Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów preintegracyjnych lub wyizolowanych z komórek SupT1 zakażonych wirusem HIV-1. Metoda ta odpowie na niektóre z kluczowych pytań w biologii HIV, w szczególności na pytanie, w jaki sposób niektóre czynniki gospodarza i czynniki wirusowe, na przykład kapsyd wirusa, odgrywają rolę w integracji DNA HIV-1, a to pomoże nam zaprojektować lub zidentyfikować nowe cele terapii antyretrowirusowej. Główną zaletą tej metody jest to, że wymaga ona stosunkowo niewielkiej ilości kompleksu pre-integracji, czyli, przygotowania do pomiaru aktywności integracyjnej in vitro.

Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na diagnozę, jak również terapię HIV-1 AIDS, a to dlatego, że wcześniejsze wersje tej techniki odegrały kluczową rolę w odkryciu inhibitorów integrazy HIV-1, które są jednym z głównych leków anty-HIV w dzisiejszym zastosowaniu klinicznym, więc ta metoda może być stosowana nie tylko do zrozumienia integracji HIV-1, ale można go również zastosować do badania innych retrowirusów, takich jak RSV i MLV. Protokół ten zademonstruje dr Muthukumar Balasubramaniam, który jest doktorem habilitowanym w laboratorium. Aby zainfekować SupT1 wirusem HIV-1, w laboratorium BSL-2 utrzymuj komórki SupT1 między jednym a dwoma razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w pożywce Roswell Park Memorial Institute lub RPMI uzupełnionej 10% FBS i Pen-Strep.

Po wygenerowaniu wysokich mian zakaźnego HIV-1 zgodnie z protokołem tekstowym, połącz komórki SupT1 z kolb hodowlanych, dobrze wymieszaj przez pipetowanie i użyj barwienia wykluczającego błękitem trypanowym w hemocytometrze w celu określenia liczby żywotnych komórek. Podwielokrotność osiem razy 106 komórek na infekcję wirusową w 50-mililitrowych stożkowych probówkach wirówkowych, a następnie odwirować komórki w wahadłowym wirniku kubełkowym pod ciśnieniem 500 razy g i 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Nie usuwając pożywki do hodowli komórkowych, przenieś probówki zawierające granulowane komórki do laboratorium BSL-3 w celu dalszego przetwarzania, a następnie ostrożnie odessaj pożywkę z probówki, nie naruszając osadu.

Następnie dodać 30 mililitrów inokulum wirusa poddanego działaniu DNazy I do komórek i wymieszać, delikatnie pipetując, a następnie równomiernie rozprowadzić mieszaninę między dwiema sześciodołkowymi płytkami do hodowli tkankowych. W celu spinokulacji umieść płytki hodowlane w nośnikach płytek i odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym o temperaturze 480 razy g i 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć godzin. Aby zebrać i poddać lizie zakażone komórki, należy zebrać komórki odpowiadające każdej infekcji w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Odwirować komórki w temperaturze 300 razy g i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostrożnie zassać lub pipetować supernatant. Aby usunąć wszelkie pozostałości cząstek wirusa, umyj każdą osadkę, dodając dwa mililitry buforu K minus minus i ponownie odwiruj próbkę, a następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie usuń supernatant przez aspirację lub pipetę przed powtórzeniem płukania jeszcze raz. Po ostrożnym usunięciu resztek buforu za pomocą mikropipety, użyj lodowatego buforu do lizy K plus plus, aby delikatnie ponownie zawiesić każdą osadkę i przenieść do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Aby przygotować cytoplazmatyczne kompleksy wstępnej integracji lub, należy wstrząsnąć próbką w temperaturze pokojowej przez 10 minut, następnie umieścić probówki w wirniku wstępnie schłodzonym do czterech stopni Celsjusza i odwirować w temperaturze 1 500 razy g i czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty. Nie naruszając osadu, ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki i wirować z prędkością 16 000 g i czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki, następnie dodać RNazę A do końcowego stężenia 20 mikrogramów na mililitr i inkubować zawartość w temperaturze pokojowej bez kołysania przez 30 minut.

