Name: Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę szybkiej analizy rytmów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis z transfekowanym luminescencyjnym reporterem. Technika ta pozwala badać okresy oscylacji bez konieczności tworzenia stabilnych linii transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Prof. Davidowi Somersowi i Dr. Jeongsik Kimowi za plazmid reporterowy lucyferazy i wstępny rozwój metody. Prof. Karen Halliday uprzejmie dostarczyła wszystkie okołodobowe linie mutantów użyte w tym badaniu. Badania te były wspierane przez granty badawcze Towarzystwa Królewskiego RS120372 i RS140275. GvO jest pracownikiem naukowym Royal Society University (UF110173).

UWAGA: W niniejszym protokole opisane odczynniki i objętości są podane w przeliczeniu na jedną testowaną linię Arabidopsis, co daje sześć powtórzeń w dołkach dla danego genotypu. Przy analizie więcej niż jednej linii należy pomnożyć ilość materiałów przez liczbę analizowanych linii. W materiale wideo Arabidopsis typu dzikiego zostanie porównany z linią mutantem zegara okołodobowego ztl (choć w dalszej części przedstawione zostaną reprezentatywne wyniki dla dodatkowych linii).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Roztwór enzymatyczny</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Celulaza</td >
			<td >0.5% (w/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pektynaza R10</td >
			<td >0.25% (w/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >D-mannitol</td >
			<td >400 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CaCl2</td >
			<td >10 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >KCl</td >
			<td >20 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Albumin surowicy bydlęcej</td >
			<td >0.1% (w/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MES, pH 5.7</td >
			<td >20 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór W5</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl</td >
			<td >150 mM </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CaCl2</td >
			<td >125 mM </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >KCl</td >
			<td >5 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MES, pH 5.7</td >
			<td >2 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Glukoza</td >
			<td >5 mM </td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór MMg</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MES, pH 5.7</td >
			<td >4 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >D-mannitol</td >
			<td >400 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MgCl2</td >
			<td >15 mM </td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór PEG</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PEG4000</td >
			<td >40% (w/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >D-mannitol</td >
			<td >200 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CaCl2</td >
			<td >100 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór do obrazowania</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór W5</td >
			<td >do objętości końcowej</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Płodowa surowica bydlęca</td >
			<td >5% (v/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Lucyferyna</td >
			<td >1.2 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Ampicylina</td >
			<td >50 mg/ml</td >
		</tr >
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista roztworów.
1. Przygotowanie materiałów i buforów
<ol>
	<li>Materiały roślinne
	<ol>
		<li>Nasiona Arabidopsis Col-0 moczyć w wodzie w probówce 1,5 ml w temperaturze 4° C w ciemności przez cztery dni. Nasiona przenieść pipetą na glebę w doniczce i przenieść do warunków długiego dnia (16 h światła, 8 h ciemności) w temperaturze 21 °C na 7 dni. Przez pierwsze trzy dni pozostawić przykrywkę na doniczce, aby zapewnić wysoką wilgotność. Przesadzić sześć siewek do nowej doniczki o wymiarach 8 cm x 13 cm x 5 cm i kontynuować hodowlę roślin w tych samych warunkach przez kolejne 21 dni. Należy dbać o to, aby gleba była stale wilgotna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plazmid reporterowy
	<ol>
		<li>Wcześniej oczyścić plazmid reporterowy CCA1pro:LUC 19 z kultury bakteryjnej, używając zestawu do izolacji DNA zgodnie z instrukcją producenta. 
		UWAGA: Do jednej transfekcji wymagane jest 20 µg plazmidu reporterowego (10 µl przy stężeniu 2 µg/µl w dH2O).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory 
	​UWAGA: Do tego protokołu potrzebnych jest pięć roztworów: roztwór enzymów, roztwór płuczący 5 (W5), roztwór mannitolowo-magnezowy (MMg), roztwór glikolu polietylenowego (PEG) oraz roztwór do obrazowania (Tabela 1). Przygotować je przed przejściem do etapu izolacji protoplastów.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml roztworu enzymów zgodnie z Tabelą 1, dodając enzymy na samym końcu, a następnie wysterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm.</li>
		<li>Przygotować pozostałe roztwory w następujących objętościach: 15 ml roztworu W5, 10 ml roztworu MMg, 1 ml roztworu PEG oraz 1,5 ml roztworu do obrazowania zgodnie z Tabelą 1. 
		UWAGA: Ważne jest, aby roztwór PEG przygotować nie mniej niż godzinę przed transfekcją, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie PEG. Roztwór do obrazowania wysterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Próbki liści roślin do procesu ekstrakcji chlorofilu; obejmuje mikroskopię oraz analizę spektroskopową." src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1: Izolacja protoplastów. Liście dorosłych roślin Arabidopsis (A) są przymocowane taśmą do autoklawowania warstwą dolną epidermy do góry (B). (C) Taśmą Magic tape delikatnie dociska się dolną warstwę epidermy za pomocą końcówki probówki stożkowej o pojemności 15 ml. (D) Taśma Magic tape jest usuwana w celu odsłonięcia komórek mezofilu (E). (F) Paski taśmy do autoklawowania z przytwierdzonymi liśćmi są umieszczone na powierzchni roztworu enzymatycznego zawierającego celulazę i pektynazę, co powoduje uwalnianie protoplastów do roztworu. (G) Po trawieniu enzymatycznym szkielety liści pozostają na taśmie do autoklawowania i są usuwane, pozostawiając protoplasty w roztworze enzymatycznym (H). (I) Ostateczne uzyskane protoplasty mezofilu (Pasek skali = 50 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Izolacja protoplastów
<ol>
	<li>Oznakować szalkę Petriego i dodać 10 ml sterylnego roztworu enzymów przefiltrowanego przez membranę.</li>
	<li>Przymocować cztery paski taśmy autoklawowej stroną klejącą do góry do czystej powierzchni laboratoryjnej i zaznaczyć na nich wymiar szalki Petriego.</li>
	<li>Wyciąć liście z 4-tygodniowych roślin (Figure 1a) i docisnąć górną epidermę do taśmy autoklawowej (tzn. tak, aby dolna powierzchnia epidermy była skierowana do góry (Figure 1b)).</li>
	<li>Delikatnie docisnąć paski taśmy przezroczystej do dolnej powierzchni epidermy, używając probówki stożkowej 15 ml. Należy uważać, aby nie zmiażdżyć tkanki liścia (Figure 1c). Ostrożnie odkleić taśmę przezroczystą, aby usunąć dolną epidermę (Figure 1d) i odsłonić komórki mezofila (Figure 1e).</li>
	<li>Przyciąć taśmę autoklawową do rozmiaru szalki Petriego, za pomocą pęsety przenieść taśmę do szalki i ułożyć ją na powierzchni roztworu enzymów (Figure 1f) liśćmi skierowanymi w dół. Inkubować na wytrząsarce platformowej przy 60 rpm przez 60 min, podczas których protoplasty zostaną uwolnione do roztworu.</li>
	<li>Za pomocą pęsety usunąć i wyrzucić paski taśmy autoklawowej (Figure 1g), a roztwór zawierający protoplasty (Figure 1h) przenieść pipetą do probówki stożkowej 50 ml. Należy użyć końcówki do pipety o szerokim otworze (np. końcówki P5000 lub końcówki P1000 z odciętym końcem).</li>
	<li>Wirować protoplasty przy 100 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz pipetą. Należy zachować ostrożność, ponieważ osad jest bardzo luźny.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu W5 do protoplastów i resuspender poprzez delikatne wirowanie probówki ruchem okrężnym.</li>
	<li>Pozostawić protoplasty na lodzie na 30-60 min. Na tym etapie ocenić wydajność, licząc protoplasty w komorze countingowej (Figure 1i).</li>
	<li> zebrać protoplasty poprzez wirowanie przy 100 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz pipetą. Należy zachować ostrożność, ponieważ osad jest bardzo luźny.</li>
	<li>Resuspender protoplasty do stężenia 5 x 105 protoplastów/ml w roztworze MMg.</li>
</ol>
3. Transfekcja protoplastów
<ol>
	<li>Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml dodać 10 µl plazmidu reporterowego (2 µg/µl).</li>
	<li>Do probówki dodać 400 µl protoplastów.</li>
	<li>Dodać taką samą objętość (410 µl) roztworu PEG i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę 12 razy, aby przeprowadzić transfekcję protoplastów.</li>
	<li>Po 8-15 min inkubacji w temperaturze pokojowej rozcieńczyć mieszaninę protoplastów, DNA i PEG czterokrotną objętością (1640 µl) roztworu W5 i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę sześć razy.</li>
	<li>Zebrać transfekowane protoplasty poprzez wirowanie przy 100 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadosad z pipety. Ponownie należy zachować ostrożność, ponieważ osad jest bardzo luźny.</li>
	<li>Resuspendować protoplasty w 1,250 µl roztworu do obrazowania.</li>
	<li>Rozdzielić po 200 µl do sześciu powtórnych studni płytki 96-dołkowej, wypełnić pozostałe puste studnie roztworem W5 i szczelnie zamknąć płytkę przezroczystą pokrywką samoprzylepną, odpowiednią do obrazowania luminescencyjnego.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Przenieś płytkę do dowolnego systemu obrazowania luminescencyjnego odpowiedniego do obrazowania roślin. Wymień przylepne pokrywy płytek 10-15 min po przeniesieniu, aby uniknąć kondensacji i różnic ciśnienia między studziami, a następnie rozpocznij obrazowanie. Odczytuj płytkę co ok. 45 min (3 s na studzie) przez pięć dni w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Częstotliwość odczytów płytki oraz czas odczytu na jedno studio mogą się różnić w zależności od zastosowanego systemu obrazowania.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeanalizować wyniki luminescencji za pomocą dowolnego oprogramowania analitycznego (na przykład Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)22). Porównać linię mutantową z kontrolami typu dzikiego, aby wykryć defekty rytmu okołodobowego.</li>
