Name: Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Poznaj metodę bakteryjnego wyświetlacza błony wewnętrznej do przesiewowego badania fragmentów przeciwciał w E. coli. Technika wykorzystuje szlak translokacji twin-arginine do kontroli jakości składania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tomerowi Zoharowi za pracę nad badaniami przesiewowymi i charakterystyką scFv. Część tych prac została wsparta nagrodą numer F32CA150622 przyznaną przez National Cancer Institute (dla AJK). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Cancer Institute lub National Institutes of Health.

<ol><li>Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+immunization+with+cytosolic+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular immunization with cytosolic recombinant antibodies.</a> Biotechnology (NY). 12 (4), 396-399 (1994).</li>
<li>Chen, S. Y., Bagley, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+antibodies+as+a+new+class+of+therapeutic+molecules+for+gene-therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracellular antibodies as a new class of therapeutic molecules for gene-therapy.</a> Hum. Gene Ther. 5 (5), 595-601 (2008).</li>
<li>Gargano, N., Biocca, S., Bradbury, A., Cattaneo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+antibody+fragments+neutralizing+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+provide+an+experimental+basis+for+the+structural+classification+of+the+DNA+polymerase+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human recombinant antibody fragments neutralizing human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase provide an experimental basis for the structural classification of the DNA polymerase family.</a> J Virol. 70 (11), 7706-7712 (1996).</li>
<li>Mhashilkar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+Tat-mediated+LTR+transactivation+and+HIV-1+infection+by+anti-Tat+single+chain+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 Tat-mediated LTR transactivation and HIV-1 infection by anti-Tat single chain intrabodies.</a> Embo J. 14 (7), 1542-1551 (1995).</li>
<li>Strube, R. W., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anti-cyclin+E+single-chain+Fv+antibodies+and+intrabodies+in+breast+cancer+cells%3A+enhanced+intracellular+stability+of+novel+sFv-F-c+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F-c intrabodies.</a> J. Immunol. Meth. 263 (1-2), 149-197 (2002).</li>
<li>Mössner, E., Koch, H., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+selection+of+antibodies+without+antigen+purification%3A+adaptation+of+the+protein+fragment+complementation+assay+to+select+antigen-antibody+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast selection of antibodies without antigen purification: adaptation of the protein fragment complementation assay to select antigen-antibody pairs.</a> J. Mol. Biol. 308 (2), 115-122 (2001).</li>
<li>Wörn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275 (4), 2795-2803 (2000).</li>
<li>Knappik, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+turns+of+a+recombinant+antibody+improve+its+in+vivo+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding.</a> Protein Eng. 8 (1), 81-89 (1995).</li>
<li>Martineau, P., Jones, P., Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+antibody+fragment+at+high+levels+in+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm.</a> J Mol Biol. 280 (1), 117-127 (1998).</li>
<li>Steipe, B., Schiller, B., Plückthun, A., Steinbacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+statistics+reliably+predict+stabilizing+mutations+in+a+protein+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain.</a> J. Mol. Biol. 240 (3), 188-192 (1994).</li>
<li>Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+with+bacterial+display%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering with bacterial display.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (4), 474-480 (2007).</li>
<li>Lener, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverting+a+protein+from+its+cellular+location+by+intracellular+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diverting a protein from its cellular location by intracellular antibodies.</a> Eur. J. Biochem. 267 (4), 1196-1205 (2000).</li>
<li>Lynch, S. M., Zhou, C., Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+scFv+intrabody+against+the+nonamyloid+component+of+%CE%B1-synuclein+reduces+intracellular+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An scFv intrabody against the nonamyloid component of α-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity.</a> J. Mol. Biol. 377 (1), 136-147 (2008).</li>
<li>Gai, S. A., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+for+protein+engineering+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display for protein engineering and characterization.</a> Curr. Opin. Struc. Biol. 17 (4), 467-473 (2007).</li>
<li>Kieke, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+functional+T+cell+receptor+mutants+from+a+yeast+surface-display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (10), 5651-5656 (1999).</li>
<li>Steiner, D., Forrer, P., Stumpp, M. T., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+sequences+directing+cotranslational+translocation+expand+the+range+of+proteins+amenable+to+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display.</a> Nat. Biotechnol. 24, 823-831 (2006).</li>
<li>Pugsley, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+general+secretory+pathway+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria.</a> Microbiol. Rev. 57 (1), 50-108 (1993).</li>
<li>Rapoza, M. P., Webster, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filamentous+bacteriophage+assembly+proteins+require+the+bacterial+SecA+protein+for+correct+localization+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The filamentous bacteriophage assembly proteins require the bacterial SecA protein for correct localization to the membrane.</a> J. Bacteriol. 175 (6), 1856-1859 (1993).</li>
