Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał
15 października 2016
Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie kontroli jakości fałdowania szlaku translokacji podwójnej argininy do inżynierii wiązania fragmentów przeciwciał i fałdowania wewnątrzkomórkowego w jednym kroku, co będzie miało zastosowanie w inżynierii przeciwciał do funkcjonowania wewnątrzkomórkowego. Metoda ta może pomóc w przezwyciężeniu kluczowych wyzwań w dziedzinie inżynierii przeciwciał, takich jak przezwyciężenie trudności w inżynierii przeciwciał w celu prawidłowego fałdowania i funkcjonowania w redukującym środowisku cytoplazmatycznym. Tylko przeciwciała, które dobrze się fałdują w cytoplazmie, są wyświetlane i testowane pod kątem wiązania.
Zapewnia to przewagę nad wyświetlaniem drożdży i fagów, które opierają się na szlakach wydzielniczych do wyświetlania. Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię chorób neurodegeneracyjnych, nowotworów i infekcji wirusowych, ponieważ choroby te obejmują patogenezę wewnątrzkomórkową, która może być celem przeciwciał. Demonstracja tej metody metodą Visal ma kluczowe znaczenie, ponieważ zrozumienie, jak generować i pracować z sferoplastami, jest trudne.
Po połączeniu biblioteki scFv z sekwencją sygnałową ssTorA i wyhodowaniu jej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez trzy godziny, pozwól na ekspresję biblioteki scFv w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 225 obr./min przez noc przez 15 do 22 godzin. Po inkubacji użyj spektrofotometru, aby zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Następnie odwiruj obliczoną objętość indukowanej kultury w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej o sile 12 000 g i temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Usunąć supernatant i użyć 100 mikrolitrów lodowatego buforu frakcjonującego lub fB do ponownego zawieszenia granulek. Następnie odwirować próbki w temperaturze 12 000 g i temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po usunięciu supernatantu należy użyć 350 mikrolitrów lodowatego fB uzupełnionego 3,5 mikrolitra po 10 miligramów na mililitr lizozymu w celu ponownego zawieszenia granulek.
Następnie, powoli wirując probówki, dodaj kroplami 700 mikrolitrów 1 milimolowego EDTA, a następnie inkubuj probówki na rotatorze probówek w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby wymieszać próbki. Wyjmij rurki z rotatora. Dodaj 50 mikrolitrów lodowatego punktu pięciomolowego MgCl2 do każdej probówki i inkubuj je na lodzie przez 10 minut.
Następnie odwirować próbki w temperaturze 11 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Teraz za pomocą mikropipety i mililitrowej końcówki powoli wyciągnij porcję granulki. Następnie, trzymając probówkę, pod kątem z otworem bezpośrednio nad nową probówką o pojemności 1,5 mililitra, powoli wyjmij końcówkę pipety z supernatantu i wsuń granulkę do nowej probówki.
Po usunięciu nadmiaru supernatantu użyj jednego mililitra lodowatego PBS do ponownego zawieszenia sferoplastów. Feroplasty muszą być całkowicie ponownie zawieszone przed panoramowaniem, ponieważ niewiążące scFv obecne w agregatach doprowadzą do wyników fałszywie dodatnich z płukania. Po biotynylacji docelowego antygenu zgodnie z protokołem tekstowym, ponownie zasmuś kulki magnetyczne pokryte streptawidyną w ich oryginalnej fiolce.
Następnie przenieś siedem do 10 razy 10 do 9. kulek do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Umieść probówkę z kulkami na stojaku magnetycznym na dwie minuty, aby zebrać kulki z boku probówki i odpipetować, aby ostrożnie usunąć supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu i użyj PBS do ponownego zawieszenia kulek bez generowania pęcherzyków.
Następnie włóż rurkę z powrotem do magnesu i usuń bufor przed dwukrotnym umyciem kulek PBS. Dodaj jeden mililitr lizatu zawierającego biotynylowany antygen do kulek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie obracając. Po inkubacji użyj PBS z 1% BSA, aby pięciokrotnie umyć koraliki.
Następnie użyj PBS z 1%BSA, aby ponownie zawiesić koraliki. Aby przesiać bibliotekę scFv, zacznij od dodania cztery razy 10 do 9. sferoplastów i osiem razy 10 do 8. kulek do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Dodaj jeden x PBS z 1% BSA, aby zwiększyć całkowitą objętość do czterech mililitrów.
