Name: In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę rejestracji aktywności nerwów trzewnych in vitro w odcinkach jelita cienkiego i grubego myszy. Technika ta pozwala kwantyfikować odpowiedzi nerwowe na bodźce mechaniczne i chemiczne bez wpływu ośrodkowego układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SN przeprowadził opisane powyżej eksperymenty, przeprowadził analizę danych i sporządził manuskrypt. AD i JDM wdrożyły tę technikę w naszych ośrodkach badawczych i pomogły w analizie danych. HC pomagał w przeprowadzaniu eksperymentów. WJ, CK i DG pomogły we wdrożeniu techniki pomiarów aferentnych w naszym laboratorium, analizie danych i interpretacji wyników. Badanie zaprojektowały SF, JDM i BDW. Wszyscy autorzy krytycznie przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu. SN jest członkiem Funduszu Badań Naukowych (FWO) we Flandrii (11G7415N). Prace te były wspierane finansowo przez FWO (G028615N i G034113N).

<ol><li>Donovan, J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoid+modulation+of+jejunal+afferent+responses+to+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoid modulation of jejunal afferent responses to LPS.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (10), 956-e465 (2012).</li>
<li>Gregersen, H., Jiang, W., Liao, D., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stress-dependent+mechanoreceptors+linking+intestinal+biomechanics+and+sensory+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for stress-dependent mechanoreceptors linking intestinal biomechanics and sensory signal transduction.</a> Exp Physiol. 98 (1), 123-133 (2013).</li>
<li>Keating, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+hypersensitivity+in+a+mouse+model+of+post-inflammatory+gut+dysfunction%3A+role+of+altered+serotonin+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Afferent hypersensitivity in a mouse model of post-inflammatory gut dysfunction: role of altered serotonin metabolism.</a> J Physiol. 586 (18), 4517-4530 (2008).</li>
<li>Liu, C. Y., Jiang, W., Muller, M. H., Grundy, D., Kreis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+mesenteric+afferents+to+chemical+and+mechanical+stimuli+following+systemic+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Sensitization of mesenteric afferents to chemical and mechanical stimuli following systemic bacterial lipopolysaccharide.</a> Neurogastroenterol Motil. 17 (1), 89-101 (2005).</li>
<li>Deiteren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+visceral+hypersensitivity%3A+focus+on+splanchnic+afferent+nerve+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to visceral hypersensitivity: focus on splanchnic afferent nerve signaling.</a> Neurogastroenterol Motil. 27 (12), 1709-1720 (2015).</li>
<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+prolonged+CLP-induced+sepsis+on+mesenteric+afferent+nerve+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of prolonged CLP-induced sepsis on mesenteric afferent nerve activity in mice.</a> Neurogastroenterol Motil. 27 (Suppl 2), 22(2015).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. III, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+functional+characterization+of+mouse+colorectal+afferent+endings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings.</a> J Vis Exp. (95), e52310(2015).</li>
<li>Travis, L., Spencer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stretch-activated+firing+of+spinal+afferent+nerve+endings+in+mouse+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging stretch-activated firing of spinal afferent nerve endings in mouse colon.</a> Front Neurosci. 7, 179(2013).</li>
<li>De Schepper, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+receptor+signaling+mediates+afferent+nerve+sensitization+during+colitis-induced+motility+disorders+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPV1 receptor signaling mediates afferent nerve sensitization during colitis-induced motility disorders in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G245-G253 (2008).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71 (6), 2046-2060 (1994).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-man%27%3A+characterising+the+mechanosensitivity+of+human+colonic+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">First-in-man': characterising the mechanosensitivity of human colonic afferents.</a> Gut. 60 (2), 281-282 (2011).</li>
<li>Peiris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+afferent+recordings%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human visceral afferent recordings: preliminary report.</a> Gut. 60 (2), 204-208 (2011).</li>
<li>Brookes, S. J., Spencer, N. J., Costa, M., Zagorodnyuk, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+primary+afferent+signalling+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Extrinsic primary afferent signalling in the gut.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (5), 286-296 (2013).</li>
<li>Bulmer, D. C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+translation+in+models+of+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Achieving translation in models of visceral pain.</a> Curr Opin Pharmacol. 11 (6), 575-581 (2011).</li>
<li>De Winter, B. Y., De Man, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+inflammation%2C+immune+system+and+neuronal+pathways%3A+effect+on+gastrointestinal+motility%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility.</a> World J Gastroenterol. 16 (44), 5523-5535 (2010).</li>
<li>Akbar, A., Yiangou, Y., Facer, P., Walters, J. R., Anand, P., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+capsaicin+receptor+TRPV1-expressing+sensory+fibres+in+irritable+bowel+syndrome+and+their+correlation+with+abdominal+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain.</a> Gut. 57 (7), 923-929 (2008).</li>
