Name: Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy endocytozy w żywych komórkach drożdży pączkujących przy użyciu pHluorin i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia badanie wpływu mutacji na transport pęcherzykowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Gero Miesenböckowi i Timowi Ryanowi za podzielenie się cDNA pHluorin używanym do generowania odczynników w tym badaniu, Nathanowi Wrightowi, Joannie Poprawski i Lydii Nyasae za doskonałą pomoc techniczną, członkom laboratorium Wendland za pomocne dyskusje, oraz Michaelowi McCaffery'emu i Erin Pryce z Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) za porady i pomoc w mikroskopii i cytometrii przepływowej. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (dla B.W., GM60979) i National Science Foundation (dla B.W., MCB 1024818). K.W. otrzymał częściowe wsparcie z grantu szkoleniowego z National Institutes of Health (T32-GM007231). Projekt A.F.O. został wsparty funduszami rozwojowymi z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Duquesne oraz grantem National Science Foundation CAREER 553143.

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Curr+Prot+Mol+Biol%22">Curr Prot Mol Biol</a>. , John Wiley & Sons. New York. (1991).</li>
<li>Urbanowski, J. L., Piper, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+sorts+proteins+into+the+intralumenal+degradative+compartment+of+the+late-endosome%2Fvacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole.</a> Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).</li>
<li>Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamics+of+Clathrin+and+Its+Adaptor-Dependent+Recruitment+to+the+Actin-Based+Endocytic+Machinery+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast.</a> Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).</li>
<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
<li>Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+methionine+uptake+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+new+family+of+amino+acid+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases.</a> J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).</li>
<li>Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence-activated+cell+sorter-based+screen+for+yeast+endocytosis+mutants+identifies+a+yeast+homologue+of+mammalian+eps15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15.</a> J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).</li>
<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
<li>Becuwe, M., Léon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+transporter+endocytosis+and+recycling+by+the+arrestin-related+protein+Rod1+and+the+ubiquitin+ligase+Rsp5%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
<li>Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Function+of+the+Endocytic+Scaffold+Protein+Pan1p+Depends+on+Multiple+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains.</a> Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Zastosowania pHluorin do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w komórkach drożdży wykorzystują ładunki transbłonowe, w których znacznik fluorescencyjny jest połączony z cytoplazmatycznym ogonem białka (ryc. 1A). W przypadku opisanych tutaj testów, ładunki są jasno fluorescencyjne, gdy znacznik pHluorin jest wystawiony na działanie neutralnego środowiska, ale gasną, gdy znacznik pHluorin napotyka warunki kwaśne. W ten sposób ładunek endocytarny znakowany pHluoryną jest łatwo wykrywalny na cytoplaz...

Handel pęcherzykowy odgrywa ważną rolę w utrzymaniu tożsamości i funkcji organelli w komórkach eukariotycznych i jest kluczowym mechanizmem regulującym skład białek i błon poszczególnych kompartmentów komórkowych. Na błonie plazmatycznej fuzja pęcherzyków egzocytarnych dostarcza nowe białka i błony na powierzchnię komórki, podczas gdy pęcherzyki generowane przez endocytozę usuwają błonę i białka z powierzchni w celu późniejszego recyklingu lub skierowania do lizosomu. Dlatego endocytoza jest ważna dla pobierania składników odżywczych i odpowiedzi na środowisko zewnątrzkomórkowe. Egzocytoza i endocytoza są zrównoważone, aby regulować powierzchnię błony plazmatycznej i umożliwić obrót uszkodzonych białek.
Badania na komórkach drożdży i ssaków zidentyfikowały dużą liczbę białek zaangażowanych w endocytozę, a także wiele szlaków endocytarnych, które promują internalizację określonych ładunków lub działają w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe. Najlepiej zbadanym szlakiem jest endocytoza za pośrednictwem klatryny (CME), w której klatryna i cytozolowe białka pomocnicze łączą się w strukturę płaszcza, aby ustabilizować powstający pęcherzyk endocytarny. Eksperymenty na pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae dostarczyły kluczowych informacji na temat dynamiki i kolejności rekrutacji wielu białek endocytarnych1-3. Warto zauważyć, że maszyneria CME jest wysoce konserwatywna w drodze ewolucji, tak że większość białek związanych z CME w drożdżach ma ludzkie ortologi; W związku z tym pączkujące drożdże są ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów endocytozy, które są konserwatywne u wyższych eukariontów. Na przykład badania z użyciem drożdży pączkujących wykazały, że tworzenie i dojrzewanie struktur CME (określanych jako korowe łaty aktynowe u drożdży) obejmuje sekwencyjną rekrutację wielu białek, zaczynając od klatryny i białek adaptorowych wiążących ładunek, a następnie rekrutację dodatkowych białek akcesoryjnych endocytarnych, aktywację polimeryzacji aktyny za pośrednictwem Arp2 / 3 i rekrutację białek zaangażowanych w rozszczepienie pęcherzyków1,2. Rekrutacja białek maszynowych CME do korowych łat aktynowych jest wysoce uporządkowanym i stereotypowym procesem, a dokładna kolejność rekrutacji dla wielu białek została ustalona w odniesieniu do innych składników maszynerii CME. Co ważne, ostatnie badania potwierdziły podobną kolejność rekrutacji białek CME w dołach pokrytych klatryną w komórkach ssaków4.
Oprócz CME, wiele typów komórek posiada jeden lub więcej niezależnych od klatryny szlaków endocytarnych (CIE), które polegają na alternatywnych mechanizmach sprzyjających tworzeniu pęcherzyków i internalizacji z błony plazmatycznej5-7. U drożdży niedawno zidentyfikowaliśmy szlak CIE, który wykorzystuje małą GTPazę Rho1 i jej aktywujący czynnik wymiany nukleotydów guaninowych (GEF), Rom18,9. Rho1 aktywuje forminę Bni1 w celu promowania polimeryzacji aktyny10,11, która jest wymagana w tej postaci endocytozy niezależnej od klatryny u drożdży12. Co więcej, rodzina białek α-aresztyny rekrutuje ligazę ubikwityny Rsp5 w celu promowania ubikwitynacji ładunku i późniejszej internalizacji przez CME13-17, a także promuje internalizację ładunku za pośrednictwem szlaku CIE, prawdopodobnie poprzez bezpośrednią interakcję z białkami zaangażowanymi w CIE18. W komórkach ssaków istnieje również wiele szlaków CIE, w tym szlaki niezależne od klatryny i fagocytarne, które opierają się na ortologu Rho1, RhoA9,19. Rola RhoA w CIE u ssaków jest słabo poznana; w związku z tym badania na pączkujących drożdżach mogą dostarczyć dodatkowych informacji mechanistycznych, które mają zastosowanie do CIE u ssaków.
Dokładna kwantyfikacja zdarzeń endocytarnych może dostarczyć ważnych informacji na temat ról określonych białek w regulacji endocytozy i może ujawnić wpływ mutacji na internalizację ładunku lub progresję przez szlak endocytarny. W tym celu można wykorzystać metody biochemiczne do monitorowania wychwytu ligandów lub do pomiaru szybkości degradacji białek ładunku endocytarnego. W żywych komórkach fuzja białka zielonej fluorescencji (GFP) i jego wariantów z ładunkami będącymi przedmiotem zainteresowania umożliwia bezpośrednią wizualizację transportu ładunków. Jednak ładunki znakowane GFP mają ograniczone zastosowanie do ilościowego oznaczania endocytozy, ponieważ GFP jest odporny na degradację w lizosomie (lub wakuoli w drożdżach). Co więcej, fluorescencja GFP jest tylko częściowo wrażliwa na zmiany pH i pozostaje wykrywalna w świetle wakuoli20,21. W związku z tym fluorescencja znacznika GFP utrzymuje się w wakuoli długo po degradacji pozostałej części ładunku, a kwantyfikacja intensywności ładunku na podstawie całych komórek może być niedokładna ze względu na długotrwałą fluorescencję GFP w wakuoli.
