Name: Oznaczanie potencjału Zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę TRPS do oznaczania potencjału Zeta nanocząstek zmodyfikowanych DNA. Technika umożliwia analizę pojedynczych cząstek i charakteryzację ich chemii powierzchniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Izon Science Ltd za wsparcie. Prace były wspierane przez Europejską Komisję ds. Badań Naukowych (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio).

1. Wytwarzanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami za pomocą buforu Tween-20 (PBST)
<ol>
	<li>Rozpuścić jedną tabletkę PBS (0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu, 0,137 M chlorek sodu, pH 7,4) w 200 ml wody dejonizowanej (18,2 MΩ cm).</li>
	<li>Dodać 100 μl (0,05 (v/v)%) Tween-20 do 200 ml roztworu buforowego jako środek powierzchniowo czynny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wzorców cząstek polistyrenu karboksylowego
<ol>
	<li>Wirować cząstki kalibracyjne przez 30 sekund przed sonikacją przez 2 minuty przy mocy 80 watów, aby uzyskać monodyspersyjność cząstek.</li>
	<li>Rozcieńczyć cząstki kalibracyjne 1:100 do stężenia1x10 10 cząstek/ml w buforze PBST i wirować przez 30 sekund.</li>
</ol>
3. Przygotowanie cząstek pokrytych streptawidyną
<ol>
	<li>Wirować cząstki przez 30 sekund przed sonikacją przez 2 minuty przy mocy 80 watów, aby zapewnić monodyspersyjność.</li>
	<li>Rozcieńczyć cząstki pokryte streptawidyną 1:100 w buforze PBST, aby uzyskać otrzymane stężenie 1x109 cząstek/ml i wirować przez 30 sek. 
	Uwaga: Typowa objętość próbki wynosi 200 μl. Na przykład, jeśli badasz pięć stężeń DNA, przygotuj 1 ml rozcieńczonych cząstek pokrytych streptawidyną.</li>
</ol>
4. Przygotowanie oligonukleotydów
<ol>
	<li>Oligonukleotydy należy rozpuścić w wodzie dejonizowanej do otrzymanego stężenia 100 μM.</li>
</ol>
5. Dodanie DNA sondy wychwytującej (CP) do cząstek pokrytych streptawidyną
<ol>
	<li>Przed wiązaniem DNA należy wirować cząstki pokryte streptawidyną (objętość próbki 200 μl) przez 30 sekund, a następnie przeprowadzić 2-minutową sonikację o mocy 80 watów.</li>
	<li>W oparciu o zdolność wiązania zapewnioną przez dostawcę (4,352 pmol/mg), dodaj odpowiednie stężenie DNA do cząstek, aby uzyskać otrzymane stężenia 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 i 210 nM DNA.</li>
	<li>Wirować próbki przez 10 sekund i umieścić na kole obrotowym w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby umożliwić DNA związanie się z powierzchniami cząstek poprzez interakcję streptawidyna-biotyna.</li>
	<li>Po dodaniu wychwyconego DNA i inkubacji z cząstkami pokrytymi streptawidyną, należy usunąć nadmiar DNA w roztworze poprzez separację magnetyczną, umieszczając próbki na stojaku magnetycznym na 30 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć nowo powstałej grupy cząstek znajdujących się najbliżej magnesu, i zastąpić taką samą objętością nowy bufor PBST.</li>
</ol>
6. Hybrydyzacja komplementarnego DNA do cząstek CP
<ol>
	<li>Dodać wymaganą ilość docelowego DNA (nadmierną przy 500 nM), aby upewnić się, że osiągnięto maksymalne możliwe wiązanie docelowe.</li>
	<li>Wirować próbki przez 10 sekund i umieścić na obrotowym kole w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu hybrydyzacji usuń nadmiar docelowego DNA poprzez separację magnetyczną, umieszczając próbki na stojaku magnetycznym na 30 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć nowo powstałej grupy cząstek znajdujących się najbliżej magnesu, i zastąpić taką samą objętością nowy bufor PBST.</li>
	<li>Powtórz kroki od 6.1 do 6.4 dla zduplikowanych próbek i umieść te próbki na kole obrotowym w temperaturze pokojowej na 16 godzin, aby zbadać czas hybrydyzacji DNA.</li>
</ol>
7. Konfiguracja TRPS
<ol>
	<li>Podłącz przyrząd do systemu komputerowego z zainstalowanym oprogramowaniem.</li>
	<li>Skalibruj początkowe rozciąganie za pomocą suwmiarki.
	<ol>
		<li>Zmierz odległość między zewnętrzną stroną dwóch równoległych szczęk.</li>
		<li>Wprowadź dane do oprogramowania, wpisując rozciągnięcie w polu "rozciąganie" w zakładce "Ustawienia instrumentu" i klikając "Kalibruj rozciąganie" pod zakładką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na szczękach należy umieścić bocznie poliuretanową membranę nanoporową o odpowiednim rozmiarze do analizy, z numerem identyfikacyjnym nanoporów skierowanym do góry. Następnie rozciągnij szczęki do rozciągnięcia wymaganego do analizy za pomocą uchwytu do regulacji rozciągliwości z boku instrumentu. Rozciągnąć szczęki w zakresie od 43 do 48 mm. 
	Uwaga: Dokładna wartość rozciągnięcia jest określana wraz z przyłożonym napięciem, tak aby blokady cząstek kalibracyjnych miały rozmiar co najmniej 0,3 nA. Rozciągnięcie jest już wprowadzone do oprogramowania w kroku 7.2 i będzie automatycznie dostosowywane w miarę rozciągania szczęk.</li>
	<li>Umieść 80 μl buforu PBST w dolnej kuwetie płynu, poniżej nanoporów, upewniając się, że nie ma pęcherzyków, które mogłyby wpłynąć na pomiar. Jeśli widoczne są bąbelki, wyjmij i wymień bufor.</li>
	<li>Zatrzaśnij górną komórkę płynu na miejscu i umieść w niej 40 μl buforu, ponownie upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Jeśli w górnej komórce płynu znajdują się pęcherzyki, usuń je, zastępując płyn.</li>