<li>De Schepper, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+receptors+on+unmyelinated+C-fibres+mediate+colitis-induced+sensitization+of+pelvic+afferent+nerve+fibres+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve fibres in rats.</a> J Physiol. 586 (21), 5247-5258 (2008).</li>
<li>Vermeulen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TRPV1+and+TRPA1+in+visceral+hypersensitivity+to+colorectal+distension+during+experimental+colitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of TRPV1 and TRPA1 in visceral hypersensitivity to colorectal distension during experimental colitis in rats.</a> Eur J Pharmacol. 698 (1-3), 404-412 (2013).</li>
<li>Booth, C. E., Shaw, J., Hicks, G. A., Kirkup, A. J., Winchester, W., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+pattern+of+jejunal+distension+on+mesenteric+afferent+sensitivity+in+the+anaesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Influence of the pattern of jejunal distension on mesenteric afferent sensitivity in the anaesthetized rat.</a> Neurogastroenterol Motil. 20 (2), 149-158 (2008).</li>
<li>Hughes, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuro-immune+interactions+differ+between+irritable+bowel+syndrome+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Sensory neuro-immune interactions differ between irritable bowel syndrome subtypes.</a> Gut. 62 (10), 1456-1465 (2013).</li>
<li>Hughes, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+derived+opioidergic+inhibition+of+viscerosensory+afferents+is+decreased+in+Irritable+Bowel+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune derived opioidergic inhibition of viscerosensory afferents is decreased in Irritable Bowel Syndrome patients.</a> Brain Behav Immun. 42, 191-203 (2014).</li>
<li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activation+by+mucosal+biopsy+supernatants+from+irritable+bowel+syndrome+patients+is+linked+to+visceral+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal activation by mucosal biopsy supernatants from irritable bowel syndrome patients is linked to visceral sensitivity.</a> Exp Physiol. 99 (10), 1299-1311 (2014).</li>
<li>Wouters, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+Receptor+H1-mediated+Sensitization+of+TRPV1+Mediates+Visceral+Hypersensitivity+and+Symptoms+in+Patients+With+Irritable+Bowel+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Histamine Receptor H1-mediated Sensitization of TRPV1 Mediates Visceral Hypersensitivity and Symptoms in Patients With Irritable Bowel Syndrome.</a> Gastroenterology. , (2016).</li>
<li>Brenn, D., Richter, F., Schaible, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+unmyelinated+sensory+fibers+of+the+joint+nerve+to+mechanical+stimuli+by+interleukin-6+in+the+rat%3A+an+inflammatory+mechanism+of+joint+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Sensitization of unmyelinated sensory fibers of the joint nerve to mechanical stimuli by interleukin-6 in the rat: an inflammatory mechanism of joint pain.</a> Arthritis Rheum. 56 (1), 351-359 (2007).</li>
<li>Christianson, J. A., Liang, R., Ustinova, E. E., Davis, B. M., Fraser, M. O., Pezzone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+bladder+and+colon+sensory+innervation+occurs+at+the+primary+afferent+level%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level.</a> Pain. 128 (3), 235-243 (2007).</li>
<li>Daly, D. M., Chess-Williams, R., Chapple, C., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+role+of+acetylcholine+and+muscarinic+receptors+in+bladder+afferent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">The inhibitory role of acetylcholine and muscarinic receptors in bladder afferent activity.</a> Eur Urol. 58 (1), 22-28 (2010).</li>
<li>Minagawa, T., Wyndaele, M., Aizawa, N., Igawa, Y., Wyndaele, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pelvic+organ+cross-talk%3A+2.+Impact+of+colorectal+distention+on+afferent+nerve+activity+of+the+rat+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pelvic organ cross-talk: 2. Impact of colorectal distention on afferent nerve activity of the rat bladder.</a> J Urol. 190 (3), 1123-1130 (2013).</li>
<li>Wyndaele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pelvic+organ+crosstalk%3A+1.+Peripheral+modulation+of+bladder+inhibition+by+colorectal+distention+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pelvic organ crosstalk: 1. Peripheral modulation of bladder inhibition by colorectal distention in rats.</a> J Urol. 190 (2), 765-771 (2013).</li>
<li>Keating, C., Nocchi, L., Yu, Y., Donovan, J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+and+gastrointestinal+sensory+function%3A+Altered+colonic+mechanosensory+and+chemosensory+function+in+the+aged+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ageing and gastrointestinal sensory function: Altered colonic mechanosensory and chemosensory function in the aged mouse.</a> J Physiol. , (2015).</li>
<li>Valdez-Morales, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Peripheral+Sensory+Nerves+by+Mediators+From+Colonic+Biopsies+of+Diarrhea-Predominant+Irritable+Bowel+Syndrome+Patients%3A+A+Role+for+PAR2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Peripheral Sensory Nerves by Mediators From Colonic Biopsies of Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome Patients: A Role for PAR2.</a> Am J Gastroenterol. 108 (10), 1634-1643 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół w tym artykule opisuje powtarzalną technikę laboratoryjną do badania aktywności nerwu doprowadzającego krezki u gryzoni, stosowaną przez naszą grupę i innych 3,4,7,8,12,20,21,31. Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują szybką izolację tkanki, aspirację pasma nerwowego do elektrody ssącej oraz odpowiednie "uszczelnienie" szklanej kapilary z kąpieli narządowej poprzez zasysanie otaczającej tkanki tłuszczowej do naczynia włosowatego. Otwór szklanej kapilary powinien być precyzyjnie określony: zbyt ma...