</ol>

<ol><li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).</li>
<li>Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li>
<li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968(2011).</li>
<li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li>
<li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis%2C+growth%2C+survival%2C+and+competitive+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li>
<li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130(2008).</li>
<li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological%2C+Metabolic%2C+and+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li>
<li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li>
<li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li>
<li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li>
<li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9%2C+7%2C+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li>
<li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li>
<li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+circadian+clock+protein%2C+TOC1%2C+is+a+DNA-binding+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li>
<li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheels+within+wheels%3A+the+plant+circadian+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li>
<li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li>
<li>Portolés, S., Más, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li>
<li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16(2009).</li>
<li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase%3A+the+structure+is+known%2C+but+the+mystery+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li>
<li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).</li>
<li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li>
<li>Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+%28CCA1%29+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li>
<li>Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li>
<li>Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light%2Fchloroplast-related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiamy szybki test do badań przesiewowych defektów okresu okołodobowego w liniach Arabidopsis, w tym izolację protoplastów, transfekcję i obrazowanie luminescencyjne. Okres okołodobowy u rzodkiewnika typu dzikiego i mutantów zegarowych cca1/lhy, ztl i CCA1-OX obliczono na podstawie pomiarów luminescencji z reportera CCA1pro:LUC i stwierdzono, że jest on zgodny z opublikowanymi danymi wygenerowanymi z całych roślin przy użyciu bardziej czasochłonnych podejść transgenicznych (Tabela 2). Użycie tego testu do badania mutantów Arabidopsis pozwala uniknąć początkowego wymogu generowania transgenicznych linii luminescencyjnych, co jest czasochłonne i może jedynie ujawnić, że dany mutant wykazuje rytmy typu dzikiego. Niewątpliwą zaletą tego protokołu jest to, że każda linia rzodkiewnika może zostać przebadana w krótkim czasie pod kątem zmienionych okołodobowych rytmów transkrypcyjnych, co pomoże w identyfikacji większej liczby genów wpływających na pomiar czasu u roślin.
Izolacja protoplastów może być pracochłonna, zwłaszcza jeśli zmutowana linia wykazuje karłowaty fenotyp. Wcześniej opisywane metody generowania protoplastów polegają na cięciu liści lub sadzonek na cienkie paski i infiltracji próżniowej pasków roztworem enzymów, aby umożliwić enzymom dotarcie do ścian komórkowych26,27. Późniejsze trawienie wymaga co najmniej 3-godzinnej inkubacji w ciemności, aby uwolnić protoplasty do roztworu enzymu. Gdy infiltracja próżniowa nie jest stosowana, zalecany jest czas inkubacji do 18 godzin. W przedstawionym tutaj protokole infiltracja próżniowa nie jest konieczna, ponieważ warstwa komórek naskórka nieprzepuszczalna dla enzymów jest usuwana za pomocą taśmy. Podczas wytwarzania protoplastów przez cięcie materiału roślinnego konieczne jest oddzielenie protoplastów od resztek ściany komórkowej po trawieniu; Zazwyczaj odbywa się to poprzez filtrowanie roztworu lub oczyszczanie go na gradieniu cukru27,26. W tym przypadku wszelkie niestrawione tkanki pozostaną na taśmie autoklawu po strawieniu, dzięki czemu można pominąć filtrację i oczyszczanie protoplastów w gradiencie cukru. Istnieje prawdopodobieństwo, że stres wynikający z długotrwałych zabiegów protoplastowych wpływa na żywotność komórek i zegar okołodobowy. Wizualizowana tutaj metoda protoplasting oparta na taśmie20 daje dużą liczbę protoplastów; a biorąc pod uwagę żywotność komórek w okołodobowym szeregu czasowym i pasujące długości okresu protoplastów i całych siewek (Tabela 2), opisana tutaj metodologia jest preferowana w stosunku do alternatywnych metod generowania protoplastów.
Etap transfekcji protokołu jest krytycznym krokiem, który ma wpływ na żywotność protoplastów. Roztwór PEG umożliwia dostarczenie DNA do komórki, a zarówno czas inkubacji w tym roztworze (krok 3.4), jak i procentową zawartość PEG należy określić empirycznie. Standardowe stężenie wynosi 20%, przy czym niższe stężenia zmniejszają wydajność przemiany, a wyższe stężenia zmniejszają żywotność28. Czas inkubacji wynoszący zaledwie pięć minut może zapewnić efektywną transfekcję protoplastów27.
Protoplasty można obrazować na dowolnej platformie obrazowania luminescencyjnego. W tym filmie użyliśmy czytnika płytek luminescencyjnych wyposażonego w zewnętrzne światła (czerwone i niebieskie diody LED, odpowiednio 630 i 470 nm, o łącznym natężeniu ~20 μE), co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe i częste pomiary. Inne urządzenia do obrazowania, które wykrywają luminescencję, takie jak alternatywne czytniki płytek lub konfiguracje oparte na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD), mogą być stosowane równie dobrze, o ile dostępne jest oświetlenie do fotosyntezy. Zaletą korzystania z kamery CCD zamontowanej na sterowalnej szafie jest możliwość zaprogramowania światła i temperatury. Wadą jest dłuższy czas przechwytywania, wprowadzający przedłużone okresy ciemności, które mogą powodować stres u protoplastów, a także zakłócać endogenne odmierzanie czasu. Niezależnie od tego, która platforma doświadczalna zostanie wybrana, prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie ustawień w porównaniu z ustawieniami dla sadzonek lub dojrzałych roślin. Z naszego doświadczenia wynika, że zwiększenie stężenia plazmidu reporterowego podczas transfekcji i / lub lucyferyny w buforze obrazowania może rozwiązać wszelkie nieregularne lub szybko tłumiące rytmy, które mogą wystąpić w początkowych eksperymentach.
W przyszłych eksperymentach opisana tutaj metodologia może zostać zastosowana do badania fenotypu okołodobowego dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis. Przy niewielkich modyfikacjach można było badać wpływ np. różnych leków na pomiar czasu w tej konfiguracji. Co więcej, transfekcja może być modyfikowana w celu uwzględnienia sztucznego mikroRNA do wyciszania genów19, co jeszcze bardziej rozszerza wszechstronność tego protokołu. Protokoły generowania protoplastów ryżu są dobrze ugruntowane29 , a przedstawiony tutaj protokół obrazowania może być równie dobrze zastosowany do pogłębienia naszego zrozumienia zegara w ważnych gospodarczo roślinach uprawnych jednoliściennych.

Większość organizmów żyjących posiada endogeniczny chronometraż, który pomaga w efektywnym negocjowaniu codziennych zmian w środowisku. Ten chronometrażysta, zegar okołodobowy, reguluje wiele aspektów metabolizmu i fizjologii organizmu, aby przewidywać przewidywalne zmiany w środowisku zewnętrznym. Na przykład u roślin przewidywanie czasowo przewidywalnych ataków patogenów lub roślinożerców znacznie zmniejsza ogólną podatność 1-4. Metabolizm skrobi jest ściśle regulowany przez zegar okołodobowy, aby zapewnić, że rezerwy skrobi wystarczają do świtu, niezależnie od tego, czy jest uprawiana w długich, czy krótkich warunkach dnia5. Rzeczywiście, rośliny, których zegary okołodobowe pasują do 24-godzinnego środowiska, wykazują zwiększone tempo wzrostu, tempo wiązania węgla i wskaźniki przeżycia w porównaniu z roślinami, które mają zegar o niedopasowanym okresie6. Rozległy wpływ rytmów okołodobowych na wszystkie te procesy wynika w dużej mierze z rytmicznej regulacji do jednej trzeciej całkowitego transkryptomu u Arabidopsis7. Te rytmiczne produkty genów są zaangażowane w szeroki zakres procesów komórkowych, w tym szlaki metaboliczne, sygnalizację hormonalną i reakcje na stres7. Co więcej, bezpośrednia dobowa regulacja funkcji białek jest ustalana przez okołodobową regulację fosforylacji8 i najprawdopodobniej inne modyfikacje potranslacyjne (PTM).
