Name: Charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Naucz się charakteryzować makrofagi z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia ilościową analizę fenotypową komórek rezydentnych w badaniach immunologicznych i nefrologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 i PI14/00883), Hiszpańskiego Towarzystwa Miażdżycy, Hiszpańskiego Towarzystwa Nefrologicznego i Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) dla Juana Antonio Moreno. FIS/FEDER finansuje PI14/00386 i Instituto Reina Sofìa de Investigaciòn Nefrològica do Jesús Egido. Fundaciòn conchita rabago do melanii guerrero hue. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) do Alfonso Rubio Navarro.

Protokół ten został zatwierdzony przez lokalne Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania zgodnie z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE i Krajowymi Wytycznymi 53/2013.
1. Przygotowanie odczynników i roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj wszystkie odczynniki i roztwory w sterylnych warunkach i użyj pod okapem z przepływem laminarnym. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj bufor barwiący (2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 1x PBS firmy Dulbecco).</li>
	<li>Przygotuj roztwór kolagenazy, dodając 0,5 mg kolagenazy do każdego ml soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przygotować roztwór znieczulający ketaminy/ksylazyny (2:1 v/v).</li>
</ol>
2. Perfuzja i ekstrakcja nerek
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (75 mg/12 mg/kg masy ciała). Ostrożnie uszczypnij mały fałd skóry, aby sprawdzić, czy zwierzę jest wystarczająco znieczulone. Następnie zakryj oczy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Uwaga: W tym teście wykorzystuje się 4-miesięczne szczury Wistar.</li>
	<li>Gdy szczur zostanie całkowicie znieczulony, połóż go na stole operacyjnym w pozycji leżącej.</li>
	<li>Nałóż 70% etanolu na brzuch.</li>
	<li>Wykonaj centralne nacięcie przez skórę brzucha i otrzewną, od łona do klatki piersiowej, aby odsłonić jamy opłucnej i brzusznej.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór soli fizjologicznej (0,9%) do aorty brzusznej w celu perfuzji nerek za pomocą systemu perfuzyjnego, aż cała krew zostanie usunięta z nerek. Przetnij aortę na poziomie brzucha, aby pomóc uwolnić krew.</li>
	<li>Usuń obie nerki od szczura, wycinając wnękę nerki (żyła nerkowa, tętnica i moczowód). Aby zdecapsulować nerkę, należy przycisnąć palcami krawędź nerki, ostrożnie oddzielając kapsułkę11.</li>
	<li>Umieść nerkę w zrównoważonym roztworze soli Hanksa.</li>
</ol>
3. Trawienie nerek i zawieszenie komórek
<ol>
	<li>Pokrój połowę nerki nożyczkami na małe kawałki i włóż je do probówki o pojemności 1,5 ml. 
	Uwaga: Wszystkie poniższe stężenia oblicza się dla 1 próbki (1/2 nerki szczura).</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu kolagenazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Mieszać przez odwrócenie co 5 minut, aby upewnić się, że roztwór kolagenazy dotrze do całej tkanki.</li>
	<li>Zebrać roztwór i przepuścić go przez sitko (40 μm) za pomocą tłoka, a następnie ponownie zawiesić w 10 ml buforu barwiącego.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 15 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu lizującego ACK (chlorek amonu-potasu). Po 1 min 30 s w temperaturze pokojowej dodać 10 ml buforu barwiącego, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 10 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu barwiącego (1 ml) i przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka (30 μm).</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze i dodaj 2 miliony komórek do probówki o pojemności 1,5 ml w celu barwienia.</li>
</ol>
4. Barwienie komórek i analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odwirować komórki przy 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl surowicy szczurzej (rozcieńczonej w stosunku 1:100) na 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zablokowania receptorów Fc.</li>
	<li>Przemyć dodając 1 ml buforu barwiącego i odwirować 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Wymieszać przeciwciała do barwienia powierzchni komórek w 100 μl buforu barwiącego dla każdego warunku: CD45 APC-Cy7 (1:100), CD163 A647 (4:100) i roztwór do wykrywania żywych komórek (3:1,000).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w mieszaninie przeciwciał na 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć, dodając 1 ml buforu barwiącego i odwirować przy 100 x g przez 5 minut. Powtórzyć ten krok.</li>
	<li>Dodać 600 μl roztworu utrwalającego/przepuszczalnego przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć 2 razy 1 ml buforu do przepuszczania/przemywania i odwirować przy 170 x g przez 5 min.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało CD68 FITC (35:1,000) do barwienia wewnątrzkomórkowego do 100 μl buforu permeabilizacji/płukania dla każdego stanu.</li>
	<li>Zawiesić osad w roztworze przeciwciała CD68 i inkubować przez 50 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć 1 ml buforu do przepuszczania/przemywania i odwirowywać przy 170 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl buforu do przemywania permeabilizacji/przemywać, dodać przeciwciało CD86PE (35:1 000) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć przez dodanie 1 ml buforu do przepuszczania i odwirowywać przy 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu do przepuszczania/przemywania i przekazać go do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Określ barwienie CD45 w żywych komórkach bramkowanych w oknie światła rozproszonego bocznego/światła rozproszonego do przodu (SSC/FSC). W drugim kroku przeanalizuj ekspresję CD86 i CD163 w komórkach CD68 +.</li>
</ol>

<ol><li>Gansevoort, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+kidney+disease+and+cardiovascular+risk%3A+epidemiology%2C+mechanisms%2C+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention.</a> Lancet. 382, 339-352 (2013).</li>
<li>Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+chronic+kidney+disease%3A+the+role+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages.</a> Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).</li>
<li>Belliere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+macrophage+subtypes+influence+the+progression+of+rhabdomyolysis-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).</li>
<li>Kinsey, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+dynamics+in+AKI+to+CKD+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage dynamics in AKI to CKD progression.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).</li>
<li>Lech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phenotype+controls+long-term+AKI+outcomes--kidney+regeneration+versus+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Ortiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+value+of+animal+models+of+kidney+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Translational value of animal models of kidney failure.</a> Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).</li>
<li>Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+double+negative+alphabeta+T+cells+from+the%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of double negative alphabeta T cells from the.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Martin-Fernandez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldosterone+Induces+Renal+Fibrosis+and+Inflammatory+M1-Macrophage+Subtype+via+Mineralocorticoid+Receptor+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats.</a> PLoS. One. 11, e0145946(2016).</li>
<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> J. Vis. Exp. (e52749), (2015).</li>
<li>Komohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+infiltration+and+its+prognostic+relevance+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma.</a> Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).</li>
<li>Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+the+fibrotic+phase+of+rat+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis.</a> Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).</li>
<li>Ndisang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+heme+oxygenase-adiponectin-atrial+natriuretic+peptide+axis+in+renal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function.</a> Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).</li>
<li>Blackbeard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+rat+spinal+microglial+response+to+peripheral+nerve+injury+as+revealed+by+immunohistochemical+image+analysis+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).</li>
<li>Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+CD68+molecule+expression+in+normal+and+malignant+haemopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis.</a> Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Makrofagi to heterogenne komórki, które odgrywają ważną rolę w różnych chorobach zapalnych, w tym zaburzeniach nerek. Rośnie zainteresowanie charakterystyką podzbiorów makrofagów w chorobie nerek, ponieważ każda subpopulacja makrofagów przyczynia się w inny sposób do rozwoju uszkodzenia nerek, jak stwierdzono w kłębuszkowym zapaleniu nerek, nefropatii cukrzycowej i raku nerki14-16. We wczesnych stadiach ostrego uszkodzenia nerek obserwuje się dominację makrofagów M1, które sprzyjają martwicy kanalików i zapale...