Sygnalizacja sensoryczna i percepcja bólu to złożony proces, który wynika ze skomplikowanego współdziałania między nerwami doprowadzającymi, neuronami rdzeniowymi, wznoszącymi się i opadającymi szlakami ułatwiającymi i hamującymi oraz kilkoma różnymi obszarami mózgu. W związku z tym zmiany na jednym lub więcej z tych poziomów mogą powodować zmienioną sygnalizację czuciową i ból trzewny w stanach chorobowych. Aby zbadać wszystkie te różne aspekty sygnalizacji sensorycznej, opracowano wiele technik, począwszy od eksperymentów z pojedynczymi komórkami (np. obrazowanie wapnia na neuronach) po modele całych zwierząt (np. reakcje behawioralne, takie jak odpowiedź trzewnoruchowa). Technika opisana w tym artykule pozwala naukowcom na specyficzną ocenę aktywności nerwów aferentnych in vitro z izolowanego odcinka jelita cienkiego lub okrężnicy u gryzoni. Krótko mówiąc, izolowany segment przewodu pokarmowego (zwykle jelito czcze lub okrężnica) jest montowany w specjalnie zbudowanej komorze rejestracyjnej wypełnionej fizjologicznym roztworem Krebsa. Nerw splanchniczny jest wycinany swobodnie i połączony z elektrodą, co umożliwia rejestrację aferentnej aktywności neuronalnej w nerwach doprowadzających splanchnicznych lub miednicznych. Aktywność nerwów może być rejestrowana zasadniczo lub w odpowiedzi na rosnące ciśnienie śródświetlne i/lub związki farmakologiczne, które mogą być stosowane bezpośrednio do komory rejestrującej (surowiczo) lub przez perfuzat śródświetlny (błona śluzowa) w celu oceny ich wpływu na wydzielinę aferentną 1-6. Warto zauważyć, że nerwy splanchniczne oprócz aferentów czuciowych zawierają również włókna odprowadzające i aferenty trzewno-ofugalne. Jedną z głównych zalet rejestracji nerwów splanchnicznych ex vivo jest fakt, że naukowcy mogą określić ilościowo aktywność nerwów bez modulacji lub wkładu z ośrodkowego układu nerwowego, co pozwala na badanie bezpośredniego wpływu miejscowo stosowanych związków na aktywność nerwów. Ponadto monitorowanie parametrów życiowych, które jest konieczne przy użyciu podejścia in vivo (zob. poniżej), nie ma już znaczenia. Zapis splanchnicznyczny in vitro jest wreszcie znacznie mniej czasochłonny niż jego odpowiednik in vivo.
Aktywność neuronów aferentnych w odpowiedzi na inne bodźce, takie jak głaskanie błony śluzowej, sondowanie za pomocą włosów von Freya lub rozciąganie segmentu, może być badana w zmodyfikowanym układzie eksperymentalnym, w którym tkanka jelitowa jest przygwożdżona i otwierana wzdłużnie (co jest przeciwieństwem naszego układu wykorzystującego nienaruszony segment), jak to opisano w poprzednim numerze 7,8. Ponadto, dopiero niedawno, opisano technikę badania aktywacji nerwu doprowadzającego okrężnicy w samej ścianie okrężnicy za pomocą obrazowania wapnia, ponownie przy użyciu przypiętego, podłużnie otwartego segmentu 9.
Alternatywna wersja tej techniki in vivo polega na pomiarze aktywacji neuronów w pobliżu wejścia aferenta do rdzenia kręgowego. Krótko mówiąc, zwierzę poddane sedacji umieszcza się w pozycji leżącej, odsłaniając rdzeń kręgowy lędźwiowo-krzyżowy, do którego wystaje nerw doprowadzający będący przedmiotem zainteresowania, za pomocą laminektomii, budując studnię wypełnioną parafiną przy użyciu skóry nacięcia i udrapując korzeń grzbietowy na platynowej elektrodzie bipolarnej 10,11. Technika ta pozwala ponadto naukowcom scharakteryzować włókna na podstawie ich prędkości przewodzenia i odróżnić niezmielinizowane włókna C od cienko zmielinizowanych włókien Aδ. Ponadto korzonki grzbietowe zawierają wyłącznie czuciowe włókna doprowadzające, w przeciwieństwie do wspomnianych wcześniej mieszanych nerwów doprowadzających i odprowadzających.
Rejestrowanie wydzieliny nerwów aferentnych in vitro z izolowanych segmentów jelita może być również wykonane przy użyciu próbek ludzkich, ponieważ dwie grupy badawcze niezależnie opublikowały pierwsze manuskrypty rejestrujące aktywność nerwu doprowadzającego okrężnicy w próbkach do resekcji u ludzi 12,13. Wdrożenie tej techniki może skutkować łatwiejszą translacją danych mysich na stan humanitarny i może pozwolić naukowcom na łatwą identyfikację leków ukierunkowanych na uwrażliwiony nerw czuciowy. Kliniczne znaczenie scharakteryzowania aktywności nerwów doprowadzających, a także odkrycie nowych odczynników terapeutycznych, które celują w wygórowaną aktywność nerwów doprowadzających, zostało szczegółowo omówione przez wielu ekspertów w tej dziedzinie 14-19.
Wyżej wymieniona technika in vitro uzupełnia bardziej powszechnie znane pomiary aktywności nerwów doprowadzających in vivo. Podczas pomiaru aktywności neuronalnej in vivo, aktywność nerwów może być mierzona bezpośrednio u zwierzęcia poddanego sedacji, podczas którego segment zainteresowania jest identyfikowany, a następnie intubowany, a następnie budowana jest studzienka wypełniona ciekłą parafiną przy użyciu ściany brzucha i skóry gryzonia 20. Nerw doprowadzający będący przedmiotem zainteresowania jest następnie identyfikowany, dzielony i umieszczany na dwubiegunowej elektrodzie platynowej, co umożliwia pomiar aktywności neuronalnej. Technika ta pozwala badaczowi modulować aktywność nerwów doprowadzających u żywych, choć uspokojonych zwierząt; W związku z tym można badać aktywność neuronalną reagującą na zakłócenia, takie jak wzdęcia światła lub dożylne podawanie związku.
Badania translacyjne obecnie koncentrują się głównie na zastosowaniu supernatantów pochodzenia ludzkiego (np. z biopsji okrężnicy, hodowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, itp.) na aferentach myszy z jelita czczego i/lub okrężnicy 21,22. Naukowcy mogą bezpośrednio aplikować supernatanty albo do kąpieli narządowej, albo do roztworu śródświetlnego, który ukrwia odcinek jelita, dzięki czemu można badać różnicowy wpływ aplikacji surowiczej i śluzówkowej na doprowadzające wyładowanie nerwowe. W związku z tym wykazano, że supernatany biopsji błony śluzowej jelita grubego od pacjentów z zespołem jelita drażliwego mogą powodować nadwrażliwość w aferentach okrężnicy myszy, neuronach podśluzówkowych świnki morskiej i neuronach zwojów korzenia grzbietowego myszy 21,23,24.
Wreszcie, rejestrowanie aktywności neuronalnej nie jest ograniczone do neuronów krezkowych i/lub miednicznych unerwiających przewód pokarmowy. Inni wykazali, że zapisy nerwowe mogą być wykonywane w aferentach zaopatrujących staw kolanowy 25, podczas gdy inni scharakteryzowali również aktywność nerwów doprowadzających pęcherz moczowy 26-28 i wykazali, że aferenty miednicy z pęcherza moczowego oraz przewodu pokarmowego zbiegają się, co może prowadzić do przesłuchów neuronalnych 29.