<li>Karlsson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antibody+fitness+and+function+using+membrane-anchored+display+of+correctly+folded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering antibody fitness and function using membrane-anchored display of correctly folded proteins.</a> J. Molec. Biol. 416 (1), 94-107 (2012).</li>
<li>DeLisa, M. P., Tullman, D., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+quality+control+in+the+export+of+proteins+by+the+bacterial+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 6115-6120 (2003).</li>
<li>Fisher, A. C., Kim, W., DeLisa, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+for+protein+solubility+enabled+by+the+folding+quality+control+feature+of+the+twin-arginine+translocation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic selection for protein solubility enabled by the folding quality control feature of the twin-arginine translocation pathway.</a> Protein Sci. 15 (3), 449-458 (2006).</li>
<li>Maynard, J., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Antibody engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 339-376 (2000).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, Fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioNumbers--the+database+of+key+numbers+in+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioNumbers--the database of key numbers in molecular and cell biology.</a> Nucleic Acids Res. 38, D750-D753 (2010).</li>
<li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Third, Elsevier/Academic Press. (2013).</li>
<li>Tayapiwatana, C., Chotpadiwetkul, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+using+streptavidin+magnetic+bead-sorted+in+vivo+biotinylated+survivin+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach using streptavidin magnetic bead-sorted in vivo biotinylated survivin for monoclonal antibody production.</a> J Immunol Methods. 317 (1-2), 1-11 (2006).</li>
<li>Zhu, G., Song, L., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+inhibition+of+nucleosome+mobility+and+transcription+by+cisplatin-DNA+interstrand+crosslinks+in+live+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Visualizing inhibition of nucleosome mobility and transcription by cisplatin-DNA interstrand crosslinks in live mammalian cells.</a> Cancer Res. 73 (14), 4451-4460 (2013).</li>
<li>Bogsch, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+component+of+a+novel+bacterial+protein+export+system+with+homologues+in+plastids+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 18003-18006 (1998).</li>
<li>Julian, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+affinity+and+stability+of+grafted+amyloid-motif+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domain antibodies.</a> Protein Eng. Des. Sel. 28 (10), 339-350 (2015).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+rise+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies rise again.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 13 (11), 799-801 (2014).</li>
<li>Marschall, A. L., Dübel, S., Böldicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+in+vivo+knockdown+of+protein+function+by+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies.</a> MAbs. 7 (6), 1010-1035 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Inżynieria przeciwciał dla aktywności cytoplazmatycznej jest trudnym zadaniem ze względu na redukujące się środowisko cytoplazmy, które utrudnia tworzenie stabilizujących wiązań dwusiarczkowych6,7. Powoduje to, że większość przeciwciał jest cytoplazmatycznie nieaktywna, chyba że są one zaprojektowane pod kątem stabilności i rozpuszczalności w cytoplazmie, a także są zaprojektowane pod kątem powinowactwa wiązania. Istniejące metody wyświetlania fagów, ekspozycji powierzchni bakterii i metod wyświetlania powierzchni drożdży wykorzystują szlak wydzielniczy14-16 do wyświetlania zmodyfikowanych przeciwciał, ale metody te nie mają środków do inżynierii fałdowania wewnątrzkomórkowego. Przeciwciała zmodyfikowane przy użyciu wyświetlacza błony wewnętrznej poprawiły stabilność cytoplazmatyczną i rozpuszczalność, ponieważ kontrola jakości fałdowania szlaku Tat zapobiega translokacji przeciwciał, które są słabo sfałdowane i niestabilne w cytoplazmie. Metoda ta upraszcza iteracyjny proces inżynierii przeciwciał wewnątrzkomórkowych pod kątem powinowactwa i rozpuszczalności, ponieważ te dwie właściwości są projektowane w jednym kroku. Chociaż metoda ta została zaprojektowana do inżynierii przeciwciał o rozpuszczalności w redukującym środowisku wewnątrzkomórkowym, może być również stosowana do inżynierii przeciwciał tak, aby działały w warunkach nieredukcyjnych, ponieważ białka zmodyfikowane tą metodą utrzymują fałdowanie w środowisku utleniającym peryplazmy.
Chociaż technika ta upraszcza proces inżynierii przeciwciał o wysokim powinowactwie i wysokiej rozpuszczalności cytoplazmatycznej, podczas korzystania z tego protokołu należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Analizując sygnały ELISA z wtórnego badania przesiewowego w celu zidentyfikowania obiecujących wariantów scFv, próg rozróżnienia między potencjalnie interesującymi wariantami a tymi, które mogą nie wykazywać odpowiedniego wiązania antygenu, prawdopodobnie nie będzie widoczny, dopóki kilka klonów nie zostanie dalej scharakteryzowanych. Ważne jest, aby szukać lepszego wiązania z przeciwciałem macierzystym; Jednak nienormalnie wysoki sygnał może wskazywać na awidność29 lub efekty agregacji30, co nie jest wyzwaniem charakterystycznym dla podejścia opartego na ekranowaniu wyświetlacza z wnętrzną błoną. Kluczowym ograniczeniem, o którym należy pamiętać podczas korzystania z tego protokołu, jest brak możliwości odzyskania sferoplastów po płukaniu, ponieważ są one niezdolne do życia (dane niepublikowane). Wymaga to etapów amplifikacji i transformacji DNA w celu odzyskania plazmidów kodujących przeciwciała.
Kilka kluczowych etapów protokołu umożliwia jednoczesną inżynierię fałdowania i wiązania przeciwciał. Aby badanie przesiewowe zakończyło się sukcesem, przeszukiwana biblioteka scFv musi być wyrażona jako fuzja z peptydem sygnałowym ssTorA. Bez tej sekwencji przeciwciała nie zostaną skierowane na szlak Tat, a tym samym nie zostaną przemieszczone do peryplazmy19. Ponadto konieczne jest połączenie C-końcowego znacznika epitopu z przeciwciałami, aby umożliwić wykrycie wyświetlanych przeciwciał w testach wiązania. Oczywiste jest, że szczep E. coli używany do ekspresji scFv musi również mieć niezbędną maszynerię szlaku Tat, ale jest to prawdą w przypadku powszechnie stosowanych szczepów E. coli .
Modyfikacje tego protokołu są możliwe w celu zwiększenia jego potencjału do izolowania przeciwciał o pożądanych cechach. Przed panoramowaniem względem antygenu docelowego można wykonać etap subtraktywnego panoramowania w celu wyczerpania biblioteki scFv niepożądanych składników. Sferoplasty biblioteczne mogą być inkubowane z kulkami magnetycznymi pokrytymi samym BCCP lub pokrytymi niepożądanym białkiem, a sferoplasty, które wiążą się z tymi kulkami, można wyrzucić przed przesiewaniem pozostałych niezwiązanych sferoplastów pod kątem wiązania z pożądanym celem. Jak wspomniano w reprezentatywnych wynikach, metodą poprawy powinowactwa izolowanego scFv jest włączenie rozpuszczalnego konkurenta do reakcji płukania, aby konkurować z scFv wyświetlanymi na sferoplastach. Ponieważ rozpuszczalny konkurent jest oczyszczonym białkiem, nie jest z niego amplifikowane DNA, więc w reakcji PCR zostaną odzyskane tylko sekwencje scFv wyświetlane na sferoplastach. Ponadto metoda ta może zostać rozszerzona na inne rodzaje przeciwciał lub na białka niewiążące przeciwciał.
Wyświetlacz błony wewnętrznej E. coli jest potężną platformą do inżynierii przeciwciał o wysokim powinowactwie i wysokim poziomie rozpuszczalności wewnątrzkomórkowej. Metoda ta jest szczególnie przydatna do efektywnej inżynierii przeciwciał zaprojektowanych do funkcjonowania w środowisku wewnątrzkomórkowym. Te wewnątrzkomórkowe przeciwciała są już badane jako potencjalne terapie w wielu dziedzinach, w tym w chorobach neurodegeneracyjnych, nowotworach i infekcjach wirusowych31. Technika ta umożliwi szersze zastosowanie przeciwciał wewnątrzkomórkowych jako narzędzi badawczych i medycznych w tych dziedzinach i każdej innej dziedzinie, w której pożądane jest badanie docelowego białka in situ.

Przeciwciała zdolne do fałdowania i funkcjonowania w środowisku wewnątrzkomórkowym są obiecującymi narzędziami zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i terapeutycznych. Posiadają one zdolność do modulowania aktywności białek poprzez wiązanie się z białkiem docelowym wewnątrz komórek, co pozwala zapobiegać oddziaływaniom białko-białko, zakłócać oddziaływania białko-kwas nukleinowy lub blokować dostęp substratu do enzymów1-5.
Mimo że przeciwciała mają ogromny potencjał w zastosowaniach wewnątrzkomórkowych, ich projektowanie pod kątem prawidłowego fałdowania i rozpuszczalności w środowisku wewnątrzkomórkowym, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do wiązania się z docelowym antygenem, jest trudnym zadaniem. Redukujące środowisko cytoplazmy zapobiega tworzeniu się mostków disiarczkowych, które są zazwyczaj niezbędne do stabilnego fałdowania pełnowymiarowych przeciwciał i fragmentów przeciwciał, w tym przeciwciał z jednoczyznianym fragmentem zmiennym (scFv)6,7. W celu zaprojektowania przeciwciał o wysokim powinowactwie do docelowych antygenów zastosowano szereg metod ewolucji ukierunkowanej8-10. Podejścia te zazwyczaj wykorzystują prezentację na fagach, prezentację na powierzchni drożdży lub prezentację na powierzchni bakterii do przesiewania dużych bibliotek przeciwciał11-13. Metody te są potężne i skuteczne w identyfikacji przeciwciał wiążących się z celami, jednak opierają się na szlaku wydzielniczym w celu transportu białek, które mają zostać zaprezentowane14-16. Szlak wydzielniczy translokuje niepofałdowane białka z redukującej cytoplazmy do światła retikulum endoplazmatycznego u drożdży lub do peryplazmy u bakterii. Białka te fałdują następnie w warunkach utleniających i są prezentowane na powierzchni komórki lub pakowane do cząsteczek fagów w celu oceny powinowactwa wiązania17,18. W rezultacie przeciwciała wyizolowane za pomocą tych technik niekoniecznie będą się prawidłowo fałdować w cytoplazmie, a rozpuszczalność wewnątrzkomórkową często trzeba projektować oddzielnie, jeśli przeciwciała mają zostać wykorzystane w aplikacjach wewnątrzkomórkowych.
