Name: Skuteczne zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj efektywną metodę zarodnikowania Saccharomyces cerevisiae w formacie 96-dołkowym. Optymalizacja napowietrzenia umożliwia wysokoprzepustowe badania genetyczne drożdży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Josepha P. Healeya z University of Massachusetts Boston (L.S.H.) oraz R15 GM86805 z NIH (L.S.H.). S.M.P. jest częściowo wspierany przez Sanofi-Genzyme Fellowship na University of Massachusetts Boston.

1. Przygotowanie do zarodnikowania
Uwaga: Media opisane w tym protokole są wykonane przy użyciu standardowych receptur i metod13,17. W tabeli 1 przedstawiono skład chemiczny dla 1 litra różnych pożywek stosowanych w niniejszym protokole.
<obramowanie tabeli="1" cellpadding="0" odstępy między komórkami="0" wysokość="180" szerokość="469">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="3" />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr wysokość="15">
			<td height="15" style="wysokość:20px;"></td>
			<td style="szerokość: 55px;">Pepton Bacto</td>
			<td style="szerokość: 50px;">Ekstrakt drożdżowy</td>
			<td style="szerokość: 50px;">Agar Bacto</td>
			<td style="szerokość: 60px;">Dekstroza</td>
			<td style="szerokość: 70px;">Octan potasu</td>
			<td style="szerokość: 60px;">Glicerol</td>
			<td style="szerokość: 60px;">ddH2O</td>
		</tr>
		<tr wysokość="15">
			<td height="15" style="wysokość:20px;">Tabliczki YPG</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>10 gramów</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Pojemność 30 ml</td>
			<td>Pojemność 970 ml</td>
		</tr>
		<tr wysokość="15">
			<td height="15" style="wysokość:20px;">Tabliczki YPD</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>10 gramów</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Pojemność 1 000 ml</td>
		</tr>
		<tr wysokość="15">
			<td height="15" style="wysokość:20px;">płyn YPD</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>10 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Pojemność 1 000 ml</td>
		</tr>
		<tr wysokość="15">
			<td height="15" style="wysokość:20px;">płyn YPA</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>10 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>Pojemność 1 000 ml</td>
		</tr>
		<tr wysokość="15">
			<td style="wysokość: 20px; szerokość: 80px;">Podłoża do zarodnikowania</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 gramów</td>
			<td>-</td>
			<td>Pojemność 1 000 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Formuły podłoży. Ilości podane są dla 1 l podłoża. Szczegółowe informacje na temat składników podłoża można znaleźć w tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Jeśli wszystkie komórki zarodnikujące będą miały ten sam genotyp, postępuj zgodnie z tą procedurą:
	<ol>
		<li>Rozmrozić drożdże i użyć ich na talerzu YPG (YPGlycerol). Drożdże należy hodować przez 12-16 godzin w temperaturze 30 °C. Co ważne, komórki SK1 są również gotowe do zarodnikowania, więc szczepy SK1 nie powinny być pozostawiane zbyt długo na płytkach YPG, ponieważ mogą one zarodnikować na płytce. 
		Uwaga: Preferowany jest świeżo rozmrożony szczep wyhodowany na YPG, ponieważ wykorzystanie glicerolu jako źródła węgla wymaga fosforylacji oksydacyjnej, a tym samym selekcji komórek, które mają funkcjonalne mitochondrialne DNA. Komórki SK1 mają tendencję do utraty funkcjonalnego mitochondrialnego DNA i stają się drobne. Do zarodnikowania potrzebne jest funkcjonalne mitochondrialne DNA.</li>
		<li>Przenieś drożdże z płytki YPG na płytkę YPD (YPDextrose) dla pojedynczych kolonii. Drożdże uprawiać na talerzu YPD 24-28 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Po około 36-48 godzinach wzrostu na pożywce stałej YPD, rozpocznij 25 ml kultury YPD, używając pojedynczej kolonii z płytki YPD. Hoduj tę kulturę, aż komórki osiągną okołoOD 600 = 4,0 do 7,0. Wykonać ten krok w temperaturze 30 °C przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.</li>
		<li>Z hodowli YPD użyj odpowiedniej ilości komórek, aby rozpocząć 1,000 ml kultury YPA (YPAcetate), która wynosiOD 600 = 0,1 na każdą 96-dołkową płytkę potrzebną w sekcji 2. Drożdże hodować w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 °C (wytrząsanie przy 220 obr./min) do momentu, gdy poziom OD600 kultury wyniesie od 1,3 do 1,5<,5 br />
		Uwaga: Zaszczepić 100 ml kultury YPA na każdą 96 płytek wielodołkowych, które mają być poddane badaniom przesiewowym w sekcji 2. Na przykład, w przypadku badań przesiewowych czterech 96 płytek wielodołkowych, potrzebne będzie 400 ml kultury YPA. Począwszy od 10% dodatkowej objętości w kulturze YPA, konieczne jest zabezpieczenie przed utratą objętości parowania. Zazwyczaj potrzeba od 12 do 16 godzin, aby ogniwa osiągnęły odpowiedni OD600; Czas ten może się różnić w zależności od genotypu szczepu drożdży. YPA jest pożywką presporulacyjną. Wstępny wzrost octanu pomaga indukować ekspresję genów (takich jak IME1) potrzebnych do wydajnego i synchronicznego zarodnikowania6.</li>
