Name: Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności integracyjnej kompleksów przedintegracyjnych HIV-1 in vitro z użyciem komórek SupT1. Technika ta umożliwia identyfikację nowych celów terapeutycznych dla terapii antyretrowirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty DA024558, DA30896, DA033892 i DA021471 z NIDA/NIH na CD. Uznajemy również grant RCMI G12MD007586, grant Vanderbilt CTSA UL1RR024975, grant U54 RR026140 Meharry Translational Research Center (MeTRC) z NCRR/NIH, MD007593 grantowy U54 z NIMHD/NIH oraz grant Tennessee CFAR P30 AI110527.

1. Produkcja wirusów
UWAGA: Aby wygenerować wysokie miana zakaźnego HIV-1, przetransfekuj linię komórkową 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) zakaźnym klonem molekularnym HIV-1 za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie aktywowanego dendrymeru. Zaobserwowano, że metoda transfekcji fosforanu wapnia daje porównywalne wyniki.
<ol>
	<li>W laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) wysiewaj 3 x 106 komórek 293T na 10 cm naczynie w 8 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną i streptomycyną. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 O/N.</li>
	<li>Następnego dnia, w celu transfekcji komórek w każdym 10-centymetrowym naczyniu, rozcieńczyć 8 μg plazmidowego DNA pNL4-3 (patrz Tabela Materiałów) do końcowej objętości 300 μL DMEM bez surowicy i antybiotyków. Dodać 80 μl odczynnika do transfekcji, dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut w celu utworzenia kompleksu transfekcji.</li>
	<li>Usuń pożywkę z szalek przez aspirację i dodaj 7 ml na naczynie świeżego DMEM zawierającego surowicę i antybiotyki.</li>
	<li>Dodać 1 ml DMEM zawierającego surowicę i antybiotyki do kompleksu transfekcyjnego, wymieszać pipetując i dodać tę mieszaninę do komórek. Delikatnie zamieszaj naczynie, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie kompleksów transfekcyjnych.</li>
	<li>Natychmiast przenieść komórki do laboratorium BSL3, umieścić w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i hodować komórki przez 48 godzin.</li>
	<li>Zebrać supernatant kultury tkankowej zawierający wirusa za pomocą pipety, a następnie przenieść go do probówki wirówkowej. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki i zanieczyszczenia, a następnie przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm.</li>
	<li>Aby wyeliminować wszelkie przeniesione plazmidowe DNA w tym bezkomórkowym preparacie wirusa, należy traktować DNazą 1 (20 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Aby określić ilościowo miano wirusa HIV-1, należy użyć testu immunoenzymatycznego (ELISA) specyficznego dla p24, ponieważ jest to szybka i łatwa metoda do rutynowego stosowania22. 
	UWAGA: Należy zauważyć, że test ELISA p24 mierzy miano fizyczne (liczbę cząstek wirusa). Alternatywnie, pomiar aktywności RT związanej z wirusem (egzogenny test RT) lub zakaźności wirusa (testy zakaźności oparte na linii komórkowej wskaźnikowej TZM-bl) zapewni wyłączny odczyt zakaźnych cząstek wirusa.</li>
</ol>
2. Infekcja wirusowa komórek Sup-T1 (BSL3 Lab)
<ol>
	<li>W laboratorium BSL2 utrzymuj komórki Sup-T1 między 1,0 x 106 a 2,0 x 106 komórek/ml w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, penicyliną i streptomycyną (stosunek podziału 1:2 co 2-3 dni). Zebrać komórki Sup-T1 z kolb hodowlanych, dobrze wymieszać przez pipetowanie i określić liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i metody barwienia wykluczającego błękit trypanowy.
	<ol>
		<li>Przygotować wymaganą liczbę podwielokrotności 80 x 106 komórek (na infekcję wirusową) w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki w wirniku z wahliwym kubełkiem o ciśnieniu 500 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut. Nie usuwając pożywki do hodowli komórkowych, przenieś probówki zawierające granulowane komórki do laboratorium BSL3 w celu dalszego przetwarzania. Ostrożnie odessać pożywkę do hodowli komórkowych z probówki, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać odpowiednią ilość inokulum wirusa poddanego działaniu DNazy I do komórek w probówce i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. W przypadku komórek 80 x 106 użyj 30 ml wirusa potraktowanego DNazą I (50 μg wirusa równoważnego p24). 
