Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

Ogólnym celem tej procedury jest synteza zdyspersjonowanej w wodzie polianiliny, która mogłaby być wykorzystana do wykrywania kwasów nukleinowych w sposób bezznacznikowy. Technika ta jest opłacalną metodą wykrywania kwasów nukleinowych. Laboratoria, które go przyjmą, uznają go za łatwy, solidny i czuły.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nie zawiera znaczników i może być używana do bezpośredniego wykrywania RNA i DNA bez konieczności manipulacji enzymatycznej. Technika ta ma potencjał dla nowych technologii diagnostycznych, a ponieważ nie wykorzystuje etykiety, może być używana do przetwarzania próbek pacjentów przy niewielkiej manipulacji. Demonstracja wizualna pomoże zdemistyfikować czujnik.

Platforma ta obejmuje naukę i biologię polimerów, które wydają się bardzo egzotyczne, ale w rzeczywistości są niezwykle łatwe do wdrożenia. Rozpuścić całkowicie anilinę w 60 ml chloroformu w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml. Po mieszaniu z prędkością 600 obr./min przez pięć minut schłodzić lodem do zera do pięciu stopni Celsjusza.

Zwykle zajmuje to od 15 do 20 minut. Następnie dodać dodecylobenzenosulfonian sodu do roztworu aniliny w kolbie okrągłodennej, mieszając przy 600 obr./min. Rozpuść nadsiarczan amonu w 20 ml wody i dodawaj go kroplami przez 30 minut, aby uniknąć przegrzania reakcji.

Reakcję przeprowadzać w temperaturze od zera do pięciu stopni Celsjusza przez 24 godziny. Obserwuj, jak mieszanina reakcyjna początkowo zmienia kolor na mlecznobiały po 15 minutach, następnie ciemnobrązowy po dwóch godzinach, a ostatecznie na ciemnozielony po 24 godzinach. Następnie pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową przez kolejne 24 godziny.

Przefiltrować roztwór dodecylobenzenosulfonianu sodu PANI za pomocą lejka Buchnera. Wymieszać filtrat z 80 ml chloroformu i 120 ml wody w rozdzielaczu. Inkubować roztwór przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie zebrać ciemnozielony PANI z rozdzielacza, pozostawiając nieprzereagowany dodecylobenzenosulfonian sodu i APS w wodnym supernatancie.

Rozcieńczyć roztwór PANI 10 X wodą chloroformową, a następnie wymieszać 200 mikrolitrów rozcieńczonego PANI z 6,4 mikromolami oligonukleotydów DNA sondy, delikatnie kołysząc przez 15 minut w probówce do mikrofuge. Napromieniać roztwór DNA PANI 1200 mikrodżulami na centymetr kwadratowy promieniowania UV w urządzeniu sieciującym przez dwie minuty. Bardzo ważne jest, aby ekspozycja na promieniowanie UV była ograniczona do wskazanej ilości.

Przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV upośledza zmianę fluorescencji w PANI, prawdopodobnie z powodu kowalencyjnego przecieku krzyżowego PANI i DNA. Kompleksy osadów przez odwirowanie przy 17 000 x g przez sześć minut i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS. Po ponownym granulowaniu ponownie zawiesić w PBS.

Dodaj osiem mikrolitrów 100 mikromolowych komplementarnych oligonukleotydów DNA lub docelowych kwasów nukleinowych do 200 mikrolitrów kompleksów sondy PANI. Przeprowadź hybrydyzację, kołysząc mieszaniną roztworu przez 15 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po zagnieżdżeniu kompleksów PANI przez odwirowanie w ilości 17 000 x g przez sześć minut, przemyć PBS i ponownie zawiesić w wodzie.

Dodaj PANI z różnych zabiegów do 96-dołkowej mikropłytki i zmierz fluorescencję emisyjną w zakresie od 270 do 850 nanometrów przez wzbudzenie przy 250 nanometrach. Szczyt emisji dla PANI powinien być obserwowany w okolicach 500 nanometrów. Aby wykonać pomiar mikroskopii fluorescencyjnej hiberdyzowanego dupleksu, nałóż warstwę PANI na szkiełko nakrywkowe ze szkła borokrzemianowego i susz w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Dodaj osiem mikrolitrów sondy o mocy 100 mikromolów na wysuszoną folię PANI, a następnie naświetlaj ją światłem UV przez dwie minuty. Po napromieniowaniu umyj folię sondy PANI PBS i susz w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Wykonuj hybrydyzację przez 15 minut, dodając docelowe kwasy nukleinowe.

Może to być próbka biologiczna lub kontrolowany oligonukleotyd docelowy. Następnie wykonaj pranie PBS. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne w powiększeniu 40x za pomocą filtra przepustowego o długości 500 nanometrów.

Pokazano tutaj oddziaływanie elektrostatyczne sond PANI i DNA wzmocnione promieniowaniem UV. Hybrydyzacja docelowego kwasu nukleinowego wyzwala tworzenie dupleksu, zmieniając potwierdzenie strukturalne, co powoduje dysocjację celu sondy od powierzchni PANI. Rysunek ten przedstawia zmianę fluorescencji PANI przy braku lub obecności sondy, zarówno w roztworze, jak i w stałym ośrodku powlekającym.

Wzrost fluorescencji jest spowodowany strumieniem elektronów z ujemnie naładowanego DNA, zwiększając gęstość elektronów polimeru. Po hybrydyzacji komplementarnych docelowych oligonukleotydów sondy odłączają się, prowadząc do przywrócenia fluorescencji bazylii. I odwrotnie, hybrydyzacja z pojedynczymi niedopasowanymi docelowymi oligonukleotydami nie powoduje przywrócenia fluorescencji bazylii.

Główną nowością tej techniki jest to, że wykorzystuje ona łagodne promieniowanie UV do dokładnej interakcji, co faktycznie pomaga jej odróżnić interakcję niespecyficzną i lekką. Po opanowaniu tej techniki może to zająć do dwóch godzin, nie licząc czasu zmysłów i czasu schnięcia powłok. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że DNA rozpuszcza się w wodzie, a kwaśna herbata faktycznie zmienia właściwości elektroniczne PANI.

Po obejrzeniu tego filmu widzowie powinni dobrze zrozumieć, jak syntetyzować zdyspersjonowaną w wodzie polianilinę i wykorzystywać jej właściwości fluorescencyjne do wykrywania kwasów nukleinowych. Będą one w stanie unieruchomić DNA sondy i przeprowadzić hybrydyzację w celu wykrycia celów. Pracując z monomerem, należy pamiętać, że ta synteza jest niebezpieczna i powinna być przeprowadzana w kapturze ze sprzętem ochronnym, takim jak okulary ochronne, rękawice i fartuchy laboratoryjne.