Name: Izolacja i aktywacja mysich limfocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów mysich z wykorzystaniem mikrokulek magnetycznych anti-CD43 do badań immunologicznych. Technika umożliwia szybką puryfikację komórek z minimalnym stresem środowiskowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie jest wspierane przez Ministerstwo Edukacji Singapuru (AcRF Tier1-RG40/13 i Tier2-MOE2013-T2-2-038). Rękopis został zredagowany przez Amy Sullivan z Obrizus Communications.

Wszystkie myszy są hodowane i utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie protokoły na myszach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Przygotowanie i odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj kompletne podłoże Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS), 2 mM L-glutamina, penicylina (100 IU/ml)/streptomycyna (100 μg/ml), 55 μM 2-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Przygotuj oddzielnie 20x Zbilansowany roztwór soli (BSS) Zapas 1 i Zapas 2.
	<ol>
		<li>Przygotuj 20x BSS stock 1 (111 mM dekstrozy, 8,8 mM fosforanu potasu, 26,7 mM fosforanu sodu dwuzasadowego w 1 l sterylnej wody) i dodaj 40 ml 0,5% czerwieni fenolowej do 20x BSS stock 1 przed ostateczną regulacją objętości. Sterylny filtr z filtrem 0,2 μm przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj 20x BSS stock 2 (25,8 mM dwuwodnego chlorku wapnia, 107 mM chlorku potasu, 2,73 M chlorku sodu, 19,6 mM sześciowodnego chlorku magnezu, 16,6 mM siarczanu magnezu w 1 l sterylnej wody). Sterylny filtr z filtrem 0,2 μm przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby przygotować 1x BSS do użytku eksperymentalnego, rozcieńczyć 50 ml bulionu BSS 1 i 50 ml bulionu BSS 2, oddzielnie, w 400 ml sterylnej wody każdy. Połączyć oba rozcieńczone roztwory, dostosować do pH 7 i dodać 20 ml FBS (2%). Uzupełnić do 1 l sterylną wodą i sterylnym filtrem za pomocą filtra 0,2 μm. 
		UWAGA: Roztwory podstawowe BSS należy przygotowywać oddzielnie, ponieważ bezpośrednie mieszanie skoncentrowanych roztworów BSS może spowodować wytrącanie się osadów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC)
	<ol>
		<li>Aby przygotować bufor do lizy RBC, przed użyciem wymieszaj 9 części podstawowego chlorku amonu (155 mM chlorku amonu w sterylnej wodzie) z 1 częścią podstawowej zasady Tris (130 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu w sterylnej wodzie, pH 7,65). 
		UWAGA: Sterylne roztwory podstawowe chlorku amonu i tris-zasady należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować świeży bufor do lizy, aby zapewnić skuteczną lizę erytrocytów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytwarzanie zawiesiny limfocytów ze śledziony lub węzłów chłonnych
UWAGA: Ważne jest, aby przygotować wszystkie odczynniki i sprzęt potrzebne do eksperymentu przed eutanazją myszy i jak najszybciej wytworzyć zawiesiny limfocytów w pojedynczych komórkach, aby utrzymać wysoką żywotność komórek.
<ol>
	<li>Eutanazja myszy eksperymentalnej przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2. 
	UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie procedury eksperymentalne powinny być wykonywane aseptycznie.</li>
	<li>Zanurz całą mysz w 70% etanolu przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. Usunąć śledzionę i węzły chłonne w aseptyki8 i umieścić je w oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml zawierających 5 ml lodowatego RPMI/FBS (RPMI z 2% FBS) lub BSS/FBS (od kroku 1.2.3). 