		<li>Wirować przy 1,800 x g w wirówce stołowej przez 5 minut, aby osadzać komórki wyhodowane w YPA. Umyj komórki 1x 0,5 objętości sterylnej autoklawowanej wody dejonizowanej. Ponownie zakręć i wyrzuć pranie. Ponownie zawiesić komórki w pożywce zarodnikowej o objętości 1x. Przejdź do sekcji 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku używania komórek do zarodnikowania, które są o różnych genotypach (tj. przekształcone za pomocą różnych plazmidów lub zawierających różne mutacje, zwykle uzyskiwane i przechowywane jako zamrożone zapasy), komórki o różnych genotypach należy ułożyć w formacie 96 wielodołkowym. Następnie postępuj zgodnie z tą procedurą:
	<ol>
		<li>Użyj sterylnej żabki z 96 bolcami, aby przenieść komórki z rozmrożonych zamrożonych wywarów w 96 płytkach wielodołkowych na stałe podłoże YPG. Drożdże uprawiać przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Używając sterylnego żabki z 96 bolcami, przenieś komórki z pożywki stałej YPG na pożywkę stałą YPD lub selektywną pożywkę stałą (tj. syntetyczną pożywkę minimalną pozbawioną aminokwasów, jeśli komórki zawierają plazmidy wymagające selekcji). Drożdże należy uprawiać w temperaturze 30 °C, aż dla każdego szczepu utworzą się kolonie, zazwyczaj 1 dzień w przypadku YPD i 2 dni, jeśli konieczne jest stosowanie selektywnych pożywek.</li>
		<li>Podwielokrotność 1,2 ml pożywki płynnej YPD lub selektywnej pożywki ciekłej do każdego dołka płytki wielodołkowej o głębokości 96 ml i pojemności 2 ml. Przenieś komórki z pożywki stałej do pożywki płynnej za pomocą żabki, przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą i hoduj przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 220 obr./min. 
		Uwaga: Aby zminimalizować zanieczyszczenie, przykryj płyty za pomocą plastikowych pokrywek z prostokątnej płytki Petriego. Przytrzymaj pokrywki na miejscu za pomocą kawałka taśmy, aby cyrkulacja powietrza była minimalnie ograniczona.</li>
		<li>Odwirować płytki o masie 1 800 x g przez 5 minut, używając obrotowej wirówki kubełkowej z adapterami, aby pomieścić 96-dołkowe płytki. Odlej pożywkę z komórek; dodać 500 μl YPA do każdej studzienki i ponownie zawiesić granulowane komórki w YPA. Przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą.</li>
		<li>Hodować komórki przez 15 godzin w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, wytrząsając z prędkością 220 obr./min. Przejdź do sekcji 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Komórki zarodnikujące w formacie wielodołkowym 96
<ol>
	<li>Dodać jeden sterylny kulkę szklaną o średnicy 3 mm lub sterylny mieszadło magnetyczne o wymiarach 5 mm x 2 mm do każdej studzienki na płytce 96-dołkowej z dołkami o pojemności 1,3 ml. (Zobacz reprezentatywne wyniki poniżej, aby zapoznać się z dyskusją na temat tego, czy używać koralika, czy mieszadła.)</li>
	<li>Jeśli wszystkie komórki, które mają być poddane badaniom przesiewowym, mają ten sam genotyp, przejdź do 2.2.1. Jeżeli komórki, które mają być poddane badaniom przesiewowym, mają różne genotypy, należy przejść do sekcji 2.2.2.
	<ol>
		<li>Pobrać komórki z kroku 1.1.5 i podwielokrotność 500 μl komórek wraz z pożywką do każdego dołka na 96 płytkach wielodołkowych. Przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą. Przejdź do punktu 2.3.</li>
		<li>Wiruj komórki, które są w YPA od 1.2.4 przy 1,800 x g przez 5 minut, używając wahadłowej wirówki kubełkowej z adapterami, aby pomieścić 96-dołkowe płytki. Odlej pożywkę z komórek. Dodać 500 μl pożywki zarodnikowej do każdej studzienki i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce zarodnikowej. Przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą. Przejdź do punktu 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku użycia szklanego kulki umieścić próbki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i wstrząsnąć z prędkością 220 obr./min w celu zarodnikowania. W przypadku korzystania z mieszadła magnetycznego należy umieścić próbki na płytce mieszającej w inkubatorze o temperaturze 30 °C w celu zarodnikowania. 
	Uwaga: Dokładna prędkość mieszania mieszadła magnetycznego nie jest bardzo ważna, o ile wszystkie pręty poruszają się energicznie, a kultura jest napowietrzona.</li>
	<li>Aby monitorować postęp poprzez zarodnikowanie, pobrać próbki z kultury zarodnikującej w celu wizualizacji, dodać 6 μl komórek z kultur zarodnikujących do 24 μl pożywki zarodnikowej w 96-dołkowej płytce nakrywkowej (rozcieńczenie 1:5). Pozostaw komórki na 5 minut przed badaniem komórek za pomocą mikroskopu odwróconego. 
	Uwaga: W komórkach SK1 typu dzikiego zwarte dojrzałe zarodniki utworzą się w ciągu 36 godzin po przeniesieniu do pożywki zarodnikowej. Postęp poprzez zarodnikowanie można monitorować za pomocą mikroskopii przy użyciu markerów fluorescencyjnych, takich jak marker jądrowy (tj. Htb2-mCherry18) w celu zbadania podziału mejotycznego lub marker błony prosporowej (tj. G2019) w celu zbadania morfogenezy zarodników. Alternatywnie, tworzenie się ogniotrwałych zarodników można zaobserwować za pomocą mikroskopii Nomarski DIC, rozpoczynającej się około 12 godzin po przeniesieniu do pożywki zarodnikowej.</li>
</ol>

