Skuteczne zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96

Ogólnym celem tego protokołu jest skuteczne zarodnikowanie pączkujących drożdży w formacie 96-dołkowym. Chociaż przeprowadzono wiele badań przesiewowych na dużą skalę na pączkujących drożdżach, wysokoprzepustowe badania dotyczące mejozy i zarodnikowania były ograniczone. Technika opisana w tym filmie ma tę zaletę, że zarodnikowanie drożdży jest skuteczne i opłacalne w formacie 96-dołkowym, kompatybilnym z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, ponieważ chciałem użyć kafelkowej biblioteki plazmidów o grubości dwóch mikronów, aby przebadać pod kątem wysokich supresorów kopii mutanta, który nie mógł tworzyć ogniotrwałych zarodników. Początkowo moja wydajność zarodnikowania była słaba w formacie 96-dołkowym. Okazało się, że było to spowodowane nieodpowiednim napowietrzeniem.

Rozpocznij tę procedurę od rozmrożenia szczepu drożdży SK1 na talerzu z ekstraktem drożdżowym, peptonem, glicerolem lub YPG. Użyj sterylnego patyczka, aby zeskrobać niewielką ilość komórek z fiolki zamrażarki zawierającej bulion glicerolowy i rozprowadź ją na płytce YPG. Drożdże uprawiaj przez 12 do 16 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Następnie rozłóż drożdże z płytki YPG na płytce z dekstrozą peptonową z ekstraktem drożdżowym lub YPD dla pojedynczych okrężnic. Drożdże hoduj na talerzu YPD przez 24 do 48 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po 24 do 48 godzinach wzrostu na pożywkach stałych YPD rozpocznij 25-mililitrową hodowlę YPD, używając pojedynczej kolonii z płytki YPD.

Hoduj tę kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 220 obr./min, aż komórki osiągną OD600 od 4,0 do 7,0. Następnego dnia użyj odpowiedniej ilości komórek z kultury YPD, aby rozpocząć 125-mililitrową hodowlę w octanie peptonu z ekstraktem drożdżowym lub YPA o OD600 0,1. Hoduj kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 220 obr./min, aż OD600 osiągnie wartość od 1,3 do 1,5.

Przenieś kulturę do probówek wirówkowych i wiruj z prędkością 1800X G w wirówce stołowej przez pięć minut, aby osadzać komórki. Umyj komórki raz 0,5 objętości sterylnej, autoklawowanej wody dejonizowanej. Ponownie zakręć i wylej wodę.

Ponownie zawiesić komórki w 1X objętości pożywki zarodnikowej. Aby przygotować komórki o różnych genotypach, komórki z rozmrożonych zamrożonych zapasów na 96-dołkowej płytce są najpierw przenoszone na stałe podłoże YPG. Podpal żabkę o zębach 96, a następnie ostudź ją na chwilę na talerzu ze stałym podłożem przed dotknięciem jej do kolonii drożdży.

Drożdże uprawiać przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś komórki z pożywki stałej YPG na pożywkę YPD lub selektywną pożywkę stałą, w zależności od genotypu szczepu. YPD jest używany w tej demonstracji.

Hoduj drożdże w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż utworzą się kolonie dla każdego szczepu. Podwielokrotność 1,2 mililitra płynnego podłoża YPD do każdej studzienki płytki o głębokości 96 stopni. Przenieś komórki z pożywki stałej do pożywki płynnej.

Przykryj talerz plastikową pokrywką z prostokątnej płytki Petriego i przytrzymaj pokrywkę na miejscu za pomocą kawałka taśmy, aby zminimalizować cyrkulację powietrza. Hoduj komórki przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 220 obr./min. Następnego dnia odwirować przy 1800X G przez pięć minut.

Odlej pożywkę i dodaj 500 mikrolitrów YPA do każdej studzienki. I ponownie zawiesić granulowane komórki. Przykryj talerz plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą.

Hoduj komórki przez 15 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 220 obr./min. Aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie w celu skutecznego zarodnikowania, dodaj do każdej studzienki 96-dołkowej płytki jeden sterylny koralik ze stałego szkła o średnicy trzech milimetrów lub sterylny mieszadło magnetyczne o wymiarach pięć milimetrów na dwa milimetry. Jeśli wszystkie komórki mają ten sam genotyp, należy wprowadzić 500 mikrolitrów komórek wraz z pożywką do każdego dołka 96-dołkowej płytki.

Przykryj talerz plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą. Jeśli komórki mają różne genotypy, obracaj komórki znajdujące się w YPA w temperaturze 1800X G przez pięć minut i odlej pożywkę. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki zarodnikowej do każdej studzienki.

I ponownie zawieś granulowane komórki w pożywce zarodnikowej. Przykryj talerz plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą. W przypadku użycia szklanych kulek należy umieścić próbki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza i wstrząsnąć z prędkością 220 obr./min w celu zarodnikowania.

W przypadku korzystania z mieszadeł magnetycznych należy umieścić próbki na płytce mieszającej w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza w celu zarodnikowania. Dokładna prędkość mieszania prętów magnetycznych nie jest bardzo ważna, o ile wszystkie pręty poruszają się energicznie, a kultura jest napowietrzona. 36 godzin później pobrać próbki, aby monitorować postęp poprzez zarodnikowanie.

Pobrać sześć mikrolitrów komórek z każdej kultury zarodnikującej i dodać do 24 mikrolitrów pożywki zarodnikowej na 96-dołkowej płytce nakrywkowej. Pozostaw komórki na pięć minut przed zbadaniem ich za pomocą odwróconego mikroskopu. Reprezentatywne zarodnikowanie dwóch różnych szczepów jest pokazane na tych obrazach komórek wizualizowanych za pomocą obiektywu 63X na odwróconym mikroskopie.

Ogniotrwałe tetrady, oznaczone grotami strzał, można zobaczyć w kulturze typu dzikiego. Ale nie w kulturze zawierającej komórki delecji smk1 z niedoborem zarodników. Porównano skuteczność zarodnikowania z komórek zarodnikowanych na płytkach wielodołkowych i komórek zarodnikowanych przy użyciu większych objętości w kolbach.

Zastosowanie płytek wielodołkowych nie pozwoliło osiągnąć wysokiej wydajności, którą rutynowo obserwuje się przy stosowaniu bardziej typowego protokołu zarodnikowania w kolbach. Zarodnikowanie na płytkach wielodołkowych z odpowiednim napowietrzeniem może osiągnąć wystarczającą wydajność zarodnikowania większą niż 50%, przy czym najlepsze wyniki uzyskano przy użyciu pięciomilimetrowego mieszadła. Biorąc jednak pod uwagę wysoki koszt małych mieszadeł, wydajność uzyskana przy użyciu szklanych kulek jest porównywalna.

Chociaż zarówno pięciomilimetrowe, jak i siedmiomilimetrowe mieszadła mieszczą się w studzience 96-dołkowej płytki, użycie siedmiomilimetrowej mieszadła spowodowało słabą wydajność zarodnikowania. Siedmiomilimetrowy pręt mieszający w studni ma tendencję do interakcji z mieszadłem w sąsiedniej studzience. Zapobieganie prawidłowemu mieszaniu prętów i zapewnienie odpowiedniego napowietrzenia kultury.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie zarodnikować komórki drożdży w płynnej hodowli w formacie 96-dołkowym. Po opanowaniu proces ten można zakończyć w ciągu sześciu dni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Ta procedura może być stosowana do badań przesiewowych różnych zmutowanych szczepów, plazmidów lub inhibitorów drobnocząsteczkowych pod kątem ich wpływu na mejozę i zarodnikowanie.

Po jego opracowaniu, technika ta została wykorzystana do zbadania regulacji mejotycznego cyklu komórkowego oraz tego, jak cytokineza i mejoza są sprzężone w zarodnikowaniu u Saccharomyces cerevisiae.