W centrum zegara okołodobowego, który napędza to codzienne przeprogramowanie transkrypcji, znajduje się sieć pętli transkrypcyjnych/translacyjnych zwrotnych (TTFL), w tym geny o porannej ekspresji CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) i LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY), które hamują ekspresję wieczornych genów TIMING OF CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) i członków kompleksu wieczornego (EC); LUX ARYTMIO (LUX), WCZESNE KWITNIENIE 3 (ELF3) i ELF4 9-11. Wraz z genami PSEUDO RESPONSE REGULATOR (PRR3, 5, 7 i 9), TOC1 hamuje ekspresję CCA1 / LHY, podczas gdy EC działa jako pozytywny regulator12-14. Oprócz mechanizmów sprzężenia zwrotnego, ważną rolę w dostrajaniu rytmów okołodobowych odgrywa potranskrypcyjna i potranslacyjna regulacja komponentów sieci TTFL. Do tej pory najliczniejszym PTM zidentyfikowanym na białkach zegara okołodobowego jest fosforylacja15. Fosforylacja CCA1 przez kinazę kazeinową 2 (CK2) wpływa na jej wiązanie z docelowymi promotorami16 i jest ważna dla kompensacji temperatury zegara okołodobowego17. Białka PRR są fosforylowane w różny sposób w cyklu okołodobowym, a fosforylacja TOC1 wpływa na interakcję z jego ujemnym regulatorem, składnikiem zegara o fazie wieczornej ZEITLUPE (ZTL)18. Przykłady te ilustrują, w jaki sposób PTM i interakcje białko-białko dostrajają sieć TTFL do 24-godzinnego oscylatora transkrypcyjnego. Bardziej szczegółowe wprowadzenie do sieci zegara transkrypcyjnego i jej regulacji można znaleźć w doskonałych najnowszych recenzjach (np. odniesienie 15).
Jednak to, co pozostaje mniej jasne, to zakres, w jakim rytmicznie regulowane procesy i inne aspekty metabolizmu komórkowego wracają do samego mechanizmu pomiaru czasu. Szeroko zakrojone badania przesiewowe mutantów Arabidopsis pod kątem wad zegara mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia, które mechanizmy lub szlaki sygnałowe mogą być zaangażowane w generowanie 24-godzinnych rytmów z sieci TTFL. W tym celu Kim i Somers opublikowali wcześniej przełomową metodę wydajnej i szybkiej analizy funkcji zegara w dowolnej linii19 Arabidopsis. Opierając się na wykorzystaniu ekspresji przejściowej w protoplastach, metodologia ta przewyższa zapotrzebowanie na stabilne linie transgeniczne lub krzyżówki z liniami znaczników zegara luminescencyjnego. W tym miejscu wizualizujemy wysokowydajną metodę izolacji protoplastów20 w połączeniu ze zoptymalizowanym protokołem badania przesiewowego defektów okołodobowych poprzez luminescencyjne obrazowanie przejściowo wyrażonych znaczników zegara w 96-dołkowym czytniku płytek.
Porównamy dzikiego typa Col-0 Arabidopsis z dobrze scharakteryzowanymi mutantami zegarowymi, aby potwierdzić, że opisana tutaj metodologia skutecznie wykrywa zmienione rytmy okołodobowe. Protoplasty pochodzące z tych linii są transfekowane konstruktem reporterowym, który wyraża lucyferazy świetlika z okołodobowego promotora CCA1; CCA1pro:LUC19. Lucyferazy katalizują wieloetapową reakcję, w której lucyferyna jest przekształcana w elektronicznie wzbudzoną oksylucyferynę, która emituje światło21, które jest obrazowane w czasie w celu oceny okresu, amplitudy i fazy rytmów transkrypcyjnych w tych protoplastach.
Protokół składa się z trzech głównych części: izolacji protoplastów, transfekcji protoplastów plazmidem reporterowym i obrazowania luminescencyjnego. Te trzy części należy zawsze wykonywać w ciągu jednego dnia, przy użyciu świeżo przygotowanych i odczynników. Wzrost roślin i oczyszczanie wystarczającej ilości plazmidu reporterowego powinny być przeprowadzone z wyprzedzeniem i nie są wizualizowane w tym protokole.

<table><tbody><tr><td>CELULIZYNA Celulaza, Trichoderma viride&nbsp; </td><td>Merck Millipore</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pektynaza R10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Acros Organics</td><td>327765000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>327300010</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Fischer Scientific</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG) 4000</td><td>Acros Organics</td><td>434630010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferin, Firefly</td><td>Biosynth AG</td><td>L-8200</td><td>Rozpuść lucyferynę w proszku w 0,1 M buforze trifosforanowym pH 8,0 do stężenia 50</td></tr><tr><td>mM Ampicylina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9618</td><td></td></tr><tr><td>Comply Taśma wskaźnikowa pary</td><td>3M</td><td>1222</td><td></td></tr><tr><td>Magiczna taśma</td><td>3M</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Szalki</td> <td>PetriegoMateriały Laboratorium Naukowego</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 dołków, płaskie dno, białe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>TopSeal-A, samoprzylepne pokrywki do płytek 96-dołkowych</td><td>Perkin Elmer</td><td>6050195</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 10 ml, bez igły</td><td>BD Plastipak</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,22 &mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td><td></td><td></td><td>Do pobrania za darmo pod adresem amillar.org</td></tr><tr><td>QIAfilter Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12262</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana komora licząca Fucha-Rosenthala, dwukomórkowa</td><td>Hawksley</td><td>AC6000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Optika Mikroskopy</td><td>B-150POL-B</td><td></td></tr><tr><td>LB942 Czytnik wielomodowy TriStar2 z modułem luminescencyjnym</td><td>Berthold Technologies Ltd</td><td>57947/57948</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Zegar okołodobowy roślin pozwala przewidywać codzienne zmiany w środowisku. To przewidywanie wspomaga reakcje na czasowo przewidywalny stres biotyczny i abiotyczny. I odwrotnie, zakłócenie okołodobowego pomiaru czasu poważnie zagraża zdrowiu roślin i zmniejsza plony upraw rolnych. Dlatego konieczne jest, abyśmy zrozumieli zawiłą regulację rytmów okołodobowych u roślin, w tym czynniki wpływające na ruch samego mechanizmu zegarowego transkrypcji.
Testowanie defektów okołodobowych w modelowej roślinie Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) tradycyjnie polega na przekraczaniu określonych linii mutantów do linii rytmicznie wyrażającej lucyferazy świetlika z promotora genu zegara okołodobowego. Takie podejście jest pracochłonne, czasochłonne i może być bezowocne, jeśli mutant nie ma fenotypu okołodobowego. Przedstawiona tu metodologia pozwala na szybką wstępną ocenę fenotypów okołodobowych. Protoplasty pochodzące ze zmutowanego i dzikiego typu Arabidopsis są izolowane, transfekowane rytmicznie wyrażonym luminescencyjnym reporterem i obrazowane w stałych warunkach oświetleniowych przez 5 dni. Ślady luminescencyjne bezpośrednio pokażą, czy okres swobodnego biegu zmutowanych roślin różni się od okresu roślin dziko rosnących. Zaletą tej metody jest to, że każda linia Arabidopsis może być skutecznie przesiewana, bez konieczności generowania stabilnej transgenicznej linii znacznika zegara luminescencyjnego na tym zmutowanym tle.

Protoplasty Arabidopsis typu dzikiego porównano ze znanymi mutantami zegara cca1/lhy (mutant o krótkim okresie2), ztl (mutant o długim okresie23) oraz linią z nadekspresją CCA1-OX (arytmiczną24). Wszystkie próbki zostały przejściowo przetransfekowane reporterem CCA1pro:LUC i obrazowane w stałym świetle za pomocą czytnika płytek przez 5 dni.
Wykazujemy tutaj, że u mutanta cca1/lhy okres swobodny ekspresji genów kontrolowanej przez rytm okołodobowy jest skrócony (Ryc. 2a), co jest zgodne z opublikowanym okresem analizowanym za pomocą stabilnej transgenicznej ekspresji luminescencyjnych markerów zegara2,9. Okres oscylacji okołodobowych w protoplastach mutanta ztl jest dłuższy niż w typie dzikim (Ryc. 2b), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami uzyskanymi z siewek, kultur zawiesin komórkowych i protoplastów19,23,25.
Nadekspresja CCA1 blokuje zegar w fazie porannej, a globalna transkrypcja staje się arytmiczna24. Zgodnie z tym zaobserwowano brak oscylacji w ekspresji CCA1pro:LUC w CCA1-OX protoplastach (Rycina 2c).