<ol><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+in+budding+yeast%3A+sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li>
<li>Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+meiotic+recombination+initiation%3A+general+principles+and+molecular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways.</a> Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).</li>
<li>Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+signaling+pathways+orchestrate+yeast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development.</a> Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).</li>
<li>Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+growth+and+development+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of growth and development in yeast.</a> Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparison+of+recombination+and+synaptonemal+complex+formation+during+meiosis+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae.</a> Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).</li>
<li>Liti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+domestic+and+wild+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population genomics of domestic and wild yeasts.</a> Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).</li>
<li>McCusker, J. H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sporulation+of+yeast+in+media+buffered+near+pH6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6.</a> J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).</li>
<li>Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+which+affect+the+frequency+of+sporulation+and+tetrad+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+baker%27s+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2015 (11), 1003-1008 (2015).</li>
<li>Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6rner%2C+GV+%22Cold+Spring+Harb.+Protocols%22">Cold Spring Harb. Protocols</a>. (10), 908-913 (2015).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpession+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpession screen.</a> J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).</li>
<li>Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+Closure+of+the+Prospore+Membrane+Requires+SPS1+and+SPO77+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. , (2016).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Labooratory+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPO71+mediates+prospore+membrane+size+and+maturation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).</li>
<li>Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+a+SNARE+protein+by+control+of+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization.</a> Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).</li>
<li>Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smk1p+MAP+kinase+negatively+regulates+Gsc2p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase%2C+during+spore+wall+morphogenesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy protokół zarodnikowania drożdży SK1 w formacie wielodołkowym 96. Napowietrzanie jest kluczem do wydajnego zarodnikowania, które wymaga użycia mieszadła lub szklanego koralika w każdej studzience. Kiedy komórki są zarodnikowane na 96-dołkowej płytce w inkubatorze z wytrząsaniem bez kulki lub mieszadła, komórki nie zarodnikują wydajnie. Tylko niewielki wzrost skuteczności zarodnikowania obserwuje się, gdy komórki są zarodnikowane bez kulki lub mieszadła w inkubatorze do wytrząsania, w porównaniu...

Sporulacja u pączkujących drożdży została zbadana, aby dostarczyć wglądu w wiele aspektów biologii, w tym kontrolę segregacji chromosomów podczas mejozy1, mechanizmy rekombinacji genetycznej2, kontrolę rozwoju przez sygnalizację komórkową3, kontrolę rozwoju odżywiania4, transkrypcyjną regulację rozwoju5 oraz badanie tworzenia się zarodników6. Tworzenie przetrwalników obejmuje nowe zdarzenie podziału komórki, polegające na tworzeniu nowych przedziałów błonowych w komórce macierzystej, po którym następuje osadzanie się ochronnej ściany zarodników6. Badania te, które badają komórki zarodnikujące, często wykorzystują szybko zarodnikujący szczep drożdży SK1, który może przejść proces zarodnikowania w ciągu około 24 godzin w stosunkowo wydajny sposób7,8. Chociaż optymalizacja warunków zarodnikowania dla pączkujących drożdży została opisana9-13, eksperymenty te dotyczyły zarodnikowania na pożywkach stałych lub w większych kulturach płynnych, w których zarodnikowanie przeprowadza się za pomocą probówek hodowlanych lub kolb.
Tutaj opisujemy metodę zarodnikowania drożdży w formacie 96-dołkowej płytki wielodołkowej. Stwierdziliśmy, że w przypadku tej metody napowietrzanie ma kluczowe znaczenie dla synchronicznego i wydajnego zarodnikowania i opracowaliśmy techniki zapewniające wystarczającą ilość zarodnikowania w formacie wielodołkowym o małej objętości. Zarodnikowanie w formacie 96-dołkowej płytki wielodołkowej pozwala na przesiewanie komórek przy użyciu technik o wysokiej przepustowości i odczynników zoptymalizowanych pod kątem formatu płytek wielodołkowych, takich jak badanie przesiewowe pod kątem supresorów o wysokiej liczbie kopii przy użyciu kafelkowej biblioteki14-16.

<table><tbody><tr><td>Nunc 1,3 ml Płytki DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>260251</td><td>Służy do zarodnikowania</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml Płytki DeepWell</td><td>ThermoScientific</td><td>278743</td><td>Służy do wzrostu przed zasporulacją, krok 1.2.3</td></tr><tr><td>Koralik szklany 3 mm</td><td>Fisher</td><td>11-312A</td><td>Używany do zarodnikowania</td></tr><tr><td>5 mm x 2 mm mieszadło, opakowanie 12 szt</td>. <td>Fisher</td><td>14-511-82</td><td>Używany do zarodnikowania</td></tr><tr><td>96 cóż, frogger</td><td>V& P Scientific</td><td>VP407</td><td>potrzebny do kroku 1.2</td></tr><tr><td>kopiarki bibliotecznej</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381</td><td>potrzebny do kroku 1.2; do stosowania z</td></tr><tr><td>prostokątną szalką Petriego</td> froggera <td>ThermoScientific</td><td>264728</td><td>potrzebne do kroku 1.2</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>potrzebne do podłoża</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD</td><td>212750</td><td>potrzebny do podłoża</td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>BD</td><td>212750</td><td>potrzebny do podłoża</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td>potrzebny do podłoża</td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher</td><td>P171-500</td><td>potrzebny do podłoża</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>potrzebny do podłoża</td></tr><tr><td>96-dołkowa szklana płyta dolna</td><td>MatTek</td><td>PBK96G-1.5.5-F</td><td>potrzebny do kroku 2.4</td></tr></tbody></table>

skuteczne zarodnikowanie saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Podczas stresu żywieniowego, Saccharomyces cerevisiae przechodzi gametogenezę, znaną jako sporulacja. Diploidalne komórki drożdży, które są pozbawione azotu i węgla, zainicjują proces zarodnikowania. Proces zarodnikowania obejmuje mejozę, po której następuje tworzenie zarodników, w których haploidalne jądra są pakowane w odporne na środowisko zarodniki. Opracowaliśmy metody efektywnego zarodnikowania pączkujących drożdży na 96 płytkach wielodołkowych, aby zwiększyć przepustowość badań przesiewowych komórek drożdży pod kątem fenotypów zarodnikowania. Metody te są zgodne z badaniami przesiewowymi drożdży zawierających plazmidy wymagające selekcji żywieniowej, gdy stosuje się odpowiednie minimalne pożywki, lub z badaniami przesiewowymi drożdży ze zmianami genomowymi, gdy stosuje się bogaty schemat presporulacji. Odkryliśmy, że w przypadku tej metody napowietrzanie podczas zarodnikowania ma kluczowe znaczenie dla tworzenia zarodników i opracowaliśmy techniki zapewniające wystarczające napowietrzenie, które są zgodne z formatem płytki wielodołkowej 96. Chociaż metody te nie osiągają typowego ~80% poziomu zarodnikowania, który można osiągnąć w eksperymentach opartych na kolbach o dużej objętości, metody te niezawodnie osiągną około 50-60% poziomu zarodnikowania na płytkach wielodołkowych o małej objętości.

Aby ocenić ten protokół, porównano wydajność sporulacji uzyskanych z komórek sporulujących w płytkach wielodołkowych (opisanych powyżej) z komórkami sporulującymi w większych objętościach w kolbach (Tabela 2). Zastosowanie płytek wielodołkowych nie pozwoliło na osiągnięcie tak wysokiej wydajności, jaka jest obserwowana podczas sporulacji w kolbach, gdzie rutynowo uzyskuje się wydajność na poziomie ~80%. Sporulacja w płytkach wielodołkowych przy odpowiednim napowietrzaniu ...

Tutaj zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae odbywa się w formacie 96 wielodołkowym.