	<li>Po osiągnięciu powtarzalnego prądu podstawowego po zastąpieniu górnej kuwety płynu buforem, dodaj 40 μl próbki do górnej kuwety płynu i zmierz, klikając przycisk "start" w zakładce "Akwizycja danych" na ekranie oprogramowania. 
	Uwaga: Akwizycja danych odbywa się z częstotliwością 50 kHz przy dolnej granicy wielkości blokady wynoszącej 0,05 nA, chociaż można to zmienić za pomocą oprogramowania za pomocą zakładki "Analizuj dane" (w sekcji "Ustawienia analizy" i "Blokady rezystancyjne").</li>
	<li>Umieść klatkę Faradaya na górze systemu ogniw płynu, aby zredukować elektryczny szum tła podczas pomiarów.</li>
	<li>Użyj modułu zmiennego ciśnienia (VPM), aby wytworzyć ciśnienie lub podciśnienie w próbkach.
	<ol>
		<li>Aby zastosować ciśnienie zewnętrzne, podłącz dyszę do górnej komory płynu, a następnie obróć ramię dociskowe i zatrzaśnij na swoim miejscu (w zależności od tego, czy zostanie zastosowane nadciśnienie (PRE), czy podciśnienie (VAC)).</li>
		<li>Zastosuj nacisk w skali "cm" lub "mm" za pomocą pokrętła stage ciśnienia znajdującego się na górze VPM. Naciśnij pokrętło w dół, aby wywrzeć nacisk na skalę "cm" i pociągnij je w górę, aby wywrzeć nacisk na skalę "mm".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Przygotowanie próbek do analizy TRPS
<ol>
	<li>Wiruj próbki przez 30 sekund i poddaj sonifikacji przez 2 minuty przy mocy 80 watów przed analizą TRPS.</li>
</ol>
9. Kalibracja nanoporów do analizy Zeta
<ol>
	<li>Po umieszczeniu 40 μl cząstek kalibracyjnych (1x10 10 cząstek/ml) w górnej celi płynu, wykonaj pomiar TRPS (konfiguracja jak w sekcji 7) przy 3 przyłożonych napięciach. Zmień napięcie, klikając przyciski "+" i "-" na voltage skala w zakładce "Ustawienia instrumentu" w oprogramowaniu.</li>
	<li>Sprawdź, czy 3 voltages zwracają prądy tła o wartości około 140, 110 i 80 nA. Upewnij się, że przy średnim napięciu cząstki kalibracyjne wytwarzają średnią wielkość blokady co najmniej 0,3 nA.</li>
	<li>Zastosuj ciśnienie tak, aby średni czas trwania połowy maksimum na całej szerokości (FWHM) cząstek kalibracyjnych wynosił co najmniej 0,15 ms. Zrób to ręcznie za pomocą ramienia dociskowego przymocowanego do modułu zmiennego ciśnienia. Wybierz ciśnienie (PRE) lub podciśnienie (VAC), obracając ramię, aż usłyszysz kliknięcie w żądanej pozycji i zastosuj odpowiednio, postępując zgodnie z instrukcjami konfiguracji w kroku 7.8.2. Po spełnieniu tych warunków należy rozpocząć uruchamianie, klikając przycisk "start" w oprogramowaniu w zakładce "Akwizycja danych".</li>
	<li>Zakończ przebieg, naciskając przycisk "stop" w zakładce "Akwizycja danych", gdy zmierzono co najmniej 500 cząstek (patrz "Liczba cząstek" na dole ekranu oprogramowania podczas pomiaru), a przebieg przekroczył 30 sekund (patrz "Czas pracy" również u dołu ekranu).</li>
	<li>Skalibruj system, wykonując przebieg kalibracji zgodnie z opisem za każdym razem, gdy wprowadzany jest nowy nanopor lub dla każdego nowego dnia analizy, wykonując kroki 9.1-9.4.</li>
</ol>
10. Uruchamianie próbki
<ol>
	<li>Próbki należy uruchomić przy najwyższym lub drugim najwyższym napięciu jak próbki kalibracyjne, zapewniając podobny (±10 nA), jeśli nie taki sam, prąd podstawowy.
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu odpowiedniego prądu podstawowego zastąp elektrolit w górnej celi płynowej próbką o objętości 40 μl. Po wprowadzeniu próbki na ścieżce sygnału widoczne będą blokady. Rozpocznij przebieg próbki, klikając przycisk "start" w zakładce "Akwizycja danych" i zapisz co najmniej 500 cząstek (sprawdź "Liczba cząstek" znajdująca się pod ścieżką sygnału) i upewnij się, że czas pracy wynosi co najmniej 30 sekund (patrz "Czas trwania" również znajdujący się poniżej ścieżki sygnału).</li>
		<li>Aby zakończyć pomiar, kliknij "zatrzymaj" w zakładce "Akwizycja danych" i zapisz plik danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zapisać plik, wprowadź informacje o pliku w następującym formacie: "Dochodzenie" to folder, w którym plik zostanie zapisany, "Nanopore ID" to numer seryjny używanego poru, "Część #" to typ poru (np. NP150/NP200), "Identyfikator próbki" to nazwa próbki, "Kalibracja lub próbka" zawiera szczegółowe informacje, czy jest to kalibracja czy pomiar próbki, "Rozcieńczenie" stosuje się, jeżeli próbka została rozcieńczona (typ 100, jeśli próbka została rozcieńczona 100-krotnie), "Ciśnienie" oznacza ciśnienie przyłożone do próbki (w cm - patrz ppkt 7.8), "ID elektrolitu" oznacza nazwę buforu, w którym próbka jest sporządzana, a "Uwagi" to wszelkie osobiste notatki dotyczące próbki lub przebiegu.</li>
	<li>Pomiędzy każdą próbą należy umyć system, umieszczając kilkakrotnie 40 μl buforu PBST w górnej komorze płynu i stosując różne ciśnienia (zwykle na poziomie -10, -5 cm (próżnia) oraz 5 i 10 cm (nadciśnienie)), aż nie wystąpią już zdarzenia blokady, upewniając się, że w systemie nie pozostały żadne resztki cząstek, a tym samym nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Próbki należy rozprowadzić w trzech egzemplarzach, przy czym ten etap płukania jest wykonywany między każdym powtórzeniem próbki, jak również między różnymi próbkami.</li>
</ol>