	UWAGA: Izolacja funkcjonalnych wymaga zakażenia komórek docelowych bardzo dużą wielokrotnością infekcji (MOI).</li>
	<li>Rozprowadzić mieszaninę równomiernie między dwiema 6-dołkowymi płytkami do hodowli tkankowej (tj. 12 x 2,5 ml podwielokrotności; użyć 2 płytek na zakażenie).</li>
	<li>W celu spinokulacji umieścić płytki hodowlane w nośnikach płytek i odwirować za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o sile 480 x g i temperaturze 25 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Inkubować komórki kolczaste w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 godzin.</li>
</ol>
3. Pobieranie i liza zainfekowanych komórek (BSL3 lab)
<ol>
	<li>Połącz komórki odpowiadające każdej infekcji z płytek hodowlanych w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (łącznie ~30 ml).</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 x g i temperaturze 25 °C przez 10 minut. Ostrożnie odessać supernatant z probówki (alternatywnie użyć pipety).</li>
	<li>Aby usunąć wszelkie pozostałości cząstek wirusa, przemyć każdą komórkę, dodając 2 ml buforu K-/- (150 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM MgCl2) i odwirowując próbkę w temperaturze 300 x g i 25 °C przez 10 minut. Następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację lub za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórz krok 3.3.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć resztki buforu za pomocą mikropipety. Zawiesić każdą komórkę w 2 ml lodowatego buforu do lizy K+/+ (bufor K-/- uzupełniony 0,025% digitoniny, 1 mM DTT, 20 μg/ml aprotyniny), wymieszać zawartość przez delikatne pipetowanie i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
4. Przygotowanie cytoplazmatycznych (laboratorium BSL3)
<ol>
	<li>Wstrząsaj próbkami na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki, z wirnikiem wstępnie schłodzonym do temperatury 4 °C, przy 1 500 x g i 4 °C przez 4 minuty.</li>
	<li>Nie naruszając osadu, ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki i wirować w temperaturze 16 000 x g i 4 °C przez 1 min.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać RNazę A (20 mg/ml) do końcowego stężenia 20 μg/ml (2 μl na 2 ml) i inkubować zawartość w temperaturze pokojowej przez 30 minut (bez kołysania).</li>
	<li>Dodać sacharozę (60% w/v w buforze K-/-) do końcowego stężenia 7% i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. Przygotować podwielokrotności (np. 200 μl) w probówkach do mikrowirówek, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
5. Testy integracji in vitro (IVI) z wykorzystaniem HIV-1
<ol>
	<li>Przygotuj docelowe DNA użyte w teście IVI, amplifikując region 2,0 kb z plazmidowego DNA phiX174 za pomocą PCR przy użyciu niestandardowych starterów, phiX174-F i phiX174-R.
	<ol>
		<li>Zmontuj mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tabeli 1. Przeprowadzić PCR w termocyklerze, stosując warunki cykli termicznych zalecane w Tabeli 2. Produkt PCR należy oczyścić żelem za pomocą zestawu do oczyszczania żelu (zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta) i przechowywać oczyszczone docelowe DNA w postaci podwielokrotności w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 600 ng docelowego DNA do 200 μl podwielokrotności, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 min. 