	UWAGA: Ponieważ BSS zapobiega efektywnej lizie RBC, użyj RPMI do przygotowania zawiesiny komórek śledziony i przełącz się na BSS po lizie RBC.</li>
	<li>Aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki ze śledziony lub węzłów chłonnych, należy umieścić narząd (narządy) między dwoma kawałkami sterylnej siatki sitowej o wielkości 100 μm na szalce Petriego zawierającej 2 ml lodowatego RPMI/FBS lub BSS/FBS. Używając tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, rozgnieć narząd (narządy), aż zostanie rozerwany na bardzo drobne części.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i umyć siatkę sitka komórkowego lodowatym środkiem RPMI/FBS lub BSS/FBS. Zebrać pozostałą zawiesinę komórkową, dodać ją do tej samej probówki o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 453 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. 
	UWAGA: Ponownie zawiesić granulowane komórki, przesuwając probówkę palcami przed dodaniem buforu do lizy RBC lub pożywki w kolejnych krokach.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy RBC o temperaturze pokojowej (RT) podczas wirowania zawiesiny komórek (patrz krok 1.3). Po zagnieżdżeniu komórek i usunięciu supernatantu, ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml buforu do lizy RBC na każde10-8 komórek. Inkubować reakcję lizy w temperaturze pokojowej przez 3-4 minuty.</li>
	<li>Zatrzymać lizę RBC za pomocą 14 ml lodowatego BSS/FBS i wirować przy 453 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie komórek B i T
<ol>
	<li>Oczyszczanie limfocytów B
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić do 108 komórek śledziony w 300 μl BSS/FBS i dodać 50 μl mikrokulek magnetycznych anty-CD439,10. Aby usunąć martwe komórki, dodaj 30 μl kulek magnetycznych Aneksyny V. Zawiesinę komórkową inkubować w lodówce o temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie limfocytów T
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić do 108 komórek w koktajlu przeciwciał przeciwko zubożeniu limfocytów T (biotynylowane przeciwciała przeciwko CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 i CD4 lub CD8 w zależności od docelowej populacji komórek, która ma być oczyszczona), rozcieńczony w stosunku 1:200 w 200 μl BSS/FBS4,5. Zawiesinę komórkową inkubować w lodówce o temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 10 ml BSS/FBS w celu przepłukania komórek i odwirowywać w temperaturze 453 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 165 μl BSS/FBS z 30 μl mikrogranulek streptawidyny i 15 μl kulek magnetycznych aneksyny V. Zawiesinę komórkową inkubować w lodówce o temperaturze 4 °C przez 30 min. 
		UWAGA: Aby zapewnić równomierne etykietowanie za pomocą mikrokulek magnetycznych, inkubować komórki z mikrogranulkami przez 15 minut, a następnie delikatnie wymieszać zawiesinę komórek, stukając w probówkę 15 ml i inkubować kolejne 15 minut w kroku 3.1.1. lub 3.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kolumny separacyjnej do oczyszczania komórek
	<ol>
		<li>Przygotować nieużywaną kolumnę separacyjną podczas znakowania komórek mikrokulkami (etap 3.1.1. lub 3.2.2.). Wstępnie podgrzej BSS (bez FBS) do RT i użyj 2 ml do aseptycznego umycia i wyrównania kolumny. Po zrównoważeniu z BSS nie należy dopuścić do wyschnięcia umytej kolumny. 
		UWAGA: Używamy kolumny LS zamiast zalecanej kolumny LD ze względu na jej możliwość ponownego użycia (patrz krok 3.4.).</li>
		<li>Po oznaczeniu kulkami magnetycznymi dodać 14 ml BSS/FBS w celu umycia komórek i wirować w temperaturze 453 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1-3 ml RT BSS.</li>
		<li>Przymocuj sterylną igłę 21 G do końcówki kolumny, aby zmniejszyć natężenie przepływu podczas procesu oczyszczania. Załadować zawiesinę komórek na zrównoważoną kolumnę i zebrać przepływ przez nią zawierającą oczyszczone komórki docelowe. 
		UWAGA: Unikaj wprowadzania bąbelków do kolumny podczas ładowania.</li>
		<li>Przemyć kolumnę raz 1 ml BSS/FBS i zebrać przepływ przez oczyszczone komórki docelowe. Ponownie załaduj kolumnę przepływem. Zebrać przepływ po drugim załadowaniu do tej samej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 3 razy 1 ml BSS/FBS i zebrać przepływ przez oczyszczone komórki docelowe. Następnie dodać 5 ml BSS/FBS do kolumny i za pomocą tłoka wypłukać magnetycznie znakowane komórki z kolumny do nowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Sprawdzić czystość komórek pobranych za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciał wiążących się z antygenami powierzchniowymi oczyszczonych limfocytów B lub T4,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowne użycie kolumny separacyjnej 
	UWAGA: Kolumna LS może być ponownie użyta do 4 razy bez wpływu na wydajność oczyszczania.
	<ol>
		<li>Przemyć kolumnę 3 razy 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 3 razy 5 ml wody destylowanej od góry za pomocą tłoka.</li>
		<li>Umyj kolumnę 5 ml 70% etanolu i dokładnie wysusz kolumnę za pomocą kranu powietrznego, aby zapobiec gromadzeniu się rdzy w kolumnie.</li>
		<li>Aby przygotować używaną kolumnę LS do oddzielnego eksperymentu oczyszczania, należy umyć kolumnę od dołu do góry 5 ml 70% etanolu za pomocą adaptera strzykawki. Następnie przemyć kolumnę od dołu do góry dwukrotnie 5 ml sterylnego PBS, a następnie 5 ml PBS raz od góry kolumny. Dodaj 2 ml RT BSS, aby zrównoważyć kolumnę, a następnie przystąp do ładowania kolumny komórkami oznaczonymi etykietami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Etykietowanie i stymulacja CFSE
UWAGA: Oczyszczone komórki mogą być poddawane różnorodnym testom funkcjonalnym in vitro i in vivo. Tutaj używamy oczyszczonych limfocytów T do określenia zdolności stymulacji limfocytów T APC5.
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzany roztwór do etykietowania (0,1% FBS w PBS) do 37 °C przed załadunkiem CFSE. 
	UWAGA: Użycie niskiego procentu FBS w PBS zmniejsza śmierć komórek podczas ładowania CFSE i minimalizuje utratę komórek podczas wirowania. Jednak zbyt duża ilość FBS może zakłócać ładowanie CFSE.</li>
	<li>Oczyszczone komórki przemyć dwukrotnie roztworem do znakowania, a następnie ponownie zawiesić w stężeniu 2 x 107 komórek/ml we wstępnie podgrzanym roztworze do znakowania w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przygotować 10 μM roztwór CFSE (rozcieńczenie 1:500 5 mM roztworu podstawowego CFSE) we wstępnie podgrzanym roztworze do etykietowania. Roztwór CFSE powinien być za każdym razem przygotowywany na nowo, aby uzyskać optymalne oznakowanie.</li>
	<li>Aby załadować komórki CFSE, dodaj 1 część zawiesiny komórek do 1 części 10 μM roztworu CFSE w probówce o pojemności 15 ml i inkubuj w ciemności przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Końcowe stężenie 5 μM CFSE służy do znakowania 1 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Odwróć rurkę co 2 minuty, aby zapewnić jednorodną mieszaninę komórek podczas ładowania CFSE.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję, dodać kilka objętości lodowatej pożywki o pełnym RPMI i wirować w temperaturze 453 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po pomyślnym załadowaniu CFSE granulka komórki będzie miała kolor żółtawy.</li>
	<li>Umyj komórki naładowane CFSE jeszcze raz lodowatą pożywką Full RPMI i wiruj w temperaturze 453 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C przed użyciem do hodowli in vitro lub stymulacji in vivo.</li>
</ol>
5. Stymulacja in vitro
