Name: Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę bezetykietowej detekcji kwasów nukleinowych przy użyciu polianiliny. Technika ta jest ekonomiczna, czuła i pozwala rozróżniać różnice pojedynczych nukleotydów bez manipulacji enzymatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

1. Przetwarzalna synteza PANI
<ol>
	<li>W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml rozpuścić całkowicie anilinę (1 ml, 11 mmol) w 60 ml chloroformu. Mieszać przy 600 obr./min przez 5 minut i schłodzić do 0-5 °C z lodem. Zwykle zajmuje to 15-20 minut (rysunek 2A).</li>
	<li>Dodać dodecylobenzenosulfonian sodu (NaDBS) (7,44 g, 21 mmol) do roztworu aniliny w kolbie okrągłodennej, mieszając z prędkością 600 obr./min.</li>
	<li>Rozpuścić nadsiarczan amonu (APS) (3,072 g, 13,5 mmol) w 20 ml wody i dodawać go kroplami przez 30 minut, aby uniknąć przegrzania reakcji.</li>
	<li>Przeprowadzać reakcję w temperaturze 0-5 °C przez 24 godziny i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Obserwuj, że mieszanina reakcyjna początkowo zmienia kolor na mlecznobiały po 15 minutach, następnie ciemnobrązowy po 2 godzinach, a ostatecznie na ciemnozielony po 24 godzinach (rysunek 2B-F).</li>
	<li>Przefiltrować roztwór PANI-NaDBS za pomocą lejka Buchnera. Zmieszać z 80 ml chloroformu i 120 ml wody w rozdzielaczu (Rysunek 2G).</li>
	<li>Inkubować roztwór przez 24 godziny w temperaturze pokojowej i zebrać ciemnozieloną PANI z rozdzielacza, pozostawiając nieprzereagowane NaDBS i APS w wodnym supernatanicie.</li>
</ol>
2. Mieszanie sondy PANI i naświetlanie UV
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór PANI 10x chloroformem-wodą (1:3 v/v) i zmieszać 200 μl rozcieńczonego PANI z 6,4 μmol oligonukleotydów sondy DNA, delikatnie kołysząc przez 15 minut w probówce do mikrofuge.</li>
	<li>Napromieniać roztwór PANI-DNA promieniowaniem UV o stężeniu 1 200 μJ/cm2 w urządzeniu sieciującym przez 2 minuty. Bardzo ważne jest, aby ekspozycja na promieniowanie UV była ograniczona do wskazanej ilości. Przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV upośledza zmianę fluorescencji w PANI, prawdopodobnie z powodu kowalencyjnego sieciowania PANI i DNA.</li>
	<li>Kompleksy peletów przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 6 minut i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Ponownie wypluj i ponownie zawieś w PBS.</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja sondy PANI-probe
<ol>
	<li>Dodać 8 μl 100 μM komplementarnych oligonukleotydów DNA lub docelowych kwasów nukleinowych do 200 μl kompleksów sondy PANI.</li>
	<li>Przeprowadzić hybrydyzację przez kołysanie mieszaniny roztworu przez 15 minut w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Kompleksy PANI osadzać przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 6 minut. Przemyć PBS i ponownie zawiesić w wodzie.</li>
</ol>
4. Pomiar fluorescencji w stanie ustalonym emisji
<ol>
	<li>Dodać PANI z różnych zabiegów do 96-dołkowej mikropłytki i zmierzyć fluorescencję emisyjną w zakresie 270-850 nm przez wzbudzenie przy 250 nm. Szczyt emisji dla PANI powinien być obserwowany około 500 nm.</li>
</ol>
5. Pomiar mikroskopii fluorescencyjnej hybrydowego dupleksu
<ol>
	<li>Ułóż warstwę PANI na szkiełku nakrywkowym ze szkła borokrzemianowego i schnij w temperaturze 40 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Dodać sondę (8 μl ze 100 μM) na wysuszoną folię PANI i naświetlać ją światłem UV (1 200 μJ/cm2) przez 2 minuty.</li>
	<li>Umyj folię sondy PANIE za pomocą PBS i susz w temperaturze 40 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Przeprowadzaj hybrydyzację przez 15 minut, dodając docelowe kwasy nukleinowe. Może to być próbka biologiczna lub kontrolny oligonukleotyd docelowy (8 μl ze 100 μM). Następnie wykonaj pranie PBS.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne w 40-krotnym powiększeniu, z filtrem długoprzepustowym 500 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hahm, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polymers+in+protein+detection+platforms%3A+optical%2C+electrochemical%2C+electrical%2C+mass-sensitive%2C+and+magnetic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).</li>
<li>Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+hybridization+sensors+based+on+conducting+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers.</a> Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).</li>
