Charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej
18 października 2016
Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół analizy fenotypowej i ilościowej makrofagów rezydentnych z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Powstałe w ten sposób wybarwione komórki mogą być również wykorzystane do innych zastosowań, w tym do sortowania komórek, analizy ekspresji genów lub badań funkcjonalnych, zwiększając w ten sposób informacje uzyskane w modelu eksperymentalnym.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie i scharakteryzowanie makrofagów rezydentnych z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda może dać odpowiedź na kluczowe pytanie dotyczące płynności, takie jak udział każdego typu makrafaga w uszkodzeniu nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona cewnikowanie nerki różnych markerów białkowych. W związku z tym, ograniczenie integralności komórkowej Demonstracja procedury będzie Elena Olivares, studentka A.P.A.S.D. z Uniwersytetu Complutense i Melania Guerrero, studentka A.P.A.S.D. z W przypadku perfuzji i ekstrakcji nerek zacznij od uszczypnięcia małego fałdu skóry, aby potwierdzić, że szczur osiągnął odpowiedni poziom sedacji. I zakryj oczy maścią weterynaryjną. Ułóż zwierzę na stole operacyjnym w pozycji leżącej. I namocz brzuch 70% etanolem. Następnie wykonaj centralne nacięcie przez skórę brzucha i otrzewną od łona do klatki piersiowej, aby odsłonić jamy opłucnej i brzusznej. Użyj systemu perfuzyjnego, aby wstrzyknąć 0,9% roztwór soli fizjologicznej do aorty brzusznej w celu przepłukania nerek. Przecięcie aorty w jamie brzusznej, aby pomóc uwolnić krew. Gdy cała krew zostanie usunięta z nerek, odetnij wnękę nerki. Następnie naciśnij krawędź każdej nerki, aby ostrożnie usunąć narządy. I przenieś wyekstrahowane nerki do świeżych H.B.S.S.To wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki nerkowej, użyj nożyczek, aby przeciąć połowę jednej nerki na małe fragmenty. Przenieść kawałki tkanki do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1 ml świeżo przygotowanej kolagenazy do probówki na 30-minutową inkubację w temperaturze 37
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół fenotypowej i ilościowej analizy makrofagów rezydentnych z nerek szczura przy użyciu cytometrii przepływowej. Uzyskane barwione komórki mogą być wykorzystane w różnych zastosowaniach, rozszerzając zakres informacji pozyskiwanych w modelu doświadczalnym.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Makrofagi odgrywają kluczową rolę w zdrowiu i chorobach nerek.
- Cytometria przepływowa umożliwia szczegółową analizę populacji komórkowych.
- Zrozumienie zachowania makrofagów może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Modele szczurze są powszechnie wykorzystywane do badania funkcji nerek.
Cel badania
- Opracowanie protokołu izolacji i analizy makrofagów nerkowych.
- Ułatwienie dalszych badań nad funkcjami makrofagów w kontekście nerek.
- Zapewnienie zasobów dla badaczy z pokrewnych dziedzin.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do analizy komórek.
- Techniki barwienia w celu identyfikacji makrofagów.
- Protokoły sortowania komórek i analizy ekspresji genów.
- Badania funkcjonalne w celu oceny aktywności makrofagów.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja makrofagów rezydentnych z nerek szczura.
- Szczegółowa charakterystyka fenotypów makrofagów.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad ekspresją genów i funkcjami komórkowymi.
- Głębsze zrozumienie roli makrofagów w zdrowiu nerek.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę analizy makrofagów.
- Wyniki mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad chorobami nerek.
- Badania można rozszerzyć o inne zastosowania poza cytometrią przepływową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna charakterystyka fenotypowa subpopulacji makrofagów w modelach chorób nerek jest kluczowa dla zmniejszenia ryzyka związanego z walidacją celów terapeutycznych w patologii nerek napędzanej przez procesy zapalne. Niniejszy protokół cytometrii przepływowej umożliwia ilościowe rozróżnienie fenotypów makrofagów prozapalnych (M1) i immunoregulacyjnych (M2) w nerkach szczura, co wspiera poznanie mechanizmów włóknienia i modulacji odpornościowej. Dostarczając wiarygodną metodę oceny udziału makrofagów w uszkodzeniu nerek, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznym wyborze celów i analizie szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe oznaczenie stosunku makrofagów M1/M2 w modelach uszkodzenia nerek.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje podwójne bramkowanie CD45/CD68 wraz z barwieniem powierzchniowym CD86/CD163 do definiowania fenotypów makrofagów z wysoką swoistością.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka w wyborze celu terapeutycznego poprzez powiązanie stanów polaryzacji makrofagów z włóknieniem i szlakami immunoregulacyjnymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki cytometrii przepływowej dotyczące częstotliwości występowania makrofagów i ekspresji markerów.
- Powtarzalność: Wykazuje niską śmiertelność komórek i zachowaną integralność, co umożliwia spójne odczyty fenotypowe w różnych eksperymentach.
- Zastosowania dalsze: Izolowane makrofagi pozostają żywotne w celu sortowania komórek oraz analizy mRNA i białek, co wspiera dalsze badania multiomiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Bezpośrednio zastosowalne w modelach zapalnych chorób nerek, w których fenotypy makrofagów napędzają patogenezę.
- Ciągłość translacyjna: Dane fenotypowe z sortowanych makrofagów mogą służyć do odkrywania biomarkerów i walidacji funkcjonalnej w badaniach przedklinicznych.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Umożliwia obiektywną ocenę wpływu związków immunomodulujących na polaryzację makrofagów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, obejmujący etapy od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, dostarczając odczytów immunologicznych, które służą do optymalizacji wiodących związków oraz badań nad mechanizmem działania w modelach chorób nerek.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących szlaków zależnych od makrofagów w uszkodzeniach nerek poprzez kwantyfikację fenotypową.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane dotyczące makrofagów, odpowiednie do walidacji testów i kampanii przesiewowych związków.
- Analityka: Zapewnia wieloparametryczne odczyty z cytometrii przepływowej (CD45+/CD68+/CD86+ dla M1; CD45+/CD68+/CD163+ dla M2), umożliwiając analizę porównawczą grup.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypowanie makrofagów z następczymi testami funkcjonalnymi i profilowaniem ekspresji genów w systemach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia znormalizowany proces immunofenotypowania, który można zastosować w wielu modelach chorób nerek i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w uszkodzeniu nerek indukowanym przez makrofagi poprzez umożliwienie precyzyjnego rozróżnienia fenotypowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, niskowariabilną izolację i barwienie makrofagów, kompatybilną z centralnymi ośrodkami cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie modulacji celu z mierzalnymi zmianami w polaryzacji makrofagów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację kandydatów immunomodulujących w oparciu o modulację fenotypu makrofagów w modelach przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie kompensacji w cytometrii przepływowej, strategii bramkowania oraz walidacji markerów makrofagów.
- Zależne od dostępu do sprzętu do trawienia kolagenazą oraz sterylnej infrastruktury do przetwarzania komórek.
- Wymaga standaryzacji paneli przeciwciał i kontroli fluorescencji we wszystkich ośrodkach w celu uzyskania powtarzalnej ilościowej oceny fenotypów M1/M2.
- Adaptacja do innych tkanek może wymagać optymalizacji enzymów dysocjujących oraz paneli markerów.
- Ograniczone przez dostępność markerów makrofagów specyficznych dla szczura (CD86, CD163) w porównaniu do bardziej rozbudowanego repertuaru dla myszy.
