Name: Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj technikę patch-clamp do subkomórkowych pomiarów z dendrytów neuronów dopaminowych. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę kanałów jonowych i mechanizmów sygnalizacji neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję dr Vincentowi Seutinowi za jego nieustanne wsparcie, Christelle Gillissen i Laurentowi Massotte za doskonałą pomoc techniczną, doktorom Jean Defourny i Sandrze Ormenese za porady dotyczące mikroskopu konfokalnego, dr Jacques'owi Destiné za podarowanie drugiego wzmacniacza Axopatch 200B, platformie GIGA-Imaging za udostępnienie mikroskopu konfokalnego i oprogramowania Imaris oraz dr Stephenowi Freemanowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Praca ta została wsparta grantami z belgijskiego F.R.S. - FNRS (U.N002.13 i T.N0015.13) i opublikowana dzięki wsparciu Belgijskiej Fundacji Uniwersyteckiej (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym raporcie opisano krok po kroku protokół implementacji podwójnych zapisów somatodendrytycznych całych komórek i lokalnych zapisów dendrytycznych. Jest przydatny odpowiednio do określania wpływu kanałów jonowych (tj. Ih) na przebieg w czasie potencjałów postsynaptycznych i mapowania rozmieszczenia kanału jonowego (Ih) wzdłuż domeny somatodendrytycznej neuronów nikralnych DA. Uzyskane pomiary elektrofizjologiczne są łączone z histochemią post hoc w celu odtworzenia morfologii komórki. Procedura została zastosowana do zbadania neuronów DA zlokalizowanych w istocie czarnej, ale można ją uogólnić na sąsiednie neurony GABA nigralne, neurony DA w brzusznym obszarze nakrywki lub inne neurony śródmózgowia. Wszystkie kroki można również wykonać, aby zbadać inne kanały jonowe wyrażone w dendrytach neuronów nikralnych bez istotnych modyfikacji. Wizualizacja post hoc jest szczególnie istotna w przypadku neuronów z dendrytami zawierającymi aksony, takich jak neurony nigralne 25,26, interneurony hipokampa orektowa-pęcherzyka 21 lub niektóre neurony piramidowe CA1 67. Co ciekawe, neurony posiadające tę cechę wydają się być bardziej powszechne niż się powszechnie uważa 67. Analiza morfologiczna ujawnia również dokładne położenie elektrod i aksonu. Wykrywanie tych ostatnich można zoptymalizować poprzez znakowanie białek ulegających ekspresji w początkowym segmencie aksonu (kanały bramkowane napięciem Na+ lub Ankyryna G) za pomocą immunohistochemii 68,69.
Wiarygodność danych zebranych za pomocą zapisów dendrytycznych i późniejszego znakowania neuronów niezmiennie zależy od jakości wycinka. W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby zachować żywotność komórek w tkance. Osiąga się to dzięki delikatnemu obchodzeniu się ze zdrowymi zwierzętami, wysokiej jakości narzędziom i odczynnikom, wystarczającemu natlenieniu tkanki i lodowatym temperaturom podczas przygotowywania plastrów. Stabilne warunki zapisu zależą od selekcji zdrowych neuronów. W trybie całej komórki rezystancja szeregowa powinna być początkowo jak najniższa i utrzymywana na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Stabilność nagrań jest dodatkowo uzależniona od wysokiej jakości manipulatorów pozbawionych dryfu i wibracji. Zakłócenia te można zmniejszyć, optymalizując stabilność pipety: sprawdzając połączenie z uchwytem pipety i stołem głównym, kontrolując, czy kable mikromanipulatora są luźne, unikając nagłych zmian temperatury lub ruchu stolika oraz sprawdzając mechanizm manipulatora. W przypadku podwójnych zapisów siarczan metylu 13,15,21 został zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym, ale alternatywnie można zastosować glukonian 9,14,25 . Jednak główny anion może zmieniać potencjał błony 70,71 i niektóre prądy zależne od napięcia 72. Roztwór wewnątrzkomórkowy może być uzupełniony o ATP, GTP i fosfokreatynę w celu zachowania fizjologicznych funkcji neuronów. Dodatkowo, dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu pipety (np. Alexa 594 lub Sulforodamine 101 41) w celu wizualizacji dendrytów podczas zapisu somatycznego może być przydatne na przykład do zastosowania ciśnienia (ryc. 7 w odnośniku 41) lub pipety stymulującej elektryczność. Roztwór pipet do nagrań podłączonych do komórek zawiera wysokie stężenie K+ i nie zawiera Na+ do rejestrowania dużych Ih. Warto zauważyć, że stosunek stężeń Na+/K+ wpływa na amplitudę prądu 10, potencjał odwrócenia prądu 11 i bramkowanie Ih 73. Alternatywnie, Ih może być również nagrywany za pomocą out-outs 10. Jednak w tej konfiguracji zapisu środowisko wewnątrzkomórkowe w pobliżu kanałów może być zaburzone. W związku z tym różnice w zależnej od napięcia aktywacji Ih obserwuje się przy porównywaniu prądów uzyskanych za pomocą łat dołączonych do ogniw i wyjść zewnętrznych 10. Obrzęk neuronów występuje sporadycznie podczas rejestracji patch-clamp i często wynika z różnych przyczyn, takich jak niska jakość wody, silna nierównowaga osmolarności lub pH między roztworami wewnątrz- i zewnątrzkomórkowymi 39 lub błędy w składzie roztworów. Jakość zapisów elektrofizjologicznych ma bezpośredni wpływ na jakość morfologii odzyskanych neuronów. Pipety somatyczne o wysokiej rezystancji są używane do podwójnych zapisów (6 - 10 MΩ, jak w Refs. 6,11) oraz dla pojedynczych zapisów somatycznych po zapisach przyłączonych do komórek w celu zminimalizowania rozcieńczenia środowiska wewnątrzkomórkowego 14. Zapis somatyczny całej komórki następujący po zapisie dołączonym do komórki jest zatem krótki (< 10 minut). Plamy na zewnątrz zarówno z pipet somatycznych, jak i dendrytycznych są niezbędne do prawidłowego zamknięcia błony komórkowej i późniejszego przywrócenia morfologii komórki. Oprócz struktury komórki, dla zarejestrowanych neuronów można określić zawartość neurochemiczną 59,74. Na przykład wewnątrzkomórkowa hydroksylaza tyrozynowa białka może być znakowana immunologicznie w celu jednoznacznej identyfikacji neuronów DA 13.
Neurony DA są skoncentrowane głównie w SN pars compacta, ze znacznie mniejszą gęstością obecną w SN pars reticulata, gdzie są mieszane z większą liczbą neuronów GABA 75. Podczas gdy ciało komórkowe neuronów DA jest często większe niż neuronów GABA, wizualna identyfikacja tych komórek za pomocą wideomikroskopii IR jest niepewna i częściowo utrudniona przez nieprzezroczystość pars compacta. Aby obejść te ograniczenia, wstępna selekcja neuronów DA może być ułatwiona dzięki zastosowaniu transgenicznych myszy wykazujących ekspresję markera fluorescencyjnego w określonej populacji neuronów (TH 65 lub DAT dla neuronów DA, dla neuronów GABA) i oświetlenie epifluorescencyjne. Alternatywnie, barwnik fluorescencyjny może być dodany do roztworu elektrody somatycznej, aby ułatwić wizualizację dendrytów. Zwiększoną rozdzielczość komórki fluorescencyjnej zapewnia konfokalna 14,22,30 soczewka wirującego dysku Nipkowa lub mikroskopia dwufotonowa7 w połączeniu z IR-DGC 6. DGC ma kilka zalet w porównaniu z DIC. Po pierwsze, ponieważ pryzmaty DIC nie są wymagane, obraz IR-DGC można nałożyć na obraz fluorescencyjny 49,52,53,76. Po drugie, DGC można łączyć z fotostymulacją i optogenetyką 77.