<li>Sengupta, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Intrinsic+Properties+of+Polyaniline+to+Detect+Nucleic+Acid+Hybridization+through+UV-Enhanced+Electrostatic+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction.</a> Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).</li>
<li>Song, E., Choi, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conducting+Polyaniline+Nanowire+and+Its+Applications+in+Chemiresistive+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing.</a> Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyaniline+nanofibres+for+fluorescent+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection.</a> Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).</li>
<li>Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+DNA+Immobilized+onto+a+Highly+Oriented+Pyrolytic+Graphite+Electrode+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface.</a> Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28m-Phenylenediamine%29+Nanospheres+and+Nanorods%3A+Selective+Synthesis+and+Their+Application+for+Multiplex+Nucleic+Acid+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).</li>
<li>Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-chemical+structure+of+polyaniline+synthesized+by+self-stabilized+dispersion+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Res%22%5BJournal%5D)">Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization.</a> Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).</li>
<li>John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+solution+processable+conducting+polyaniline+by+inverted+emulsion+polymerization+using+didecyl+ester+of+4-sulfophthalic+acid+as+multifunctional+dopant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Polym+Sci+A%3A+Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant.</a> J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).</li>
<li>El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+polyaniline+nanostructures+in+micellar+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions.</a> J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).</li>
<li>Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Investigations+of+Polyaniline+Prepared+in+the+Presence+of+Dodecylbenzenesulfonic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Therm+Anal+Calorim%22%5BJournal%5D)">Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid.</a> J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).</li>
<li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyaniline-DBSA%2Forganophilic+clay+nanocomposites%3A+synthesis+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Met%22%5BJournal%5D)">Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization.</a> Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).</li>
<li>Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Polyaniline+Nanoparticles+in+Micellar+Solutions+as+Polymerization+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium.</a> Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).</li>
<li>Scales, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corona-Stabilized+Interpolyelectrolyte+Complexes+of+siRNA+with+Nonimmunogenic%2C+Hydrophilic%2FCationic+Block+Copolymers+Prepared+by+Aqueous+RAFT+Polymerization%E2%80%A0%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†.</a> Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).</li>
<li>Kadashchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+trions+in+conjugated+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+B%22%5BJournal%5D)">Localized trions in conjugated polymers.</a> Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).</li>
<li>Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+Biosensor+Based+on+Conducting+Polyaniline+nanotube+Array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array.</a> Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).</li>
<li>Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemically+fabricated+polyaniline+nanowire-modified+electrode+for+voltammetric+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eletrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization.</a> Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).</li>
</ol>