<ol><li>Alexander, C. M., Maye, M. M., Dabrowiak, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-capped+nanoparticles+designed+for+doxorubicin+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA-capped nanoparticles designed for doxorubicin drug delivery.</a> Chem Commun. 47 (12), 3418-3420 (2011).</li>
<li>Billinge, E. R., Platt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+based+dispersion+assay+using+tunable+resistive+pulse+sensing+%28TRPS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Aptamer based dispersion assay using tunable resistive pulse sensing (TRPS).</a> Anal Methods. 7 (20), 8534-8538 (2015).</li>
<li>Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Binding+Microarrays+for+the+Characterization+of+Protein-DNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein Binding Microarrays for the Characterization of Protein-DNA Interactions.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 104, 65-85 (2007).</li>
<li>Platt, M., Rowe, W., Knowles, J., Day, P. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aptamer+sequence+activity+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of aptamer sequence activity relationships.</a> Integr Biol. 1 (1), 116-122 (2009).</li>
<li>Ruiz-Hernández, E., Baeza, A., Vallet-Regí, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+Drug+Delivery+through+DNA%2FMagnetic+Nanoparticle+Gates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Smart Drug Delivery through DNA/Magnetic Nanoparticle Gates.</a> ACS Nano. 5 (2), 1259-1266 (2011).</li>
<li>Murdock, R. C., Braydich-stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Nanomaterial+Dispersion+in+Solution+Prior+to+In+Vitro+Exposure+Using+Dynamic+Light+Scattering+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of Nanomaterial Dispersion in Solution Prior to In Vitro Exposure Using Dynamic Light Scattering Technique.</a> Toxicol Sci. 101 (2), 239-253 (2008).</li>
<li>Hupfield, S., Holsaeter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+size+analysis+by+dynamic%2Fstatic+light+scattering+upon+size+exclusion-%2Ffield+flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanosci+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow fractionation.</a> J Nanosci Nanotechnol. 6 (7), 3025-3031 (2006).</li>
<li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosens Bioelectron. 31 (1), 17-25 (2012).</li>
<li>Roberts, G. S., Kozak, D., Anderson, W., Broom, M. F., Vogel, R., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+nano%2Fmicropores+for+particle+detection+and+discrimination%3A+scanning+ion+occlusion+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Tunable nano/micropores for particle detection and discrimination: scanning ion occlusion spectroscopy.</a> Small. 6 (23), 2653-2658 (2010).</li>
<li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sizing+of+nano%2Fmicroparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Anal Chem. 83 (9), 3499-3506 (2011).</li>
<li>Booth, M. A., Vogel, R., Curran, J. M., Harbison, S., Travas-Sejdic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+target-probe+oligonucleotide+hybridization+using+synthetic+nanopore+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of target-probe oligonucleotide hybridization using synthetic nanopore resistive pulse sensing.</a> Biosens Bioelectron. 45, 136-140 (2013).</li>
<li>Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+size+and+%CE%B6-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Simultaneous size and ζ-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS Nano. 6 (8), 6990-6997 (2012).</li>
<li>Kozak, D., Anderson, W., Vogel, R., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Resistive+Pulse+Sensors%3A+Devices+bridging+the+void+between+molecular+and+microscopic+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Advances in Resistive Pulse Sensors: Devices bridging the void between molecular and microscopic detection.</a> Nano Today. 6 (5), 531-545 (2011).</li>
<li>Weatherall, E., Willmott, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+tunable+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Applications of tunable resistive pulse sensing.</a> Analyst. 140, 3318-3334 (2015).</li>
<li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> J Phys Condens Matter. 22 (45), 454116(2010).</li>
<li>Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+tunable+resistive+pulse+sensing+as+a+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor.</a> Anal Methods. 7, 7055-7066 (2015).</li>
<li>Platt, M., Willmott, G. R., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistive+Pulse+Sensing+of+Analyte-Induced+Multicomponent+Rod+Aggregation+Using+Tunable+Pores%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Resistive Pulse Sensing of Analyte-Induced Multicomponent Rod Aggregation Using Tunable Pores.</a> Small. 8 (15), 2436-2444 (2012).</li>
<li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Anal Chem. 84 (7), 3125-3131 (2012).</li>
<li>Blundell, E. L. C. J., Vogel, R., Platt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-by-Particle+Charge+Analysis+of+DNA-Modified+Nanoparticles+Using+Tunable+Resistive+Pulse+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing.</a> Langmuir. 32 (4), (2016).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+Potential+in+Colloid+Science%3A+Principles+and+Applications%22">Zeta Potential in Colloid Science: Principles and Applications</a>. , Academic Press. New York. (1981).</li>
<li>Arjmandi, N., Van Roy, W., Lagae, L., Borghs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+electric+charge+and+zeta+potential+of+nanometer-sized+objects+using+pyramidal-shaped+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Measuring the electric charge and zeta potential of nanometer-sized objects using pyramidal-shaped nanopores.</a> Anal Chem. 84 (20), 8490-8496 (2012).</li>
<li>Bacri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+colloids+in+single+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Dynamics of colloids in single solid-state nanopores.</a> J Phys Chem B. 115 (12), 2890-2898 (2011).</li>
<li>Cabello-Aguilar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+polymer+nanoparticles+through+a+single+artificial+nanopore+with+a+high-aspect-ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Dynamics of polymer nanoparticles through a single artificial nanopore with a high-aspect-ratio.</a> Soft Matter. 10 (42), 8413-8419 (2014).</li>
<li>Billinge, E. R., Muzard, J., Platt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+resistive+pulse+sensing+as+a+tool+to+monitor+analyte+induced+particle+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomater+Nanosci%22%5BJournal%5D)">Tunable resistive pulse sensing as a tool to monitor analyte induced particle aggregation.</a> Nanomater Nanosci. 1 (1), 11(2013).</li>
<li>Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+Drug+Delivery+Nanocarriers+with+Self-Assembled+DNA+Nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures.</a> Adv Mater. 25 (32), 4386-4396 (2013).</li>
<li>Billinge, E. R., Broom, M., Platt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+aptamer-protein+interactions+using+tunable+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Monitoring aptamer-protein interactions using tunable resistive pulse sensing.</a> Anal Chem. 86 (2), 1030-1037 (2014).</li>
<li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Multiplexed+Proteomic+Technology+for+Biomarker+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004(2010).</li>
<li>Park, S. -J., Taton, T. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-Based+Electrical+Detection+of+DNA+with+Nanoparticle+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes.</a> Science. 295 (5559), 1503-1506 (2002).</li>
</ol>