Następnie podziel roztwór na cztery 1,5-mililitrowe probówki po jednym mililitrze każda i inkubuj reakcje w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie obracając przez pięć godzin. Aby przygotować sferoplasty związane z koralikami do PCR, umieść probówki reakcyjne do płukania na magnesie na trzy minuty. Usunąć supernatant i umyć kulki jednym x PBS z 1% BSA cztery razy, tak jak poprzednio.
Następnie użyj 25 mikrolitrów ddH20 na probówkę, aby ponownie zawiesić kulki. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy przeprowadzić PCR całego plazmidu w celu amplifikacji genów dla scFv związanych z kulkami, a następnie poddać recyrkularyzacji plazmid z produktu PCR. Przekształć całą reakcję w wyrównane komórki MC4100 zgodnie z protokołem tekstowym.
Aby zidentyfikować klony za pomocą testu ELISA, rozmrozić jedną probówkę z podbiblioteki z patelnią i płytkę na płytkach agarowych LB. Dodaj 200 mikrolitrów LB z 20 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu do każdej studzienki 96-dołkowej płytki hodowlanej z okrągłym dnem. Za pomocą końcówki pipety wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej.
Następnie umieść końcówkę w pierwszym dołku płytki 96-dołkowej i delikatnie wymieszaj, aby zaszczepić. Kontynuuj inokulację jednej kolonii w każdej studzience. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin na wytrząsarce do mikropłytek.
Po przygotowaniu docelowego roztworu powłoki antygenowej zgodnie z protokołem tekstowym, dodać 50 mikrolitrów roztworu do każdego dołka 96-dołkowej płytki ELISA z przezroczystego polistyrenu o wysokim poziomie wiązania. Inkubuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie powtórz kolonie z 96-dołkowych płytek hodowlanych na płytkach agarowych zgodnie z protokołem tekstowym.
Następnie opróżnij roztwór powlekający z płytek ELISA i dodaj 100 mikrolitrów roztworu blokującego przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Dodać 20 mikrolitrów skoncentrowanego detergentu do lizy komórek do każdego dołka na okrągłej płytce hodowlanej i inkubować płytkę hodowlaną na wytrząsarce do mikropłytek w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut.
Opróżnij roztwór blokujący z płytek ELISA i umyj studzienki czterokrotnie 200 mikrolitrami buforu do przemywania przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym. Po usunięciu końcowego płukania przenieś 50 mikrolitrów z każdej studzienki płytki do lizy komórek do odpowiedniego dołka płytki ELISA. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin.
Przystąpić do opróżniania próbek z płytki ELISA i czterokrotnego mycia studzienek. Następnie przygotuj roztwór przeciwciał w celu wykrycia scFvs zgodnie z protokołem tekstowym. Dodać 50 mikrolitrów przeciwciała do każdej studzienki i inkubować przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.
Umyć płytki ELISA czterokrotnie buforem do przemywania przed dodaniem 200 mikrolitrów na studzienkę substratu HRP przygotowanego zgodnie z protokołem producenta. Inkubować płytki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut. Aby ugasić reakcję, dodaj 50 mikrolitrów trzech molowych H2SO4 do każdej studzienki i delikatnie pipetuj do wymieszania roztworu.
Na koniec zmierz absorbancję za pomocą odczytu płytki przy 492 nanometrach. W tym eksperymencie przeciwciała scFv13 i scFv13. R4 zostały połączone z natywną sekwencją ssTorA lub zmodyfikowanym ssTorA, który nie jest rozpoznawany przez szlak translokacji podwójnej argininy, zwany również szlakiem Tat.ScFv.
R4 dobrze się fałduje i ulega ekspresji na błonie wewnętrznej po podaniu do natywnego ssTorA. ScFv13 nie składa się dobrze i nie jest wyświetlany na wewnętrznej membranie, niezależnie od tego, z którym peptydem sygnałowym Tat jest połączony. Wyniki te pokazują, że tylko białka, które zawierają peptyd sygnałowy Tat i są prawidłowo pofałdowane w cytoplazmie, są wyświetlane na błonie wewnętrznej, dzięki czemu szlak Tat może działać jako ekran do fałdowania wewnątrzkomórkowego.
