Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób poszczególne kanały jonowe bramkowane napięciem przyczyniają się do funkcji określonego neuronu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na odwzorowanie funkcji kanałów jonowych na poziomie subkomórkowym w neuronach. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia mózgu na 9-centymetrowej szalce Petriego, której dno pokryte jest warstwą SiliGuard.

Następnie otocz mózg lodowatą sacharozą-ACSF. Aby przygotować plastry koronalne, wykonaj dwa cięcia, aby usunąć móżdżek i rostralną część mózgu. Następnie nałóż klej cyjanoakrylowy na tacę na próbki i przyklej blok mózgu do tacy tak, aby część rostralna była skierowana w stronę etapu krojenia.

Następnie nałóż kilka kropli sacharozy-ACSF na mózg i powoli zanurz tackę w komorze tnącej. Następnie wyreguluj żyletkę pod kątem 15 stopni w stosunku do płaszczyzny poziomej. Wytnij koronalne plastry mózgu o wielkości około 500 mikrometrów w kierunku nosa przed dotarciem do istoty czarnej.

Następnie dostosuj grubość, aby wyciąć 300 mikrometrowych plasterków zawierających interesujący Cię obszar. Oddziel plastry od bloku tkanki za pomocą bardzo cienkiej igły do obfitości przymocowanej do strzykawki równoległej do krawędzi żyletki. Następnie przenieś plastry do komory rezerwowej w temperaturze 34 stopni Celsjusza na godzinę.

W tej procedurze przenieś wycinek mózgu do komory nagrywającej. Zakotwicz plasterek na dnie komory nagraniowej za pomocą platynowego pierścienia i upewnij się, że plasterek jest dobrej jakości i ma gładką, równą powierzchnię. Następnie wybierz neuron z dendrytem rozciągającym się na dużą odległość w tej samej płaszczyźnie i upewnij się, że interesujący go dendryt może być śledzony do dobrze zdefiniowanej somy.

Następnie napełnij pipetę z plastrem roztworem elektrody. Aby załatać dendryt w trybie przyłączonym do komórki, zidentyfikuj i skup się na części dendrytu. Zastosuj nadciśnienie do pipety i opuść ją za pomocą mikromanipulatora.

Następnie umieść pipetę blisko membrany i wyreguluj ciśnienie, aby uzyskać małe wgłębienie. Następnie zwolnij nacisk na końcówkę pipety i załataj dendryt, kontrolując opór pipety. Spróbuj uzyskać rezystancję uszczelnienia większą niż jeden gigaom, w najlepszym razie od trzech do dziesięciu gigaomów, dla nagrań podłączonych do komórki.

Następnie należy odsunąć pipetę od membrany o kilka mikrometrów, aby uniknąć deformacji dendrytu. Widoczne tutaj prądy czynnościowe reprezentują spontaniczne potencjały czynnościowe neuronów nikralnych. Aby stłumić prądy działania, zastosuj blokery kanału wapniowego i sodowego do ACSF.

Następnie zastosuj krok napięcia 90 miliwoltów, od potencjału podtrzymania wynoszącego zero miliwoltów, aby wywołać prąd kationowy aktywowany hiperpolaryzacją. Pod koniec nagrania rozerwij łatkę, aby uzyskać tryb całej komórki. Następnie powoli i delikatnie wyjmij pipetę dendrytyczną z błony neuronalnej, aby uzyskać plaster na zewnątrz.

Aby nagrywać z odpowiedniej somy w trybie całej komórki, zlokalizuj odpowiednią somę dendrytu. Obniż pipetę o rezystancji od pięciu do dziesięciu megaomów za pomocą wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie potasu do ciała komórki. Następnie zastosuj krótkie podciśnienie do końcówki pipety, aby rozerwać membranę w celu uzyskania trybu całej komórki.

Sprawdź tożsamość neuronu w trybie cęgów prądowych, stosując długie hiper i depolaryzujące kroki prądu i pozwól biocytynie z pipety dyfundować wzdłuż dendrytów. Po 10 minutach wyjmij pipetę, aby uzyskać plaster na zewnątrz. Użyj sekwencji krótkich ruchów bocznych w górę, aby sprzyjać prawidłowemu zamknięciu błony komórkowej, gdy pipeta znajdzie się nad plasterkiem, aby całkowicie wydostać się z komory nagrywającej.

Trzymaj plasterek w komorze rejestrującej przez dodatkowe 15 minut w standardowym ACSF, aby umożliwić zrównoważenie biocytyny i zarejestrowanego neuronu. Następnie delikatnie przenieś plasterek do 25-mililitrowej butelki ze szkła bursztynowego zawierającej standardowy ACSF do badania histologicznego. W tej procedurze z grubsza zlokalizuj znakowany fluorescencyjnie neuron w plasterku z epifluorescencją.

Krótko zbadaj dendrytyczną altanę neuronów i zlokalizuj akson i pęcherzyk aksonalny za pomocą obiektywu 10X. Następnie przełącz się na mikroskop konfokalny i wybierz diodę laserową o długości 488 nanometrów, aby wzbudzić znakowany neuron. Podążaj za przedłużeniem aksonu i dendrytów w osi Z i rejestruj kolejne obrazy, aby uzyskać stos Z dla całej komórki.

Dostosuj rozdzielczość osi Z i zbierz obrazy konfokalne komórki przy małym i dużym powiększeniu. Na koniec otwórz plik obrazu neuronu za pomocą oprogramowania do obrazowania. Porównaj obraz z projekcji Z z obrazem IR-DGC na oko, aby zlokalizować dokładne położenie pipety z plastrem podczas zapisu elektrofizjologicznego.

Pokazany tutaj jest obraz IR-DGC neuronu dopaminowego i pipety na proksymalnym dendrycie. Ścieżka prądowa pokazuje pojemność prądów upływowych EN w odpowiedzi na polecenie napięcia pięciomiliwoltowego, w konfiguracji podłączonej do ogniwa, z rezystancją uszczelnienia wynoszącą pięć gigaomów. Hiperpolaryzujący krok napięcia, z potencjału błony wynoszącego zero miliwoltów, indukował powoli aktywujący się prąd kationowy aktywowany hiperpolaryzacją.

Ślad prądu został odwrócony i wyposażony w pojedynczą funkcję wykładniczą, co dało stałą czasową wynoszącą 632 milisekundy. Oto odpowiedzi napięciowe całej komórki zarejestrowanej soma na jednosekundowe hiper i depolaryzujące impulsy prądu w obecności bramkowanych napięciem blokerów prądu sodowego i wapniowego w celu usunięcia potencjałów czynnościowych podczas zapisu przyłączonego do komórki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o uzyskaniu zdrowej tkanki i stabilnych warunków nagrywania. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak tożsamość zarejestrowanego neuronu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurofizjologią do zbadania funkcji właściwości i roli kanałów jonowych bramkowanych napięciem w komórkach pobudliwych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować i badać rozkład prądów przepływających przez kanały jonowe bramkowane napięciem w dendrytach.