<img alt="Analiza rytmu okołodobowego, wykresy CPS względem czasu, porównania mutantów: cca1/lhy, ztl, CCA1-OX." src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rytmy okołodobowe protoplastów Protoplasty Col-0, cca1/lhy, ztl oraz CCA1-OX poddano przejściowej transformacji konstruktem CCA1pro:LUC, a następnie obrazowano rytmy okołodobowe luminescencji przez 5 dni (A-C). (D) Szacunki okresu okołodobowego na podstawie przebiegów luminescencji w Col-0, cca1/lhy i ztl (A-B). Średnia ± SEM, n = 3-5, wartość p testu t zgodnie z oznaczeniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Genotyp</td>
			<td>Okres (protoplasty)</td>
			<td>Period (transgeniczny)</td>
			<td>Zgłoszone przez:</td>
			<td>Literatura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kol-0</td>
			<td>23.0 ±0.21</td>
			<td>24.4 ±0.09</td>
			<td>pCCA1:LUC w Col-0</td>
			<td>(2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cca1/lhy</td>
			<td>20.6 ±0.13</td>
			<td>19.9 ±0.11</td>
			<td>pCCA1:LUC w kolumnie-0</td>
			<td>(2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>~18</td>
			<td>RNA w Ler Wprowadzenie</td>
			<td>(9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ztl</td>
			<td>25.1 ±0.12</td>
			<td>27.4 ±0.5</td>
			<td>CAB2:LUC w ekotypie C24</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCA1-OX</td>
			<td>arytmiczny</td>
			<td>arytmiczny</td>
			<td>pCCA1:LUC (tylko dane LD)</td>
			<td>(2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>arytmiczny</td>
			<td>RNA i białka w Col-0 Wstęp</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Rytmy okołodobowe w protoplastach w porównaniu z siewkami transgenicznymi.Okres okołodobowy ekspresji pCCA1:LUC w protoplastach w porównaniu z długościami okresów zgłoszonymi po raz pierwszy dla danej mutacji oraz, jeśli dostępne, z ekspresją pCCA1:LUC w Col-0.

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Ogólnym celem tego testu jest wyznaczenie okresu okołodobowego w liniach Arabidopsis poprzez pomiar luminescencji emitowanej przez przetransfekowane protoplasty. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rytmów okołodobowych, takie jak określenie, które geny wpływają zwrotnie na sam mechanizm pomiaru czasu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybką analizę okresu okołodobowego dowolnego mutanta Arabidopsis bez konieczności tworzenia stabilnych linii transgenicznych.Aby rozpocząć tę procedurę, należy opisać szalkę Petriego i wlać do niej 10 mililitrów przefiltrowanego, sterylizowanego roztworu enzymu. Przymocować cztery paski taśmy autoklawowej stroną klejącą do góry na czystej powierzchni laboratoryjnej i zaznaczyć na nich wymiary szalki Petriego. Pobrać rośliny z pomieszczenia hodowlanego.Odetnij liście z roślin czterotygodniowych i dociśnij górny naskórek do taśmy autoklawowej w taki sposób, aby dolna powierzchnia naskórka była skierowana do góry. Na dolną powierzchnię naskórka naklej paski przezroczystej taśmy klejącej. Używając probówki stożkowej o pojemności 15 ml, delikatnie dociśnij paski do liści, uważając, aby nie zmiażdżyć tkanki liściowej.Ostrożnie oderwij taśmę, aby zdjąć dolną epidermę i odsłonić komórki mezofila. Następnie dotnij taśmę autoklawową do rozmiaru szalki Petriego, za pomocą pęsety umieść taśmę w szalce i pozwól jej pływać na powierzchni roztworu enzymu, stroną z liśćmi skierowaną w dół. Inkubuj na wytrząsarce platformowej przy 60 RPM przez 60 minut; w tym czasie protoplasty zostaną uwolnione do roztworu.Po 60 minutach za pomocą pęsety należy usunąć i wyrzucić paski taśmy autoklawacyjnej. Używając końcówki do pipety o szerokim wlocie, należy przenieść roztwór zawierający protoplasty do 15 mililitrowej probówki stożkowej. Protoplasty należy odwirować przy 100 gee przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz, ponieważ osad jest bardzo luźny.Dodaj 10 mililitrów roztworu W5 do protoplastów i resuspenduj, delikatnie obracając probówkę. Pobierz alikwot protoplastów w celu ich policzenia. Pozostaw protoplasty na lodzie na 30 do 60 minut.Podczas gdy protoplasty znajdują się w lodzie, oceń wydajność, licząc protoplasty w komorze licznikowej (hemocytometrze). Zbierz protoplasty poprzez wirowanie przy 100 ×g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń nadsącz, ponieważ osad jest bardzo luźny.Na koniec resuspender protoplasty w roztworze MMg do stężenia 500 000 protoplastów na mililitr. Rozpocząć procedurę transfekcji protoplastów, dodając 10 µL plazmidu reporterowego do probówki stożkowej o pojemności 15 mL, a następnie 400 µL protoplastów. Dodać taką samą objętość glikolu polietylenowego (roztworu PEG) i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę 12 razy, aby przeprowadzić transfekcję protoplastów.Inkubować od ośmiu do 15 minut w temperaturze pokojowej. Protoplasty muszą być inkubowane wystarczająco długo, aby zapewnić wydajną transfekcję, ale nie zbyt długo, ponieważ zmniejszy to ich żywotność. Następnie zmieszaninę DNA protoplastów i PEG rozcieńczyć czterokrotnością objętości roztworu W5 i wymieszać, delikatnie odwracając naczynie sześć razy.Zebrać transfektowane protoplasty poprzez wirowanie przy 100 gee przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pipety, zachowując szczególną ostrożność, ponieważ osad jest bardzo luźny. Resuspendować protoplasty w 1 250 microliters roztworu do obrazowania.Protoplasty powinny zawiesić się dość łatwo, co wskazuje na to, że pozostały nienaruszone po transfekcji. Rozdziel po 200 µL na każdą z sześciu powtórnych studzienek płytki 96-dołkowej, a pozostałe puste studzienki wypełnij roztworem W5. Zamknij płytkę przezroczystą pokrywą z klejem, odpowiednią do obrazowania luminescencyjnego.Aby obrazować protoplasty, przenieś płytkę 96-dołkową do dowolnego zestawu do obrazowania luminescencyjnego odpowiedniego dla tkanek roślinnych. Wymień przylepną pokrywkę płytki od 10 do 15 minut po przeniesieniu, aby uniknąć kondensacji i różnic ciśnienia między dołkami. Rozpocznij obrazowanie.Odczytuj płytkę co 45 minut przez pięć dni w temperaturze pokojowej. Następnie przeanalizuj wyniki luminescencji za pomocą dowolnego oprogramowania analitycznego, na przykład Biological Rhythms Analysis Software System. Protoplasty mezofylowe wyizolowane zgodnie z tym protokołem przedstawiono na tym obrazie przy powiększeniu 200-krotnym.Protoplasty typu dzikiego arabidopsis oraz mutanty cca1/lhy zostały poddane transfekcji i obrazowaniu w stałym świetle przy użyciu czytnika płytek przez pięć dni. Zgodnie z oczekiwaniami, okres wolnobieżny ekspresji genów kontrolowanych przez zegar jest skrócony u tego mutanta. W przeciwieństwie do tego, okres oscylacji okołodobowych w protoplastach mutanta ztl jest wydłużony.W protoplastach z nadekspresją CCA1 nie odnotowano oscylacji w ekspresji konstruktu reporterowego, ponieważ nadekspresja CCA1 prowadzi do arytmii. Ten wykres słupkowy przedstawia szacunki okresu okołodobowego na podstawie śladów luminescencji w protoplastach typu dzikiego oraz mutantach zegara. Okresy okołodobowe te są zgodne z opublikowanymi danymi uzyskanymi z całych roślin przy użyciu czasochłonnych metod transgenicznych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest użycie zdrowych roślin oraz ostrożne obchodzenie się z protoplastami, ponieważ są one delikatne. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu trzech do czterech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować, transfekować i obrazować protoplasty Arabidopsis.Techniki te można teraz zastosować do dowolnej linii mutantów, a nawet zmodyfikować w celu obrazowania protoplastów innych gatunków roślin.

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Ta nowo opracowana technologia oparta na fluorescencji umożliwia długoterminowe monitorowanie transkrypcji genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

Raport opisuje metodę wykorzystującą skrypt R w otwartym oprogramowaniu RStudio do analizy dużych zbiorów danych uzyskanych z eksperymentów z szeregami czasowymi.

Przyjazna użytkownikowi i wydajna analiza R dużych zbiorów danych

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Poznaj metodę szybkiej analizy rytmów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis z transfekowanym luminescencyjnym reporterem. Technika ta pozwala badać okresy oscylacji bez konieczności tworzenia stabilnych linii transgenicznych.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Przeglądaj więcej filmów