Skuteczne zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest efektywne indukowanie sporulacji drożdży pączkujących w formacie 96-dołkowym. Chociaż przeprowadzono wiele szeroko zakrojonych analiz przesiewowych na drożdżach pączkujących, badania wysokoprzepustowe dotyczące mejozy i sporulacji były ograniczone. Technika opisana w tym filmie daje możliwość efektywnej sporulacji drożdży w sposób kosztowo efektywny w formacie 96-dołkowym, kompatybilnym z badaniami wysokoprzepustowymi.Pomysł na tę metodę zrodził się z chęci wykorzystania mozaikowej biblioteki plazmidów 2 µm do przesiewania wysokokopiowych supresorów mutanta, który nie był w stanie tworzyć refrakcyjnych przetrwalników. Początkowo wydajność sporulacji w formacie 96-dołkowym była niska. Ustaliłem, że przyczyną było niewystarczające napowietrzanie.Rozpocznij procedurę od rozmrożenia szczepu drożdży SK1 na płytce z agarem z ekstraktem drożdżowym, peptonem i glicerolem (YPG). Używając sterylnego patyczka, pobierz niewielką ilość komórek z fiolki z mrożonym stokiem glicerolowym i roznieś ją na płytce YPG. Hoduj drożdże przez 12 do 16 godzin w temperaturze 30 °C.Następnie przenieś drożdże z płytki YPG metodą kreskowania na płytkę z ekstraktem drożdżowym, peptoną i dekstrozą (YPD), aby uzyskać pojedyncze kolonie. Inkubuj drożdże na płytce YPD przez 24 do 48 godzin w temperaturze 30 °C. Po 24 do 48 godzinach wzrostu na stałym medium YPD, przygotuj 25 ml kultury YPD, wykorzystując pojedynczą kolonię z płytki YPD.Hoduj tę kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 220 RPM, aż komórki osiągną OD600 od 4,0 do 7,0. Następnego dnia użyj odpowiedniej ilości komórek z kultury YPD, aby zaszczepić 125 mililitrów kultury w pożywce YPA (yeast extract peptone acetate) o OD600 wynoszącym 0,1. Hoduj kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 220 RPM, aż OD600 wyniesie od 1,3 do 1,5.Przenieś hodowlę do probówek do wirowania i wiruj przy 1800X G w wirówce stołowej przez pięć minut, aby odwirować komórki w formie osadu. Przemyj komórki raz objętością 0,5 sterylnej, autoklawowanej wody dejonizowanej. Wiruj ponownie i odlej wodę.Resuspenduj komórki w objętości 1X pożywki do sporulacji. Aby przygotować komórki o różnych genotypach, komórki z rozmrożonych zapasów w 96-dołkowej płytce wielodołkowej przenosi się najpierw na stałe podłoże YPG. Wypal płomieniem 96-zębny przenośnik (frogger), a następnie schłodź go przez chwilę na płytce z podłożem stałym przed przykładaniem go do kolonii drożdży.Hodujcie drożdże przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieście komórki z podłoża stałego YPG na podłoże stałe YPD lub selektywne, w zależności od genotypu szczepu. W niniejszej demonstracji zastosowano YPD.Hodować drożdże w temperaturze 30 °C, aż dla każdego szczepu powstaną kolonie. Odmierzyć 1,2 ml płynnej pożywki YPD do każdej studni płytki 96-dołkowej o głębokich studniach. Przenieść komórki z pożywki stałej do pożywki płynnej.Przykryj płytkę plastikową pokrywką od prostokątnej płytki Petriego i przymocuj ją za pomocą kawałka taśmy, aby minimalnie ograniczyć cyrkulację powietrza. Hoduj komórki przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 220 RPM. Następnego dnia odwiruj zawiesinę przy 1800X G przez pięć minut.Odlać pożywkę i dodać 500 µL YPA do każdej studni. Następnie zawiesić osad komórkowy. Przykryć płytkę plastikową pokrywką przymocowaną taśmą.Hoduj komórki przez 15 godzin w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 220 RPM. Aby zapewnić odpowiednie napowietrzanie niezbędne do efektywnej sporulacji, dodaj do każdej studzienki płytki 96-dołkowej albo jedną sterylną szklaną kuleczkę o średnicy trzech milimetrów, albo sterylny magnesowy mieszadło o wymiarach pięciu na dwa milimetry. Jeśli wszystkie komórki mają ten sam genotyp, rozlej 500 mikrolitrów zawiesiny komórek w medium do każdej studzienki płytki 96-dołkowej.Przykryj płytkę plastikową pokrywką zabezpieczoną taśmą. Jeśli komórki mają różne genotypy, odwiruj komórki znajdujące się w YPA przy 1800X G przez pięć minut i odlej pożywkę. Do każdego dołka dodaj 500 µL pożywki do sporulacji.Następnie zawiesić osad komórkowy w pożywce do sporulacji. Przykryć płytkę plastikową pokrywką przymocowaną taśmą. W przypadku użycia kulek szklanych, umieścić próbki w inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 30 °C i wytrząsać z prędkością 220 RPM w celu indukcji sporulacji.W przypadku użycia magnetycznych mieszadełek, należy umieścić próbki na mieszadle magnetycznym wewnątrz inkubatora w temperaturze 30 °C w celu indukcji sporulacji. Dokładna prędkość obrotowa mieszadełek nie jest kluczowa, o ile wszystkie mieszadełka poruszają się energicznie, a kultura jest napowietrzana. Po 36 godzinach należy wyjąć próbki, aby monitorować postępy sporulacji.Pobrać 6 µL komórek z każdej kultury sporulującej i dodać do 24 µL pożywki do sporulacji w płytce 96-dołkowej z przykrywkami. Pozostawić komórki na pięć minut w celu ich osadzenia, a następnie zbadać je pod mikroskopem odwróconym. Reprezentatywna sporulacja dwóch różnych szczepów została przedstawiona na tych obrazach komórek wizualizowanych za pomocą obiektywu 63X pod mikroskopem odwróconym.W kulturze typu dzikiego widoczne są załamujące światło tetradami, wskazane grotami strzałek. Nie występują one jednak w kulturze zawierającej komórki z delecją smk1, które wykazują deficyt sporulacji. Przeprowadzono porównanie wydajności sporulacji komórek sporulujących w płytkach wielodobkowych oraz komórek sporulujących w większych objętościach w kolbach.Zastosowanie płytek wielodobkowych nie pozwoliło na osiągnięcie wysokiej wydajności, która jest rutynowo obserwowana przy stosowaniu typowego protokołu sporulacji w kolbach. Sporulacja w płytkach wielodobkowych z odpowiednią aeracją może pozwolić na uzyskanie wystarczającej wydajności sporulacji przekraczającej 50%, przy czym najlepsze wyniki uzyskano przy użyciu magnesów mieszających o długości pięciu milimetrów. Jednakże, biorąc pod uwagę wysoką cenę małych magnesów mieszających, wydajności uzyskane przy użyciu kulek szklanych są porównywalne.Choć zarówno mieszadła magnetyczne o długości 5 mm, jak i 7 mm mieszczą się w dołku płytki 96-dołkowej, zastosowanie mieszadła o długości 7 mm skutkowało niską wydajnością sporulacji. Mieszadło 7 mm w dołku ma tendencję do wchodzenia w interakcję z mieszadłem w sąsiednim dołku, co uniemożliwia prawidłowe mieszanie i zapewnia niewystarczające napowietrzanie hodowli.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak efektywnie przeprowadzić sporulację komórek drożdży w kulturze płynnej w formacie 96-dołkowym. Po opanowaniu techniki proces ten można ukończyć w ciągu sześciu dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Procedura ta może być wykorzystana do przesiewania różnych szczepów mutantów, plazmidów lub inhibitorów małocząsteczkowych w celu zbadania ich wpływu na mejozę i sporulację.Po opracowaniu ta technika została wykorzystana do badania regulacji cyklu komórkowego w mejozie oraz sposobu, w jaki cytokineza i mejoza są ze sobą powiązane podczas sporulacji u Saccharomyces cerevisiae.