Prace były wspierane przez University of Southern Mississippi College of Science and Technology oraz Mississippi College of Science and Technology oraz program Mississippi INBRE (nagroda numer P204M103476 od National Institute of General Medical Science).

Czujnik kwasów nukleinowych oparty na PANIE wymaga solubilizacji polimeru w wodzie w celu interakcji z DNA i RNA. Dyspersja PANI w wodzie odbywa się za pomocą środków powierzchniowo czynnych, tworząc micele, jak wcześniej opisano8. Oprócz stosowanych tutaj NaDBS do syntezy przetwarzalnego PANI9,10 można również stosować inne anionowe środki powierzchniowo czynne, takie jak ester dodecylowy kwasu 4-sulfoftalowego, niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak etoksylowany nonylofenol lub kationow...

Sprzężone polimery oferują wiele opcji dla czujników molekularnych. Obejmuje to reakcje fluorescencyjne, elektroniczne i kolorymetryczne1. Podjęto wiele wysiłków w celu włączenia sprzężonych polimerów do czujników kwasów nukleinowych. Jednak większość systemów wymaga detekcji wtórnej, co ogranicza możliwości wykrywania2. Niedawno informowaliśmy o platformie czujników opartych na sprzężonym polimerze zbudowanej na polianilinie (PANI), która wykorzystuje właściwości tego polimeru, tworząc system bez etykiet3. PANI jest silnie sprzężonym elektroaktywnie polimerem o właściwościach takich jak fluorescencja i rezystancja, które są odpowiednie do pomiaru układów biologicznych4. Ekscytony w strukturze nie są zlokalizowane, co prowadzi do ruchliwości ładunku dodatniego między podjednostkami monomerycznymi. Zapewnia to elastyczne rusztowanie ładunków dodatnich, które mogą wchodzić w interakcje z ujemnie naładowanym szkieletem DNA5,6. Co ważne, elektrostatycznie przyłączone DNA jest zorientowane w taki sposób, że zasady azotowe mogą uczestniczyć w parowaniu zasad. Asocjacja z DNA zmienia właściwości elektroniczne PANI, efekt, który może być wzmocniony przez promieniowanie UV (ryc. 1)3. Za pomocą tego systemu oligonukleotydy komplementarne do docelowych kwasów nukleinowych mogą być unieruchomione na PANI. Liczne badania wykazały, że po hybrydyzacji elektrostatycznie adsorbowane oligonukleotydy dysocjują od PANI lub innych matryc kationowych z powodu zmian konformacyjnych spowodowanych przejściem na dwuniciową strukturę DNA3,5,7.
W systemie czujników, w którym mocowanie sondy moduluje właściwości sprzężonego polimeru, zdarzenia hybrydyzacji mogą być transdukowane bez etykiet lub enzymatycznej modyfikacji sond lub docelowych kwasów nukleinowych. Polimery sprzężone oferują dużą elastyczność w metodach wykrywania, z których jedną jest fluorescencja. Dzięki monitorowaniu fluorescencji PANI można wykryć stężenia docelowych kwasów nukleinowych już od 10-11 M (10 pM)3. Detekcja jest szybka, zachodzi w ciągu 15 minut od hybrydyzacji i jest specyficzna tam, gdzie można różnicować pojedyncze niedopasowanie w cząsteczce docelowej3. 
Produkcja czujników PANI-sensor jest prosta. Można wytworzyć PANI o wysokiej masie cząsteczkowej, która jest dobrze zdyspergowana w wodzie, przy użyciu standardowych procedur syntezy obejmujących monomer aniliny, środek powierzchniowo czynny i kontrolowane dodawanie utleniacza. Wydajność może być bardzo wysoka, a nieprzereagowany utleniacz usuwany przez mycie wodą, co zapewnia brak dalszego wzrostu PANI. Asocjacja sondy PANI-probe zachodzi spontanicznie po zmieszaniu, a tworzenie kompleksu jest wzmocnione przez łagodną ekspozycję na promieniowanie UV. Hybrydyzację można przeprowadzić natychmiast, a zmiany we fluorescencji PANI oznaczyć po krótkiej inkubacji. Prostota tej technologii sprawia, że jest ona łatwo dostępna dla wielu laboratoriów.