<table><tbody><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td>VWR Chemicals</td><td>27,810,295</td><td>związek roztwór Krebsa</td></tr><tr><td>chlorek potasu (KCl)</td><td>Acros organics</td><td>196770010</td><td>związek Krebs roztwór</td></tr><tr><td>diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)</td><td>VWR Chemicals</td><td>1 063 461 000</td><td>związek roztwór Krebsa</td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1,063,291,000</td><td>złożony roztwór Krebsa</td></tr><tr><td>siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>złożony roztwór Krebsa</td></tr><tr><td>chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>23,811,000</td><td>złożony roztwór Krebsa</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>VWR Chemicals</td><td>1011175P</td><td>roztwór</td></tr> <tr><td>KrebsaZwiązek wody</td><td></td><td></td> destylowanej <td>Roztwór Krebsa</td></tr><tr><td>Rurki PVC</td><td>Materiały</td><td></td> laboratoryjne Materiały laboratoryjne <td>Segment jelitowy powinien być zamontowany na rurkach PVC</td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>Materiały</td><td></td> do laboratoriów naukowych <td>Reszta rurki, najlepiej na bazie silikonu - łatwiejsze usuwanie zanieczyszczeń w rurki</td></tr><tr><td>Nić jedwabna</td><td>Pearsall Limited</td><td>10B15S220</td><td>Mocowanie segmentu na rurce PVC</td></tr><tr><td>Sterownik strzykawki</td><td>Aparat Harvarda</td><td>55-2222</td><td>Wlew śródświetlny lornetki Krebsa</td></tr><tr><td>- w tym 10-krotne powiększenie w oku</td><td>Zeiss STEMI 2000</td><td></td><td>Optymalna wizualizacja do rozwarstwienia nerwu doprowadzającego</td></tr><tr><td>Homeotermiczny koc sterujący Aparat</td><td>Harvarda</td><td>507214</td><td>Ogrzewanie komory</td></tr> <tr><td>narządowejWykonana na zamówienie łaźnia organowa z dnem pokrytym Sylgardem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Spike2 <td>Rejestracja i analiza danych</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, 500 sztuk, stal nierdzewna, średnica 0,2 mm</td><td>Szpilki do owadów Austerlitz minétics</td><td></td><td>Rozwarstwienie nerwu doprowadzającego</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #5 inox 11 cm</td><td>Światowy instrument precyzyjny</td><td>500341</td><td>Rozwarstwienie nerwu</td></tr> <tr><td>doprowadzającegoNożyczki, sprężynowe, 14 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>15905</td><td>Rozwarstwienie nerwu doprowadzającego</td></tr><tr><td>DB digitimer&nbsp;</td><td>NL 108T2/10</td><td></td><td>przetwornik ciśnienia</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-3333</td><td>Manipulacja 3D elektrody ssącej</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>X-4 blok</td><td></td> obrotowy <td>Manipulacja 3D elektrody ssącej</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>GJ-8 Stojak</td><td></td> magnetyczny <td>Manipulacja 3D elektrody ssącej</td></tr><tr><td>LightSource</td><td>Euromex Microscopes Holandia EK-1</td><td></td><td>Optymalna wizualizacja do preparacji nerwu doprowadzającego</td></tr><tr>Aparatura <td></td><td></td><td>rejestrująca CED 1401</td><td>Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego</td></tr><tr><td>Humbug 50/60 Hz Eliminator szumów</td><td>Quest Scientific Instruments</td><td></td><td>Eliminacja szumów tła</td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna</td><td>Gibson Minipuls 2</td><td></td><td>Infuzja komory narządowej, w której zamontowany</td></tr> <tr><td>jest segmentPółogniwa uchwytu mikroelektrody 1,5 mm</td><td>Światowy instrument precyzyjny</td><td>MEH2SW</td><td>Elektroda ssąca do izolacji włókna doprowadzającego</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego, 300 szt.; 1,5/0,84 OD/ID</td><td>World Precision Instrument</td><td>1B150-4</td><td>Kapilara do izolacji nerwu doprowadzającego</td></tr></tbody></table>

