Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie zdarzeń transportu pęcherzykowego w szlaku endocytycznym żywych komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transportu pęcherzykowego, takie jak wpływ mutacji lub zmian w ekspresji białek na tempo i wydajność zdarzeń transportowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej kwantyfikacji transportu endocytycznego w żywych komórkach poprzez pomiar intensywności fluorescencyjnie znakowanych białek ładunkowych.

Po przygotowaniu roztworów i pożywek zgodnie z protokołem tekstowym, zaszczep dwa do trzech kolonii komórek drożdży w pięciu mililitrach pożywki YNB, pozbawionej dodatkowych składników niezbędnych do utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj kultury w temperaturze 30 °C przy potrząsaniu przez 16 do 24 godzin. Około trzech godzin przed obrazowaniem zmierz OD 600 każdej kultury nocnej.

Następnie przygotuj rozcieńczenia o objętości pięciu mililitrów przy OD 600 wynoszącej 0,35 do 0,4 w pożywce YNB, pozbawionej dodatkowych składników odżywczych niezbędnych do utrzymania plazmidów, i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy potrząsaniu przez trzy godziny. Podczas inkubacji wstępnie wyrównaj temperaturę w komorze środowiskowej mikroskopu lub na podgrzewanym stoliku do 30 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu ośmiodobowej szklanej płytki oraz szkiełka przedmiotowego z komorą do obrazowania zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 200 mikrolitrów pożywki YNB pozbawionej dodatkowych składników odżywczych do selekcji plazmidów do każdej studzienki.

Po przygotowaniu kultur przenieś jeden mililitr do probówki typu microfridge i odwiruj komórki przy 8 000 RPM przez dwie minuty. Następnie usuń 975 mikrolitrów supernatantu. Resuspender osad komórkowy w pozostałym supernatancie.

Następnie nanieś 2,5 µL zawiesiny komórkowej do centrum każdej studni płytki ośmiodołkowej. Pipetuj ciecz w górę i w dół, aby rozprzestrzenić komórki, a następnie odczekaj od pięciu do 10 minut, aż komórki osadzą się na dnie. Umieść preparat na szkiełku z komorą w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym ustawionym na 30 °C.

Następnie, używając oświetlenia w polu jasnym, zlokalizuj pole komórek. Do 200 µL medium w studzience dodaj 50 µL uprzednio ogrzanego medium YNB zawierającego 100 µg/mL metioniny, aby uzyskać końcowe stężenie metioniny wynoszące 20 µg/mL. Pozostaw komórki na dwie minuty w celu wyrównania warunków przed rozpoczęciem obrazowania.

Następnie, bezpośrednio przed obrazowaniem, ustaw mikroskop na pożądaną płaszczyznę ogniskowania. Rejestruj obrazy GFP w polu jasnym lub DIC w odstępach 5-minutowych przez okres od 45 do 60 minut, stosując identyczne parametry akwizycji dla wszystkich obrazów w ramach serii czasowej.

Dodatkowe szczegóły znajdują się w protokole tekstowym. Ilościowo określ intensywność fluorescencji poszczególnych komórek w każdym punkcie czasowym i wyraź wartości jako procent początkowej intensywności pierwszego obrazu. Po wyeksportowaniu obrazów zgodnie z protokołem tekstowym w programie ImageJ, otwórz pliki w menu pliku, korzystając z opcji Open.

Do kwantyfikacji należy wykorzystać obraz fluorescencyjny, a obraz w jasnym polu lub obraz DIC jako referencję do identyfikacji lokalizacji komórek. Należy wykluczyć martwe komórki, które w obrazowaniu DIC wydają się ciemniejsze od komórek żywych i wykazują autofluorescencję w kanale GFP. W przypadku obrazów z nierównomiernym tłem, w menu Process należy wybrać algorytm odejmowania tła (background subtraction) i zastosować ustawienia domyślne.

Po pozyskaniu obrazów ważne jest wykonanie odejmowania tła przed przystąpieniem do procedury kwantyfikacji. Krok ten jest szczególnie istotny, ponieważ sygnał tła mógłby w przeciwnym razie zamaskować lub stłumić różnice między próbkami. Używając narzędzia do zaznaczania dowolnego kształtu, obrysuj komórkę, upewniając się, że objąłeś całą komórkę, ale jak najmniejszy obszar poza nią.

Następnie w menu Analyze użyj funkcji set measurements, aby zmierzyć pole powierzchni, zintegrowaną gęstość oraz średnią wartość szarości. Otwórz ROI Manager, klikającAnalyze, a następnie Tools. W oknie ROI Manager kliknij przycisk Add, aby wprowadzić zaznaczony obszar jako nowy ROI.