Choroba nerek jest globalnym problemem zdrowotnym, o zwiększonej częstości występowania i związanym z podwyższoną zachorowalnością i śmiertelnością1. Jednym z najważniejszych mechanizmów biorących udział w progresji i rozwoju uszkodzenia nerek jest stan zapalny, wywoływany głównie przez makrofagi. Makrofagi odgrywają kluczową rolę w wielu chorobach zapalnych, w tym w zaburzeniach nerek2. W związku z tym odnotowano podwyższoną obecność naciekających makrofagów w biopsjach od pacjentów z ostrym uszkodzeniem nerek (AKI) lub przewlekłą chorobą nerek (PChN)3,4. Ostatnie badania sugerują, że długoterminowy wynik choroby nerek może być kontrolowany przez makrofagi5,6. W odpowiedzi na lokalne mikrośrodowisko makrofagi mogą różnicować się w różne fenotypy, które pełnią różne funkcje biologiczne7. Ustalono dwa dobrze zróżnicowane fenotypy makrofagów: makrofagi aktywowane klasycznie (makrofagi M1) i alternatywnie aktywowane makrofagi (M2)8. Makrofagi M1 sprzyjają stanom zapalnym, podczas gdy makrofagi M2 pełnią rolę przeciwzapalną i biorą udział w naprawie tkanek9. W związku z tym niezbędna jest lepsza wiedza na temat heterogeniczności makrofagów, aby zrozumieć ich regulację i wkład w patologię nerek oraz opracować nowatorskie podejścia terapeutyczne. 
Zarówno modele mysie, jak i szczurze były szeroko stosowane do zrozumienia molekularnego i komórkowego mechanizmu związanego z uszkodzeniem nerek10. Istnieją jednak znaczne różnice w różnych markerach stosowanych do identyfikacji fenotypów makrofagów między tymi gryzoniami. W związku z tym kilka mysich markerów, takich jak F4/80 lub Ly6C, nie jest stosowanych u szczurów, co ogranicza ekstrapolację wyników między tymi gatunkami. Co więcej, istnieje ograniczona liczba markerów opisujących fenotypy makrofagów u szczurów, co wyjaśnia rzadkie badania analizujące heterogeniczność makrofagów u tych zwierząt w porównaniu z myszami. Dlatego konieczne są nowe strategie charakterystyki podzbiorów makrofagów, aby zrozumieć rolę makrofagów w modelach chorób nerek u szczurów. 
Ten manuskrypt opisuje protokół analizy fenotypowej i ilościowej makrofagów z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta może być dalej stosowana w kilku testach, w tym sortowaniu komórek i badaniach ekspresji mRNA lub białek, aby umożliwić dogłębną charakterystykę roli makrofagów w chorobie nerek.

<table><tbody><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Szybszy</td><td></td><td>lub równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hettich</td><td></td><td>Lub równoważny sprzęt</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy (FACSAria)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu BioWest</td><td>S1820-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>LONZA</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12/1/9001</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor lizyzujący</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do cytometrii przepływowej</td><td>BD Biosciences</td><td>340626</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do cytometrii przepływowej</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>5 ml Polistyrenowa probówka okrągłodenna</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Corning centristar</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Memmert GmbH + Co. KG</td><td>WNE 7</td><td>37 &#176; C</td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający/permeabilizacyjny lub bufor permeabilizacyjny/płuczący</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Rompum (ksylazyna)</td> <td>Bayer</td><td></td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Ketalar (Ketamina)</td> <td>Pfizer</td><td></td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli Braun</td><td></td><td></td><td></td>622415</tr><tr><td>Anty-CD45 (klon: OX-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>202216</td><td>Rozcieńczony 1:100</td></tr><tr><td>Anty-CD68 (klon: ED1) FITC</td><td>Bio-RAD</td><td>MCA341F</td><td>Rozcieńczony 35:1,000</td></tr><tr><td>anty-CD86 (klon: 24F) PE</td><td>Biolegend</td><td>200307</td><td>Rozcieńczony 35:1,000</td></tr><tr><td>anty-CD163 (klon: ED2) Alexa Fluor 647</td><td>Bio-RAD</td><td>MCA342R</td><td>Rozcieńczony 4:100</td></tr><tr><td>Żywa/martwa plama&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>L34955</td><td>rozcieńczone w stosunku 3:1,000</td></tr></tbody></table>

charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Istnieje coraz więcej dowodów sugerujących ważną rolę stanu zapalnego, a następnie makrofagów w rozwoju i postępie choroby nerek. Makrofagi to niejednorodne komórki, które są zaangażowane w uszkodzenie nerek. Makrofagi można podzielić na dwa różne fenotypy: klasycznie aktywowane makrofagi (makrofagi M1), które uwalniają cytokiny prozapalne i sprzyjają zwłóknieniu; i alternatywnie aktywowane makrofagi (makrofagi M2), które są związane z funkcjami immunoregulacyjnymi i przebudowy tkanek. Te fenotypy makrofagów muszą być rozróżniane i analizowane w celu określenia ich udziału w uszkodzeniu nerek. Istnieje jednak niewiele badań przedstawiających spójne informacje fenotypowe i funkcjonalne na temat podtypów makrofagów w modelach zapalnych chorób nerek, zwłaszcza u szczurów. Fakt ten może być związany z ograniczonymi markerami makrofagów stosowanymi u szczurów, w przeciwieństwie do myszy. W związku z tym konieczne są nowe strategie, aby w wiarygodny sposób określić ilościowo i scharakteryzować zawartość nerek w tych naciekających komórkach. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje protokół trawienia nerek oraz dalszą analizę fenotypową i ilościową makrofagów z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Krótko mówiąc, nerki inkubowano z kolagenazą, a całkowite makrofagi zidentyfikowano na podstawie podwójnej obecności CD45 (wspólny antygen leukocytów) i CD68 (marker makrofagów PAN) w żywych komórkach. Następnie nastąpiło barwienie powierzchni CD86 (marker M1) i CD163 (marker M2). Makrofagi otrzewnowe szczurów zastosowano jako kontrolę pozytywną do wykrywania markerów makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej. Nasz protokół skutkował niską śmiertelnością komórkową i umożliwił scharakteryzowanie różnych wewnątrzkomórkowych i powierzchniowych markerów białkowych, ograniczając w ten sposób utratę integralności komórkowej obserwowaną w innych protokołach. Co więcej, procedura ta pozwala na wykorzystanie makrofagów do dalszych technik, w tym m.in. sortowania komórek i badań mRNA czy ekspresji białek.