	Uwaga: Reakcje dożylne z pominięciem docelowego DNA lub zawierające inhibitor integrazy (np. Raltegravir) są zalecanymi reakcjami kontrolnymi.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję IVI, dodając SDS, EDTA i proteinazę K do końcowych stężeń odpowiednio 0,5%, 8 mM i 0,5 mg / ml. Dokładnie wymieszać zawartość reakcyjną i inkubować przez noc w temperaturze 56 °C.</li>
	<li>Następnego dnia oczyść całkowite DNA z reakcji IVI przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu. Przeprowadzić wszystkie etapy wirowania przy 16 000 x g i RT.</li>
	<li>Dodać równą objętość fenolu do odbiałkozczałej próbki, energicznie wymieszać przez wirowanie i odwirować przez 2 minuty. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną i przenieść ją do świeżej probówki.</li>
	<li>Powtórz krok 5.5. Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki.</li>
	<li>Dodać równą objętość mieszaniny fenolu i chloroformu w stosunku 1:1, energicznie wymieszać przez wirowanie i odwirować przez 2 minuty. Przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.</li>
	<li>Dodać równą objętość chloroformu, energicznie wymieszać przez wirowanie i odwirować przez 2 minuty. Przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.</li>
	<li>Aby wytrącić DNA, dodaj glikogen do końcowego stężenia 0,1 μg/μl, 3 M octanu sodu do końcowego stężenia 0,3 M i 2,5 objętości 100% etanolu (lodowaty). Zmieszać wirowo, krótko odwirować w celu zebrania zawartości i umieścić probówkę w temperaturze -80 °C O/N.</li>
	<li>Następnego dnia odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 16 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Dodać 500 μl 80% etanolu (lodowatego) do osadu i odwirować przy 16 000 x g i 4 °C przez 10 min. Wysuszyć na powietrzu osad DNA w temperaturze pokojowej i dokładnie zawiesić w 50 μl wody wolnej od nukleaz. Przechowywać próbki DNA w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Testy PCR do ilościowego określania aktywności
UWAGA: Liczba kopii DNA HIV-1 zintegrowanego z docelowym DNA jest określana ilościowo za pomocą zagnieżdżonej strategii PCR, która wykorzystuje 2 zestawy starterów i 2 sekwencyjne rundy PCR.
<ol>
	<li>Wykonaj pierwszą rundę konwencjonalnego PCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na wirusowy LTR i DNA phiX174 (odpowiednio startery LTR i phiX174) w celu amplifikacji połączeń zintegrowanego DNA HIV-1.
	<ol>
		<li>Zebrać mieszaninę PCR pierwszej rundy zgodnie z opisem w tabeli 3. Zebrać główną mieszankę wszystkich składników z wyjątkiem matrycy DNA, dozować 45 μl porcji do oddzielnych probówek do PCR i dodać 5 μl matrycy DNA lub wody wolnej od nukleaz (kontrola).</li>
		<li>Przeprowadzić PCR w termocyklerze, stosując warunki cykli termicznych zalecane w Tabeli 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj drugą rundę qPCR przy użyciu starterów, które otaczają krótki region wirusowego LTR (startery LTR-R i LTR-U) w celu selektywnej amplifikacji zintegrowanych sekwencji vDNA z produktów pierwszej rundy PCR. Aby określić liczbę zintegrowanych kopii vDNA, wygeneruj krzywą standardową, używając 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń znanych liczb kopii (np. 100 - 108) klonu molekularnego HIV-1.
	<ol>
		<li>Zebrać mieszaninę qPCR drugiej rundy zgodnie z opisem w tabeli 5. Zebrać główną mieszankę wszystkich składników z wyjątkiem matrycy DNA, ostrożnie dozować 25 μl podwielokrotności do odpowiedniej liczby dołków na 96-dołkowej płytce reakcyjnej PCR, a następnie dodać 5 μl nieoczyszczonych produktów pierwszej rundy PCR lub wody wolnej od nukleaz (kontrola). Przeprowadzić wszystkie reakcje qPCR w trzech powtórzeniach.</li>
		<li>Załaduj płytkę PCR do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym i wykonaj qPCR w warunkach cyklicznych zalecanych w Tabeli 6.</li>
		<li>Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4+antigen%3A+physiological+ligand+and+HIV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li>
<li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+HIV+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li>
<li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li>
<li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li>
<li>Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li>
<li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li>
<li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+structure+of+an+integration+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li>
<li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li>
<li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li>
<li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+retroviral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+rev+gen%22%5BJournal%5D)">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li>
<li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li>
<li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li>
<li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li>
<li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li>
<li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+acid+res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li>
<li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+human+immunodeficiency+virus+%28HIV%29+integration+protein+in+vitro%3A+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li>
<li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li>
<li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li>
<li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li>
<li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4%2B+T+cells%3A+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuk+Biol%22%5BJournal%5D)">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych i niefinansowych.