efficient-sporulation-saccharomyces-cerevisiae-96-multiwell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikromanipulacja komórkami drożdży jest niezbędna do analizy genetycznej mejozy lub do selekcji zygot diploidalnych. Mikromanipulacje te przeprowadza się przy użyciu mikroigły mikroskopu sekcyjnego. Mikroigła służy do przenoszenia komórek i jest sterowana przez mikromanipulator, który może być dostępny w różnych stopniach automatyzacji.

Wypreparowanie woreczków Saccharomyces Cerevisiae

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Metoda Green Monster umożliwia szybkie tworzenie wielokrotnych delecji oznakowanych genem reporterowym kodującym zielone białko fluorescencyjne. Metoda ta opiera się na przeprowadzaniu szczepów drożdży przez powtarzalne cykle seksualnego sortowania delecji oraz wzbogacania komórek posiadających więcej delekcji na podstawie fluorescencji.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Tutaj prezentujemy protokół do oszacowania metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego poprzez dopasowanie wykładniczego wzrostu Saccharomyces cerevisiae do równania wzrostu wykładniczego. Obliczanie parametrów kinetycznych pozwala na badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na fermentację lub oddychanie mitochondrialne.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Poznaj efektywną metodę zarodnikowania Saccharomyces cerevisiae w formacie 96-dołkowym. Optymalizacja napowietrzenia umożliwia wysokoprzepustowe badania genetyczne drożdży.

Skuteczne zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96

Przeglądaj więcej filmów