in vitro rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Nerwy doprowadzające nie tylko przekazują informacje dotyczące normalnej fizjologii, ale także sygnalizują zaburzoną homeostazę i procesy patofizjologiczne różnych układów narządowych od peryferii do ośrodkowego układu nerwowego. W związku z tym zwiększona aktywność lub "uwrażliwienie" nerwów doprowadzających krezki przypisuje się ważną rolę w patofizjologii nadwrażliwości trzewnej i zespołów bólowych brzucha.
Aktywność nerwu doprowadzającego krezki może być mierzona in vitro w izolowanym segmencie jelita, który jest zamontowany w specjalnie zbudowanym pomieszczeniu narządowym i od którego odizolowany jest nerw splanchniczny, co pozwala badaczom bezpośrednio ocenić aktywność nerwów przylegających do odcinka przewodu pokarmowego. Aktywność można rejestrować na początku badania w warunkach znormalizowanych, podczas rozdęcia segmentu lub po dodaniu związków farmakologicznych podawanych doświetlnie lub surowiczo. Technika ta pozwala badaczowi łatwo zbadać działanie leków ukierunkowanych na obwodowy układ nerwowy w próbkach kontrolnych; Poza tym dostarcza kluczowych informacji o tym, jak zmienia się aktywność neuronów podczas choroby. Należy jednak zauważyć, że pomiar aktywności neuronów aferentnych stanowi tylko jedną stację przekaźnikową w złożonej kaskadzie sygnalizacji neuronalnej, a naukowcy powinni pamiętać, aby nie przeoczyć aktywności neuronalnej na innych poziomach (np. Zwoje korzenia grzbietowego, rdzeń kręgowy lub ośrodkowy układ nerwowy), aby w pełni wyjaśnić złożoną fizjologię neuronów w zdrowiu i chorobie.
Powszechnie używane aplikacje obejmują badanie aktywności neuronalnej w odpowiedzi na podanie lipopolisacharydu, oraz badanie aktywności nerwów doprowadzających w modelach zwierzęcych zespołu jelita drażliwego. W bardziej translacyjnym podejściu, izolowany segment jelita myszy może być wystawiony na działanie supernatantów okrężnicy od pacjentów z IBS. Co więcej, niedawno wykazano, że modyfikacja tej techniki ma zastosowanie w próbkach jelita grubego u ludzi.

Aktywność włókien aferentnych jelita czczego mierzono w stanie spoczynku oraz w odpowiedzi na rampowe rozciąganie u 9 ośmiotygodniowych samców myszy OF-1. Zwierzęta utrzymywano w grupach w zestandaryzowanych warunkach (6 zwierząt w klatce, 20 - 22 °C, wilgotność 40 - 50%, 12-godzinny cykl światła i ciemności) z nieograniczonym dostępem do wody kranowej i standardowej karmy. Odcinki jelita czczego myszy wykazywały nieregularne spontaniczne wyładowania nerwów aferentnych w stanie spoczynku ...

Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego w kierunku mózgu dotyczące normalnej homeostazy, jak również patofizjologii. Aktywność nerwów doprowadzających przewodu pokarmowego można ocenić, montując izolowane segmenty jelita z przyczepionymi nerwami doprowadzającymi do kąpieli narządowej, izolując nerw i oceniając aktywność podstawową i stymulowaną.

In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Ogólnym celem tej techniki jest rejestracja in vitro aktywności aferentnych nerwów trzewnych z pojedynczego pęczka nerwowego jelita czczego lub okrężnicy w odpowiedzi na stopniowe rozciąganie oraz aplikację związków chemicznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak to, czy nerwy aferentne zaopatrujące przewód pokarmowy ulegają nadwrażliwości lub desensytyzacji w różnych stanach chorobowych. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość rejestracji wyładowań nerwowych in vitro oraz możliwość ilościowego określenia aktywności nerwowej bez modulacji lub sygnałów z ośrodkowego układu nerwowego.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię lub diagnostykę kilku zespołów bólowych, takich jak zespół jelita drażliwego, ponieważ uwrażliwienie nerwowe odgrywa kluczową rolę w patogenezie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności, gdyż preparatyka pęczków nerwowych oraz analiza pojedynczych jednostek zarejestrowanego sygnału wymagają znacznych treningów. Aby rozpocząć tę procedurę, ułóż uśmierconą mysz w pozycji grzbietowej.Wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha przez skórę i warstwę mięśni brzucha za pomoc

in-vitro-recording-mesenteric-afferent-nerve-activity-mouse-jejunal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę rejestrowania aktywności nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczura ex-vivo, kaniulowanej na obu końcach i podawanej solą fizjologiczną w celu zwiększenia ciśnienia śródświetlnego. Wraz ze wzrostem ciśnienia sygnał nerwowy wzrasta, wskazując na jego stymulację.

Zapis elektrofizjologiczny nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczurzej okrężnicy

Ten film pokazuje proces rejestrowania sygnałów elektrycznych z krezkowych nerwów doprowadzających w wypreparowanym segmencie jelita czczego myszy w celu zbadania wpływu ciśnienia w tkance i zmian ruchu na aktywność nerwu doprowadzającego.

Zapis aktywności nerwu doprowadzającego krezki w segmencie jejunum myszy ex vivo

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

Nieprawidłowa funkcja czuciowa leży u podstaw bólu trzewnego i innych objawów funkcjonalnych i zapalnych chorób jelit. Przedstawiono protokół elektrofizjologicznego zapisu nerwów doprowadzających okrężnicy w preparacie ex vivo jelita grubego szczura.

In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Poznaj metodę rejestracji aktywności nerwów trzewnych in vitro w odcinkach jelita cienkiego i grubego myszy. Technika ta pozwala kwantyfikować odpowiedzi nerwowe na bodźce mechaniczne i chemiczne bez wpływu ośrodkowego układu nerwowego.

In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

Przeglądaj więcej filmów