Przeanalizowano heterogeniczność makrofagów w zapalnym modelu doświadczalnym uszkodzenia nerek, wiążącym się ze zwiększoną obecnością naciekających makrofagów w nerkach. W tym modelu uszkodzenie nerek indukowano poprzez podawanie aldosteronu (1 mg-1kg-1day) oraz soli (NaCl 1%) w wodzie pitnej przez 3 tygodnie u szczurów linii Wistar, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami12.
Harmonogram naszych e...

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół analizy fenotypowej i ilościowej makrofagów rezydentnych z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Powstałe w ten sposób wybarwione komórki mogą być również wykorzystane do innych zastosowań, w tym do sortowania komórek, analizy ekspresji genów lub badań funkcjonalnych, zwiększając w ten sposób informacje uzyskane w modelu eksperymentalnym.

Charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie i charakterystyka makrofagów rezydentnych z nerek szczura za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące dynamiki procesów, takie jak udział poszczególnych typów makrofagów w uszkodzeniu nerek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość identyfikacji różnych markerów białkowych. W ten sposób wykazuje się integralność komórkową. Procedurę zaprezentują Elena Olivares, studentka A.P.A.S.D. z Uniwersytetu Complutense oraz Melania Guerrero, studentka A.P.A.S.D. W celu perfuzji i wycięcia nerek należy rozpocząć od uszczypnięcia małego fałdu skóry, aby potwierdzić, że szczur osiągnął odpowiedni poziom sedacji. Następnie należy pokryć oczy maścią weterynaryjną. Umieść zwierzę na stole operacyjnym w pozycji grzbietnej i przemyj brzuch 70% ethanol. Następnie wykonaj nacięcie centralne przez skórę brzucha i otrzewną od łonka do klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową i jamę brzuszną. Użyj systemu do perfuzji, aby wstrzyknąć 0,9% roztwór soli fizjologicznej do aorty brzusznej w celu wypłukania nerek. Przetnij aortę w obrębi brzucha, aby ułatwić odpływ krwi. Gdy cała krew zostanie usunięta z nerek, przetnij wnękę nerkową. Następnie uciśnij krawędź każdej nerki, aby ostrożnie usunąć torebkę organów. Przenieś wycięte nerki do świeżego H.B.S.S. Aby przygotować jednokomórkową zawiesinę nerkową, użyj nożyczek, aby pociąć połowę jednej nerki na małe fragmenty. Przenieś kawałki tkanki do probówki 1,5 mL i dodaj do niej 1 mL świeżo przygotowanej kolagenazy, a następnie inkubuj przez 30 minut w 37

phenotypic-characterization-macrophages-from-rat-kidney-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje metodę analizy zawartości komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej poprzez izolację komórek odpornościowych z tkanki tłuszczowej i późniejszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej.

Charakterystyka komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej człowieka za pomocą cytometrii przepływowej

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Podano tutaj protokół selektywnej ablacji makrofagów nerkowych w celu zbadania ich regeneracji przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / intermedialyzyny. Metoda ta ma również zastosowanie do badania funkcji i regeneracji innych populacji komórek w nerkach, wątrobie i tkance tłuszczowej.

Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin

Praca ta opisuje ustandaryzowany protokół in vitro służący do ilościowego określenia i porównania wskaźników fagocytozy ksenogenicznych (ludzkich) i allogenicznych (szczurów) czerwonych krwinek przez izolowane makrofagi szczurów.

Ilościowa ocena fagocytozy erytrocytów allogenicznych i ksenogenicznych przez makrofagi szczurów in vitro

Naucz się charakteryzować makrofagi z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia ilościową analizę fenotypową komórek rezydentnych w badaniach immunologicznych i nefrologicznych.

Charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów