Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zdarzeń transportu pęcherzykowego w szlaku endocytarnym żywych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu pęcherzykowego, takie jak to, w jaki sposób mutacje lub zmiany w ekspresji białek wpływają na tempo i skuteczność zdarzeń związanych z transportem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośrednią ocenę ilościową transportu endocytarnego i żywych komórek poprzez pomiar intensywności znakowanych fluorescencyjnie białek ładunkowych.

Po przygotowaniu roztworów i pożywek zgodnie z protokołem tekstowym należy zaszczepić dwie do trzech kolonii komórek drożdży w pięciu mililitrach pożywki YNB, pozbawionej dodatkowych składników odżywczych do utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 16 do 24 godzin. Około trzy godziny przed obrazowaniem zmierz OD 600 w każdej nocnej hodowli.

Następnie przygotuj pięć mililitrowych rozcieńczeń przy OD 600 od 0,35 do 0,4 w pożywce YNB, bez dodatkowych składników odżywczych do utrzymania plazmidu i rosnąć w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem przez trzy godziny. Podczas inkubacji należy wstępnie zrównoważyć komorę środowiskową mikroskopu lub podgrzewany stolik do 30 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu szklanego garnka z ośmioma dołkami i szkiełka komorowego do obrazowania zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj do każdej studzienki 200 mikrolitrów pożywki YNB pozbawionej dodatkowych składników odżywczych do selekcji osocza.

Gdy kultury będą gotowe, przenieś jeden mililitr do rurki mikrolodówki i granuluj komórki z prędkością 8 000 obr./min przez dwie minuty. Następnie usunąć 975 mikrolitrów supernatantu. Zawiesić osad komórkowy w pozostałym supernatencie.

Następnie wrzuć 2,5 mikrolitra zawiesiny komórek do środka każdej studzienki ośmiodołkowej płytki. Pipetuj w górę i w dół, aby rozproszyć komórki i pozwól im osiąść przez pięć do 10 minut. Umieść szkiełko komory na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym w równowadze do 30 stopni Celsjusza.

Następnie użyj jasnego oświetlenia pola, aby zlokalizować pole komórek. Dodać 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki YNB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr metioniny do 200 mikrolitrów pożywki w studzience, aby uzyskać końcowe stężenie metioniny 20 mikrogramów na mililitr. Pozwól komórkom zrównoważyć się przez dwie minuty przed rozpoczęciem obrazowania.

Następnie bezpośrednio przed obrazowaniem należy ustawić mikroskop na żądanej płaszczyźnie ogniskowej. Rejestruj GFP w jasnym polu lub obrazy DIC w odstępach 5-minutowych przez 45 do 60 minut. Używanie identycznych parametrów akwizycji dla wszystkich obrazów w szeregach czasowych.

Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje. Określ ilościowo intensywność fluorescencji poszczególnych komórek w każdym punkcie czasowym i wyraź wartości jako procent początkowej intensywności pierwszego obrazu. Po wyeksportowaniu obrazów zgodnie z protokołem tekstowym w obrazie j, otwórz pliki w menu plików za pomocą opcji Otwórz.

Użyj obrazu fluorescencyjnego do oceny ilościowej, a obrazu jasnego pola lub obrazu DIC jako odniesienia do identyfikacji lokalizacji komórek. Wyklucz martwe komórki obecne, które wydają się ciemniejsze niż żywe komórki, gdy są oglądane przez DIC i autofluorescencję w kanale GFP. W przypadku obrazów z nierównym tłem w menu Proces wybierz algorytm odejmowania tła i wybierz ustawienie domyślne.

Po uzyskaniu obrazów ważne jest, aby wykonać odejmowanie tła przed przystąpieniem do procedury kwantyfikacji. Ten krok jest szczególnie ważny, ponieważ sygnał tła mógłby w przeciwnym razie maskować lub tłumić różnice między próbkami. Korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, obrysuj komórkę, upewniając się, że obejmuje całą komórkę, ale jak najmniej obszaru poza komórką.

Następnie w menu Analizuj użyj funkcji ustaw pomiary, aby zmierzyć obszar, zintegrowaną gęstość i średnią wartość szarości. Otwórz Menedżera ROI, klikając Analizuj, a następnie Narzędzia. W oknie Menedżer ROI kliknij przycisk Dodaj, aby wprowadzić podświetlony region jako nowy ROI.