Aby przezwyciężyć wady wakuolarnej fluorescencji GFP, poprzednio użyliśmy superekliptycznej pHluorin, wrażliwej na pH odmiany GFP, która fluoryzuje jasno przy neutralnym pH, ale traci fluorescencję w kwaśnym środowisku, takim jak światło wakuoli/lizosomu20,22,23. Umieszczenie znacznika pHluorin na ogonie cytoplazmatycznym ładunków endocytarnych umożliwia wizualizację ładunków na błonie plazmatycznej i na wczesnych endosomach, gdzie znacznik pHluorin pozostaje wystawiony na działanie cytoplazmy (ryc. 1A). W miarę dojrzewania wczesnych endosomów, endosomalny kompleks sortujący wymagany do transportu (ESCRT) pakuje zlokalizowane na powierzchni ładunki w pęcherzyki, które pączkują w świetle endosomu, tworząc ciała wielopęcherzykowe (MVB)24. W przypadku ładunków, które zostały włączone do wewnętrznych pęcherzyków MVB, znacznik pHluorin jest skierowany w stronę światła pęcherzyka. Wewnętrzne pęcherzyki MVB są zakwaszone; w ten sposób ładunki znakowane pHluoryną tracą fluorescencję na wczesnych endosomach, gdy dojrzewają do MVB20. Późniejsze połączenie MVB z wakuolą dostarcza zawartość światła MVB do degradacji, a znaczniki pHluorin pozostają stłumione w kwaśnym środowisku światła wakuoli.
Ten artykuł zawiera szczegółowe opisy ilościowych testów endocytarnych z użyciem ładunków z cytoplazmatycznymi znacznikami pHluorin w drożdżach. Szczepy wykazujące ekspresję ładunków znakowanych pHluoryną mogą być stosowane w testach kinetycznych i/lub końcowych, w zależności od właściwości i zachowania transportowego określonego ładunku. Ponadto niektóre ładunki znakowane pHluoryną są podatne na wysokoprzepustowe metody analizy, w tym cytometrię przepływową. Co ważne, znacznik pHluorin jest wszechstronnym narzędziem do badania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach, umożliwiając ilościowe określenie endocytozy i porównanie funkcji endocytarnej w szczepach typu dzikiego i zmutowanych.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626-25G</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Służy do przygotowania podłoża płytkowego</td></tr><tr><td>BD Difco Drożdże Azot Zasada (bez aminokwasów)</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Służy do przygotowania pożywek płynnych i płytkowych</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>Służy do powlekania komory Szkiełka</td></tr><tr><td>dekstrowe</td><td>Fisher</td><td>BP350-1</td><td>Służy do przygotowywania pożywek płynnych i płytkowych</td></tr><tr><td>L-histydyny</td><td></td><td>Fisher BP382-100</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Acros</td><td>125121000</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>Fisher</td><td>BP386-100</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>L-Metioniny</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>L-Tryptofanu</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-dołkowy)</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Zastosowanie do testów kinetycznych i końcowych internalizacji Mup1-pHluorin</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Służy do przygotowania mieszaniny aminokwasów i roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Axiovert 200</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-apochromatyczny obiektyw zanurzeniowy z olejkiem</td> Obiektyw <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>powinien mieć wartość 100X, 1.4NA lub nowszy</td></tr><tr><td>Aparat Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>powinien mieć 12-bitowy lub wyższy zakres dynamiki</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q Źródło oświetlenia</td><td>Oprogramowanie Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

