In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy
25 października 2016
Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego w kierunku mózgu dotyczące normalnej homeostazy, jak również patofizjologii. Aktywność nerwów doprowadzających przewodu pokarmowego można ocenić, montując izolowane segmenty jelita z przyczepionymi nerwami doprowadzającymi do kąpieli narządowej, izolując nerw i oceniając aktywność podstawową i stymulowaną.
Ogólnym celem tej techniki jest rejestracja in vitro aktywności aferentnych nerwów trzewnych z pojedynczego pęczka nerwowego jelita czczego lub okrężnicy w odpowiedzi na stopniowe rozciąganie oraz aplikację związków chemicznych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak to, czy nerwy aferentne zaopatrujące przewód pokarmowy ulegają nadwrażliwości lub desensytyzacji w różnych stanach chorobowych. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość rejestracji wyładowań nerwowych in vitro oraz możliwość ilościowego określenia aktywności nerwowej bez modulacji lub sygnałów z ośrodkowego układu nerwowego.
Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię lub diagnostykę kilku zespołów bólowych, takich jak zespół jelita drażliwego, ponieważ uwrażliwienie nerwowe odgrywa kluczową rolę w patogenezie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności, gdyż preparatyka pęczków nerwowych oraz analiza pojedynczych jednostek zarejestrowanego sygnału wymagają znacznych treningów. Aby rozpocząć tę procedurę, ułóż uśmierconą mysz w pozycji grzbietowej.
Wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha przez skórę i warstwę mięśni brzucha za pomocą skalpela, prowadząc je od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej. Następnie wypłucz jamę brzuchną zimnym roztworem Krebsa, aby zapobiec wysychaniu tkanek wewnątrzbrzusznych. Po tym szybko wytnij cały jelito czcze za pomocą ostrych nożyczek, usuwając około 20 centymetrów jelita cienkiego, zaczynając bezpośrednio od zgięcia dwunastniczo-żylnego.
Należy uważać, aby nie uszkodzić okolicznych struktur i zachować nienaruszoną krezkę jelita, w której znajdują się naczynia krwionośne i nerwy doprowadzające jelita cienkiego. Następnie wycięte jelito cienkie należy umieścić w schłodzonym roztworze Krebsa na lodzie, stale natleniając je mieszanką Carbigen. Następnie jelito cienkie należy pociąć na pętle o długości około trzech centymetrów.
Zlokalizuj pęczek krezkowy zawierający naczynia i nerw trzewny w pobliżu środka odpowiedniej pętli, aby ułatwić zamocowanie pętli w komorze rejestracyjnej. Następnie przepłucz każdy segment roztworem Krebsa za pomocą tępego cewnika, aby usunąć zawartość światła i treści pokarmowe, ponieważ zawierają one enzymy trawienne, które przyspieszą degradację próbki tkanki in vitro. Po tym zabiegu wybierz segment do pomiaru aktywności włókien aferentnych nerwu i umieść go w komorze rejestracyjnej pokrytej warstwą elastomeru silikonowego.
Utrzymuj temperaturę roztworu Krebsa w komorze pomiarowej na poziomie 34°C. Następnie zamocuj odcinek jelita czczego w kąpieli organowej w taki sposób, aby koniec proksymalny był połączony z dozownikiem strzykawkowym zapewniającym przepływ luminalny, a koniec dystalny z odpływem. Delikatnie rozciągnij odcinek, uważając, aby nie doprowadzić do nadmiernego napięcia.
Oba końce należy mocno przywiązać za pomocą jedwabnych ligatur do portów dopływowych i odpływowych. Następnie należy podłączyć pompę strzykawkową do końca jamnego i przeprowadzić śródświatową perfuzję odcinka jelita cienkiego (jelita kształtniczego) roztworem Krebsa z prędkością 10 ml/h. Krezkę zamocowanego odcinka jelita należy przyszpilić płasko do dolnej warstwy z elastomeru silikonowego.