Powtórz tworzenie konspektu i wykonywanie pomiarów dla pozostałych komórek na obrazie, z wyłączeniem martwych komórek lub komórek, które dotykają krawędzi obrazu. Zapisz wybrane ROI jako plik zip, klikając przycisk pomiaru, który wyświetli zmierzone wartości w nowym oknie. Następnie kliknij przycisk więcej i wyeksportuj wszystkie pomiary do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do analizy statystycznej.

Zaszczep dwie do trzech kolonii komórek drożdży i 0,5 mililitra pożywki YNB, bez dodatkowych składników odżywczych do utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj komórki na bębnie rolkowym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Dodaj jeden mililitr pożywki YNB pozbawionej dodatkowych składników odżywczych do utrzymania plazmidu i hoduj przez dodatkowe trzy godziny.

Następnie przenieś jeden mililitr komórek do każdej z dwóch pięciomililitrowych probówek o okrągłym dnie. Następnie dodaj 0,25 mililitra pożywki YNB Met do pierwszej probówki i 0,25 mililitra pożywki YNB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr metioniny do drugiej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mikrogramów na mililitr. W przypadku dużej liczby próbek należy rozłożyć dodawanie metioniny w czasie, aby uwzględnić czas na analizę faktów.

Nasz cytometr przepływowy może zmierzyć do 40 próbek na cykl. Metioninę dodajemy partiami. Osiem próbek co pięć minut.

Gwarantuje to, że wszystkie próbki są mierzone między 45 a 50 minutami po dodaniu metioniny. Inkubować komórki przez 45 minut. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, wybierając rozproszenie do przodu lub FS jako miarę wielkości komórki i zmapuj jedną płynącą intensywność fluorescencji z filtra FITC jako miarę internalizacji ładunku.

Podczas 45-minutowej inkubacji użyj przycisków suwaków, aby dostosować napięcie kanałów FS i FITC, aby zoptymalizować wykrywanie dla zakresu wielkości i intensywności fluorescencji używanych komórek drożdży. Zmierz FS i intensywność fluorescencji dla 10 000 komórek z każdego stanu. Korzystając z ustawienia wysokiego natężenia przepływu, wygeneruj wykres rozrzutu FS w zależności od intensywności fluorescencji, klikając przycisk Dodaj wykres.

Następnie wybierz FITC dla osi x i FS dla osi y i narysuj wykres 1000 punktów. Korzystając z funkcji bramki i warunku Met typu wild, przypisz bramkę pionową tak, aby około 5% najjaśniejszych komórek spadło na prawo od bramki. Użyj tego bramkowania dla wszystkich innych warunków w eksperymencie.

Jak pokazano tutaj, obrazowanie poklatkowe komórek wykonywano w pięciominutowych odstępach czasu przy braku lub obecności metioniny w celu monitorowania internalizacji Mup1 znakowanej GFP lub fluorem i zmian we fluorescencji. Zgodnie z oczekiwaniami, GFP i fluor znakowane Mup1 pozostały na błonie plazmatycznej pod nieobecność metioniny. W przeciwieństwie do tego, komórki zobrazowane w obecności metioniny wykazywały postępujące zubożenie sygnału fluorescencyjnego z powierzchni komórki, co było zgodne z internalizacją ładunku.

Jednak kinetyka fluorescencji utraconej w obecności metioniny była opóźniona w komórkach GFP Mup1 w porównaniu z komórkami Mup1 pHlourin. Te wykresy punktowe porównują intensywność fluorescencji komórek typu dzikiego lub czterech komórek delta ENTH1 w obecności lub braku metioniny po zastosowaniu bramki pionowej. 4% komórek Met typu dzikiego znajdowało się po prawej stronie bramki, odpowiadającej najjaśniejszym komórkom w populacji, podczas gdy 65% nieleczonych komórek typu dzikiego znajdowało się w bramce.

W przeciwieństwie do tego, cztery komórki delta ENTH1 nie wykazały różnicy w rozmieszczeniu jasnych i ciemnych komórek, co jest zgodne z defektem endocytozy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozłożeniu w czasie czasu rozpoczęcia jednoczesnego wykonywania eksperymentów, tak aby dane końcowe mogły być zebrane po tym samym czasie leczenia dla wszystkich próbek.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak genetyczne badania przesiewowe kwiatów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak nowe czynniki przyczyniające się do transportu pęcherzykowego. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transportem pęcherzykowym do zbadania aspektów ścierania endosomów, a także nowo odkrytego niezależnego i kwaśnego szlaku klatryny u pączkujących drożdży. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać ładunków typu florentnego do ilościowego określania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach.