonać zliczanie komórek i w razie potrzeby rozcieńczyć je świeżą pożywką z dodatkami do stężenia 1×10⁶ komórek/ml. Przenieść 500 µL rozcieńczonych komórek do dołków płytki 24-dołkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe powlekane poli-L-lizyną lub do komory przedmiotowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez minimum sześć godzin.Po inkubacji limfocyty T CD4+ będą przylegać do szkiełek podstawowych. Ostrożnie usuń pożywkę z dołków, a następnie powoli dodaj 500 µL sterylnego PBS. Dodawanie PBS podczas płukania należy przeprowadzać bardzo ostrożnie, zwłaszcza w przypadku przygotowywania komór na szkiełkach, w których znajduje się mniej niż 50 000 komórek na dołek.Odssać PBS i dodać do dołków kolejne 500 µL PBS, aby dokładnie usunąć pożywkę hodowlaną. Po usunięciu całego PBS dodać 500 µL przefiltrowanego 4%paraformaldehydu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Po utrwaleniu usunąć utrwalacz i przemyć co najmniej dwukrotnie PBS.W razie potrzeby płytkę można przechowywać przez kilka dni w temperaturze 4°C, z 500 µL PBS w każdej studzience. Najpierw należy usunąć PBS z utrwalonych komórek i dodać 500 µL zimnego buforu blokującego. Inkubować przez 20 minut na lodzie.Podczas inkubacji kluczowe jest, aby nie potrząsać intensywnie płytką, ponieważ spowoduje to odklejenie się komórek. Ostrożnie odessać bufor blokujący i dodać bufor blokujący zawierający 2,5 µg/ml jednego z przeciwciał pierwszorzędowych, przeciwciała anty-CD25 sprzężonego z PE, przeciwciała anty-TCR sprzężonego z APC lub kontroli izotypowej. Inkubować przez dwie godziny w lodzie, chroniąc przed światłem, lub przez noc w temperaturze 4 °C.Po inkubacji ostrożnie usunąć roztwór przeciwciał i powoli dodać 500 µL PBS. Następnie dodać odpowiednie przeciwciała wtórne rozcieńczone w buforze blokującym do stężenia 0.1 µg/mL. Chronić przed światłem i inkubować przez jedną godzinę w lodzie, uważając, aby nie wstrząsać próbkami.Po trzykrotnym przemyciu w PBS, jak wcześniej, dodać barwnik Hoecht rozcieńczony w PBS do stężenia 0.1 micrograms per milliliter i inkubować w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieścić przemyte preparaty na ręczniku papierowym i dodać 20 microliters medium montażowego lub komercyjnego medium montażowego, aby zapobiec blaknięciu i gaszeniu fluorescencji. Na koniec chwycić szkiełko nakrywkowe precyzyjną pęsetą, odwrócić je i położyć na medium montażowym tak, aby strona nakrywki, do której przytwierdzone są komórki, miała kontakt z roztworem.Uszczelnij szkiełka podstawowe lakierem do paznokci i przeanalizuj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Ten obraz przedstawia wizualizację w świetle przechodzącym utrwalonych komórek CD4+T 72 godziny po aktywacji. Walidację efektywnej aktywacji po barwieniu ocenia się przy użyciu przeciwciała anty-CD25, przedstawionego na czerwono.Gangliozyd GD3 znajduje się wewnątrzkomórkowo oraz na powierzchni komórek aktywowanych limfocytów T CD4+, co oceniono poprzez barwienie przeciwciałem anty-GD3 przedstawionym w kolorze zielonym. GD3, ponownie pokazany w kolorze zielonym, nie kolokalizuje z TCR, ponownie pokazanym w kolorze czerwonym, co oceniono za pomocą barwienia przeciwciałami anty-GD3 i anty-TCR. Natomiast gangliozyd GD2 kolokalizuje z TCR w limfocytach T CD4+, co oceniono poprzez barwienie przeciwciałem anty-GD2, przedstawionym w kolorze zielonym, oraz barwienie przeciwciałem anty-TCR, przedstawionym w kolorze czerwonym.Barwienie gangliozydem GD3 wykazuje lokalizację wewnątrzkomórkową oraz na powierzchni komórek w podgrupie aktywowanych PBMC. Z kolei barwienie gangliozydem GD2 wykazuje lokalizację wewnątrzkomórkową i na powierzchni komórek we wszystkich aktywowanych PBMC. Po przeprowadzeniu tej procedury przylegania i manipulacji limfocytami T CD4+, można zastosować inne metody, takie jak barwienie przedziałów wewnątrzkomórkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące specyficznej lokalizacji wewnątrzkomórkowej lub przetwarzania gangliozydów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak obchodzić się z niewielką liczbą limfocytów T CD4+ oraz jak je przytwierdzić do podłoża, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej do analizy ekspresji gangliozydów.

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Ten film pokazuje in vitro różnicowanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów, makrofagów lub komórek pomocniczych T G (THGM). Wyizolowane naiwne limfocyty T są stymulowane do różnicowania się w THGM, co potwierdza się poprzez wykrycie wysokiej wewnątrzkomórkowej produkcji GM-CSF i niskiej ekspresji innych cytokin specyficznych dla komórek T pomocniczych.

Technika in vitro do różnicowania komórek T pomocniczych wytwarzających GM-CSF od naiwnych limfocytów T

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Ten film demonstruje test do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ na różnych etapach cyklu komórkowego. Znakowane fluorescencyjnie żywe komórki są wybierane za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki na różnych etapach cyklu komórkowego są identyfikowane na podstawie zawartości DNA przy użyciu przeciwciał przeciwko białku jądrowemu związanemu z proliferacją komórek i barwienia kwasem nukleinowym.

Test do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Gangliozydy to glikosfingolipidy zawierające kwas sjalowy, których szczególnie dużo występuje w mózgu. Ich amfipatyczny charakter wymaga technik ekstrakcji i oczyszczania organicznego/wodnego, aby zapewnić optymalny odzysk i dokładne analizy. Ten artykuł zawiera omówienie ekstrakcji gangliozydów w skali analitycznej i preparatywnej, oczyszczania i analizy chromatografii cienkowarstwowej.

Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Poznaj metodę barwienia przeciwciałami do wizualizacji gangliozydów GD3 i GD2 na powierzchni ludzkich limfocytów T CD4+. Technika ta umożliwia analizę ekspresji przy niskiej liczbie komórek, co jest kluczowe w badaniach nad białaczką.

Przygotowanie limfocytów T CD4 ⁺ do analizy ekspresji błony gangliozydowej GD3 i GD2 za pomocą mikroskopii

Przeglądaj więcej filmów