Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym
17 września 2016
Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.
Ogólnym celem tego testu jest określenie okresu okołodobowego na liniach Arabidopsis poprzez pomiar luminescencji emitowanej przez transfekowane protoplasty. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii okołodobowej, takie jak to, które geny zasilają sam mechanizm pomiaru czasu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybką analizę okresu okołodobowego dowolnego mutanta Arabidopsis bez konieczności generowania stabilnych linii transgenicznych.
Aby rozpocząć tę procedurę, oznacz szalkę Petriego i dodaj do niej 10 mililitrów przefiltrowanego wysterylizowanego roztworu enzymu. Przymocuj cztery paski taśmy autoklawu lepką stroną do góry na czystej powierzchni laboratoryjnej i zaznacz rozmiar szalki Petriego na paskach. Zbierz plany z pokoju wzrostu.
Odetnij liście czterotygodniowych roślin i dociśnij górny naskórek do taśmy autoklawu tak, aby dolna powierzchnia naskórka była skierowana do góry. Umieść paski magicznej taśmy klejącej na dolnej powierzchni naskórka. Za pomocą stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów delikatnie dociśnij paski do liści, uważając, aby nie zmiażdżyć tkanki liścia.
Ostrożnie ściągnij taśmę, aby zdjąć dolny naskórek i odsłonić komórki mezofilu. Następnie przetnij taśmę autoklawu, aby pasowała do szalki Petriego i użyj pęsety, aby przesunąć taśmę do szalki Petriego i unieść ją na roztworze enzymu, liśćmi skierowanymi w dół. Obracaj z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce platformowej przez 60 minut, podczas których protoplasty zostaną uwolnione do roztworu.
Po 60 minutach użyj pęsety, aby usunąć i wyrzucić paski taśmy autoklawu. Używając końcówki do pipet o szerokim otworze, odpipetuj roztwór zawierający protoplasty do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować protoplasty w temperaturze 100 gee przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant, ponieważ osad jest bardzo luźny.
Dodaj 10 mililitrów roztworu W5 do protoplastów i ponownie zawijaj, delikatnie obracając probówkę. Usuń podwielokrotność protoplastów do zliczenia. Odstaw protoplasty na lodzie na 30 do 60 minut.
Gdy protoplasty są na lodzie, oceń wydajność, licząc protoplasty w hemocytometrze. Zebrać protoplasty przez odwirowanie w temperaturze 100 gee przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant ostrożnie, ponieważ osad jest bardzo luźny.
Na koniec ponownie zawiesić protoplasty w roztworze MMg do stężenia 500 000 protoplastów na mililitr. Rozpocznij procedurę transfekcji protoplastów od dodania dziesięciu mikrolitrów plazmidu reporterowego do 15-mililitrowej stożkowej probówki, a następnie 400 mikrolitrów protoplastów. Dodać jedną objętość glikolu polietylenowego lub roztworu PEG i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę 12 razy, aby transfekować protoplasty.
Inkubować przez osiem do 15 minut w temperaturze pokojowej. Protoplasty muszą być inkubowane wystarczająco długo, aby zapewnić wydajną transfekcję, ale nie za długo, ponieważ zmniejszy to ich żywotność. Następnie rozcieńczyć mieszaninę protoplastów DNA PEG czterema objętościami roztworu W5 i wymieszać, delikatnie odwracając sześć razy.
Zebrać transfekowane protoplasty przez odwirowanie przy 100 gée przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety, ponownie zachowując szczególną ostrożność, ponieważ osad jest bardzo luźny. Zawiesić protoplasty w 1 250 mikrolitrach roztworu do obrazowania.
Protoplasty powinny dość łatwo zawiesić się ponownie, co wskazuje, że są nienaruszone po transfekcji. Podaniec 200 mikrolitrów na studzienkę do sześciu powtórzonych dołków na 96-dołkowej płytce i napełnij puste studzienki roztworem W5. Uszczelnij płytkę samoprzylepną przezroczystą pokrywką odpowiednią do obrazowania luminescencyjnego.
Aby zobrazować protoplasty, przenieś 96-dołkową płytkę do dowolnego zestawu do obrazowania luminescencyjnego odpowiedniego do obrazowania roślin. Wymień pokrywkę samoprzylepną na płytce 10 do 15 minut po przeniesieniu, aby uniknąć kondensacji i różnic ciśnień między studzienkami. Rozpocznij obrazowanie.
Czytaj tabliczkę co 45 minut przez pięć dni w temperaturze pokojowej. Następnie przeanalizuj wyniki luminescencji za pomocą dowolnego oprogramowania analitycznego, na przykład oprogramowania do analizy rytmów biologicznych. Protoplasty mezofilu wyizolowane za pomocą tego protokołu są pokazane na tym obrazie w powiększeniu 200 razy.
Proplasty są rabidopsami typu dzikiego, a mutant cca1/lhy transfekowano i obrazowano w ciągłym świetle na czytniku płytkowym przez pięć dni. Zgodnie z oczekiwaniami, swobodny okres ekspresji genów kontrolowanych przez zegar jest skrócony w tym mutancie. Natomiast okres oscylacji okołodobowych w protoplastach mutanta ztl ulega wydłużeniu.
W protoplastach z nadmierną ekspresją CCA1 nie było oscylacji w ekspresji konstruktu reporterowego, ponieważ nadmierna ekspresja CCA1 prowadzi do arytmii. Ten wykres słupkowy przedstawia szacunki okresu okołodobowego na podstawie śladów luminescencji w protoplastach z mutacją typu dzikiego i zegarowego. Te okresy okołodobowe są zgodne z opublikowanymi danymi wygenerowanymi z całych roślin przy użyciu czasochłonnych podejść transgenicznych.
Podczas próby tej procedury ważne jest, aby używać zdrowych roślin i ostrożnie obchodzić się z protoplastami, ponieważ są one delikatne. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli działa prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować, transfekować i obrazować protoplasty Arabidopsis.
Techniki te można teraz zastosować do dowolnej zmutowanej linii, a nawet zmodyfikować w celu zobrazowania protoplastów innych gatunków roślin.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę oceny fenotypów okołodobowych u Arabidopsis z wykorzystaniem obrazowania luminescencyjnego protoplastów. Technika ta umożliwia szybką analizę okresów okołodobowych w różnych liniach mutantów bez konieczności tworzenia stabilnych linii transgenicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rytmów okołodobowych
- Fizjologia roślin
- Analiza genetyczna
Wprowadzenie
- Zegar okołodobowy wpływa na znaczną część transkryptomu Arabidopsis.
- Zrozumienie, które geny przyczyniają się do pomiaru czasu, jest kluczowe dla biologii rytmów okołodobowych.
- Tradycyjne metody wymagają stabilnych linii transgenicznych, których tworzenie jest czasochłonne.
- Ta nowa metoda usprawnia ten proces poprzez wykorzystanie przejściowo ekspresowanych raportorów okołodobowych.
Cel badania
- Wyznaczenie okresu okołodobowego w liniach Arabidopsis.
- Identyfikacja genów wpływających poprzez ujemne sprzężenie zwrotne na mechanizm pomiaru czasu okołodobowego.
- Opracowanie szybkiej i wydajnej metody analizy rytmów okołodobowych w liniach mutantów.
Zastosowane metody
- Izolacja protoplastów mezofila z liści Arabidopsis.
- Transfekcja protoplastów luminescencyjnym reporterem rytmów okołodobowych.
- Pomiar luminescencji w celu oceny rytmów okołodobowych.
- Analiza danych luminescencyjnych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
Główne wyniki
- Wykazano możliwość pomiaru okresów okołodobowych w różnych mutantach Arabidopsis.
- Potwierdzono, że mutant cca1/lhy wykazuje skrócony okres wolno bieżący.
- Wykazano, że mutant ztl posiada wydłużony okres oscylacji okołodobowych.
- Zwalidowano metodę w odniesieniu do tradycyjnych podejść transgenicznych.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia szybką ocenę rytmów okołodobowych u Arabidopsis.
- Można ją zastosować do dowolnej linii mutantów, co usprawnia badania nad biologią rytmów okołodobowych.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne gatunki roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie fenotypowanie funkcji zegara okołodobowego w protoplastach Arabidopsis z wykorzystaniem reporterów luminescencyjnych umożliwia przyspieszoną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju (R&D) w biologii roślin. Podejście to usprawnia ocenę wpływu perturbacji genetycznych na regulację okołodobową, zwiększając pewność predykcyjną w krytycznych momentach wczesnego etapu odkryć. Elastyczność tej metody pozwala na szerokie przesiewanie portfolio bez ograniczeń wynikających z konieczności generowania stabilnych linii transgenicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji genów w regulacji rytmów okołodobowych za pomocą przejściowych testów reporterowych.
- Ułatwia szybką biologiczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnianie mutantów o zmienionych fenotypach zegara biologicznego.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów dzięki dostarczeniu ilościowych pomiarów okresu.
- Przyspiesza selekcję projektów w portfolio poprzez umożliwienie wysokoprzepustowego przesiewu mutantów.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy oparte na protoplastach do dalszych procesów funkcjonalnej genomiki.
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne odczyty luminescencyjne do opracowywania analiz ilościowych.
- Umożliwia skalowalny screening zróżnicowanych tło genetycznych bez konieczności stabilnej transformacji.
- Wspiera niezawodną ocenę perturbacji genów w kontrolowanym środowisku.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie funkcji genów z wynikami okołodobowymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej w systemach roślinnych.
- Zmniejsza ryzyko przy wdrażaniu kandydatów poprzez potwierdzenie mechanistycznego wpływu na funkcję zegara biologicznego.
- Oferuje predykcyjne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do cech istotnych dla produktywności rolniczej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten luminescencyjny test protoplastów znajduje zastosowanie na etapie przejściowym między wczesnym odkrywaniem a identyfikacją wiodących związków, umożliwiając szybką weryfikację hipotez i przesiew funkcjonalny przed rozpoczęciem prac transgenicznych wymagających dużych nakładów zasobów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji genów w regulacji rytmu okołodobowego.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych luminescencyjnych do analizy porównawczej.
- Analityka: Generuje wyniki w postaci szeregów czasowych, odpowiednie do statystycznego szacowania okresu i klasyfikacji fenotypów.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w modelach roślinnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnych mutantów i gatunków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w fenotypowaniu.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go i poprawia efektywność kapitałową we wczesnej fazie B+R.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów genetycznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w izolacji protoplastów, transfekcji oraz obrazowaniu luminescencyjnym.
- Wymaga dostępu do czytników luminescencji do płytek oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga starannego obchodzenia się z materiałem i standaryzacji w celu zapewnienia żywotności protoplastów i jakości danych.
- Możliwość adaptacji do innych gatunków roślin po optymalizacji protokołu.
- Ograniczone przez przejściowy charakter ekspresji reportera oraz stabilność protoplastów.