E.L.C.J.B. jest wspierany przez Izon Science Ltd.

Obliczenie potencjału zeta oparto na metodzie kalibracyjnej nawiązującej do prac Arjmandi et al.21. Czas translokacji cząsteczek podczas przechodzenia przez nanopor jest mierzony jako funkcja przyłożonego napięcia, przy zastosowaniu średniego pola elektrycznego i prędkości cząsteczek w obrębie całego regularnego poru stożkowego. Ruchliwość elektroforetyczna stanowi pochodną 1/T (gdzie T to czas blokady) względem napięcia, pomnożoną przez kwadrat długości strefy detekcji, l. W celu zminimalizo...

Funkcjonalizowane nanocząstki stają się coraz popularniejsze jako biosensory zarówno w medycynie, jak i w ochronie środowiska. Możliwość modyfikacji chemii powierzchni nanocząstek, na przykład za pomocą DNA, okazuje się przydatna w systemach celowanego dostarczania leków1 oraz w monitorowaniu oddziaływań DNA-białko2-4. Właściwością nanocząstek coraz częściej wykorzystywaną w bioanalizach i dostarczaniu środków terapeutycznych jest superparamagnetyzm5. Cząstki superparamagnetyczne (SPPs) są niezwykle użyteczne w identyfikacji i usuwaniu konkretnych analitytów z złożonych mieszanin, co można osiągnąć za pomocą jednego magnesu. Po oddzieleniu, cząstki z wiązanym analitytem mogą zostać poddane charakterystyce i analizie zgodnie z przeznaczeniem.
Poprzednie metody stosowane do detekcji i charakterystyki nanocząsteczek obejmowały techniki optyczne, takie jak dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), znane również jako spektroskopia korelacji fotonowej. Mimo że DLS jest techniką wysokoprzepustową, ogranicza ją fakt, że opiera się ona na wyznaczaniu średnich; podczas analizy próbek multimodalnych, bez zastosowania specjalistycznego oprogramowania, większe cząstki generują znacznie silniejszy sygnał, przez co niektóre z mniejszych cząsteczek pozostają całkowicie niezauważone6,7. Techniki charakterystyki pojedynczych cząsteczek są zatem znacznie bardziej korzystne do analizy układów nanocząsteczek oraz nanocząsteczek funkcjonalizowanych.
Technologie oparte na RPS opierają się na przyłożeniu pola elektrycznego do próbki i monitorowaniu mechanizmu transportu cząstek przez syntetyczny lub biologiczny nanopor. Stosunkowo nową techniką detekcji i charakterystyki nanocząstek opartą na RPS jest regulowane pomiarowe czuwanie impulsowe (TRPS)8-16. TRPS jest systemem dwuelektrodowym rozdzielonym przez elastomerową, regulowaną membranę z porem. Metoda regulowanego poru pozwala na pomiar analitów o różnym kształcie17 i rozmiarze poprzez analizę mechanizmów ich transportu przez por. Regulowane pory były wcześniej wykorzystywane do detekcji małych cząstek (średnica 70-95 nm), dając wyniki porównywalne z innymi technikami, takimi jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)10. Po przyłożeniu pola elektrycznego obserwuje się prąd jonowy, a gdy cząstki/cząsteczki przechodzą przez por, tymczasowo go blokują, co powoduje spadek natężenia prądu, który można zdefiniować jako „zdarzenie blokady”. Każde zdarzenie blokady reprezentuje pojedynczą cząstkę, dzięki czemu każdą cząstkę w próbce można scharakteryzować indywidualnie na podstawie amplitudy blokady, Δ<img alt="Schemat ogniwa elektrochemicznego, równanie Nernsta, obliczanie potencjału redoks, układ równowagi statycznej." src="/files/ftp_upload/54577/54577eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">, pełnej szerokości połówki maksimum, FWHM, a także innych właściwości blokady. Analiza pojedynczych cząstek podczas ich przechodzenia przez nanopor jest korzystna dla próbek multimodalnych, ponieważ TRPS może z sukcesem i skutecznie rozróżnić szereg rozmiarów cząstek w obrębie jednej próbki. Regulowane pomiarowe czuwanie impulsowe umożliwia jednoczesny pomiar rozmiaru10, potencjału zeta12,18 oraz stężenia15 w jednym cyklu, a zatem może nadal rozróżniać próbki o podobnym, a nawet identycznym rozmiarze na podstawie ich ładunku powierzchniowego19, co stanowi przewagę nad alternatywnymi technikami pomiaru wielkości.
Potencjał zeta jest definiowany jako potencjał elektrostatyczny w płaszczyźnie ścinania20 i jest obliczany na podstawie prędkości cząsteczek podczas przechodzenia przez por19. Pomiary potencjału zeta poszczególnych cząsteczek dostarczają zatem wglądu w mechanizmy translokacji i zachowanie układów nanocząsteczek w roztworze, co stanowi cenne informacje dla przyszłych projektów testów z wykorzystaniem nanocząsteczek w szerokim zakresie zastosowań. Analiza poszczególnych cząsteczek tego typu pozwala również na zbadanie rozrzutu i rozkładu wartości potencjału zeta w populacji próbki, co umożliwia uzyskanie szerszych informacji na temat kinetyki reakcji (np. przejścia jednoniciowego DNA w dwuniciowe) oraz stabilności cząsteczek w roztworze.
W niniejszym materiale opisujemy technikę wykrywania i charakteryzacji powierzchni SPP zarówno niemodyfikowanych, jak i modyfikowanych DNA. Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do szerokiej gamy nieorganicznych i biologicznych nanocząstek, jednak procedurę tę demonstrujemy na przykładzie powierzchni modyfikowanych DNA ze względu na ich szeroki zakres zastosowań. Technika ta pozwala użytkownikowi rozróżnić jednoniciowe i dwuniciowe cele DNA na powierzchni nanocząstki na podstawie prędkości translokacji cząstek przez system porów, a tym samym ich potencjałów zeta.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>P4417</td><td>1 tabletka rozpuszczona w 200&nbsp; ml wody dejonizowanej do przygotowania roztworu buforowego.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>P1379</td><td>0,05% (v/v) w buforze PBS jako środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Nanocząstki polistyrenu karboksylowego</td><td>Bangs Laboratories, US</td><td>CPC200</td><td>Średnica nominalna 220&nbsp; nm, stężenie surowe 1 x 1012 cząstek/ml, właściwy ładunek powierzchniowy 86 &mikro; eq/g (co odpowiada gęstości ładunku powierzchniowego 3,2 x 1019 C/nm2.</td></tr><tr><td>Nanocząstki pokryte streptawidyną</td><td>Ademtech, Francja</td><td>3121</td><td>Partia miała zdolność wiązania 4,352 pmol/mg (teoretyczna zdolność wiązania DNA 188 nM) przy surowym stężeniu 1,1 x 1011 cząstek/ml.</td></tr><tr><td>Biotynylowane oligonukleotydy</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>VC00001</td><td>Specyfikacja dostawcy: Oczyszczanie w odwróconej fazie 1 (skala 0,05); Modyfikacja biotyny na końcu 3'; Liofilizowane proszki odtworzone do 100&nbsp; &mikro; M przy użyciu wody dejonizowanej i rozcieńczone w razie potrzeby. Sekwencje: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC
GCGTGGC[Btn]3'Standardowe</td></tr> <tr><td>ligonukleotydy</td><td>Sigma Aldrich, Wielka Brytania</td><td>VC00001</td><td>Specyfikacja dostawcy: Oczyszczanie w odwróconej fazie 1 (skala 0,05); Liofilizowane proszki rozpuszczone do 100 &mikro; M przy użyciu wody dejonizowanej i rozcieńczone w razie potrzeby. Sekwencje docelowych DNA: W pełni komplementarne - 5'GCCACGCGTAGTGA
GGTTTAACCAT3', Wiązanie środkowe - 5'GTAGTGAGGT3', Wiązanie końcowe - 5'GTTTAACCAT3', Częściowo uzupełniające zwisanie - 5'GTGAGGTTTAACCAT
TTTTTTTTTTTTTTT3".</td></tr><tr><td>Izon qNano</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Ciśnienie własne w układzie 47&nbsp; </td></tr><tr><td>Moduł zmiennego ciśnienia Pa Izon (VPM)</td><td>Izon Science, NZ</td><td></td><td>Każdy "cm" ciśnienia odpowiada około 100 Pa.</td></tr><tr><td>Membrany poliuretanowe z nanoporami</td><td>Izon Science, NZ</td><td>NP150</td><td>Zakres wielkości analitu 60-480 nm, średnica porów obliczona na 799 nm przy rozciągnięciu 45 mm.</td></tr><tr><td>Magrack 6</td><td>GE Healthcare, Wielka Brytania</td><td>28-9489-64</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel soniczna</td><td>Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>10692353</td><td>80 watów</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>IKA, Niemcy</td><td>0003365000</td><td></td></tr><tr><td>Koło obrotowe&nbsp;</td><td>Labnet International, Stany Zjednoczone</td><td>H5500-230 V</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie potencjału zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych dna