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotować 2x roztwór podstawowy bodźców (2x roztwór podstawowy bodźców) tak, aby 100 μl roztworu podstawowego 2x bodźców można było dodać do 100 μl komórek do końcowej objętości 200 μl na studzienkę na płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Jeśli wymagana jest płytka pokryta bodźcami (IgM lub CD40 dla limfocytów B lub CD3 i CD28 dla limfocytów T), należy rozcieńczyć bodźce w PBS i wstępnie pokryć płytkę hodowlaną w temperaturze 4 °C przez noc. Alternatywnie, płytka hodowlana może być powlekana w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w dniu doświadczenia. Umyj powlekaną płytkę dwukrotnie za pomocą PBS (w żadnym momencie nie dopuścić do wyschnięcia płytki).</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dla komórek B </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bodziec </td>
			<td>Końcowe stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F(ab')2 koza anty-mysia IgM</td>
			<td>0,6-2,4 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało przeciw myszom CD40</td>
			<td>0,5-2 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mysz rekombinowana IL-4</td>
			<td>25 j./ml </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolisacharyd</td>
			<td rowspan="2">0,1-10 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(LPS) z E. coli Serotyp 055:B5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dla limfocytów T </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bodziec </td>
			<td>Końcowe stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 (powlekany płytą)</td>
			<td>2-10 μg /ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(50 μl/studzienkę do powlekania)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anty-CD28 (powlekany płytą) </td>
			<td>2 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowana IL-2</td>
			<td>40 j./ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDBu (ester Phorbol)</td>
			<td>5-50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A23187 (jonofor wapnia)</td>
			<td>250 ng/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Stężenia bodźców stosowanych do stymulacji limfocytów w hodowli in vitro.
<ol start="3">
	<li>W przypadku komórek B znakowanych CFSE ponownie zawiesić do 3 x 106 komórek/ml w kompletnej pożywce RPMI i hodować w trzech egzemplarzach z 3 x 105 komórek/basenik na 96-dołkowych płytkach o płaskim dnie przez 72 godziny.</li>
	<li>W przypadku limfocytów T znakowanych CFSE ponownie zawiesić do 0,5-3 x 106 komórek/ml w kompletnej pożywce RPMI i hodować w trzech egzemplarzach z 0,5-3 x 105 komórek/studzienka w 96-dołkowych płytkach o okrągłym dnie przez 48 lub 72 godziny.</li>
</ol>
6. Stymulacja in vivo 
<ol>
	<li>W przypadku stymulacji in vivo należy adoptywnie przenieść 4 x 106 limfocytów T znakowanych CFSE na mysz (dożylnie (dożylnie) w 200 μl PBS) do każdej myszy biorcy dopasowanej do MHC. 
	UWAGA: W tym protokole limfocyty T znakowane CFSE mogą być adoptywnie przenoszone za pomocą żyły ogonowej lub wstrzyknięcia zaoczodołowego, ponieważ komórki te będą domem dla narządów limfatycznych, takich jak śledziona i węzły chłonne.</li>
	<li>Rzuć wyzwanie myszom biorcy dzień później za pomocą antygenu. 
	UWAGA: W tym przykładzie używamy albuminy jaja kurzego (białko OVA, 50 μg / mysz) jako antygenu, ponieważ specyficzne dla OVA, transgeniczne receptory limfocytów T (TCR) zostały adoptywnie przeniesione do myszy biorców. Przygotować białko OVA w sterylnym PBS i wstrzyknąć 100 μl białka OVA/PBS lub kontroli PBS, poprzez wstrzyknięcie podskórne (si), każdej myszy biorcy5.</li>
	<li>Zbierz i wygeneruj zawiesiny pojedynczych komórek z narządów limfatycznych (węzłów chłonnych i śledziony) myszy biorców 3 dni po immunizacji białkiem OVA lub PBS. Podziel węzły chłonne na proksymalne węzły chłonne (pLN), które obejmują węzły chłonne pachowe, ramienne i powierzchowne szyjne) i dystalne węzły chłonne (dLN), które obejmują węzły chłonne krezkowe, podkolanowe, pachwinowe, lędźwiowe i ogonowe. Wybarwić komórki za pomocą odpowiednich przeciwciał FACS w celu sprawdzenia proliferacji limfocytów T. 