Aby zwiększyć wydajność projektowania przeciwciał prawidłowo fałdujących się w cytoplazmie, zgłosiliśmy wcześniej sukces metody MAD-TRAP (membrane-anchored display for Tat-based recognition of associating proteins), która służy do przesiewania biblioteki przeciwciał scFv przy użyciu ekspozycji na wewnętrznej błonie Escherichia coli19. Ekspozycja na wewnętrznej błonie bakteryjnej opiera się na ścieżce translokacji twin-arginine (Tat) do transportu eksponowanych przeciwciał, w przeciwieństwie do innych powszechnych metod ekspozycji wykorzystujących ścieżkę wydzielniczą. Ścieżka Tat zawiera mechanizm kontroli jakości, który pozwala na transport z cytoplazmy E. coli, przez błonę wewnętrzną do periplazmy, wyłącznie białek rozpuszczalnych i prawidłowo sfałdowanych20,21. Nadmiernie eksprymowane substraty Tat (t.j. białka skierowane do ścieżki Tat poprzez fuzję N-końca z peptydem sygnałowym Tat ssTorA), które są prawidłowo sfałdowane w cytoplazmie, tworzą trwały pośrednik translokacji z N-końcem w cytoplazmie i C-końcem w periplazmie19. Umożliwia to ekspozycję prawidłowo sfałdowanych substratów Tat, w tym fragmentów przeciwciał, na powierzchni periplazmatycznej wewnętrznej błony E. coli. Po usunięciu błony zewnętrznej za pomocą trawienia enzymatycznego w celu uzyskania sferoplastów, przeciwciała zostają wyeksponowane na przestrzeń zewnątrzkomórkową (Rysunek 1). Pozwala to na przesiewanie substratów Tat eksponowanych na błonie wewnętrznej pod kątem wiązania ze specyficznym celem. Co istotne, wykorzystanie ścieżki Tat do ekspozycji na powierzchni komórki gwarantuje, że pod kątem wiązania będą sprawdzane tylko te przeciwciała z biblioteki, które są prawidłowo sfałdowane w cytoplazmie, co pozwala na jednoczesne optymalizowanie powinowactwa wiązania i fałdowania wewnątrzkomórkowego. W niniejszym protokole opisujemy sposób ekspozycji biblioteki scFv na wewnętrznej błonie E. coli, przeprowadzanie selekcji wstępnej (panning) biblioteki przeciwko antygenowi docelowemu oraz wykonywanie drugiego etapu przesiewania w celu zidentyfikowania najbardziej obiecujących składników biblioteki. Choć w protokole skupiamy się na scFv, metoda ta może zostać zastosowana do projektowania każdego białka, którego zastosowanie wymaga wiązania i prawidłowego fałdowania wewnątrzkomórkowego.
<img alt="Schemat ścieżki Tat; transport białek do periplazmy; ekspozycja periplazmatyczna; detekcja substratu." src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ekspozycja na wewnętrznej błonie za pomocą systemu Tat. W E. coli przeciwciała scFv, które są ekspresjonowane jako białka fuzyjne z sekwencją sygnałową ssTorA i prawidłowo sfałdowane w cytoplazmie, są transportowane przez błonę wewnętrzną. Tworzy się kompleks pośredni translokacji, w którym scFv są zakotwiczone w błonie wewnętrznej z końcem N-terminalnym w cytoplazmie, a końcem C-terminalnym w periplazmie. Zewnętrzna błona E. coli jest trawiona enzymatycznie w celu otrzymania sferoplastów, co eksponuje zakotwiczone przeciwciała na przestrzeń zewnątrzkomórkową i umożliwia ich detekcję przy użyciu przeciwciała wiążącego się z epitopowym znacznikiem fuzyjnym na końcu C-terminalnym eksponowanego przeciwciała. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Biblioteka scFv</td><td>Różni się</td><td></td><td>Odpowiednią bibliotekę scFv należy uzyskać ze źródła komercyjnego lub akademickiego.</td></tr><tr><td>MC4100 E. coli</td><td>komórki Coli Genetic Stock Center</td><td>6152</td><td>Komórki muszą być kompetentne chemicznie lub elektrokompetentne, w zależności od wybranej metody transformacji.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco odwodnione podłoże hodowlane LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (detergent do lizy komórek)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3,000&nbsp; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Antygen docelowy</td><td>Różni się</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oczyszczony antygen docelowy można zakupić lub wyprodukować/oczyścić.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Dynamag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>Startery do PCR</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Sekwencje starterów są zgodne z opisem w protokole.</td></tr><tr><td>10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td> Kinaza wielonukleotydowa <td></td></tr><tr><td>T4 (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Upewnij się, że bufor ligazy T4 stosowany w reakcji fosforylacji startera zawiera 1 mM ATP.&nbsp;</td></tr><tr><td>5x pakiet buforowy Phusion HF</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP), po 10 mM każdy dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>Inne polimerazy o wysokiej wierności mogą być stosowane jako alternatywa, ale temperatura wyżarzania w Tabela 3 musi zostać dostosowana.</td></tr><tr><td>Termocykler C1000 Touch z podwójnym modułem szybkiej reakcji 48/48</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV i system czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S Mikrodializa</td><td></td></tr><tr><td> filtr membranowy</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórek polistyrenowych z okrągłym dnem</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki do ogólnych płytek do oznaczania polistyrenu Costar</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikromiareczkowania</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 well EIA/RIA Easy Wash przezroczysta mikropłytka z płaskiego polistyrenu o wysokim poziomie wiązania</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter z poliwęglanu 96-dołkowe narzędzie do replikowania</td><td>Bel-Art Produkty</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Błyskawiczne beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik PopCulture (skoncentrowany detergent do lizy komórek)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało ANTI-FLAG M2-peroksydazy (HRP) wytwarzane u myszy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4), 10&nbsp; Roztwór N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap folia aluminiowa</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy BioTek Epoch</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Przeciwciała zaprojektowane do funkcji wewnątrzkomórkowych muszą nie tylko wykazywać powinowactwo do docelowego antygenu, ale muszą być również rozpuszczalne i prawidłowo złożone w cytoplazmie. Powszechnie stosowane metody wyświetlania i badań przesiewowych bibliotek rekombinowanych przeciwciał nie obejmują kontroli jakości fałdowania białek wewnątrzkomórkowych, a zatem zdolność wiązania antygenu oraz fałdowanie cytoplazmatyczne i rozpuszczalność przeciwciał zaprojektowanych przy użyciu tych metod często muszą być projektowane oddzielnie. W tym miejscu opisujemy protokół badania przesiewowego rekombinowanej biblioteki przeciwciał przeciwko jednołańcuchowym zmiennym fragmentom (scFv) pod kątem jednoczesnego wiązania antygenu i prawidłowego fałdowania cytoplazmatycznego. Metoda wykorzystuje wewnętrzny wewnątrzkomórkowy mechanizm kontroli jakości fałdowania szlaku translokacji podwójnej argininy (Tat) Escherichia coli w celu wyświetlenia biblioteki scFv na wewnętrznej błonie E. coli. Szlak Tat zapewnia, że tylko rozpuszczalne, dobrze pofałdowane białka są transportowane z cytoplazmy i wyświetlane na błonie wewnętrznej, eliminując w ten sposób słabo pofałdowane scFv przed badaniem w celu wiązania antygenu. Po usunięciu błony zewnętrznej, scFv wyświetlane na błonie wewnętrznej są przesuwane w stosunku do docelowego antygenu unieruchomionego na kulkach magnetycznych w celu wyizolowania scFv, które wiążą się z docelowym antygenem. Wtórne badanie przesiewowe oparte na teście immunoenzymatycznym (ELISA) służy do identyfikacji najbardziej obiecujących scFv w celu dodatkowej charakterystyki. Wiązanie antygenu i rozpuszczalność cytoplazmatyczną można poprawić dzięki kolejnym rundom mutagenezy i badaniom przesiewowym w celu uzyskania przeciwciał o wysokim powinowactwie i wysokiej rozpuszczalności cytoplazmatycznej do zastosowań wewnątrzkomórkowych.

Wewnątrzkomórkowy mechanizm kontroli jakości fałdowania białek w szlaku Tat w E. coli ogranicza transport przez wewnętrzną błonę komórkową do białek, które są prawidłowo sfałdowane w redukującym środowisku cytoplazmy. Poprzez nadekspresję fuzji scFv z sekwencją sygnałową ssTorA (sekwencją sygnałową białka TorA, które jest naturalnie transportowane szlakiem Tat20), translokacja zostaje zatrzymana, co skutkuje prezentacją scFv na błonie wewnętrznej19. Po enzymatycznym rozbiciu błony zewnętrznej, prezentowane przeciwciała stają się dostępne do przesiewania pod kątem aktywności wiązania antygenu. Możliwość wykorzystania szlaku Tat do prezentacji scFv została wykazana przez Karlsson et al.19 (Rysunek 6). Przeciwciała scFv scFv13 i scFv13.R4 zostały połączone albo z natywną sekwencją ssTorA, albo z modyfikowaną sekwencją ssTorA, w której brakuje pary reszt arginina-arginina rozpoznawanej przez szlak Tat. scFv13.R4 zostało zaprojektowane przez Martineau et al. na podstawie scFv13 poprzez cztery rundy ewolucji ukierunkowanej i wiadomo, że dobrze fałduje się w cytoplazmie9. To scFv było prezentowane na błonie wewnętrznej, ale tylko wtedy, gdy było ekspresyjne jako fuzja z natywną sekwencją sygnałową ssTorA (Rysunek 6). Przeciwnie, scFv13 nie fałduje się prawidłowo w cytoplazmie9, w związku z czym nie jest dobrze prezentowane na błonie wewnętrznej, niezależnie od sekwencji sygnałowej, z którą jest połączone. Dodatkowo, jeśli scFv były ekspresowane w komórkach pozbawionych białka TatC, kluczowego komponentu aparatu Tat20,28, nie zaobserwowano prezentacji, co wskazuje na istotny związek między prezentacją na błonie wewnętrznej a szlakiem Tat. Wyniki te dowodzą, że tylko białka zawierające peptyd sygnałowy Tat i prawidłowo sfałdowane w cytoplazmie są prezentowane na błonie wewnętrznej, co pozwala transportowi przez szlak Tat pełnić funkcję przesiewania pod kątem fałdowania wewnątrzkomórkowego.
<img alt="Wykres analizy danych z cytometrii przepływowej; intensywność fluorescencji w funkcji liczby zdarzeń dla ekspresji białek." src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Detekcja ekspozycji scFv na błonie wewnętrznej. Przeprowadzono analizę cytometrią przepływową w celu wykrycia ekspozycji słabo sfałdowanego scFv13 oraz dobrze sfałdowanego scFv13.R4 na błonie wewnętrznej. scFv zostały połączone z natywnym ssTorA lub ssTorA(KK), w którym para Arg-Arg w sekwencji ssTorA została zastąpiona sekwencją Lys-Lys. C-końcowe znaczniki epitopu FLAG na scFv wykryto za pomocą przeciwciała anty-FLAG sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Jako kontrole przetestowano komórki pozbawione białka TatC (ΔtatC) oraz ssTorA-scFv13 bez znacznika FLAG. M oznacza medianową wartość fluorescencji. Przedruk z referencji 19 za zgodą autora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Prezentacja na wewnętrznej błonie może skutecznie izolować przeciwciała scFv o wysokim powinowactwie do białka docelowego i wysokiej rozpuszczalności w cytoplazmie. Dodatkowo kolejne rundy ewolucji sterowanej z wykorzystaniem prezentacji na wewnętrznej błonie poprawiają charakterystykę przeciwciał19. Aby to zademonstrować, bibliotekę PCR podatną na błędy, opartą na scFv13 wykazującym niskie powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy, poddano panningowi przeciwko antygenowi docelowemu, jakim jest β-galaktozydaza, stosując metodę prezentacji i panningu opisaną w protokole. Po jednej rundzie mutagenezy i panningu wyizolowano scFv 1-4, które wykazywało wyższe powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy niż scFv13 (Rysunek 7A) oraz wyższy poziom rozpuszczalności w cytoplazmie (Rysunek 7B).
Nową bibliotekę, opartą na scFv 1-4, stworzono przy użyciu PCR podatnej na błędy (error-prone PCR), a panning tej biblioteki drugiej generacji przeciwko β-galaktozydazie przeprowadzono z zastosowaniem modyfikacji opisanego protokołu. Panning przeciwko β-galaktozydazie w drugiej rundzie ewolucji przeprowadzono w obecności oczyszczonego, rozpuszczalnego scFv 14 jako konkurenta, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wyizolowania klonów o wyższym powinowactwie niż scFv 1-4. Po tej drugiej rundzie mutagenezy i panningu, za pomocą drugiego etapu przesiewania opartego na metodzie ELISA, wyizolowano scFv 2-1 oraz scFv 2-3. Te scFv wykazały nie tylko wyższe powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy niż scFv13, ale także lepsze wiązanie niż klon z pierwszej rundy, scFv 1-4. scFv 2-1 wykazało wiązanie β-galaktozydazy porównywalne z wiązaniem scFv13.R4 (Ryc. 7A). scFv 2-3 wykazuje również dalszy wzrost rozpuszczalności cytoplazmatycznej w porównaniu do scFv 14, co podkreśla jednoczesną inżynierię rozpuszczalności i wiązania antygenu. Ponieważ powinowactwo i rozpuszczalna ekspresja scFv są przesiewane jednocześnie, możliwe jest, że wybrany scFv posiada umiarkowaną rozpuszczalność, ale wysokie wiązanie lub odwrotnie. Na przykład scFv 2-1 ma niższą ekspresję rozpuszczalną niż scFv 2-3, ale wykazuje wyższe powinowactwo wiązania do β-galaktozydazy.