<table><tbody><tr><td>Anilina&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>A7401-500&nbsp;</td><td>ACS, płynne, chłodzone</td></tr><tr><td>Peroksydisiarczan amonu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A682-500&nbsp;</td><td>ACS, krystaliczne</td></tr><tr><td>Dodecylobenzenosulfonian sodu</td><td>Pfaltz & Bauer&nbsp;</td><td>D56340&nbsp;</td><td>95% solidny</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>MCX 10601&nbsp;</td><td>ciecz</td></tr><tr><td>Startery DNA</td><td>MWG operon</td><td>n/a</td><td>niestandardowa sekwencja DNA ~20&nbsp; Mikropłytka bps</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Amerykański Naukowiec&nbsp;</td><td>1402-9800&nbsp;</td><td>96 Cóż, polipropylen, ponieważ nie reaguje z chloroformem</td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna do mikropłytek</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>2920-0000&nbsp;</td><td>Zmniejsza zanieczyszczenie od studni do studni, rozlewanie próbek i parowanie</td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-D&nbsp;</td><td>PANI powlekane na naświetlanym promieniowaniem UV szkle nakrywkowym</td></tr><tr><td>Środek sieciujący UV&nbsp;</td><td>UVP&nbsp;</td><td>HL-2000&nbsp;</td><td>Energia: X100 &mu; J/cm2; Czas: 2 min</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>VWR</td><td>01014705 T</td><td>Temperatura: 400&nbsp; &#176; C; z bujaniem przez 15 min</td></tr><tr><td>Aparatura szklana&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Kolba okrągłodenna z trzema szyjkami do reakcji; lejek do zakraplania, korki, skraplacz, rozdzielacz</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica IMC S80</td><td>Powiększenie 20x; Pseudo kolor 536 nm; Ekspozycja 86 ms; Zysk 1,0x; Czytnik mikropłytek Gamma 1.6</td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Wykrywanie kwasów nukleinowych jest w centrum technologii diagnostycznych stosowanych w badaniach i klinice. Standardowe podejścia stosowane w tych technologiach opierają się na modyfikacji enzymatycznej, która może wprowadzać odchylenia i artefakty. Kluczowym elementem platform detekcyjnych nowej generacji będzie bezpośrednia detekcja molekularna, co pozwoli uniknąć konieczności amplifikacji lub etykietowania. Zaawansowane nanomateriały mogą zapewnić odpowiednie modalności chemiczne do realizacji czujników bez etykiet. Polimery sprzężone są idealne do wykrywania biologicznego, posiadają właściwości kompatybilne z biomolekułami i wykazują wysoką wrażliwość na zlokalizowane zmiany środowiskowe. W artykule przedstawiono metodę wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą elektroprzewodzącego polimeru polianiliny. Proste oligonukleotydy "sondowe" DNA komplementarne do docelowych kwasów nukleinowych są przyłączane elektrostatycznie do polimeru, tworząc system czujników, który może różnicować różnice między pojedynczymi nukleotydami w cząsteczkach docelowych. Poza specyficznym i bezstronnym charakterem tej technologii, jest ona wysoce opłacalna.

Rysunek 2A przedstawia układ reakcyjny na początku procesu polimeryzacji, i.e., przed dodaniem APS. Tworzenie miceli jest pierwszym etapem procesu reakcji – synteza PANI zachodzi na granicy fazy micelarnej. Rysunek 2B pokazuje mleczną zawiesinę po 5 min. 30 min po dodaniu APS roztwór zmienia kolor na lekko brązowy. Rysunek 2C przedstawia zmianę barwy związaną z tworzeniem się oligomerów. Rysunek 2D pokazuje ciemn...

Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza polianiliny dyspersyjnej w wodzie, która może być wykorzystana do bezetykietowej detekcji kwasów nukleinowych. Technika ta stanowi kosztowo efektywną metodę wykrywania kwasów nukleinowych. Laboratoria wdrażające tę metodę uznają ją za prostą, stabilną i czułą.Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona znakowania i może być wykorzystana do bezpośredniej detekcji RNA oraz DNA bez konieczności manipulacji enzymatycznych. Technika ta ma potencjał w tworzeniu nowych technologii diagnostycznych, a dzięki brakowi konieczności znakowania może być stosowana do przetwarzania próbek pacjentów przy minimalnej manipulacji. Demonstracja wizualna pomoże wyjaśnić zasadę działania sensora.Platforma ta obejmuje naukę o polimerach oraz biologię, co może wydawać się bardzo egzotyczne, lecz w rzeczywistości jest niezwykle łatwe do wdrożenia. Całkowicie rozpuścić anilinę w 60 ml chloroformu w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml. Po mieszaniu przy 600 RPM przez pięć minut schłodzić do temperatury od zero do pięciu stopni Celsius z użyciem lodu.Zazwyczaj trwa to od 15 do 20 minut. Następnie do roztworu aniliny w kolbie okrągłodennej dodaj dodecylobenzenosulfonian sodu, mieszając przy 600 RPM. Rozpuść nadtlenek amonu w 20 ml wody i dodawaj go kroplami przez 30 minut, aby uniknąć przegrzania reakcji.Przeprowadzać reakcję w temperaturze od 0 do 5 °C przez 24 godziny. Obserwować mieszaninę reakcyjną, która początkowo po 15 minutach staje się mlecznobiała, następnie po dwóch godzinach ciemnobrązowa, a ostatecznie po 24 godzinach ciemnozielona. Następnie pozostawić ją w temperaturze pokojowej przez kolejne 24 godziny.Przefiltruj roztwór PANI z dodecylobenzenosulfonianem sodu za pomocą lejka Buchnera. Wymieszaj filtrat z 80 ml chloroformu i 120 ml wody w rozdzielaczu. Inkubuj roztwór przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie zbierz ciemnozieloną PANI z rozdzielacza, pozostawiając nieprzereagowany dodecylobenzenosulfonian sodu i APS w wodnym nadfiltracie.Rozcieńczyć 10-krotny roztwór PANI w wodzie z chloroformem, a następnie zmieszać 200 µl rozcieńczonego PANI z 6,4 µmol oligonukleotydów sondy DNA poprzez delikatne kołysanie przez 15 minut w probówce do wirówki. Naświetlić roztwór PANI DNA dawką 1200 µJ/cm² promieniowania UV w urządzeniu do sieciowania przez dwie minuty. Kluczowe jest, aby ekspozycja na UV była ograniczona do wskazanej wartości.Przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV upośledza zmianę fluorescencji PANI, co prawdopodobnie wynika z kowalencyjnego sieciowania PANI i DNA. Kompleksy należy sfragmentować przez wirowanie przy 17 000 x g przez sześć minut i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS. Po ponownym wirowaniu należy resuspendować w PBS.Dodaj 8 µL komplementarnych oligonukleotydów DNA lub docelowych kwasów nukleinowych o stężeniu 100 µM do 200 µL kompleksów sond PANI. Przeprowadź hybrydyzację, delikatnie mieszając roztwór przez 15 minut w temperaturze 40 °C. Po wytrąceniu kompleksów PANI poprzez wirowanie przy 17 000 ×g przez sześć minut, przemyj je buforem PBS i resuspenduj w wodzie.Nanieś PANI z różnych serii badań na mikropłytkę 96-dołkową i zmierz fluorescencję emisyjną w zakresie od 270 do 850 nanometrów przy wzbudzeniu przy 250 nanometrach. Piku emisji dla PANI powinien być obserwowany w okolicach 500 nanometrów. Aby przeprowadzić pomiar mikroskopii fluorescencyjnej zhybrydyzowanego dupleksu, nanieś PANI metodą drop-coating na szklaną nakrywkę borokrzemianową i susz w temperaturze 40 °C przez 48 godzin.Nanieś 8 µL sondy o stężeniu 100 µM na wysuszoną warstwę PANI, a następnie naświetlaj ją światłem UV przez dwie minuty. Po naświetlaniu przemyj warstwę sondy PANI buforem PBS i susz w temperaturze 40 °C przez 48 godzin. Przeprowadź hybrydyzację przez 15 minut, dodając docelowe kwasy nukleinowe.Może to być próbka biologiczna lub kontrolowany docelowy oligonukleotyd. Następnie należy przeprowadzić przemywanie w PBS. Obrazy fluorescencyjne należy uzyskać przy powiększeniu 40x, stosując filtr długoprzepustowy 500 nm.Przedstawiono tutaj oddziaływanie elektrostatyczne między PANI a sondami DNA, wzmocnione naświetlaniem UV. Hybrydyzacja docelowego kwasu nukleowego wywołuje tworzenie dupleksu, zmieniając konformację strukturalną, co prowadzi do dysocjacji kompleksu sonda-cel z powierzchni PANI. Rysunek ten pokazuje zmianę fluorescencji PANI w obecności lub przy braku sondy, zarówno w roztworze, jak i w medium w postaci powłoki stałej.Wzrost fluorescencji wynika z przepływu elektronów z ujemnie naładowanego DNA, co zwiększa gęstość elektronową polimeru. Po hybrydyzacji komplementarnych oligonukleotydów docelowych sondy odrywają się, co prowadzi do przywrócenia fluorescencji podstawowej. Z kolei hybrydyzacja z pojedynczymi niedopasowanymi oligonukleotydami docelowymi nie prowadzi do przywrócenia fluorescencji podstawowej.Główną nowością tej techniki jest wykorzystanie łagodnego promieniowania UV do precyzyjnej interakcji, co w rzeczywistości pomaga odróżnić oddziaływania nieswoiste od tych indukowanych światłem. Po opanowaniu metoda ta może zająć do dwóch godzin, z wyłączeniem czasu inkubacji oraz czasu schnięcia powłok. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że DNA rozpuszcza się w wodzie, a kwaśny roztwór zmienia właściwości elektroniczne PANI.Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni dobrze zrozumieć, jak syntetyzować polianilinę dyspergowaną w wodzie oraz jak wykorzystać jej właściwości fluorescencyjne do detekcji kwasów nukle nowych. Będą oni w stanie unieruchomić sondy DNA i przeprowadzić hybrydyzację w celu wykrycia celów. Podczas pracy z monomerem należy pamiętać, że synteza ta jest niebezpieczna i powinna być przeprowadzana w dygestorium przy użyciu środków ochrony osobistej, takich jak okulary ochronne, rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.