Analizy biochemiczne retrowirusowych dostarczyły kluczowych informacji na temat mechanizmu integracji retrowirusowego DNA. Pomiar aktywności integracyjnej retrowirusowych można osiągnąć za pomocą testu tworzenia blaszek miażdżycowych, analizy Southern blot i zagnieżdżonego qPCR. Eksperymentalna strategia oznaczania płytki nazębnej jest pracochłonna i wykorzystuje metodę pośrednią do pomiaru integracji 6,7,18. Testy oparte na Sou...

Replikacja HIV-1 w komórce docelowej składa się z wielu etapów, podzielonych na dwie fazy: wczesne i późne zdarzenia. Wczesne zdarzenia rozpoczynają się, gdy HIV-1 sekwencyjnie wiąże się z receptorem na powierzchni komórki docelowej CD4 i jednym z dwóch koreceptorów (CCR5 lub CXCR4)1. W konsekwencji błony komórkowe wirusa łączą się, a rdzeń kapsydu wirusa (CA) jest uwalniany do cytoplazmy2. Rdzeń CA zawiera jednoniciowy RNA genomu wirusa (ssRNA) i kilka białek, zarówno pochodzenia wirusowego, jak i komórkowego. Białka wirusowe związane z CA obejmują odwrotną transkryptazę (RT) i integrazę (IN), dwa enzymy, które pośredniczą w krytycznych etapach podczas wczesnych zdarzeń replikacji wirusa. Funkcja RT i IN w kontekście kompleksów nukleoproteinowych, a mianowicie odpowiednio kompleksu odwrotnej transkrypcji (RTC) i kompleksu pre-integracji ()3,4,5,6. Końce wirusowego genomu ssRNA zawierają końcowe elementy powtórzeń (R) sąsiadujące z unikalnymi sekwencjami U5 (na końcu 5') i U3 (na końcu 3'). RTC przekształca genom wirusa ssRNA w dwuniciową (ds) kopię DNA (vDNA). Ten proces odwrotnej transkrypcji powoduje również duplikację sekwencji U5 i U3, generując w ten sposób długie powtórzenia końcowe (LTR) na obu końcach vDNA7,8. Następnie IN związany z katalizuje dwie sekwencyjne reakcje biochemiczne, które umożliwiają integrację vDNA z chromosomem gospodarza9,10,11. Po pierwsze, w cytoplazmie, multimery IN angażują oba LTRs12 i rozszczepiają dinukleotyd z każdego z 3'-końcowych końców. To przetwarzanie końca 3' generuje grupę hydroksylową na każdym końcu 3' (CAOH) vDNA. Następnie przemieszcza się do jądra, w którym IN wykorzystuje vDNA CAOH jako nukleofil do przecięcia obu nici chromosomalnego DNA w sposób rozłożony. Jednocześnie IN koordynuje oba końce vDNA z powstałymi wiązaniami fosfodiestrowymi na przeciwległych niciach chromosomalnego DNA. Po tym etapie przenoszenia nici maszyneria komórki gospodarza usuwa dwa niesparowane nukleotydy na końcach 5' vDNA i naprawia powstałe jednoniciowe luki na styku miejsca integracji. Kulminacją wczesnych wydarzeń jest zatem ustanowienie zintegrowanej kopii DNA (prowirusa) genomu HIV-1. Prowirus zapewnia odpowiednie środowisko dla efektywnej ekspresji genów wirusa, która inicjuje późniejsze zdarzenia, w tym ekspresję białek kodowanych przez wirusa; gromadzenie się niedojrzałego wirusa; oraz pączkowanie, uwalnianie i dojrzewanie do zakaźnych wirionów13.
Oczyszczony rekombinowany retrowirusowy IN jest kompetentny do przeprowadzania, in vitro, zarówno przetwarzania końca 3', jak i przenoszenia nici na egzogennie dostarczonym substramencie podobnym do LTR DNA. Badania biochemiczne z użyciem tak oczyszczonego rekombinantu IN ujawniły krytyczne aspekty integracji vDNA14,15,16,17. Jednak w przeciwieństwie do naturalnej infekcji, ta reakcja biochemiczna in vitro nie wspiera skoordynowanej integracji obu końców substratowego DNA z docelowym DNA. W przeciwieństwie do tego, retrowirusowe wyizolowane z ostro zakażonych komórek zgodnie integrują oba końce endogennego vDNA z heterologicznym docelowym DNA. Doprowadziło to do powszechnego przyjęcia i późniejszego udoskonalenia testów integracji invitro (IVI) z wykorzystaniem izolowanych natywnych.
W pierwszym opisanym retrowirusowym teście IVI, ekstrakty cytoplazmatyczne z komórek zakażonych rekombinowanym wirusem białaczki mysiej (MLV) zawierającym gen E. coli supF w swoim LTR służyły jako źródło aktywności IN, a DNA zmutowanego faga lambda z defektem wzrostu litycznego było egzogennie dostarczane jako docelowe DNA. Udana integracja kopii rekombinowanego DNA MLV z DNA faga i wynikająca z tego ekspresja supF doprowadziły do przywrócenia zdolności rekombinowanych fagów do tworzenia płytek miażdżycowych. Jednak ta eksperymentalna strategia jest pracochłonna i mierzy integrację w sposób pośredni. Aby rozwiązać takie zastrzeżenia, opracowano test pośredniego znakowania końcowego oparty na Southern blot, który określa ilościowo aktywność IVI związaną z jako miarę endogennego vDNA zintegrowanego z egzogennym linearyzowanym DNA bakteriofaga phiX174, 6,7,18. Chociaż metoda ta zapewnia bezpośredni pomiar wydarzeń integracyjnych, wymagane są stosunkowo duże ilości przygotowania, co pozostaje technicznie trudnym przedsięwzięciem. Aby obejść ten problem, opracowano zagnieżdżone testy oparte na PCR, wymagające jedynie niewielkiej ilości4,5,19.
W tym raporcie opisujemy zaktualizowaną wersję zagnieżdżonej metody in vitro opartej na PCR, opracowanej w celu podsumowania aktywności integracyjnej HIV-1 za pośrednictwem występującej podczas naturalnej infekcji. Metoda ta wykorzystuje ekstrakty cytoplazmatyczne z komórek docelowych zakażonych wirusem HIV-1 jako źródło endogennej aktywności, która jest mierzona za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym. Procedury izolowania i pomiaru ich działań integracyjnych są zaadaptowane, z modyfikacjami, na podstawie protokołów opublikowanych przez laboratorium Engelmana20. W tej metodzie aktywność integracyjna związana z jest inicjowana przez dostarczenie egzogennego liniowego docelowego DNA21, a produkty DNA powstałe w wyniku tej reakcji integracji są oczyszczane i wykorzystywane jako materiał wyjściowy do późniejszej kwantyfikacji opartej na PCR. W pierwszej rundzie konwencjonalnej PCR połączenia DNA wirus-cel są amplifikowane przy użyciu odpowiednich starterów. W drugiej rundzie qPCR startery specyficzne dla LTR są używane do specyficznego wzbogacenia populacji vDNA z produktów pierwszej rundy PCR. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą protokołu, aby uzyskać szczegółowy opis tej metody.
Badania in vitro z retrowirusowymi doprowadziły do znacznego postępu w naszym zrozumieniu mechanizmu integracji retrowirusowego DNA oraz w rozwoju inhibitorów IN. Opierając się na niedawnym zwiększonym nacisku na mapowanie miejsc integracji HIV-1, określanie roli czynników wirusa i gospodarza w integracji HIV-1 oraz opracowywanie nowych leków przeciwwirusowych w celu zwalczania oporności na leki, przewidujemy zwiększone zainteresowanie i powszechne stosowanie testów IVI, takich jak te opisane w niniejszym raporcie. To z kolei doprowadzi do przyszłych udoskonaleń metody, a tym samym zróżnicowania zakresu jej zastosowań.