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Technologie nanoporowe, znane jako Rezystancyjne Czujniki Impulsowe (RPS), są używane do wykrywania, ilościowego określania i charakteryzowania białek, molekuł i nanocząstek. Przestrajalne rezystancyjne wykrywanie impulsów (TRPS) to stosunkowo nowa adaptacja RPS, która obejmuje przestrajalne pory, które można zmieniać w czasie rzeczywistym. W tym przypadku używamy TRPS do monitorowania czasów translokacji nanocząstek zmodyfikowanych DNA, gdy przechodzą one przez przestrajalną błonę porową w funkcji stężenia i struktury DNA (tj. DNA jednoniciowego do dwuniciowego).
TRPS opiera się na dwóch elektrodach Ag/AgCl, oddzielonych elastomerową membraną porową, która wytwarza stabilny prąd jonowy na przyłożonym polu elektrycznym. W przeciwieństwie do różnych technologii charakterystyki cząstek opartych na optyce, TRPS może charakteryzować pojedyncze cząstki w populacji próbek, co pozwala na łatwą analizę próbek multimodalnych. Tutaj demonstrujemy pomiary potencjału zeta za pomocą prędkości translokacji cząstek o znanych standardach i stosujemy je do czasów translokacji analitu próbki, co skutkuje pomiarem potencjału zeta tych analitów.
Oprócz uzyskiwania średnich wartości potencjału zeta, wszystkie próbki są mierzone przy użyciu perspektywy cząstka po cząsteczce, pokazując więcej informacji o danej próbce, na przykład poprzez rozkłady populacji próbek. Spośród nich metoda ta wykazuje potencjał w zastosowaniach czujnikowych zarówno w medycynie, jak i środowisku.

<img alt="Proces separacji magnetycznej, pomiar TRPS, schemat zdarzenia blokady, układ analizy cząstek." src="/files/ftp_upload/54577/54577fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przedstawienie procesów oczyszczania magnetycznego oraz pomiaru TRPS. A) Przykład oczyszczania magnetycznego próbki rozpoczynającego się od próbki zawierającej nadmiar niezwiązanego DNA sondy wychwytującej. B) P...

Tutaj używamy poliuretanowego przestrajalnego nanopora zintegrowanego z techniką rezystancyjnego wykrywania impulsów, aby scharakteryzować chemię powierzchni nanocząstek poprzez pomiar prędkości translokacji cząstek, które mogą być użyte do określenia potencjału zeta poszczególnych nanocząstek.

Oznaczanie potencjału Zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych DNA

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka chemii powierzchni nanocząsteczek z wykorzystaniem tunowalnego detektora opartego na pomiarze prądu blokującego, czyli TRPS, oraz oznaczenie potencjału zeta materiału. Zostanie to zademonstrowane poprzez charakterystykę nanocząsteczek modyfikowanych DNA. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące charakterystyki nanomateriałów oraz opracowywania bioassayów.Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia analizy pojedynczych cząsteczek. Sygnał każdej cząsteczki DNA jest przeliczany na pomiar potencjału zeta, co pozwala na uzyskanie pełnego obrazu analizowanej próbki. Starsza metoda mogła dostarczać informacji przydatnych w charakterystyce materiałów.Metodę tę można zastosować również w innych obszarach, takich jak opracowywanie testów biologicznych do wykrywania komórek, wirusów, DNA oraz białek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie polega ona na prostym wstrzyknięciu próbki i oczekiwaniu na wynik. Wymagany jest pewien wkład analityczny ze strony naukowca.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wymieszać cząsteczki pokryte streptawidyną w wirówce typu vortex przez 30 sekund, a następnie poddać je sonikacji przez dwie minuty przy mocy 80 W w celu zapewnienia monodyspersyjności. Rozcieńczyć cząsteczki pokryte streptawidyną w stosunku 1:100 w buforze PBST, aby uzyskać końcowe stężenie 1×10⁹ cząsteczek/mL. Następnie wymieszać cząsteczki w wirówce typu vortex przez 30 sekund.Opierając się na pojemności wiązania wynoszącej 4 352 pikomoli na miligram przy odpowiednim stężeniu DNA w stosunku do cząsteczek, uzyskano stężenia wynoszące odpowiednio 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 i 210 nanomolar. Po wstrząsaniu próbek na wirówce typu vortex przez 10 sekund, należy umieścić je na wirówce rotacyjnej w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby umożliwić związanie DNA z powierzchnią cząsteczek poprzez oddziaływanie streptawidyna-biotyna. Po dodaniu wychwyconego DNA i inkubacji z cząsteczkami, należy usunąć nadmiar DNA oraz roztworu za pomocą separacji magnetycznej, umieszczając próbki na statywie magnetycznym na 30 minut.Następnie usuń nadsącz, uważając, aby nie naruszyć nowo powstałego skupiska cząsteczek znajdującego się najbliżej magnesu. Następnie zastąp nadsącz taką samą objętością świeżego buforu PBST. Teraz do każdej próbki dodaj wymaganą ilość docelowego DNA, aby zapewnić osiągnięcie maksymalnego możliwego wiązania celu.Mieszaj próbki w wirówce vortex przez 10 sekund, a następnie umieść je na rotatorze w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po zakończeniu hybrydyzacji usuń nadmiar docelowego DNA za pomocą separacji magnetycznej, umieszczając próbki na statywie magnetycznym na 30 minut.Następnie należy usunąć nadsącz, uważając, aby nie zaburzyć nowo powstałego skupiska cząsteczek znajdującego się najbliżej magnesu. Potem nadsącz należy zastąpić taką samą objętością świeżego buforu PBST. Po powtórzeniu poprzednich kroków dla próbek dubletowych, należy umieścić próbki na wirówce rotacyjnej w temperaturze pokojowej na 16 godzin, aby zbadać czasy hybrydyzacji DNA.W tym momencie należy podłączyć instrument TRPS do systemu komputerowego z zainstalowanym oprogramowaniem. Za pomocą suwmiarki zmierz odległość między zewnętrznymi krawędziami dwóch równoległych szczęk. Wpisz zmierzoną odległość w polu stretch w zakładce ustawień instrumentu (instrument settings), a następnie kliknij calibrate stretch znajdujący się pod tą zakładką.Następnie w szczelinach zacisków należy zamocować bocznie membranę z nanoporami z poliuretanu o rozmiarze odpowiednim do analizy, tak aby numer identyfikacyjny nanoporu był skierowany do góry. Następnie, używając pokrętła regulacji rozciągania znajdującego się z boku urządzenia, rozciągnąć zaciski do poziomu wymaganego dla danej analizy. W dolnej celi płynowej pod nanoporem należy umieścić 80 µL buforu PBST, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza, które mogłyby wpłynąć na pomiar.Teraz dociśnij górną komorkę płynową, aż wskoczy na miejsce, i dodaj 40 µL buforu, upewniając się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza. Następnie nałóż klatkę Faradaya na system i przyłóż ciśnienie zewnętrzne zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wprowadzeniu 40 µL cząsteczek kalibracyjnych do górnej komorki płynowej, przeprowadź pomiar TRPS przy trzech zastosowanych napięciach.Zmień napięcie, klikając przyciski plus i minus na skali napięcia w karcie ustawień instrumentu w oprogramowaniu. Sprawdź, czy trzy poziomy napięcia dają odpowiednie prądy tła. Upewnij się, że przy średnim napięciu cząsteczki kalibracyjne generują średnią wielkość blokady wynoszącą co najmniej 0,3 nanoamperes.Po osiągnięciu warunków opisanych w protokole tekstowym należy rozpocząć pomiar, klikając start w oprogramowaniu w karcie akwizycji danych. Aby zakończyć pomiar, należy kliknąć stop w karcie akwizycji danych i zapisać plik z danymi. System należy przemyć, zastępując cząsteczki kalibracyjne 40 µL buforu PBST w górnych komórkach płynowych, powtarzając tę czynność kilka razy.Następnie należy przykładać różne poziomy ciśnienia, aż do momentu, gdy nie będą pojawiać się już zdarzenia blokady, co zapewni brak pozostałych cząstek oraz brak zanieczyszczeń krzyżowych. Po osiągnięciu odpowiedniego prądu bazowego należy zastąpić elektrolit w górnej komórce cieczowej 40 µL próbki. Rozpocznij pomiar próbki, klikając start w zakładce akwizycji danych.Należy zarejestrować minimum 500 cząstek i zapewnić, aby czas pomiaru wynosił co najmniej 30 sekund. Aby zakończyć pomiar, należy kliknąć stop w karcie akwizycji danych i zapisać plik z danymi. Poniżej przedstawiono przykład analizy rozmiaru i potencjału zeta cząstek powlekanych streptawidyną bez modyfikacji oraz cząstek powlekanych streptawidyną nasyconych na powierzchni jednoniciowym DNA.Mimo że obie próbki miały podobną wielkość, potencjał zeta był znacząco różny i znacznie większy w przypadku funkcjonalizacji powierzchni cząstek za pomocą DNA. Przedstawiono tutaj dane dotyczące wielkości i potencjału zeta dla próbek z najniższym i najwyższym stężeniem DNA zhybrydyzowanego z cząstkami powlekanymi streptawidyną. Wyższą wartość potencjału zeta odnotowano dla cząstek zhybrydyzowanych z wyższym stężeniem DNA.Przedstawiono tutaj zmianę potencjału zeta zmierzoną dla samego sondującego DNA wychwytującego, w pełni komplementarnego DNA docelowego, DNA docelowego wiążącego się w środkowej części, DNA docelowego wiążącego się na końcach oraz DNA docelowego z nawisem. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć 20 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o dokładnym przemywaniu nanoporu pomiędzy każdą kalibracją a próbką, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym między próbkami oraz uniknąć zablokowania nanoporu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biosensorów do analizy oddziaływań białko-białko oraz białko-DNA w testach multipleksowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat sposobu wyznaczania potencjału zeta przy użyciu TRPS oraz przygotowywania cząstek modyfikowanych DNA do analiz biologicznych.