a-polyaniline-based-sensor-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny –...

Test biosensoryczny konduktometryczny na bazie β-laktamazy do interakcji białko-białko

Synteza asymetrycznych gatunków ferrocenu jest wyzwaniem przy użyciu technik rozwiązań.  Niniejszy raport koncentruje się na metodach przeprowadzonych w celu wytworzenia biokoniugatu ferrocen-biotyna przy użyciu łatwych i czystych reakcji przeprowadzanych w drodze syntezy w fazie stałej.  Wykazano, że włączenie ugrupowania tiolanowego nadaje zdolność do unieruchamiania na powierzchniach złota.

Metodologia syntezy asymetrycznych układów biosprzężonych pochodzących z ferrocenu za pomocą metodologii opartej na żywicy w fazie stałej

Opisujemy kluczowe etapy biodetekcji za pomocą tranzystorów polowych z polikrzemu nanoprzewodowego, w tym przygotowanie urządzenia oraz immobilizację i potwierdzenie sondy molekularnej DNA na powierzchni nanodrutu, a także warunki do wykrywania DNA.

Przygotowanie tranzystora polowego z nanodrutu krzemowego do zastosowań chemicznych i biosensorycznych

Przedstawiamy protokół inżynierii fazy koronowej w bliskiej podczerwieni fluorescencyjnych jednościennych nanorurek węglowych (SWNT) przy użyciu amfifilowych polimerów i DNA do opracowania czujników dla celów molekularnych bez znanych elementów rozpoznających.

Inżynieria rozpoznawania molekularnego za pomocą polimerów biomimetycznych na jednościennych nanorurkach węglowych

W tej pracy opisujemy nową metodę badania interakcji białko-białko za pomocą konduktometrycznego biosensora opartego na technologii hybrydowej β-laktamazy. Metoda ta polega na uwalnianiu protonów w wyniku hydrolizy β-laktamów.

Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Tutaj przedstawiamy protokół produkcji chemicznie zredukowanego mikroczujnika pH z powłoką Nafion, funkcjonalizowanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu. Ten półprzewodnikowy czujnik pH oparty na chemiorezystorze może wykrywać zmiany pH w czasie rzeczywistym podczas procesu fermentacji Lactococcus lactis.

Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej

Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).

Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj metodę bezetykietowej detekcji kwasów nukleinowych przy użyciu polianiliny. Technika ta jest ekonomiczna, czuła i pozwala rozróżniać różnice pojedynczych nukleotydów bez manipulacji enzymatycznej.

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

Przeglądaj więcej filmów