	UWAGA: W tym eksperymencie śledzenia komórek CFSE limfocyty T znakowane CFSE od myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto PBS, ustanawiają wyjściową fluorescencję dla komórek niedzielących się. Podziały komórkowe proliferujących, stymulowanych antygenem, znakowanych CFSE komórek są wizualizowane poprzez pomiar pików fluorescencji12,13. Dzięki kontroli PBS można określić liczbę podziałów komórkowych proliferujących limfocytów T znakowanych CFSE12,13.</li>
	<li>Przeanalizuj dane dotyczące proliferacji komórek znakowane CFSE, porównując liczbę podziałów komórkowych lub pików między próbkami (ryc. 1 i 2). 
	UWAGA: Na przykład, znakowane CFSE, specyficzne dla OVA limfocyty T adoptywnie przeniesione do myszy biorców otrzymujących antygen OVA ulegną aktywnej proliferacji w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto PBS5,12. Ponadto warto zauważyć, że istnieje wiele sposobów analizy danych dotyczących proliferacji komórek CFSE, jak wykazano przez Hawkinsa i współpracowników14.</li>
</ol>

<ol><li>Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+important+facets+of+T-cell+repertoire+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The many important facets of T-cell repertoire diversity.</a> Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).</li>
<li>LeBien, T. W., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes%3A+how+they+develop+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li>
<li>Brownlie, R., Zamoyska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signaling+networks%3A+branched%2C+diversified+and+bound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).</li>
<li>Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-rel+regulates+ezh2+expression+in+activated+lymphocytes+and+malignant+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells.</a> J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+B+lymphocytes+undergo+homeostatic+proliferation+in+response+to+B+cell+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit.</a> J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes.</a> J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Su, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+controls+B+cell+development+through+histone+h3+methylation+and+Igh+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement.</a> Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).</li>
<li>Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%CE%B4+controls+self-antigen-induced+B-cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance.</a> Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).</li>
<li>Rush, J. S., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+activated+via+CD40+and+IL-4+undergo+a+division+burst+but+require+continued+stimulation+to+maintain+division%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation.</a> Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).</li>
<li>Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole demonstrujemy procedurę oczyszczania limfocytów z narządów limfatycznych. Oczyszczanie komórek za pomocą magnetycznego sortowania kulkowego to szybka i prosta metoda, która pozwala uzyskać żywotne, wysoce oczyszczone komórki docelowe.
Kluczowe kroki w ramach protokołu
Żywotność komórek i wydajność komórek
Utrzymanie żywotności komórek linii krwiotwórczej in vitro ma kluczowe znaczenie dla zapewnieni...

Dojrzałe limfocyty zazwyczaj istnieją w stanie spoczynku, jeśli nie ma wcześniej istniejącej infekcji lub stanu zapalnego u danej osoby. Dlatego ważne jest, aby zachować naiwny stan limfocytów podczas procesu izolacji przed wykonaniem testów funkcjonalnych in vitro lub in vivo. Kluczem do zapewnienia spójnych i powtarzalnych wyników jest ograniczenie wszelkich niepotrzebnych manipulacji komórkami. 
Magnetyczne sortowanie komórek wykorzystuje przeciwciała i mikrogranulki do oznaczania komórek, aby wzbogacić interesującą populację komórek. Przy takim podejściu istnieją dwie strategie oczyszczania: pozytywne wzbogacenie i negatywne zubożenie. Pozytywne wzbogacenie wzbogaca badaną populację komórek za pomocą przeciwciała, które wiąże się z komórkami docelowymi. Z drugiej strony ujemne zubożenie wyczerpuje komórki niedocelowe, pozostawiając interesującą populację komórek. W naszym laboratorium preferujemy ujemne zubożenie niż dodatnie wzbogacenie, ponieważ wiązanie przeciwciał z komórkami docelowymi może potencjalnie zmienić cechy i zachowanie komórek. W rzeczywistości wiele ustalonych markerów powierzchni komórek odpowiednich do izolacji określonej populacji komórek jest również receptorami funkcjonalnymi. 