determination-zeta-potential-via-nanoparticle-translocation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Przedstawiono metodologię przygotowania nanoporów w stanie stałym w roztworze do eksperymentów z translokacją biomolekularną. Stosując krótkie impulsy o silnym polu elektrycznym, średnica nanoporów może być kontrolowana z subnanometryczną precyzją, a jej charakterystyka szumu elektrycznego znacznie się poprawia. Procedura ta jest wykonywana in situ przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego w warunkach eksperymentalnych.

Dostrajanie rozmiaru i minimalizowanie szumów nanoporów w stanie stałym

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Ten protokół opisuje syntezę cząstek magnetycznych i ocenę ich właściwości wiązania DNA za pomocą dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła. Metoda ta koncentruje się na monitorowaniu zmian wielkości cząstek, ich polidyspersyjności i potencjału zeta powierzchni cząstek, które odgrywają główną rolę w wiązaniu materiałów takich jak DNA.

Analiza wiązania cząstek DNA-magnetycznych za pomocą dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.

Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania bezprzewodowej elektrody nanoporowej typu zamkniętego i późniejszego elektrochemicznego pomiaru zderzeń pojedynczych nanocząstek.

Bezprzewodowa elektroda nanoporowa typu zamkniętego do analizy pojedynczych nanocząstek

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Poznaj metodę TRPS do oznaczania potencjału Zeta nanocząstek zmodyfikowanych DNA. Technika umożliwia analizę pojedynczych cząstek i charakteryzację ich chemii powierzchniowej.

Oznaczanie potencjału Zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych DNA (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie potencjału Zeta za pomocą prędkości translokacji nanocząstek przez przestrajalne nanopory: na przykładzie cząstek zmodyfikowanych DNA

Przeglądaj więcej filmów