Oznaczanie potencjału Zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych DNA

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie chemii powierzchni nanocząstek za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania końcowego (TRPS) i określenie potencjału zeta materiału. Dowodem na to jest charakterystyka nanocząstek zmodyfikowanych DNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące charakterystyki nanomateriałów i rozwoju testów biologicznych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można przeprowadzić analizę cząstka po cząstce. Każdy sygnał cząstki DNA jest tłumaczony na pomiar potencjału zeta, zapewniając pełny obraz analizowanej próbki. Najstarsza metoda może dostarczyć informacji na temat charakterystyki materiałów.

Może być również stosowany do innych zastosowań, takich jak rozwój testów biologicznych do wykrywania komórek, wirusów, DNA i białek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ nie jest to proste wstrzyknięcie samp, a następnie czekanie na odpowiedź. Potrzebny jest pewien wkład ze strony naukowca.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wirować cząstki pokryte streptawidyną przez 30 sekund przed sonikacją przez dwie minuty z mocą 80 watów, aby zapewnić monodyspersję. Rozcieńczyć cząstki pokryte streptawidyną jeden na sto w buforze PBST, aby uzyskać wynikowe stężenie od jednego razy dziesięć do dziewięciu cząstek na mililitr. Następnie wiruj cząsteczki przez 30 sekund.

Na podstawie zdolności wiązania 4 352 pikomoli na miligram przy odpowiednim stężeniu DNA do cząstek dla otrzymanych stężeń 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 i 210 nanomolowych. Po wirowaniu próbek przez 10 sekund umieść je na kole obrotowym w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby DNA mogło związać się z powierzchniami cząstek poprzez interakcję streptawidyny z biotyną. Po dodaniu wychwyconego DNA i inkubacji z cząstkami, należy usunąć nadmiar DNA i roztworu poprzez separację magnetyczną, umieszczając próbki na stojaku magnetycznym na 30 minut.

Następnie usuń supernatant, uważając, aby nie zakłócić nowo powstałego skupiska cząstek, znajdującego się najbliżej magnesu. Następnie zastąpić supernatant tą samą objętością świeżego buforu PBST. Teraz dodaj wymaganą ilość docelowego DNA do każdej próbki, aby upewnić się, że osiągnięto maksymalne możliwe wiązanie docelowe.

Wirować próbki przez 10 sekund. I umieść je na kole obrotowym w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po zakończeniu hybrydyzacji usuń nadmiar docelowego DNA poprzez separację magnetyczną, umieszczając próbki na stojaku magnetycznym na 30 minut.

Następnie usuń supernatant, uważając, aby nie zakłócić nowo powstałego skupiska cząstek, znajdującego się najbliżej magnesu. Następnie zastąpić supernatant tą samą objętością świeżego buforu PBST. Po powtórzeniu poprzednich kroków dla zduplikowanych próbek, umieść próbki na kole obrotowym w temperaturze pokojowej na 16 godzin, aby zbadać czas hybrydyzacji DNA.

W tym momencie podłącz instrument TRPS do systemu komputerowego z zainstalowanym oprogramowaniem. Za pomocą suwmiarki zmierz odległość między zewnętrzną stroną dwóch równoległych szczęk. Wpisz odległość w polu rozciągania w zakładce ustawień przyrządu i kliknij kalibruj rozciąganie pod zakładką.

Następnie należy dopasować bocznie poliuretanową membranę nanoporową o odpowiednim rozmiarze do analizy na szczękach z numerem identyfikacyjnym nanoporów skierowanym do góry. Następnie rozciągnij szczęki do rozciągnięcia wymaganego do analizy za pomocą uchwytu do regulacji rozciągliwości z boku instrumentu. Umieść 80 mikrolitrów buforu PBST w dolnej komorze płynu pod nanoporami, upewniając się, że nie ma pęcherzyków, które mogłyby wpłynąć na pomiar.

Teraz zatrzaśnij górną komórkę płynu na miejscu i dodaj 40 mikrolitrów buforu, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Następnie umieść klatkę Faradaya nad systemem i zastosuj ciśnienie zewnętrzne zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po umieszczeniu 40 mikrolitrów cząstek kalibracyjnych w górnej celi płynu, wykonaj pomiar TRPS przy trzech przyłożonych napięciach.

Zmień napięcie, klikając przyciski plus i minus na skali napięcia w zakładce ustawień przyrządu w oprogramowaniu. Sprawdź, czy trzy napięcia zwracają odpowiednie prądy tła. I upewnij się, że przy średnim napięciu cząstki kalibracyjne wytwarzają średnią wielkość blokady co najmniej 0,3 nanoampera.

Po spełnieniu warunków określonych w protokole tekstowym należy uruchomić uruchomienie, klikając start w oprogramowaniu w zakładce akwizycji danych. Aby zakończyć pomiar, kliknij stop w zakładce akwizycji danych i zapisz plik danych. Umyj system, kilkakrotnie zastępując cząstki kalibracyjne 40 mikrolitrami z buforem PBST do górnych komórek płynu.

I stosowanie różnych ciśnień, aż nie będzie już żadnych zdarzeń blokujących, upewniając się, że nie ma żadnych szczątkowych cząstek i nie ma zanieczyszczenia krzyżowego. Po osiągnięciu odpowiedniego prądu podstawowego zastąp elektrolit w górnej celi płynowej próbką o pojemności 40 mikrolitrów. Uruchom przykładowy przebieg, klikając przycisk start na karcie pobierania danych.

Zapisz co najmniej 500 cząstek i upewnij się, że czas pracy wynosi co najmniej 30 sekund. Aby zakończyć pomiar, kliknij stop w zakładce akwizycji danych i zapisz plik danych. Przykład analizy wielkości i potencjału zeta cząstek pokrytych streptawidyną bez modyfikacji oraz cząstek pokrytych streptawidyną nasyconych jednoniciowym DNA na powierzchni pokazano tutaj.

Chociaż obie próbki miały podobną wielkość, potencjał zeta był znacząco różny i znacznie większy, gdy DNA było funkcjonalizowane na powierzchni cząstki. Dane dotyczące wielkości i potencjału zeta przedstawione dla próbek o najniższym i najwyższym stężeniu DNA zhybrydyzowanego z cząstkami pokrytymi streptawidyną są wyświetlane tutaj. Większą wartość potencjału zeta rejestruje się dla cząstek zhybrydyzowanych o wyższym stężeniu DNA.

Pokazano tutaj zmianę potencjału zeta mierzoną tylko dla wychwytu sondowanego DNA, w pełni komplementarnego celu DNA, środkowego celu wiążącego DNA, celu wiążącego koniec DNA i zwisającego celu DNA. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym umyciu nanopola między każdą kalibracją a próbką, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami i zapobiec blokowaniu się nanopóli.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biozmysłami do badania interakcji białko-białko i białko-DNA w testach multipleksowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać potencjał zeta za pomocą TRPS i przygotować zmodyfikowane cząstki DNA do testów biologicznych.