Magnetyczne sortowanie komórek nie tylko daje bardzo czyste populacje żywotnych komórek docelowych, ale jest również mniej czasochłonne i pozwala uniknąć stresu komórkowego wywołanego przepływem o wysokim ciśnieniu, używanym w sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Znakując niechciane populacje komórek i wyczerpując je za pomocą kolumny separacji magnetycznej, jesteśmy w stanie przeprowadzić szybką izolację komórek bez uszczerbku dla żywotności docelowej populacji komórek. W tym protokole demonstrujemy zastosowanie negatywnych strategii zubożenia w celu oczyszczenia naiwnych limfocytów B lub limfocytów T.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (bez L-glutaminy)</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica</td><td></td><td></td> bydlęca <td>inaktywowana termicznie&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140114</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki magnetyczne anty-CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-801</td><td>Dobrze wymieszaj przed użyciem</td></tr><tr><td>Mikrogranulki streptawidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td>Dobrze wymieszać przed użyciem</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Anti-Annexin V</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-201</td><td>Dobrze wymieszać przed użyciem</td></tr><tr><td>MACS LD&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa sterylna płytka hodowlana z dnem w kształcie litery U</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa sterylna płytka hodowlana z dnem F</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m siatka</td><td></td><td></td> sitkowa do komórek <td>Do sterylizacji za pomocą promieniowania UV przed użyciem</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m&nbsp; sterylne jednorazowe jednostki filtrujące</td><td>Nalgene</td><td>567-0020</td><td>Można zastąpić dowolnym sterylnym urządzeniem filtrującym</td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>CTV, w skrócie; alternatywa dla CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Yellow</td><td>Invitrogen</td><td>C34567</td><td>CTY; alternatywa dla CFSE</td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td>CTFR w skrócie; alternatywa dla CFSE</td></tr><tr><td>Barwnik proliferacyjny komórek eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840</td><td>w skrócie CPD670; alternatywa dla CFSE</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td>PKH26, alternatywa dla CFSE</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck Millipore</td><td>S7653</td><td>Można używać z innych źródeł</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td></td></tr> <tr><td>(5-(i 6-) karboksyfluoresceiny dioctan sukcynimidylu ester (CFSE)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>C-1157</td><td>Rozpuszczają się w DMSO</td></tr><tr><td>Phorbol 12,13-dimaślan (PBDU, ester Phorbol)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P1269</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (jonofor wapnia)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała i białko rekombinowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b biotyna (klon m1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>Biotyna CD11c (klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów</td></tr><tr><td>T Biotyna Gr-1 (klon RB6-8C5)</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów</td></tr><tr><td>T Ter119 biotyna (klon Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>TCR-&gamma; &delta; biotyna (klon GL-3)</td><td>Biolegend</td><td>118103</td><td>koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>Biotyna CD19 (klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>Biotyna B220 (klon RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>Biotyna CD49b (klon DX5)</td><td>Biolegend</td><td>108904</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>Biotyna CD4 (klon GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100404</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>Biotyna CD8 (klon 53-6,7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>Koktajl zubożenia limfocytów T</td></tr><tr><td>F (ab ')2 kozie przeciwciała anty-mysie IgM (powlekane płytką)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-006-075</td><td>50 &mikro; l/studzienka do powlekania (96-dołkowa)</td></tr><tr><td>Anti-mysz CD40 mAb (powlekana płytką)</td><td>Pharmingen&nbsp;</td><td>553722</td><td>50 & mikro; l/studzienka do powlekania (96-dołkowa)</td></tr><tr><td>Rekombinowana IL-4</td><td>ProSpec&nbsp;</td><td>Cyt-282</td><td></td></tr><tr><td>LPS z E. coli Serotyp 055:B5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-4005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (klon klonu OKT3) (powlekany płytką)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0037-85</td><td>50 &mikro; l/studzienka do powlekania (96-dołkowa)</td></tr><tr><td>Anty-CD28 (klon klonu 37.51) (powlekana płytką)</td><td>eBioscience&nbsp;</td><td>16-0281-85</td><td>50 & mikro; l/studzienka do powlekania (96-dołkowa)</td></tr><tr><td>Rekombinowana IL-2</td><td>ProSpec</td><td>Cyt-370</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z białka jaja kurzego, Albumina jaja kurzego</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A7641</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

Limfocyty B i T, z ich niezwykle zróżnicowanym repertuarem antygen-receptor, mają zdolność do wywoływania specyficznych odpowiedzi immunologicznych przeciwko prawie każdemu atakującemu patogenowi1,2. Zrozumiałe jest, że tak skomplikowane zdolności są kontrolowane przez dużą liczbę cząsteczek biorących udział w różnych procesach komórkowych, aby zapewnić terminową i przestrzennie regulowaną odpowiedź immunologiczną3. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalne, które pozwalają na szybką izolację wysoce oczyszczonych mysich limfocytów przy użyciu technologii magnetycznego sortowania komórek. Powstałe oczyszczone limfocyty można następnie poddać różnym testom funkcjonalnym in vitro lub in vivo, takim jak określenie zdolności sygnalizacyjnej limfocytów po stymulacji przez immunoblotting4 oraz badanie zdolności proliferacyjnych przez inkorporację 3H-tymidyny lub znakowanie estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE)5-7. Oprócz porównania zdolności funkcjonalnych limfocytów kontrolnych i genetycznie modyfikowanych, możemy również określić zdolność stymulacyjną komórek T prezentujących antygen (APC) in vivo, jak pokazano w naszych reprezentatywnych wynikach przy użyciu przeszczepionych komórek T OT-I znakowanych CFSE.

Magnetyczne oczyszczanie limfocytów pozwala na wyizolowanie docelowej populacji komórek w stosunkowo krótkim czasie. Stosując protokół deplekcji, udało nam się zwiększyć odsetek limfocytów T CD8 (OT-I u myszy z niedoborem genu 1 aktywującego rekombinację (RAG-1)) z 72,8% (przed oczyszczaniem) do 94,2% (po oczyszczaniu; Rycina 1A)4,5. Tak oczyszczone limfocyty mogą być następnie wykorzystane w dalszych analizach funkcjonalnych w celu określenia proliferacji limf...

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie zdolności funkcjonalnych oczyszczonych limfocytów mysich przy użyciu różnych testów funkcjonalnych in vitro oraz in vivo. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i biologii molekularnej, takie jak badanie funkcji konkretnego białka w limfocytach z niedoborem genów.Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego oczyszczania limfocytów przy minimalnej manipulacji i stresie środowiskowym. Aby oczyścić limfocyty B, należy resuspender do 1×10⁸ całych komórek śledziony poddanych lizie erytrocytów w 300 µL zrównoważonego roztworu soli (BSS) uzupełnionego o FBS. Następnie należy dodać 50 µL magnetycznych mikrokulek anty-CD43.Aby usunąć martwe komórki, należy dodać 30 µL magnetycznych kuleczek Annexin five na 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesinę komórkową należy delikatnie potrząsnąć co 15 minut, aby zapewnić równomierne znakowanie komórek. Po zakończeniu inkubacji znakowane komórki przemyto 14 ml BSS uzupełnionego o FBS.Po wirowaniu usunąć nadsącz, lekko uderzyć w probówkę i zawiesić osad w od 1 do 3 ml BSS w temperaturze pokojowej z dodatkiem FBS. W czasie wirowania zamieścić kolumnę

isolation-and-activation-of-murine-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Poznaj metodę izolacji limfocytów mysich z wykorzystaniem mikrokulek magnetycznych anti-CD43 do badań immunologicznych. Technika umożliwia szybką puryfikację komórek z minimalnym stresem środowiskowym.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Przeglądaj więcej filmów