Powtórz obrysowywanie i pomiary dla pozostałych komórek na obrazie, z wyłączeniem komórek martwych oraz tych, które dotykają krawędzi obrazu. Zapisz wybrane obszary zainteresowania (ROI) jako plik zip, klikając przycisk pomiaru (measure), który wyświetli zmierzone wartości w nowym oknie. Następnie kliknij przycisk więcej (more) i wyeksportuj wszystkie pomiary do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do analizy statystycznej.

Zaszczep dwie do trzech kolonii komórek drożdży do 0,5 mililitra pożywki YNB, pozbawionej dodatkowych składników odżywczych niezbędnych do utrzymania selekcji plazmidu. Hoduj komórki na bębnie obrotowym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Dodaj jeden mililitr pożywki YNB pozbawionej dodatkowych składników do utrzymania plazmidu i hoduj przez kolejne trzy godziny.

Następnie przenieś 1 ml komórek do każdej z dwóch probówek o dnie okrągłym o pojemności 5 ml. Do pierwszej probówki dodaj 0,25 ml pożywki YNB Met, a do drugiej 0,25 ml pożywki YNB zawierającej 100 µg/ml metioniny, aby uzyskać końcowe stężenie 20 µg/ml. W przypadku dużej liczby próbek dodawaj metioninę w odstępach czasowych, aby zapewnić czas na analizę faktów.

Nasz cytometr przepływowy może pomieścić do 40 próbek w jednym przebiegu. Metioninę dodajemy partiami: osiem próbek co pięć minut.

Zapewnia to, że wszystkie próbki zostaną zmierzone od 45 do 50 minut po dodaniu metioniny. Inkubuj komórki przez 45 minut. Następnie poddaj komórki analizie metodą cytometrii przepływowej, wybierając rozproszenie przednie (forward scatter lub FS) jako miarę wielkości komórek oraz mapując intensywność fluorescencji z filtra FITC jako miarę internalizacji ładunku.

Podczas 45-minutowej inkubacji należy użyć przycisków suwaka, aby dostosować napięcie kanałów FS i FITC w celu optymalizacji detekcji dla zakresu wielkości oraz intensywności fluorescencji używanych komórek drożdżowych. Pomiar FS i intensywności fluorescencji należy przeprowadzić dla 10 000 komórek z każdego wariantu. Przy ustawieniu wysokiego przepływu należy wygenerować wykres rozrzutu FS w funkcji intensywności fluorescencji, klikając przycisk dodaj wykres.

Następnie wybierz FITC dla osi x oraz FS dla osi y i wykreśl 1000 punktów. Korzystając z funkcji bramkowania i warunku Met typu dzikiego, ustaw bramkę pionową w taki sposób, aby około 5% najjaśniejszych komórek znajdowało się po prawej stronie bramki. Zastosuj to bramkowanie dla wszystkich pozostałych warunków w eksperymencie.

Jak pokazano tutaj, obrazowanie timelapse komórek przeprowadzono w odstępach pięciominutowych w obecności lub przy braku metioniny, aby monitorować internalizację Mup1 znakowanego GFP lub fluoryną oraz zmiany fluorescencji. Zgodnie z oczekiwaniami Mup1 znakowany GFP i fluoryną pozostał w błonie komórkowej przy braku metioniny. Z kolei w komórkach obrazowanych w obecności metioniny zaobserwowano postępujący zanik sygnału fluorescencyjnego z powierzchni komórki, co jest zgodne z procesem internalizacji ładunku.

Jednakże kinetyka utraty fluorescencji w obecnościy metioniny była opóźniona w komórkach Mup1 GFP w porównaniu do komórek pHlourin Mup1. Te wykresy rozrzutu porównują intensywność fluorescencji komórek typu dzikiego lub czterech komórek delta ENTH1 w obecności lub przy braku metioniny po zastosowaniu bramki pionowej. 4% komórek typu dzikiego z Met znajdowało się po prawej stronie bramki, co odpowiadało najjaśniejszym komórkom w populacji, podczas gdy w bramce znajdowało się 65% nieleczonych komórek typu dzikiego.

W przeciwieństwie do nich, w przypadku czterech linii komórkowych delta ENTH1 nie stwierdzono różnic w rozkładzie komórek jasnych i ciemnych, co jest zgodne z obecnością defektu endocytozy. Po opanowaniu techniki ta może zostać wykonana w ciągu trzech do czterech godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby rozłożyć w czasie rozpoczęcie poszczególnych doświadczeń, tak aby dane końcowe mogły zostać zebrane po takim samym czasie inkubacji dla wszystkich próbek.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak genetyczne przesiewy kwiatowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, jakie nowe czynniki przyczyniają się do transportu pęcherzykowego. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie transportu pęcherzykowego do zbadania aspektów degradacji endosomów, a także nowo odkrytej, klatryno-niezależnej i kwaśnej ścieżki w drożdżach pączkujących. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie sposobu wykorzystania ładunków typu florent do ilościowego określania zdarzeń endocytozy w żywych komórkach.