W tym eksperymencie podatna na błędy biblioteka PCR oparta na scFv13, która ma niski poziom powinowactwa wiązania do beta-galaktozydazy, została przetasowana przeciwko beta-gal. ScFv 1-4 został wyizolowany i wykazywał wyższe powinowactwo wiązania do beta-gal niż scFv13, a także wyższy poziom rozpuszczalności cytoplazmatycznej. Wykorzystując scFv 1-4 jako konkurenta wobec biblioteki scFv 1-4 drugiej generacji, scFv 2-1 i 2-3 zostały wyizolowane i wykazały jeszcze wyższe powinowactwo wiązania do beta-gal niż scFv13 1-4, podkreślając jednoczesną inżynierię rozpuszczalności i wiązania antygenu.
Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA z użyciem oczyszczonego lizatu, w celu zweryfikowania swoistości antygenu i określenia powinowactwa wiązania izolowanych klonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak przeprowadzić badanie przesiewowe przeciwciała, aby działało pod kątem wiązania z interesującym nas antygenem, używając ścieżki Tat do wyświetlenia tej biblioteki i magnetycznego przesuwania kulek w celu wzbogacenia i wyizolowania spoiw antygenu. Nie zapominaj, że praca z kwasem siarkowym może być niezwykle niebezpieczna i konieczne jest noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę przesiewania fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności z wykorzystaniem szlaku translokacji twin-arginine w Escherichia coli. Technika ta wykorzystuje kontrolę jakości fałdowania białek w ramach tego szlaku, co umożliwia efektywną wewnątrzkomórkową inżynierię przeciwciał.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Inżynieria białek
Wstęp
- Inżynieria przeciwciał mierzy się z wyzwaniami w zapewnieniu prawidłowego fałdowania w środowisku cytoplazmatycznym.
- Szlak translokacji zależny od dwóch arginin zapewnia mechanizm kontroli jakości fałdowania białek.
- Istniejące metody, takie jak display drożdżowy i fagowy, opierają się na szlakach wydzielniczych, co ogranicza ich skuteczność w zastosowaniach wewnątrzkomórkowych.
- Ta metoda może mieć potencjalne zastosowanie w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, nowotworów i infekcji wirusowych.
Cel badania
- Opracowanie metody jednoczesnego screeningu fragmentów przeciwciał pod kątem wiązania i rozpuszczalności.
- Usprawnienie inżynierii przeciwciał przeznaczonych do funkcji wewnątrzkomórkowych.
- Rozwiązanie problemów związanych z fałdowaniem przeciwciał w redukującym środowisku cytoplazmatycznym.
Zastosowane metody
- Fuzja biblioteki scFv z sekwencją sygnałową ssTorA.
- Ekspresja biblioteki w E. coli w kontrolowanych warunkach.
- Wykorzystanie biotynilowanych antygenów docelowych i magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną do screeningu.
- PCR całego plazmidu w celu amplifikacji genów dla scFv związanych z kulkami.
Główne wyniki
- Skuteczna ekspresja i analiza przeciwciał, które prawidłowo zwijają się w cytoplazmie.
- Identyfikacja klonów za pomocą testu ELISA po transformacji do E. coli.
- Wykazanie efektywności metody w generowaniu funkcjonalnych przeciwciał wewnątrzkomórkowych.
- Potencjalne zastosowania w celowaniu w wewnątrzkomórkowe mechanizmy patogenezy.
Wnioski
- Metoda ta stanowi nowatorskie podejście do inżynierii przeciwciał.
- Pozwala ona pokonać istotne wyzwania w tej dziedzinie, zapewniając prawidłowe fałdowanie i funkcję.
- Technika ta może przyczynić się do postępów w terapiach różnych chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda rozwiązuje krytyczny problem w inżynierii przeciwciał wewnątrzkomórkowych poprzez zintegrowanie kontroli jakości fałdowania cytoplazmatycznego z przesiewaniem wiązania antygenu w ramach jednego procesu. Dzięki wykorzystaniu ścieżki Tat w E. coli umożliwia ona jednoczesną selekcję pod kątem rozpuszczalności i powinowactwa do celu, ograniczając potrzebę przeprowadzania sekwencyjnych cykli optymalizacji. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów dla celów wewnątrzkomórkowych istotnych w chorobach neurodegeneracyjnych, nowotworach oraz infekcjach wirusowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmanaceutyków
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację scFv, które są jednocześnie rozpuszczalne w cytoplazmie i zdolne do wiązania antygenu.