Dodać sacharozę do końcowego stężenia 7% i dobrze wymieszać, delikatnie pipetując, a następnie przygotować porcje w probówkach do mikrowirówek. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i umieszczenie w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Aby przygotować docelowe DNA używane w integracji in vitro lub teście IVI, złóż mieszaniny PCR w celu amplifikacji regionu 2,0 kilozasady z plazmidowego DNA phiX174 za pomocą niestandardowych starterów phiX174-Forward i phiX174-Reverse i przeprowadź PCR za pomocą programu zgodnie z protokołem tekstowym.

Po oczyszczeniu żelu i porcjowaniu próbki dodać 600 nanogramów docelowego DNA do 200 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Zatrzymaj reakcję IVI dodając SDS, EDTA i proteinazę K, a następnie dokładnie wymieszaj zawartość reakcji i inkubuj w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia, w celu oczyszczenia całkowitego DNA z reakcji IVI, dodaj równą objętość fenolu do odbiałkulizowanej próbki. Mieszaj energicznie przez wirowanie i wiruj przez dwie minuty. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną i przenieść ją do świeżej probówki przed powtórzeniem ekstrakcji fenolowej, a następnie dodać równą objętość chloroformu fenolowego od jednego do jednego.

Wymieszać próbkę przez wirowanie i odwirować probówkę przez dwie minuty, a następnie przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki. Po ekstrakcji chloroformem zgodnie z protokołem tekstowym wytrącić DNA z fazy wodnej, dodając 0,1 mikrograma na mikrolitr glikogenu, 0,3 molowego octanu sodu i 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu. Umieść probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na noc.

Następnego dnia odwirować próbkę w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, a następnie ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu. Aby przeprowadzić PCR w celu ilościowego określenia aktywności, należy rozpocząć pierwszą rundę konwencjonalnego PCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na wirusowy LTR i DNA phiX174 w celu amplifikacji połączeń zintegrowanego DNA HIV-1. Złóż mieszankę wzorcową bez matrycy DNA, jak opisano tutaj, a następnie dozuj 45 mikrolitrów porcji do oddzielnych probówek PCR i dodaj pięć mikrolitrów matrycy DNA lub wody wolnej od nukleaz jako kontrolę.

Przeprowadź reakcję w termocyklerze za pomocą programu opisanego w protokole tekstowym, a następnie przeprowadź drugą rundę ilościowego PCR i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. W tym teście IVI SupT1 były spinokulane z DNAzą I traktowaną HIV-1 oraz brakiem lub obecnością inhibitora integrazy HIV-1, raltegrawiru. Po inkubacji wyizolowano, a oczyszczone DNA przeanalizowano pod kątem integracji DNA wirusa.

Jak pokazano tutaj, HIV-1 silnie integrują związane DNA wirusa z docelowym DNA, a skuteczność IVI została znacznie zmniejszona w reakcjach uzupełnionych raltegrawirem, co silnie implikuje aktywność integracji mierzoną w tym teście z integrazą HIV-1. Reakcje kontrolne nie wykazały żadnej aktywności integracyjnej. Ponadto kontrola, która wykluczyła polimerazę Taq w pierwszej rundzie PCR, nie amplifikowała produktów integracji.

Warto zauważyć, że dane z samej kontroli wskazywały, że strategia zagnieżdżonego qPCR konkretnie mierzyła zintegrowane DNA wirusa, ale nie DNA wirusa związane z. Łącznie dane te pokazują działania integracyjne związane z. Po opanowaniu, przygotowanie wirusa i testy PCR w celu ilościowego określenia aktywności można zakończyć w ciągu tygodnia.

Zakażenie komórek SupT1 i wyizolowanie z zakażonych komórek można przeprowadzić w ciągu jednego dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować HIV-1 i zmierzyć aktywność integracji in vitro. Nie zapominaj, że praca z wysokimi mianami zakaźnego wirusa HIV-1 może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować odpowiednie środki ostrożności, w tym odzież ochronną, taką jak fartuchy i fartuchy, podwójne rękawice i okulary ochronne.