zastosowania phluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Zielone białko fluorescencyjne (GFP) i jego warianty są szeroko stosowanymi narzędziami do badania lokalizacji białek i dynamiki zdarzeń, takich jak przebudowa cytoszkieletu i transport pęcherzykowy w żywych komórkach. Metodologie ilościowe wykorzystujące chimeryczne fuzje GFP zostały opracowane dla wielu zastosowań; jednak GFP jest nieco odporny na proteolizę, dlatego jego fluorescencja utrzymuje się w lizosomie/wakuoli, co może utrudniać ilościowe określenie transportu ładunku w szlaku endocytarnym. Alternatywna metoda ilościowego określania endocytozy i zdarzeń transportu po endocytarach wykorzystuje superekliptyczną pHluorinę, wrażliwy na pH wariant GFP, który jest wygaszany w środowisku kwaśnym. Chimeryczna fuzja pHluoryny z cytoplazmatycznym ogonem transbłonowych białek ładunkowych powoduje tłumienie fluorescencji po włączeniu ładunku do ciał wielopęcherzykowych (MVB) i dostarczeniu do światła lizosomu/wakuoli. W ten sposób wygaszanie fluorescencji wakuolarnej ułatwia ilościowe określenie endocytozy i wczesnych zdarzeń w szlaku endocytarnym. W artykule opisano metody wykorzystujące ładunki znakowane pHluoryną do ilościowego oznaczania endocytozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a także testy populacyjne z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Lokalizacja w stanie stacjonarnym i kwantyfikacja konstytutywnie internalizowanego białka cargo endocytowego Ste3
Aby wykazać, że ładunki znakowane pHluoryną mogą być wykorzystywane do kwantyfikacji endocytozy w żywych komórkach, porównano lokalizację chimerycznych fuzji GFP i pHluoryny z cytoplazmatycznym końcem C-terminalnym Ste3, receptora feromonu czynnika a w drożdżach. Ste3 jest receptorem sprzężonym z bia...

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie zdarzeń transportu pęcherzykowego w szlaku endocytycznym żywych komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transportu pęcherzykowego, takie jak wpływ mutacji lub zmian w ekspresji białek na tempo i wydajność zdarzeń transportowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej kwantyfikacji transportu endocytycznego w żywych komórkach poprzez pomiar intensywności fluorescencyjnie znakowanych białek ładunkowych.Po przygotowaniu roztworów i pożywek zgodnie z protokołem tekstowym, zaszczep dwa do trzech kolonii komórek drożdży w pięciu mililitrach pożywki YNB, pozbawionej dodatkowych składników niezbędnych do utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj kultury w temperaturze 30 °C przy potrząsaniu przez 16 do 24 godzin. Około trzech godzin przed obrazowaniem zmierz OD 600 każdej kultury nocnej.Następnie przygotuj rozcieńczenia o objętości pięciu mililitrów przy OD 600 wynoszącej 0,35 do 0,4 w pożywce YNB, pozbawionej dodatkowych składników odżywczych niezbędnych do utrzymania plazmidów, i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy potrząsaniu przez trzy godziny. Podczas inkubacji wstępnie wyrównaj temperaturę w komorze środowiskowej mikroskopu lub na podgrzewanym stoliku do 30 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu ośmiodobowej szklanej płytki oraz szkiełka przedmiotowego z komorą do obrazowania zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 200 mikrolitrów pożywki YNB pozbawionej dodatkowych składników odżywczych do selekcji plazmidów do każdej studzienki.Po przygotowaniu kultur przenieś jeden mililitr do probówki typu microfridge i odwiruj komórki przy 8 000 RPM przez dwie minuty. Następnie usuń 975 mikrolitrów supernatantu. Resuspender osad komórkowy w pozostałym supernatancie.Następnie nanieś 2,5 µL zawiesiny komórkowej