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średnie </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsyna-EDTA (0,25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HEK293T komórek (293T) </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> HIV-1 prowirusowy klon molekularny pNL4-3 </td><td> NIH AIDS Research and Reference Reagent Program </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> PolyFect odczynnik do transfekcji </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNaza 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Sup-T1 cells</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,2 - 7,5 (roztwór gotowy do użycia)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Roztwór chlorku potasu (KCl) </td><td> Sigma-Aldrich< </td><td> p>60142 </td><td></td></tr><tr><td> Roztwór chlorku magnezu (MgCl2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinina </td><td> Sigma-Aldrich< > </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNaza A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Sacharoza </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 Forma replikacyjna 1 DNA </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX174-F starter: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R starter: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen i/lub IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq Polimeraza DNA </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> Ultraczysta woda destylowana </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris-EDTA (TE) (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Roztwór soli disodowej (EDTA), 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K (20 mg/ml roztworu gotowego do użycia)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol (zrównoważony z 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0 oraz 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glikogen (5 mg/ml roztworu)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (3 M, pH 5,2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>Pierwsza runda : 5'-GTGCCGCTTCAGCAAG-3' Pierwsza runda spłonka phiX174: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen i/lub IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>Druga runda LTR-R Primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Druga runda Podkład LTR-U: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Druga runda sondy Taqmana: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen i/lub IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych hiv-1

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Białka otoczki HIV-1 angażują pokrewne receptory na powierzchni komórki docelowej, co prowadzi do fuzji błony komórkowej wirusa, a następnie uwolnienia rdzenia kapsydu wirusa (CA) do cytoplazmy. Następnie wirusowa odwrotna transkryptaza (RT), jako część kompleksu nukleoproteinowego o nazwie zwanego kompleksem odwrotnej transkrypcji (RTC), przekształca jednoniciowy genom wirusa RNA w dwuniciową kopię DNA (vDNA). Prowadzi to do biogenezy innego kompleksu nukleoproteinowego, zwanego kompleksem preintegracyjnym (), składającego się z vDNA i powiązanych białek wirusa oraz czynników gospodarza. Integraza wirusowa (IN) związana z koordynuje integrację vDNA z chromosomalnym DNA gospodarza w dwuetapowym procesie regulowanym czasowo i przestrzennie. Po pierwsze, IN przetwarza końce 3' vDNA w cytoplazmie, a po drugie, po tym, jak przejdzie do jądra, pośredniczy w integracji przetworzonego vDNA z chromosomalnym DNA. wyizolowane z komórek docelowych ostro zakażonych HIV-1 są funkcjonalne in vitro, ponieważ są zdolne do integracji powiązanego vDNA z egzogennie dodanym heterologicznym docelowym DNA. Takie testy integracji in vitro oparte na znacząco przyczyniły się do nakreślenia mechanistycznych szczegółów integracji retrowirusowej i odkrycia inhibitorów IN. W tym raporcie omawiamy zaktualizowany test HIV-1, który wykorzystuje zagnieżdżoną ilościową strategię opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym do pomiaru aktywności integracyjnej in vitro izolowanych natywnych.

Izolacja kompleksów PIC HIV-1
Schemat protokołu stosowanego do izolacji kompleksów PIC HIV-1 z ostro zainfekowanych komórek Sup-T1 przedstawiono na Rysunku 1. Protokół ten został opracowany na podstawie metod opisanych przez Engelmana et al.19,20. Kompleksy PIC HIV-1 są kompleksami nukleoproteinowymi, które powstają w zainfekowa...

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów preintegracyjnych lub wyizolowanych z komórek SupT1 zakażonych wirusem HIV-1. Metoda ta odpowie na niektóre z kluczowych pytań w biologii HIV, w szczególności na pytanie, w jaki sposób niektóre czynniki gospodarza i czynniki wirusowe, na przykład kapsyd wirusa, odgrywają rolę w integracji DNA HIV-1, a to pomoże nam zaprojektować lub zidentyfikować nowe cele terapii antyretrowirusowej. Główną zaletą tej metody jest to, że wymaga ona stosunkowo niewielkiej ilości kompleksu pre-integracji, czyli, przygotowania do pomiaru aktywności integracyjnej in vitro.Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na diagnozę, jak również terapię HIV-1 AIDS, a to dlatego, że wcześniejsze wersje tej techniki odegrały kluczową rolę w odkryciu inhibitorów integrazy HIV-1, które są jednym z głównych leków anty-HIV w dzisiejszym zastosowaniu klinicznym, więc ta metoda może być stosowana nie tylko do zrozumienia integracji HIV-1, ale można go również zastosować do badania innych retrowirusów, takich jak RSV i MLV. Protokół ten zademonstruje dr Muthukumar Balasubramaniam, który jest doktorem habilitowanym w laboratorium. Aby zainfekować SupT1 wirusem HIV-1, w laboratorium BSL-2 utrzymuj komórki SupT1 między jednym a dwoma razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w pożywce Roswell Park Memorial Institute lub RPMI uzupełnionej 10% FBS i Pen-Strep.Po wygenerowaniu wysokich mian zakaźnego HIV-1 zgodnie z protokołem tekstowym, połącz komórki SupT1 z kolb hodowlanych, dobrze wymieszaj przez pipetowanie i użyj barwienia wykluczającego błękitem trypanowym w hemocytometrze w celu określenia liczby żywotnych komórek. Podwielokrotność osiem razy 106 komórek na infekcję wirusową w 50-mililitrowych stożkowych probówkach wirówkowych, a następnie odwirować komórki w wahadłowym wirniku kubełkowym pod ciśnieniem 500 razy g i 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Nie usuwając pożywki do hodowli komórkowych, przenieś probówki zawierające granulowane komórki do laboratorium BSL-3 w celu dalszego przetwarzania, a następnie ostrożnie odessaj pożywkę z probówki, nie naruszając osadu.Następnie dodać 30 mililitrów inokulum wirusa poddanego działaniu DNazy I do komórek i wymieszać, delikatnie pipetując, a następnie równomiernie rozprowadzić mieszaninę między dwiema sześciodołkowymi płytkami do hodowli tkankowych. W celu spinokulacji umieść płytki hodowlane w nośnikach płytek i odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym o temperaturze 480 razy g i 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć godzin. Aby zebrać i poddać lizie zakażone komórki, należy zebrać komórki odpowiadające każdej infekcji w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Odwirować komórki w temperaturze 300 razy g i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostrożnie zassać lub pipetować supernatant. Aby usunąć wszelkie pozostałości cząstek wirusa, umyj każdą osadkę, dodając dwa mililitry buforu K minus minus i ponownie odwiruj próbkę, a następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie usuń supernatant przez aspirację lub pipetę przed powtórzeniem płukania jeszcze raz. Po ostrożnym usunięciu resztek buforu za pomocą mikropipety, użyj lodowatego buforu do lizy K plus plus, aby delikatnie ponownie zawiesić każdą osadkę i przenieść do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.Aby przygotować cytoplazmatyczne kompleksy wstępnej integracji lub, należy wstrząsnąć próbką w temperaturze pokojowej przez 10 minut, następnie umieścić probówki w wirniku wstępnie schłodzonym do czterech stopni Celsjusza i odwirować w temperaturze 1 500 razy g i czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty. Nie naruszając osadu, ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki i wirować z prędkością 16 000 g i czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki, następnie dodać RNazę A do końcowego stężenia 20 mikrogramów na mililitr i inkubować zawartość w temperaturze pokojowej bez kołysania przez 30 minut.Dodać sacharozę do końcowego stężenia 7% i dobrze wymieszać, delikatnie pipetując, a następnie przygotować porcje w probówkach do mikrowirówek. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i umieszczenie w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Aby przygotować docelowe DNA używane w integracji in vitro lub teście IVI, złóż mieszaniny PCR w celu amplifikacji regionu 2,0 kilozasady z plazmidowego DNA phiX174 za pomocą niestandardowych starterów phiX174-Forward i phiX174-Reverse i przeprowadź PCR za pomocą programu zgodnie z protokołem tekstowym.Po oczyszczeniu żelu i porcjowaniu próbki dodać 600 nanogramów docelowego DNA do 200 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Zatrzymaj reakcję IVI dodając SDS, EDTA i proteinazę K, a następnie dokładnie wymieszaj zawartość reakcji i inkubuj w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia, w celu oczyszczenia całkowitego DNA z reakcji IVI, dodaj równą objętość fenolu do odbiałkulizowanej próbki. Mieszaj energicznie przez wirowanie i wiruj przez dwie minuty. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną i przenieść ją do świeżej probówki przed powtórzeniem ekstrakcji fenolowej, a następnie dodać równą objętość chloroformu fenolowego od jednego do jednego.Wymieszać próbkę przez wirowanie i odwirować probówkę przez dwie minuty, a następnie przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki. Po ekstrakcji chloroformem zgodnie z protokołem tekstowym wytrącić DNA z fazy wodnej, dodając 0,1 mikrograma na mikrolitr glikogenu, 0,3 molowego octanu sodu i 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu. Umieść probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na noc.Następnego dnia odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, a następnie ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu. Aby przeprowadzić PCR w celu ilościowego określenia aktywności, należy rozpocząć pierwszą rundę konwencjonalnego PCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na wirusowy LTR i DNA phiX174 w celu amplifikacji połączeń zintegrowanego DNA HIV-1. Złóż mieszankę wzorcową bez matrycy DNA, jak opisano tutaj, a następnie dozuj 45 mikrolitrów porcji do oddzielnych probówek PCR i dodaj pięć mikrolitrów matrycy DNA lub wody wolnej od nukleaz jako kontrolę.Przeprowadź reakcję w termocyklerze za pomocą programu opisanego w protokole tekstowym, a następnie przeprowadź drugą rundę ilościowego PCR i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. W tym teście IVI SupT1 były spinokulane z DNAzą I traktowaną HIV-1 oraz brakiem lub obecnością inhibitora integrazy HIV-1, raltegrawiru. Po inkubacji wyizolowano, a oczyszczone DNA przeanalizowano pod kątem integracji DNA wirusa.Jak pokazano tutaj, HIV-1 silnie integrują związane DNA wirusa z docelowym DNA, a skuteczność IVI została znacznie zmniejszona w reakcjach uzupełnionych raltegrawirem, co silnie implikuje aktywność integracji mierzoną w tym teście z integrazą HIV-1. Reakcje kontrolne nie wykazały żadnej aktywności integracyjnej. Ponadto kontrola, która wykluczyła polimerazę Taq w pierwszej rundzie PCR, nie amplifikowała produktów integracji.Warto zauważyć, że dane z samej kontroli wskazywały, że strategia zagnieżdżonego qPCR konkretnie mierzyła zintegrowane DNA wirusa, ale nie DNA wirusa związane z. Łącznie dane te pokazują działania integracyjne związane z. Po opanowaniu, przygotowanie wirusa i testy PCR w celu ilościowego określenia aktywności można zakończyć w ciągu tygodnia.Zakażenie komórek SupT1 i wyizolowanie z zakażonych komórek można przeprowadzić w ciągu jednego dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować HIV-1 i zmierzyć aktywność integracji in vitro. Nie zapominaj, że praca z wysokimi mianami zakaźnego wirusa HIV-1 może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować odpowiednie środki ostrożności, w tym odzież ochronną, taką jak fartuchy i fartuchy, podwójne rękawice i okulary ochronne.

measurement-vitro-integration-activity-hiv-1-preintegration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Ten film demonstruje test wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej przy użyciu komórek reporterowych interferonu HEK-Blue α/β do ilościowego określenia interferonów typu I (IFN) uwolnionych po stymulacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych przez limfocyty T CD4+ zakażone HIV-1.

Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Zakażenie tkanek ludzkich ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) ex vivo dostarcza cennego modelu 3D patogenezy wirusa. W tym miejscu opisujemy protokół przetwarzania i infekowania próbek tkanek z ludzkich migdałków i błon śluzowych żeńskich narządów płciowych wirusem HIV-1 i utrzymywania ich w kulturze na granicy faz ciecz-powietrze.

Ex vivo Zakażenie ludzkiej tkanki limfatycznej i błony śluzowej żeńskich narządów płciowych ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 i histokultura

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę pomiaru aktywności integracyjnej kompleksów przedintegracyjnych HIV-1 in vitro z użyciem komórek SupT1. Technika ta umożliwia identyfikację nowych celów terapeutycznych dla terapii antyretrowirusowej.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Przeglądaj więcej filmów