- Wartość operacyjna: Redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z błędnie sfałdowanych fragmentów, wykorzystując ścieżkę Tat jako wbudowany filtr fałdowania przed etapem panningu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie, że tylko prawidłowo sfałdowane przeciwciała przechodzą do kolejnych etapów, co zwiększa pewność co do ich funkcjonalności wewnątrzkomórkowej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wygenerowanie wstępnie zwalidowanej biblioteki scFv eksponowanych na sferoplastach o potwierdzonej rozpuszczalności cytoplazmatycznej, co usprawnia późniejszy panning przeciwko unieruchomionym antygenom.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki ekspozycji poprzez kontrolowaną ekspresję w 20°C oraz izolację z wykorzystaniem kulek magnetycznych, co poprawia powtarzalność kolejnych rund przesiewania.
- Gotowość do analizy: Przygotowuje scFv związane z kuleczkami do odzyskiwania metodą PCR i wtórnego przesiewania za pomocą testu ELISA, umożliwiając ilościowe rankingowanie powinowactwa wyizolowanych klonów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od fazy odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez uzyskanie fragmentów scFv o potwierdzonej rozpuszczalności cytoplazmatycznej i zdolności wiązania antygenów, co jest kluczowe dla oddziaływania z celami wewnątrzkomórkowymi.
- Znaczenie dla chorób: Bezpośrednio zastosowalne w przypadku celów zaangażowanych w patogenezę wewnątrzkomórkową, takich jak cele w chorobach neurodegeneracyjnych, nowotworach i infekcjach wirusowych, zgodnie z treścią źródła.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia iteracyjną mutogenezę i screening w celu poprawy zarówno powinowactwa, jak i rozpuszczalności, co wspiera optymalizację wiodących związków przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka niepowodzenia projektu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, w szczególności wspierając identyfikację wiodących kandydatów poprzez generowanie rozpuszczalnych, zdolnych do wiązania fragmentów przeciwciał przed przeprowadzeniem obszernych charakterystyk przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotezy, że rozpuszczalność cytoplazmatyczna i wiązanie antygenu mogą być współwybiórczo selekcjonowane przy użyciu naturalnej ścieżki fałdowania, co pozwala określić wykonalność oddziaływania z celem.
- Przesiewanie: Uzyskanie sferoplastów gotowych do analizy, wykazujących jedynie zfałdowane scFv zależne od Tat, co umożliwia powtarzalny panning przeciwko antygenom unieruchomionym na kuletkach magnetycznych.
- Analityka: Wykorzystanie pomiarów absorbancji w teście ELISA przy 492 nm do ilościowego określenia sygnałów wiązania, co pozwala na porównanie wzbogacenia scFv w kolejnych rundach.
- Badania translacyjne: Promowanie kandydatów z podwójną optymalizacją rozpuszczalności i powinowactwa, co odpowiada potrzebom przedklinicznym w zakresie wewnątrzkomórkowych leków biologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie platformy do powtarzalnego przesiewania bibliotek, w której zwalidowane procedury przygotowania sferoplastów i panningu mogą być stosowane dla różnych celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez eliminację błędnie sfałdowanych fragmentów scFv przed oceną wiązania, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji generowania sferoplastów, obsługi kulek magnetycznych oraz etapów detekcji metodą ELISA.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go poprzez dostarczanie kandydatów z uprzednio zweryfikowanym potencjałem sfałdowania wewnątrzkomórkowego, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na przeciwciała w oparciu o podwójną funkcjonalność z uwzględnieniem ryzyka, co wspiera efektywne kapitałowo postępy w badaniach.
Wskazówki dotyczące wdrażania
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie hodowli bakterii, generowania sferoplastów oraz metod detekcji bez użycia fluorescencji, takich jak ELISA.
- Zależne od dostępu do wirówek, rotatorów do probówek, statywów magnetycznych oraz czytników płytek do pomiaru absorbancji przy 492 nm.
- Wymaga standaryzacji buforów lizujących, blokujących i płuczących pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnych sygnałów ELISA.
- Adaptacja do alternatywnych antygenów wymaga biotynylacji i sprzęgania z kuleczkami streptawidynowymi, wraz z optymalizacją warunków panningu (np. temperatury, czasu rotacji).
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność usunięcia błony zewnętrznej w celu uzyskania dostępu do scFv eksponowanych na błonie wewnętrznej oraz zależność od kompatybilności ścieżki Tat z fuzjami ssTorA.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Express scFv Library and Prepare Spheroplasts
3:46
Immobilize Target Antigen onto Magnetic Beads
5:05
Screen scFv Library
6:32
Identify Clones in Secondary Screen Using ELISA
9:51
Results: scFv Antibody Library Screening Using the E. coli Twin-arginine Translocation Pathway
11:39
Conclusion