Wadą przygotowania plastrów jest zachowanie integralności neuronów. Neurony DA rozciągają swoje dendryty w trzech płaszczyznach przestrzennych 78,79 i dlatego nie można całkowicie uniknąć obcięcia przedziału dendrytycznego w plasterkach 80. Wybór orientacji plastrów (czołowa, pozioma lub przystrzałkowa) jest kompromisem. Należy wziąć pod uwagę pochodzenie unerwienia i projekt eksperymentalny, aby wybrać właściwą orientację plastrów.
Bezpośrednie łatanie dendrytyczne jest techniką stosowaną do mapowania rozmieszczenia funkcjonalnych kanałów jonowych w różnych przedziałach komórek. Ponadto technika ta umożliwia określenie zmienności właściwości funkcjonalnych kanałów 20. Jako uzupełnienie, lokalizację i gęstość kanałów jonowych można ustalić za pomocą immunohistochemii na poziomie mikroskopii świetlnej i elektronicznej 17,23. Takie podejście daje również możliwość określenia gęstości kanałów w strukturach małego kalibru, które są niedostępne dla pipet z łatkami. Jednak kanały te mogą być w wyraźnym stanie funkcjonalnym 24 lub nawet nieaktywne w porównaniu z tymi nagranymi przy użyciu technik patch-clamp. Obie techniki są zatem niezbędne do uzyskania pełnego obrazu lokalizacji i właściwości kanałów jonowych w określonym regionie komórkowym 17. Wraz z rozwojem barwników wrażliwych na napięcie, obrazowanie napięciowe zostało wykorzystane do zbadania propagacji AP i EPSP w neuronach w wielu lokalizacjach 81. Jako alternatywa dla nagrań z podwójnym patch-clampem, podejście to można zastosować nawet w przypadku cienkich dendrytów, które nie są dostępne dla pipet krosowych, ale wymagają dokładnej kalibracji sygnału i uśrednienia.
Podczas gdy neurony DA w SN i brzusznym obszarze nakrywki są szeroko badane za pomocą zapisów somatycznych w kontekście fizjologicznym i patofizjologicznym, właściwości funkcjonalne ich dendrytów pozostają w dużej mierze nieznane w obu stanach. Łatanie z dendrytów zostało wdrożone dla neuronów dopaminy nigralnej przez kilka grup z powodzeniem 13,25,26 i pozostaje metodą z wyboru do analizy pobudliwych właściwości tych drobnych struktur subkomórkowych 8. Zapisy dendrytyczne stanowią kolejną okazję do zbadania skuteczności i plastyczności transmisji synaptycznej oraz plastyczności pobudliwości dendrytycznej 82,83.

Neurony otrzymują informacje synaptyczne głównie na swoich dendrytach. Pobudzające i hamujące sygnały synaptyczne rozprzestrzeniają się z miejsca ich wytwarzania do miejsca integracji, gdzie potencjały czynnościowe (AP) są wywoływane jako sygnał wyjściowy. Na ich drodze na potencjały synaptyczne wpływa zarówno budowa dendrytów, jak i interakcja między pasywnymi i aktywnymi właściwościami błony. Połączenie tych bardzo zmiennych parametrów poszerza moc obliczeniową neuronów 1,2. Jednak mała średnica dendrytów utrudnia jednak badanie ich właściwości elektrycznych. Ciągły rozwój techniki patch-clamp 3, optyki 4 i udoskonalenie metod przygotowania plastrów 5 w ciągu ostatnich dziesięcioleci umożliwiły zapisy z bardzo cienkich (0,7 - 3 μm Ø) dendrytów 6,7. Metody te były i nadal są powszechnie stosowane do badania pobudliwości dendrytów w różnych neuronach8. Bezpośrednie zapisy dendrytyczne są niezbędne do określenia rozkładu 9-19 i różnic we właściwościach funkcjonalnych 20-22 kanałów jonowych w różnych przedziałach neuronalnych. Dane te są niezbędnym uzupełnieniem rozkładów kanałów jonowych wykrywanych za pomocą immunohistochemii w połączeniu z mikroskopią świetlną i elektronową 23,24. Podwójne zapisy somatodendrytyczne zostały zaimplementowane w celu zbadania propagacji potencjałów czynnościowych 9,13-15,21,22,25-27 i rozprzestrzeniania potencjałów synaptycznych 13,16,18 wzdłuż domeny somatodendrytycznej neuronów, uzyskania szczegółowych modeli pasywnych 28-30 i zbadania czasowej rozdzielczości integracji neuronalnej 31.
Istota (SN) to obszar znajdujący się w śródmózgowiu, zaangażowany w kilka funkcji, takich jak kontrola ruchu, kodowanie nagrody i nawykowe zachowania. Spadek dopaminy spowodowany specyficzną utratą neuronów dopaminergicznych (DA) w SN jest związany z zaburzeniami motorycznymi obserwowanymi u pacjentów cierpiących na chorobę Parkinsona 32. Obwód nikralny składa się z dwóch głównych typów komórek: neuronów dopaminergicznych i GABA-ergicznych. Co ciekawe, neurony te mają kilka specyficznych cech, które odróżniają je od innych neuronów. Akson dużej części neuronów DA i niektórych neuronów GABA pochodzi z miejsca dendrytycznego, co wskazuje, że altówka dendrytyczna jest niejednorodna (dendryty zawierające aksony i pozbawione aksonów) 25,26,33. Morfologia tych neuronów kontrastuje zatem z typową organizacją neuronów, w której przekazywanie informacji odbywa się zgodnie z prawem dynamicznej polaryzacji emitowanym przez Cajala: począwszy od dendrytów, przez somę, aż do aksonu 34. Neurony DA są również znane z tego, że uwalniają dopaminę ze swoich dendrytów 35, generują aktywność pękającą 36 i plastyczność receptora NMDA 37. Analiza tych zjawisk jest nieuchwytna bez bezpośrednich nagrań z miejsca, w którym są one inicjowane. Aby uzyskać wgląd w związek między dokładną lokalizacją i funkcjonalnymi właściwościami kanałów jonowych a ich rolą w pobudliwości dendrytycznej i przekazywaniu informacji w neuronach nikralnych, metodą z wyboru są bezpośrednie zapisy dendrytyczne.
Ten raport opisuje szczegółową procedurę, która może być użyta do uzyskania pojedynczych i podwójnych nagrań patch-clamp z dendrytów neuronów nigralnych i odpowiedniego znakowania biocytyny post hoc. Podstawowe zasady łatania błony somatycznej i dendrytycznej są bardzo podobne. W praktyce jednak nagrania ze stanowisk dendrytycznych wymagają specyficznej optymalizacji w porównaniu do nagrań somatycznych. Udane nagrania dendrytyczne zależą od jakości plastrów, optymalnego dopasowania optyki, delikatnego podejścia pipety krosowej i stabilności zapisów.

<table><tbody><tr><td>Woda podwójnie destylowana</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Rezystywność >14 M&Omega; cm, idealna 18,2 M&Omega; cm przy 25&nbsp; &deg; C, filtrowane (0,22 &mikro; m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Świece mikrofiltracyjne</td><td>Robu</td><td>Porowatość o średnicy 3, 6 mm lub 13 mm</td> Krajalnica do tkanek z sondą wibracyjną Leica VT1200 parametry cięcia: prędkość 0,07, amplituda 1,40 Krajalnica do tkanek Dosaka DTK-1000 parametry cięcia: prędkość 4, częstotliwość 7 Żyletki <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilette</td><td>Super Silver Narzędzia</td><td></td></tr><tr><td>preparacyjne</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> rezerwowa <td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0,22 i mikro; m</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy&nbsp;</td><td>UHU"</td><td>Sekunden Kleber"</td> <td>płynny klej</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa&nbsp;</td><td>Luigs & </td><td>Neumann Slice mini komora</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet poziomych</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm średn. śred.o.d./1 mm średnica wewnętrzna kapilary szklane, końcówki polerowane ogniowo, płukane</td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Colt&egrave; ne/Whaledent</td><td></td><td>paski woskowe do tacek ortodontycznych</td></tr><tr><td>Platynowa siatka</td><td></td><td></td><td>do zakotwiczania plastrów w komorze nagraniowej, wykonana na zamówienie z platynowym krążkiem</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>do polerowania ogniowego końcówek do pipet</td></tr><tr><td>Siarczan metylu potasu</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytyna</td><td>Sondy molekularne</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometr</td><td>GREISINGER elektroniczny</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs & </td> Manipulatory Neumann <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>Źródło obrazowania DFG</td><td>/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Kondensor</td> Kondensor <td>Zeiss</td><td>o wysokiej aperturze numerycznej współpracujący</td><td></td> z olejem</tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63-krotne powiększenie, duża odległość, wysoka apertura numeryczna 1.0 zanurzenie w wodzie obiektywny</td></tr><tr><td>Czterokrotny zmieniacz</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td>między kamerą a mikroskopem</td></tr><tr><td>Czarno-biały monitor wideo</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-calowy, 850 linii telewizyjnych, analogowe</td></tr><tr><td>butelki na próbki, szkło bursztynowe, z nakrętką</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>do przenoszenia plastrów z zestawu do sali histologicznej</td></tr><tr><td>Przewodnik Axon</td><td>Urządzenia</td><td></td> molekularne <td>Książka</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analiza danych elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>przed użyciem zapoznać się z KARTĄ CHARAKTERYSTYKI i Dyrektywą w sprawie substancji niebezpiecznych (UE) Płytka</td></tr><tr><td>do hodowli komórkowych Wellwell</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>do barwienia utrwalonych plastrów</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>przed użyciem zapoznać się z KARTĄ CHARAKTERYSTYKI i dyrektywą w sprawie substancji niebezpiecznych (UE)</td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne anty-TH pierwotne</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>stężenie robocze: 1/1,000</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało wtórne anty-myszy - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>stężenie robocze: 1/500</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Anti-fade</td><td>Sondy molekularne - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina Avidin</td><td>DCS Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td> <td>plugin do ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Rekonstrukcja neuronów wypełnionych biocytyną</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td> <td>Rekonstrukcja neuronów wypełnionych biocytyną</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analiza danych elektrofizjologicznych</td></tr></tbody></table>

subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendryty neuronów dopaminergicznych odbierają i przekazują sygnały synaptyczne, wspierają wsteczną propagację potencjału czynnościowego i uwalnianie neuroprzekaźników. Zrozumienie tych podstawowych funkcji rzuci światło na transfer informacji w tych neuronach. Dendrytyczne nagrania patch-clamp dają możliwość bezpośredniego zbadania właściwości elektrycznych dendrytów i leżących pod nimi kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne dla pipet do łatania ze względu na ich małą średnicę. W tym raporcie opisano krok po kroku procedurę zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminergicznych w ostrych wycinkach. Pomiary elektrofizjologiczne są połączone z odtworzeniem morfologii komórki post hoc. Udane eksperymenty polegają na lepszym przygotowaniu plastrów, roztworów i pipet, odpowiednim dostosowaniu optyki i stabilności pipety w kontakcie z zarejestrowaną strukturą. Standardowe zasady zapisu somatycznego patch-clamp są stosowane do dendrytów, ale z łagodniejszym podejściem do pipety. Te wszechstronne techniki można zastosować w celu odpowiedzi na różne pytania dotyczące właściwości pobudliwych dendrytów.

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii, takie jak wpływ poszczególnych napięciowo zależnych kanałów jonowych na funkcje konkretnego neuronu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość mapowania funkcji kanałów jonowych na poziomie subkomórkowym w neuronach. Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia mózgu na 9 centymetrowej płytce Petriego, której dno jest pokryte warstwą SiliGuard.Następnie otocz mózg lodowatym roztworem sucrose-ACSF. Aby przygotować przekroje koronalne, wykonaj dwa cięcia w celu usunięcia móżdżku oraz rostralnej części mózgu. Następnie nałóż klej cyjanoakrylowy na tackę do preparatów i przyklej blok mózgu do tacki w taki sposób, aby część rostralna była skierowana w stronę etapu krojenia.Następnie nanieś kilka kropli sucrose-ACSF na mózg i powoli zanurz tackę w komorze do cięcia. Po tym ustaw żyletkę pod kątem 15 stopni względem płaszczyzny poziomej. Wykonaj przekroje wieńczące mózgu o grubości około 500 micrometers w kierunku nosowym, przed dotarciem do substantia nigra.Następnie dostosuj grubość tak, aby wyciąć plastry o grubości 300 mikrometrów zawierające obszar zainteresowania. Oddziel plastry od bloku tkanki za pomocą bardzo cienkiej igły perfuzyjnej przymocowanej do strzykawki, prowadząc ją równolegle do krawędzi żyletki. Następnie przenieś plastry do komory rezerwuarowej w temperaturze 34 stopni Celsjusza na jedną godzinę.W tej procedurze należy przenieść skibek mózgu do komory rejestracyjnej. Przymocuj skibek do dna komory rejestracyjnej za pomocą platynowego pierścienia i upewnij się, że skibek jest dobrej jakości i posiada gładką, równą powierzchnię. Następnie wybierz neuron z dendrytem rozciągającym się na znaczną odległość w tej samej płaszczyźnie i upewnij się, że analizowany dendryt można śledzić aż do wyraźnie zdefiniowanego somy.Następnie napełnij pipetę do patch-clampu roztworem do elektrod. Aby wykonać patch dendrytu w trybie przytwierdzonym do błony (cell-attached), zidentyfikuj i ustaw ostrość na fragmencie dendrytu. Przyłóż dodatnie ciśnienie do pipety i opuść ją za pomocą mikromanipulatora.Następnie umieść pipetę blisko membrany i dostosuj ciśnienie tak, aby utworzyć niewielkie wgłębienie. Następnie zwolnij ciśnienie na końcówce pipety i wykonaj patch dendrytu, kontrolując oporność pipety. W przypadku rejestracji z konfiguracji cell-attached należy dążyć do uzyskania oporności uszczelnienia większej niż 1 GOhm, najlepiej w zakresie od 3 do 10 GOhm.Następnie wycofaj pipetę z błony o kilka mikrometrów, aby uniknąć deformacji dendrytu. Widoczne tutaj prądy potencjałów czynnościowych reprezentują spontaniczne potencjały czynnościowe neuronów istoki ciemnej. Aby zahamować prądy potencjałów czynnościowych, dodaj do ACSF blokery kanałów wapniowych i sodowych.Następnie zastosuj skok napięcia o wartości 90 mV, z potencjału trzymania wynoszącego 0 mV, aby wywołać kationowy prąd aktywowany hiperpolaryzacją. Po zakończeniu pomiaru przerwij błonę w miejscu styku (rupture), aby przejść w tryb whole cell. Następnie powoli i ostrożnie wycofaj pipetę dendrytyczną z błony neuronalnej, aby uzyskać konfigurację outside-out patch.Aby przeprowadzić rejestrację z odpowiadającego ciała komórki w konfiguracji whole-cell, zlokalizuj ciało komórki przypisane do danego dendrytu. Opuść pipetę o oporności od pięciu do dziesięciu megaomów wypełnioną wewnątrzkomórkowym roztworem na bazie potasu w kierunku ciała komórki. Następnie zastosuj krótkotrwałe podciśnienie w końcówce pipety, aby przerwać błonę i uzyskać konfigurację whole-cell.Zweryfikuj tożsamość neuronu w trybie clampy prądowej (current-clamp), aplikując długie kroki prądu hiperpolaryzującego i depolaryzującego, i pozwól biocytynie z pipety dyfundować wzdłuż dendrytów. Po 10 minutach wycofaj pipetę, aby uzyskać patch typu outside-out. Po uniesieniu pipety ponad skrawek, wykonaj sekwencję krótkich, bocznych ruchów w górę, aby ułatwić prawidłowe zamknięcie błony komórkowej i całkowicie wyjąć pipetę z komory rejestracyjnej.Pozostaw plaster w komorze rejestrującej przez dodatkowe 15 minut w standardowym ACSF, aby umożliwić równoważenie biocytyny i rejestrowanego neuronu. Następnie delikatnie przenieś plaster do 25-mililitrowej bursztynowej szklanej butelki zawierającej standardowy ACSF do histologii. W tej procedurze zlokalizuj orientacyjnie fluorescencyjnie znakowany neuron w plastrze za pomocą epifluorescencji.Krótko obejrzyj drzewo dendrytyczne neuronów, a następnie zlokalizuj akson i pęcherzyk aksonalny, używając obiektywu 10X. Następnie przejdź do mikroskopu konfokalnego i wybierz diodę laserową o długości fali 488 nanometrów, aby wzbudzić znakowany neuron. Śledź przebieg aksonu i dendrytów w osi Z i rejestruj kolejne obrazy w celu uzyskania stosu Z (Z stack) dla całej komórki.Dostosuj rozdzielczość osi Z i wykonaj obrazy konfokalne komórki przy niskim i wysokim powiększeniu. Na koniec otwórz plik obrazu neuronu w programie do analizy obrazów. Porównaj wizualnie obraz z projekcji Z z obrazem IR-DGC, aby precyzyjnie określić położenie pipety patch podczas rejestracji elektrofizjologicznej.Przedstawiony tutaj obraz IR-DGC ukazuje neuron dopaminergiczny oraz pipetę na dendrycie proksymalnym. Rejestracja prądu pokazuje pojemność prądów przeciekowych EN w odpowiedzi na komendę napięciową o wartości five millivolt, w konfiguracji cell-attached, przy rezystancji uszczelnienia wynoszącej five gigaohms. Hiperpolaryzujący skok napięcia, z potencjałem błonowym zero millivolts, wywołał powoli aktywujący się kationowy prąd aktywowany hiperpolaryzacją.Obecny ślad został odwrócony i dopasowany do funkcji pojedynczej wykładniczej, co dało stałą czasową wynoszącą 632 milisekund. Przedstawiono tutaj odpowiedzi napięciowe całego komórki zarejestrowane w somie na jednosekundowe hiperpolaryzujące i depolaryzujące impulsy prądowe w obecności blokerów napięciowo zależnych kanałów sodowych i wapniowych, aby wyeliminować potencjały czynnościowe podczas rejestracji w konfiguracji cell-attached. Po opanowaniu techniki, może ona zostać przeprowadzona w jeden dzień, pod warunkiem właściwego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pozyskać zdrową tkankę i zapewnić stabilne warunki rejestracji. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tożsamości rejestrowanego neuronu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neurofizjologii do zgłębiania funkcji, właściwości oraz roli napięciowo-zależnych kanałów jonowych w komórkach pobudliwych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu rejestrowania i badania rozkładu prądów przepływających przez napięciowo zależne kanały jonowe w dendrytach.

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Poznaj technikę patch-clamp do subkomórkowych pomiarów z dendrytów neuronów dopaminowych. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę kanałów jonowych i mechanizmów sygnalizacji neuronalnej.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Przeglądaj więcej filmów