Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie zdolności funkcjonalnych oczyszczonych mysich limfocytów przy użyciu różnych testów funkcjonalnych in vitro ad in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii i biologii molekularnej. Takich jak badanie funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania w limfocytach z niedoborem genu.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego oczyszczania limfocytów przy minimalnej manipulacji i stresie środowiskowym. Aby oczyścić limfocyty B, ponownie zawiesić do jednego razy dziesięć do ósmych czerwonych krwinek zawierających całe komórki śledziony w 300 mikrolitrach zbilansowanego roztworu soli lub BSS uzupełnionego FBS. Następnie dodaj 50 mikrolitrów mikrokulek magnetycznych anty-CD43.

Aby usunąć martwe komórki, dodaj 30 mikrolitrów aneksyny pięciu kulek magnetycznych przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza. Przesuwaj zawiesinę komórek w odstępach 15-minutowych, aby zapewnić równomierne etykietowanie komórek. Pod koniec inkubacji komórki znakowane B zawierały 14 mililitrów BSS uzupełnionego FBS.

Po odwirowaniu usunąć supernatant, przesunąć probówkę i ponownie zawiesić osad w jednym do trzech mililitrów BSS o temperaturze pokojowej uzupełnionej FBS. Podczas wirowania załaduj kolumnę separacyjną na stojak magnetyczny i przymocuj sterylną igłę o rozmiarze 21 do końcówki kolumny, aby zmniejszyć natężenie przepływu. Zrównoważyć kolumnę dwoma mililitrami BSS o temperaturze pokojowej.

Po ponownym zawieszeniu osadu w jednym do trzech mililitrów temperatury pokojowej, BSS umieszcza probówkę zbiorczą pod igłą, a następnie ładuje komórki oznaczone B na zrównoważoną kolumnę. Zbierz przepływ w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Następnie przepłukać kolumnę jednym mililitrem świeżego BSS uzupełnionego FBS.

Łącząc płukanie z zebranymi komórkami docelowymi, ponownie załaduj kolumnę z komórką docelową zawierającą aluet, zbierając przepływ w tej samej 15-militerowej probówce. I umyj kolumnę trzykrotnie jednym mililitrem BSS uzupełnionym FBS, kontynuując łączenie popłuczyn z zawiesiną komórek docelowych. Po trzecim myciu wyjmij kolumnę z magnesu i załaduj ją pięcioma mililitrami BSS uzupełnionymi FBS.

Za pomocą tłoka kolumny przepłukać magnetycznie oznakowane komórki niebędące celem do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie sprawdź czystość oddzielonych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Aby ponownie użyć kolumny separacyjnej, po przepłukaniu komórek oznaczonych kulkami magnetycznymi, umyj kolumnę trzy razy od góry pięcioma mililitrami PBS na płukanie i trzy razy pięcioma mililitrami wody destylowanej na płukanie.

Następnie umyj kolumnę pięcioma mililitrami 70-procentowego etanolu w ten sam sposób i użyj kranu powietrznego, aby dokładnie wysuszyć kolumnę przed przechowywaniem. Aby ponownie wykorzystać kolumnę w nowym eksperymencie oczyszczania, należy ponownie umyć kolumnę od dołu do góry pięcioma mililitrami 70-procentowego etanolu, a następnie wykonać dwa pięciomililitrowe płukania PBS. Następnie załaduj górną część kolumny pięcioma mililitrami PBS na jedno końcowe mycie.

I zrównoważyć kolumnę dwoma mililitrami BSS o temperaturze pokojowej. Kolumna może być następnie załadowana eksperymentalną populacją komórek. Aby oznaczyć oczyszczone komórki B za pomocą CFSE, umyj komórki dwa razy świeżo przygotowanym roztworem do etykietowania w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.

Ponowne zawieszenie drugiej granulki w stężeniu dwa razy od 10 do siódmego ogniwa na mililitr w świeżym roztworze do etykietowania o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za każdym razem odwirować próbki, usunąć supernatant i przetrzeć probówki. Następnie oznacz komórki w jednoczęściowej zawiesinie komórek na jednej części świeżo przygotowanego 10-mikromolowego roztworu CFSE w ciemności przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odwracanie probówki co dwie minuty, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie barwnika. Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że osad komórkowy jest dokładnie zawieszony w roztworze do etykietowania. Skupiska komórek mogą wpływać na jednorodność oznakowania CFSE.

Pod koniec inkubacji dodać pożywkę RPMI, aby schłodzić CFSE i umyć komórki dwa razy w kilku objętościach lodowato zimnej, kompletnej pożywki RPMI. Jeśli komórki zostały pomyślnie oznaczone, granulka będzie miała żółty kolor. Następnie umyj 96-dołkową płaską płytkę dolną pokrytą odpowiednim bodźcem dwa razy w PBS.

W przypadku komórek B znakowanych CFSE ponownie zawiesić do trzech razy 10 szóstych komórek B na mililitr i wypełnić pożywkę RPMI i wysiać 100 mikrolitrów komórek B na studzienkę na powlekanej płytce w trzech egzemplarzach przez 72 godziny. Dzięki tej metodzie zubożenia czystość izolowanych przez kulki limfocytów T OT1-CD8 może wzrosnąć z 72,8 procent do 94,2 procent. Komórki można następnie oznaczyć CFSE, jak właśnie wykazano, i adoptywnie przenieść do zwierząt biorców w celu analizy ich proliferacji in vivo.

Ponadto znakowanie przeciwciałami anty-CD45.1 można wykorzystać do dalszego potwierdzenia tożsamości komórek eksprymujących CFSE jako adoptywnie przeniesionych komórek T OT1-CD8 CD-45.1 dodatnich dawców w narządach limfatycznych myszy biorców. Alternatywnie, oczyszczone limfocyty T mogą być stymulowane in vitro, a ich proliferację można ocenić przez trytiowane włączenie tymidyny. Dzięki tej metodzie uzyskuje się również znaczny wzrost czystości limfocytów B śledziony.

Ułatwienie podobnych możliwości w zakresie dalszej analizy funkcjonalnej oczyszczonych limfocytów B. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin. Wykonując tę procedurę, ważne jest, aby zawiesina implantu ślimakowego znajdowała się na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem czasu oczyszczania i znakowania CFSE.

Oczyszczone limfocyty mogą być również stosowane w innych testach funkcjonalnych, takich jak immunoblotting do zdolności sygnalizacyjnej końca genetycznie zmodyfikowanych limfocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć lepsze pojęcie o tym, jak oczyszczać limfocyty B i T oraz jak używać komórek do różnych testów funkcjonalnych in vitro i in vivo.