do centrum każdej studni płytki ośmiodołkowej. Pipetuj ciecz w górę i w dół, aby rozprzestrzenić komórki, a następnie odczekaj od pięciu do 10 minut, aż komórki osadzą się na dnie. Umieść preparat na szkiełku z komorą w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym ustawionym na 30 °C.Następnie, używając oświetlenia w polu jasnym, zlokalizuj pole komórek. Do 200 µL medium w studzience dodaj 50 µL uprzednio ogrzanego medium YNB zawierającego 100 µg/mL metioniny, aby uzyskać końcowe stężenie metioniny wynoszące 20 µg/mL. Pozostaw komórki na dwie minuty w celu wyrównania warunków przed rozpoczęciem obrazowania.Następnie, bezpośrednio przed obrazowaniem, ustaw mikroskop na pożądaną płaszczyznę ogniskowania. Rejestruj obrazy GFP w polu jasnym lub DIC w odstępach 5-minutowych przez okres od 45 do 60 minut, stosując identyczne parametry akwizycji dla wszystkich obrazów w ramach serii czasowej.Dodatkowe szczegóły znajdują się w protokole tekstowym. Ilościowo określ intensywność fluorescencji poszczególnych komórek w każdym punkcie czasowym i wyraź wartości jako procent początkowej intensywności pierwszego obrazu. Po wyeksportowaniu obrazów zgodnie z protokołem tekstowym w programie ImageJ, otwórz pliki w menu pliku, korzystając z opcji Open.Do kwantyfikacji należy wykorzystać obraz fluorescencyjny, a obraz w jasnym polu lub obraz DIC jako referencję do identyfikacji lokalizacji komórek. Należy wykluczyć martwe komórki, które w obrazowaniu DIC wydają się ciemniejsze od komórek żywych i wykazują autofluorescencję w kanale GFP. W przypadku obrazów z nierównomiernym tłem, w menu Process należy wybrać algorytm odejmowania tła (background subtraction) i zastosować ustawienia domyślne.Po pozyskaniu obrazów ważne jest wykonanie odejmowania tła przed przystąpieniem do procedury kwantyfikacji. Krok ten jest szczególnie istotny, ponieważ sygnał tła mógłby w przeciwnym razie zamaskować lub stłumić różnice między próbkami. Używając narzędzia do zaznaczania dowolnego kształtu, obrysuj komórkę, upewniając się, że objąłeś całą komórkę, ale jak najmniejszy obszar poza nią.Następnie w menu Analyze użyj funkcji set measurements, aby zmierzyć pole powierzchni, zintegrowaną gęstość oraz średnią wartość szarości. Otwórz ROI Manager, klikającAnalyze, a następnie Tools. W oknie ROI Manager kliknij przycisk Add, aby wprowadzić zaznaczony obszar jako nowy ROI.Powtórz obrysowywanie i pomiary dla pozostałych komórek na obrazie, z wyłączeniem komórek martwych oraz tych, które dotykają krawędzi obrazu. Zapisz wybrane obszary zainteresowania (ROI) jako plik zip, klikając przycisk pomiaru (measure), który wyświetli zmierzone wartości w nowym oknie. Następnie kliknij przycisk więcej (more) i wyeksportuj wszystkie pomiary do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do analizy statystycznej.Zaszczep dwie do trzech kolonii komórek drożdży do 0,5 mililitra pożywki YNB, pozbawionej dodatkowych składników odżywczych niezbędnych do utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj komórki na bębnie obrotowym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Dodaj jeden mililitr pożywki YNB pozbawionej dodatkowych składników do utrzymania plazmidu i hoduj przez kolejne trzy godziny.Następnie przenieś 1 ml komórek do każdej z dwóch probówek o dnie okrągłym o pojemności 5 ml. Do pierwszej probówki dodaj 0,25 ml pożywki YNB Met, a do drugiej 0,25 ml pożywki YNB zawierającej 100 µg/ml metioniny, aby uzyskać końcowe stężenie 20 µg/ml. W przypadku dużej liczby próbek dodawaj metioninę w odstępach czasowych, aby zapewnić czas na analizę faktów.Nasz cytometr przepływowy może pomieścić do 40 próbek w jednym przebiegu. Metioninę