Następnie rozciągnij krezkę, aby zoptymalizować wizualizację pęczka krezkowego. Dalej przeprowadź test rozszerzenia rampowego, zamykając port wylotowy, aż ciśnienie wewnątrz światła segmentu jelitowego osiągnie 60 mmHg, aby zweryfikować, czy roztwór Krebsa nie wycieka z zamontowanego segmentu. Zaobserwuj płynny wzrost ciśnienia wewnątrz światła bez żadnych przerw.
Należy spodziewać się niewielkich skurczów segmentu podczas początkowej fazy rozszerzenia. W razie potrzeby należy zablokować aktywność perystaltyczną, dodając do roztworu Krebsa jeden mikromol nifedypiny, która jest blokerem kanałów wapniowych typu L. Pod mikroskopem stereoskopowym należy delikatnie zacząć usuwać tkankę tłuszczową z krezki, ostrożnie odciągając ją dwiema małymi pęsetami, dbając o to, aby nie uszkodzić naczyń oraz nerwu doprowadzającego, które są zatopione w tkance tłuszczowej.
Zacznij oddzielać tkankę tłuszczową w pewnej odległości od jelita czczego, aby odsłonić oba naczynia krwionośne w pęczku krezowym. Zidentyfikuj doprowadzający nerw jelita czczego znajdujący się pomiędzy oboma naczyniami jako cienką białą nić otuloną tkanką tłuszczową. Następnie przeprowadź preparację bardziej proksymalnie w stronę jelita czczego, delikatnie usuwając tkankę tłuszczową za pomocą pęsety.
Następnie wypreparuj nerw krezkowy jelita czczego w badanym segmencie, usuwając przylegającą do niego tkankę tłuszczową. Przetnij nerw za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych. W razie potrzeby delikatnie odciągnij i usuń pozostały tłuszcz, tkankę łączną oraz osłonkę epineuralną.
W tej procedurze, używając mikromanipulatora, należy opuścić końcówkę elektrody ssącej do kąpieli organowej. Następnie należy delikatnie odessać niewielką ilość roztworu Krebsa z kąpieli, tak aby końcówka elektrody została zanurzona w roztworze Krebsa. Należy upewnić się, że roztwór Krebsa pokrywa elektrodę drucianą znajdującą się wewnątrz elektrody ssącej.
Następnie umieść końcówkę elektrody ssącej bezpośrednio obok przeciętej wiązki nerwu doprowadzającego i wciągnij przeciętą wiązkę nerwową do kapilary na całej jej długości. Przesuń końcówkę elektrody w kierunku tkanki tłuszczowej i za pomocą tłoka wciągnij ją do szklanej kapilary, w ten sposób mechanicznie izolując nerw w kapilarze od zawartości kąpieli organowej. Prawidłowe uszczelnienie szklanej kapilary względem komory rejestracyjnej poprzez wciągnięcie niewielkiej ilości otaczającej tkanki tłuszczowej do kapilary jest kluczowe w celu zminimalizowania nadmiarowego szumu tła, który w ostateczności utrudniłby końcową analizę.
Aby zweryfikować rejestrację aktywności nerwów doprowadzających, wywołaj wzrost wyładowań aferentnych poprzez rampowe rozciągnięcie, zamykając port wyjściowy, co doprowadzi do stopniowego wzrostu ciśnienia w odcinku jelita. Przystąp do właściwego protokołu eksperymentalnego tylko wtedy, gdy trzy kolejne rampowe rozciągnięcia spowodują powtarzalne wyładowania wielo-jednostkowe. Po izolacji nerwu stabilizuj preparat przez 15 minut, aby uzyskać stałą, spontaniczną aktywność nerwów doprowadzających przed rozpoczęciem właściwych eksperymentów.
Przedstawiono tutaj schematyczną reprezentację różnych jednostek włókien doprowadzających w zależności od ich profilu mechanosensytywnego. Włókna o niskim progu pobudliwości wykazują przede wszystkim zwiększoną aktywność nerwową przy niskich ciśnieniach rozciągania, co skutkuje wartością LT przekraczającą 55%. Z kolei jednostki o wysokim progu pobudliwości wykazują wzrost częstotliwości wyładowań dopiero przy ciśnieniach szkodliwych. Włókna o szerokim zakresie dynamicznym wykazują stopniowy wzrost aktywności nerwowej podczas całego rozciągania, natomiast włókna niewrażliwe mechanicznie nie reagują na wzrost ciśnienia rozciągania.
Rycina ta przedstawia wyładowania aferentnych nerwów krezkowych u myszy typu dzikiego podczas rampowego rozciągania. Należy zauważyć, że w dwufazowym profilu rozciągania początkowy wzrost wyładowań nerwowych wynika z aktywności włókien o niskim progu pobudzenia i szerokim zakresie dynamicznym, natomiast włókna o wysokim progu pobudzenia i szerokim zakresie dynamicznym przyczyniają się do drugiego wzrostu wyładowań. Po opanowaniu techniki, izolacja nerwu jelita czczo oraz początkowy pomiar bazowy mogą zostać wykonane w czasie krótszym niż jedna godzina, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.
Podczas badania wpływu związków podawanych do kąpieli organowej wymagany jest dłuższy czas. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zachowanie dobrze zestandaryzowanego podejścia, np. poprzez konsekwentne identyfikowanie tego samego segmentu we wszystkich eksperymentach. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak izolacja zwojów korzeni grzbietowych z późniejszym obrazowaniem wapnia, w celu oceny, które stacje przekaźnikowe w układzie nerwowym przewodu pokarmowego są zaangażowane w patogenezę wielu chorób.
Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębiania patogenezy wielu zespołów bólowych w badaniach nad przewodem pokarmowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak izolować włókna aferentne jelita czczego z przewodu pokarmowego myszy oraz jak rejestrować ich aktywność podczas rampowych rozciągań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę rejestracji aktywności aferentnych włókien nerwów trzewnych in vitro z pęczków nerwowych jelita cienkiego lub grubego. Metoda ta pozwala na ocenę odpowiedzi nerwowych na rozciąganie rampowe oraz aplikacje związków chemicznych, dostarczając informacji na temat funkcji nerwów przewodu pokarmowego w warunkach zdrowia i choroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Gastroenterologia
- Fizjologia
Wstęp
- Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego do mózgu.
- Nerwy te uczestniczą w utrzymywaniu homeostazy i reagowaniu na stany patofizjologiczne.
- Zrozumienie ich aktywności może pomóc w opracowaniu strategii leczenia zespołów bólowych.
- Disekcja i analiza pęczków nerwowych wymagają specjalistycznego przeszkolenia.
Cel badania
- Rejestracja aktywności nerwów doprowadzających w odpowiedzi na bodźce mechaniczne i chemiczne.
- Określenie, czy nerwy doprowadzające przewodu pokarmowego wykazują nadwrażliwość lub obniżoną wrażliwość w stanach chorobowych.
- Zbadanie wpływu tych wyników na diagnostykę i leczenie schorzeń takich jak zespół jelita drażliwego.
Zastosowane metody
- Izolacja odcinków jelita z przytwierdzonymi nerwami doprowadzającymi.
- Montaż w komorze organowej w celu oceny aktywności nerwowej.
- Rejestracja podstawowej i stymulowanej aktywności nerwów.
- Stosowanie rozciągania rampowego oraz różnych związków.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia ilościowe określenie aktywności nerwowej bez modulacji ze strony ośrodkowego układu nerwowego.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie roli nadwrażliwości nerwów w zaburzeniach żołądkowo-jelitowych.
- Szkolenie jest niezbędne do prawidłowego przeprowadzenia sekcji i analizy pęczków nerwowych.
- Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki dotyczące funkcji nerwów.
Wnioski
- Technika ta jest cenna w badaniu aktywności nerwów aferentnych w przewodzie pokarmowym.
- Może ona mieć istotne znaczenie dla zrozumienia i leczenia zespołów bólowych.
- Dalsze badania mogą pogłębić naszą wiedzę na temat funkcjonowania nerwów w różnych stanach chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technika ta umożliwia bezpośredni pomiar aktywności obwodowych nerwów doprowadzających w izolowanych segmentach jelita, zapewniając redukcjonistyczny model do oceny mechanizmów sensytyzacji neuronalnej istotnych dla zespołów bólu trzewnego. Poprzez odizolowanie sygnalizacji aferentnej od modulacji ośrodkowego układu nerwowego, metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych programach odkrywania leków skoncentrowanych na neuromodulacji przewodu pokarmowego. Podejście to zapewnia ciągłość translacyjną od modeli gryzoni do tkanek ludzkich, ułatwiając międzygatunkowe potwierdzenie celów oraz zwiększając pewność prognostyczną w opracowywaniu środków przeciwbólowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie hipotez terapeutycznych dotyczących nadwrażliwości nerwów doprowadzających w szlakach bólu trzewnego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację nerwów doprowadzających krezki jako celów terapeutycznych niezależnie od kompensacji ośrodkowej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez rozróżnienie związków modulujących uwrażliwienie obwodowe od tych wymagających oddziaływania na ośrodkowy układ nerwowy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje mierzalne odczyty wielojednostkowych wyładowań nerwowych w odpowiedzi na stopniowe rozciąganie oraz stymulację farmakologiczną.
- Powtarzalność: Wymaga ustandaryzowanego wyboru segmentu i okresów stabilizacji w celu zapewnienia spójnej aktywności bazowej we wszystkich eksperymentach.
- Skalowalność: Kompatybilny z przesiewaniem związków w formacie kąpieli organowej w celu profilowania zależności dawka-odpowiedź neuromodulatorów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Bezpośrednio modeluje mechanizmy nadwrażliwości trzewnej w IBS oraz powiązanych zespołach bólowych.
- Łączy wzorce wyładowań aferentnych z podtypami włókien mechanosensytywnych (o niskim progu pobudzenia, o szerokim zakresie dynamicznym) jako potencjalne biomarkery stanu sensybilizacji.
- Umożliwia ocenę neuronalnych zmian indukowanych chorobą z wykorzystaniem supernatantów od pacjentów z IBS lub stymulacji LPS.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację wkładu nerwów obwodowych przed przejściem do testów zależnych od OUN.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację związków wiodących, dostarczając wczesnych odczytów funkcjonalnych, które pomagają w podejmowaniu decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac przed znacznymi inwestycjami w chemię medyczną lub badania skuteczności in vivo.
- Biologia odkrywcza: Pozwala sprawdzić, czy związki kandydackie zmieniają pobudliwość nerwów dośrodkowych w kontekstach mechanicznych lub zapalnych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne i mierzalne pomiary aktywności nerwów, umożliwiając analizę zależności struktura-aktywność dla chemotypów neuromodulacyjnych.
- Analityka: Zapewnia dane o częstotliwości wyładowań oraz odpowiedziach specyficznych dla typów włókien, co pozwala na analizę porównawczą efektów działania związków w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane na gryzoniach z możliwością zastosowania w tkankach ludzkich, wspierając dopasowanie biomarkerów i walidację celów terapeutycznych międzygatunkowych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny neuromodulatorów obwodowych w wielu wskazaniach dotyczących przewodu pokarmowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację wkładu aferentnego obwodowego w sygnalizację trzewną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury izolacji i rejestracji nerwów, aby zminimalizować zmienność między laboratoriami w danych dotyczących angażowania celu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji go/no-go poprzez potwierdzenie modulacji celu na obwodowym poziomie neuronalnym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój związków wykazujących selektywne działanie na uwrażliwione drogi aferentne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w mikrochirurgicznej preparacji pęczków nerwów krezkowych oraz w akwizycji sygnałów elektrofizjologicznych.
- Metoda jest zależna od infrastruktury kąpieli organowej z kontrolą temperatury, systemów perfuzji oraz manipulacji elektrodami ssącymi.
- Niezbędna jest międzyzespołowa standaryzacja wyboru segmentów, okresów stabilizacji oraz protokołów rozciągania w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują specyficzną dla gatunku anatomię nerwów oraz żywotność tkanek podczas przejścia z segmentów okrężnicy mysiej na ludzkie.
- Ograniczenia praktyczne obejmują techniczne trudności analizy pojedynczych jednostek oraz konieczność walidacji wyników w komplementarnych stacjach przekaźnikowych neuronów (np. zwojach korzeni grzbietowych, rdzeniu kręgowym) w celu pełnego wyjaśnienia przebiegu szlaku.