<img alt="Wykres ELISA i wynik żelu białkowego; stężenie wiązania scFv; analiza frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej." src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Wiązanie z celem i ekspresja cytoplazmatyczna wariantów scFv wyizolowanych za pomocą prezentacji w wewnętrznej błonie. (A) Fragmenty scFv były ekspresjonowane w cytoplazmie komórek E. coli (np. bez sekwencji sygnałowej ssTorA) z tagiem heksahistydynowym (6×-His) i oczyszczane przy użyciu kolumn wirowych z kwasem niklowo-nitrylotrioctowym. Wiązanie oczyszczonych scFv do β-galaktozydazy mierzono za pomocą testu ELISA. Oczyszczone scFv naniesiono na płytki ELISA powlekane β-galaktozydazą, a związane scFv wykryto za pomocą przeciwciała anty-6×-His. Dane stanowią średnią z sześciu powtórzeń, a słupki błędów wskazują standardowy błąd średniej. (B) Frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne lizatów komórkowych z komórek ekspresjonujących scFv w cytoplazmie analizowano metodą Western blot z użyciem przeciwciała anty-6×-His. Całkowite stężenie białka wykorzystano do normalizacji ilości naniesionych próbek. Przedrukowano (A) i zaadaptowano (B) z publikacji 19 za zgodą autorów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie kontroli jakości fałdowania w szlaku translokacji dwuargininowej do jednoczesnego projektowania wiązania fragmentów przeciwciał oraz ich fałdowania wewnątrzkomórkowego, co znajdzie zastosowanie w tworzeniu przeciwciał funkcjonujących wewnątrz komórek. Metoda ta może pomóc w pokonaniu kluczowych wyzwań w dziedzinie inżynierii przeciwciał, takich jak trudności w projektowaniu przeciwciał, które prawidłowo fałdują i funkcjonują w redukującym środowisku cytoplazmatycznym. Wyświetlane i analizowane pod kątem wiązania są wyłącznie te przeciwciała, które prawidłowo fałdują w cytoplazmie.Zapewnia to przewagę nad metodami displayu na drożdżach i fagach, które w celu prezentacji polegają na szlakach wydzielniczych. Zastosowania tej techniki obejmują terapię chorób neurodegeneracyjnych, nowotworów oraz infekcji wirusowych, ponieważ choroby te wiążą się z wewnątrzkomórkową patogenezą, która może być celem przeciwciał. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ zrozumienie sposobu generowania sferoplastów i pracy z nimi jest dużym wyzwaniem.Po połączeniu biblioteki scFv z sekwencją sygnałową ssTorA i hodowli w temperaturze 37 °C przy mieszaniu przez trzy godziny, należy przeprowadzić ekspresję biblioteki scFv w temperaturze 20 °C i przy 225 rpm przez noc, od 15 do 22 godzin. Po inkubacji należy użyć spektrofotometru do pomiaru gęstości optycznej przy 600 nm. Następnie obliczoną objętość indukowanej hodowli należy odwirować w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml przy 12 000 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Usunąć nadosad i użyć 100 µL schłodzonego w lodzie buforu do frakcjonowania lub fB do resuspensji osadów. Następnie odwirować próbki z prędkością 12 000 ×g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po usunięciu nadosadu użyć 350 µL schłodzonego w lodzie fB uzupełnionego o 3,5 µL lizozymu o stężeniu 10 mg/mL do resuspensji osadów.Następnie, powoli mieszając zawartość probówek w wirówce typu vortex, dodaj kroplowo 700 µL 1 mM EDTA, a następnie inkubuj probówki na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu wymieszania próbek. Zdejmij probówki z rotatora. Do każdej probówki dodaj 50 µL lodowatego 0,5 M MgCl2 i inkubuj je w lodzie przez 10 minut.Następnie odwiruj próbki przy 11 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Teraz, za pomocą mikropipety z końcówką o pojemności jednego mililitra, powoli pobierz część osadu. Następnie, trzymając probówkę pod kątem tak, aby otwór znajdował się bezpośrednio nad nową probówką o pojemności 1,5 mililitra, powoli wyjmij końcówkę pipety znad supernatantu i przesuń osad do nowej probówki.Po usunięciu nadmiaru supernatantu, użyj jednego mililitra lodowatego PBS, aby resuspender sferoplasty. Sferoplasty muszą zostać całkowicie resuspenderowane przed panningiem, ponieważ nie wiążące się scFv obecne w agregatach doprowadzą do uzyskania wyników fałszywie dodatnich podczas panningu. Po biotynylacji antygenu docelowego zgodnie z protokołem tekstowym, resuspender kulki magnetyczne powlekane streptawidyną w ich oryginalnej fiolce.Następnie przenieś od 7 do 10 × 10⁹ kulek do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę z kulkami na statywie magnetycznym na dwie minuty, aby zebrać kulki przy ściance probówki, a następnie ostrożnie odpipetuj i usuń nadsącz. Zdejmij probówkę z magnesu i użyj PBS, aby resuspendować kulki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Następnie należy ponownie umieścić probówkę na magnesie i usunąć bufor, a następnie dwukrotnie przemyć kuleczki w PBS. Do kuleczek należy dodać 1 mL lizatu zawierającego biotynylowany antygen i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy delikatnym obracaniu. Po inkubacji kuleczki należy pięciokrotnie przemyć w PBS z 1% BSA.Następnie należy użyć PBS z 1% BSA do resuspensji kulek. Aby przeprowadzić przesiew biblioteki scFv, należy rozpocząć od dodania 4×10⁹ sferoplastów oraz 8×10⁸ kulek do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Należy dodać 1x PBS z 1% BSA, aby uzyskać całkowitą objętość 4 ml.Następnie podziel roztwór na cztery probówki o pojemności 1,5 ml, wlewając do każdej po 1 ml i inkubuj reakcje w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu przez pięć godzin. Aby przygotować sferoplasty związane z kuleczkami do PCR, umieść probówki z reakcją panningu na magnesie na trzy minuty. Odlej nadsącz i przemyj kuleczki czterokrotnie roztworem 1x PBS z 1%BSA, analogicznie jak poprzednio.Następnie użyj 25 µL ddH20 na probówkę, aby resuspender kuleczki. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przeprowadź PCR całego plazmidu w celu amplifikacji genów dla scFv związanych z kuleczkami, a następnie zrekularyzuj plazmid z produktu PCR. Przenieś całą reakcję do komórek MC4100 o zrównoważonej wydajności zgodnie z protokołem tekstowym.Aby zidentyfikować klony za pomocą testu ELISA, rozmrozić jedną probówkę przesianej subbiblioteki i wysiać na płytki agarowe LB. Do każdego dołka okrągłodennej 96-dołkowej płytki hodowlanej dodać 200 µL pożywki LB z dodatkiem 20 µg/mL chloramfenikolu. Za pomocą końcówki pipety pobrać pojedynczą kolonię z płytki agarowej.Następnie umieść końcówkę w pierwszej studzience płytki 96-dołkowej i delikatnie wymieszaj, aby zaszczepić kulturę. Kontynuuj szczepienie pojedynczych kolonii do pozostałych studzienek. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 do 24 godzin na wstrząsarce do mikropłytek.Po przygotowaniu roztworu do powlekania antygenu docelowego zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 50 µL roztworu do każdego dołka 96-dołkowej, wysokowiążącej, przezroczystej polistyrenowej płytki ELISA. Płytki inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie należy przenieść kolonie z 96-dołkowych płytek hodowlanych na płytki agarowe zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie należy wylać roztwór powlekający z płytek ELISA i dodać 100 µL roztworu blokującego, przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym, do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc. Do każdej studzienki płytki hodowlanej z okrągłym dnem dodać 20 µL skoncentrowanego detergentu do lizy komórek i inkubować płytkę hodowlaną na wstrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut.Wylać roztwór blokujący z płytek ELISA i przemyć dołki czterokrotnie 200 µL buforu do mycia przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym. Po usunięciu ostatniej porcji buforu, przenieść 50 µL z każdego dołka płytki do lizy komórek do odpowiadającego mu dołka na płytce ELISA. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej od jednej do dwóch godzin.Następnie opróżnij płytkę ELISA z próbek i przemyj studnie cztery razy. Po tym przygotuj roztwór przeciwciał do wykrywania scFv zgodnie z protokołem tekstowym. Dodaj 50 µL przeciwciał do każdej studni i inkubuj od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.Płytki ELISA należy przemyć czterokrotnie buforem do mycia przed dodaniem 200 µl na dołek substratu HRP przygotowanego zgodnie z protokołem producenta. Płytki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej od 30 do 60 minut. Aby zatrzymać reakcję, do każdego dołka należy dodać 50 µl trzy molarnego H2SO4 i delikatnie wymieszać roztwór za pomocą pipety.Na koniec zmierz absorbancję za pomocą czytnika płytek przy 492 nanometrach. W tym eksperymencie przeciwciała scFv scFv13 oraz scFv13. R4 połączono albo z natywną sekwencją ssTorA, albo z zmodyfikowaną sekwencją ssTorA, która nie jest rozpoznawana przez szlak translokacji twin-arginine, nazywany również szlakiem Tat.ScFv.R4 prawidłowo się składa i jest ekspresowany na błonie wewnętrznej po połączeniu z natywnym ssTorA. ScFv13 nie składa się prawidłowo i nie jest prezentowany na błonie wewnętrznej, niezależnie od tego, z jakim sygnałowym peptydem Tat został połączony. Wyniki te wykazują, że na błonie wewnętrznej prezentowane są tylko białka zawierające peptyd sygnałowy Tat, które prawidłowo złożyły się w cytoplazmie, co pozwala na wykorzystanie szlaku Tat jako mechanizmu selekcji prawidłowego zwijania wewnątrzkomórkowego.W tym eksperymencie bibliotekę PCR podatną na błędy, opartą na scFv13 wykazującym niskie powinowactwo wiązania do beta-galaktozydazy, poddano panningowi przeciwko beta-gal. Wyizolowano scFv 1-4, który wykazał wyższe powinowactwo wiązania do beta-gal niż scFv13, a także wyższy poziom rozpuszczalności cytoplazmatycznej. Wykorzystując scFv 1-4 jako konkurenta przeciwko bibliotece scFv 1-4 drugiej generacji, wyizolowano scFv 2-1 i 2-3, które wykazały jeszcze wyższe powinowactwa wiązania do beta-gal niż scFv13 1-4, co podkreśla jednoczesną inżynierię rozpuszczalności i wiązania antygenu.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak testy ELISA z użyciem oczyszczonego lizatu, w celu weryfikacji specyficzności antygenu i określenia powinowactwa wiązania wyizolowanych klonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak przeprowadzić przesiew przeciwciał w celu wyłonienia tych wiążących interesujący antygen, wykorzystując ścieżkę Tat do ekspozycji biblioteki oraz panning na kulkach magnetycznych do wzbogacenia i izolacji binderów antygenowych. Pamiętaj, że praca z kwasem siarkowym może być niezwykle niebezpieczna i konieczne jest stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

bacterial-inner-membrane-display-for-screening-library-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Ten protokół opisuje produkcję przeciwciała terapeutycznego w systemie ekspresji ssaków. Opisane metody obejmują przygotowanie DNA wektora, stabilną transfekcję i adaptację ludzkiej linii komórkowej 293 zarodka nerki bez surowicy, stworzenie kultur na dużą skalę i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa.

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Poznaj metodę bakteryjnego wyświetlacza błony wewnętrznej do przesiewowego badania fragmentów przeciwciał w E. coli. Technika wykorzystuje szlak translokacji twin-arginine do kontroli jakości składania białek.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Przeglądaj więcej filmów