dodajemy partiami: osiem próbek co pięć minut.Zapewnia to, że wszystkie próbki zostaną zmierzone od 45 do 50 minut po dodaniu metioniny. Inkubuj komórki przez 45 minut. Następnie poddaj komórki analizie metodą cytometrii przepływowej, wybierając rozproszenie przednie (forward scatter lub FS) jako miarę wielkości komórek oraz mapując intensywność fluorescencji z filtra FITC jako miarę internalizacji ładunku.Podczas 45-minutowej inkubacji należy użyć przycisków suwaka, aby dostosować napięcie kanałów FS i FITC w celu optymalizacji detekcji dla zakresu wielkości oraz intensywności fluorescencji używanych komórek drożdżowych. Pomiar FS i intensywności fluorescencji należy przeprowadzić dla 10 000 komórek z każdego wariantu. Przy ustawieniu wysokiego przepływu należy wygenerować wykres rozrzutu FS w funkcji intensywności fluorescencji, klikając przycisk dodaj wykres.Następnie wybierz FITC dla osi x oraz FS dla osi y i wykreśl 1000 punktów. Korzystając z funkcji bramkowania i warunku Met typu dzikiego, ustaw bramkę pionową w taki sposób, aby około 5% najjaśniejszych komórek znajdowało się po prawej stronie bramki. Zastosuj to bramkowanie dla wszystkich pozostałych warunków w eksperymencie.Jak pokazano tutaj, obrazowanie timelapse komórek przeprowadzono w odstępach pięciominutowych w obecności lub przy braku metioniny, aby monitorować internalizację Mup1 znakowanego GFP lub fluoryną oraz zmiany fluorescencji. Zgodnie z oczekiwaniami Mup1 znakowany GFP i fluoryną pozostał w błonie komórkowej przy braku metioniny. Z kolei w komórkach obrazowanych w obecności metioniny zaobserwowano postępujący zanik sygnału fluorescencyjnego z powierzchni komórki, co jest zgodne z procesem internalizacji ładunku.Jednakże kinetyka utraty fluorescencji w obecnościy metioniny była opóźniona w komórkach Mup1 GFP w porównaniu do komórek pHlourin Mup1. Te wykresy rozrzutu porównują intensywność fluorescencji komórek typu dzikiego lub czterech komórek delta ENTH1 w obecności lub przy braku metioniny po zastosowaniu bramki pionowej. 4% komórek typu dzikiego z Met znajdowało się po prawej stronie bramki, co odpowiadało najjaśniejszym komórkom w populacji, podczas gdy w bramce znajdowało się 65% nieleczonych komórek typu dzikiego.W przeciwieństwie do nich, w przypadku czterech linii komórkowych delta ENTH1 nie stwierdzono różnic w rozkładzie komórek jasnych i ciemnych, co jest zgodne z obecnością defektu endocytozy. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w ciągu trzech do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby rozłożyć w czasie rozpoczęcie poszczególnych doświadczeń, tak aby dane końcowe mogły zostać zebrane po takim samym czasie inkubacji dla wszystkich próbek.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak genetyczne przesiewy kwiatowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, jakie nowe czynniki przyczyniają się do transportu pęcherzykowego. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie transportu pęcherzykowego do zbadania aspektów degradacji endosomów, a także nowo odkrytej, klatryno-niezależnej i kwaśnej ścieżki w drożdżach pączkujących. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie sposobu wykorzystania ładunków typu florent do ilościowego określania zdarzeń endocytozy w żywych komórkach.

applications-phluorin-for-quantitative-kinetic-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę ilościowej analizy endocytozy w żywych komórkach drożdży pączkujących przy użyciu pHluorin i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia badanie wpływu mutacji na transport pęcherzykowy.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Przeglądaj więcej filmów