Name: Symetryczne pośmiertne cięcie mózgu w bihemferze w celu zbadania zdrowych i patologicznych stanów mózgu u ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj symetryczne cięcie pośmiertne mózgu w bihemferze w celu badania patologii neuropatologicznych. Ta metoda umożliwia systematyczną analizę regionów mózgu i korelację kliniczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy tysiącom dawców mózgu, pacjentom, rodzinom i neurobiologom na całym świecie, którzy w ciągu ostatnich dwóch stuleci i dzięki swoim hojnym darom i wysiłkom intelektualnym pomogli odkryć, jak działa ludzki mózg, zrozumieć wyniszczające choroby mózgu i opracować ich metody leczenia. Szczególne podziękowania kierujemy do Pani Cecilii V. Feltis za redakcję i recenzję tego rękopisu.

Procedury z udziałem pośmiertnych tkanek ludzkich zostały poddane przeglądowi przez instytucjonalną komisję rewizyjną i zwolnione na mocy 45 CFR (Kodeks Przepisów Federalnych).
UWAGA: Protokół opisuje symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu w celu pośmiertnej oceny mózgu, sfinalizowaną dla badań neuropatologicznych u ludzi. Szczegółowe opisy aparatów, przyrządów, materiałów i materiałów niezbędnych do wykonania cięcia ludzkiego mózgu nie będą zawierane. Materiały i materiały do sekcji mózgu są wybierane według uznania pojedynczego badacza i opierają się na narzędziach autopsyjnych dozwolonych lub zatwierdzonych w każdej instytucji badawczej. Minimalny zestaw narzędzi i materiałów wymaganych do tej procedury jest opisany w Tabeli Materiał/Wyposażenie. Szczegółowe procedury cięcia i środki ostrożności w przypadku podejrzenia zakaźnych chorób mózgu, takich jak CJD u ludzi, wykraczają poza cele tego manuskryptu i są dostępne w innych źródłach7.
1. Symetryczne dwupółkulowe cięcie mózgu
Uwaga: Upewnij się, że mózg otrzymał niezbędne utrwalenie tkanek (przy użyciu, na przykład, neutralnie buforowanej 10% formaliny) przez okres dwóch do trzech tygodni, w zależności od warunków okołokątnych, metabolicznych (tj. pH) i zachowania tkanek (tj. temperatury). Jednak w badaniach korelacji obrazowo-patologicznej sugerowano dłuższy okres fiksacji (>5,4 tygodnia)8.
<ol>
	<li>Umieść mózg na płaskiej powierzchni przodem do badacza, z biegunami czołowymi skierowanymi w przeciwnym kierunku w stosunku do badacza.</li>
	<li>Umieść mózg w taki sposób, aby umożliwić pełną i wyraźną wizualizację wszystkich zakrętów korowych i bruzd całego mózgu (ryc. 1a).</li>
	<li>Najpierw zwróć uwagę na anomalie opon mózgowo-rdzeniowych, makroskopowe asymetrie półkulowe (możliwe wskaźniki ogniskowych, płatowych lub uogólnionych zjawisk atrofii półkulowej), makroskopowe zmiany tissutalne (tj. guzy lub przepuklina), wrodzone wady rozwojowe, nieprawidłowości naczyń i wszelkie inne możliwe nieprawidłowości lub nietypowe prezentacje powierzchni mózgu. 
UWAGA: Szczegółowe opisy dotyczące oceny ludzkiego mózgu można znaleźć w dostępnych na rynku podręcznikach neuropatologii i podręcznikach autopsji9,10.</li>
</ol>
2. Sekwencja protokołu
<ol>
	<li>Bieguny czołowe należy odsunąć od badacza, z powierzchownymi aspektami półkul (kresomózgowie) skierowanymi w stronę badacza. Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta badawczego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej (ryc. 1a - c).</li>
	<li>Oznacz przed- i postcentralne zakręty korowe za pomocą tuszu lub kolorowych igieł przed przecięciem mózgu (ryc. 1b). 
	UWAGA: Ta procedura ułatwia szybsze rozpoznanie motorycznej i somatosensorycznej pierwotnej kory mózgowej po przecięciu.</li>
	<li>Obróć mózg o 180 stopni, trzymając go skierowany w tym samym kierunku (tj. bieguny czołowe skierowane od badacza). Dokładnie sprawdź podstawę mózgu. Zwróć szczególną uwagę na stan układu naczyniowo-mózgowego (tj. tętnic podstawnych i kręgowych oraz koła Willisa) oraz nerwów czaszkowych na ich poziomach wyjściowych/wejściowych pnia mózgu. Ze szczególną ostrożnością należy obchodzić się z opuszkami i drogami węchowymi, aby uniknąć uszkodzenia tkanki węchowej ze względu na ich ekstremalną kruchość.
	<ol>
		<li>Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej i pnia mózgu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwrócony twarzą do podstawy mózgu i za pomocą skalpela przetnij pień mózgu poprzecznie na poziomie górnej części mostu (jak najbliżej podstawy mózgu). Dokładnie sprawdź SN (tj. pod kątem bladości)11 i innych sąsiednich struktur12. Zwróć uwagę, być może za pomocą urządzenia do nagrywania dźwięku, na każdy nietypowy wygląd mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem13.</li>
	<li>Ponownie obróć mózg o 180 stopni i za pomocą ostrego noża oddziel dwie półkule, przecinając ciało modzelowate centralnie przez przyśrodkową szczelinę podłużną i podążając w kierunku czołowo-potylicznym. Sprawdź każdą stronę każdej półkuli pod kątem możliwych anomalii (np. powiększeń komór, wad rozwojowych, zmiękczenia tkanek, guzów itp.)13. Zobacz rysunek 2a.
	<ol>
		<li>Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej. Zwróć uwagę na każdą niezwykłą cechę mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść dwie półkule płasko, leżąc na ich środkowych aspektach, z płatami czołowymi skierowanymi od badacza, jak pokazano na rysunku 2b. Ułóż je w taki sposób, aby ich środki się stykały (również w przypadku wyraźnej asymetrii półsfery).</li>
	<li>Za pomocą ostrego noża ręcznie przetnij obie półkule mózgowe, zaczynając od biegunów czołowych i przesuwając się w kierunku biegunów potylicznych na całej długości półkul. Uzyskaj dwie serie bloków tkanki mózgowej o grubości 1 cm (około 18 płyt na każdą półkulę).</li>
	<li>Umieść płyty mózgowe w anatomicznie zorganizowanej sekwencji (kierunek czołowo-potyliczny) na oddzielnej płaskiej powierzchni. Użyj białej powierzchni z wydrukowaną na niej linijką, aby uzyskać lepszy kontrast podczas fotografowania. Przedstaw dwie serie płyt mózgowych w anatomicznie symetryczny sposób (kierunek czołowo-potyliczny), upewniając się, że ich powierzchnie czołowe są widoczne do bezpośredniego wglądu wzrokowego i fotografii cyfrowej (ryc. 3a). Używaj powierzchni tnących z nadrukowanymi siatkami milimetrowymi po obu stronach, aby dokładniej zlokalizować struktury mózgu, rozmiary i możliwe nieprawidłowości.
	<ol>
		<li>Zrób tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej. Rób notatki (prawdopodobnie za pomocą urządzenia do nagrywania dźwięku) na temat każdego nietypowego aspektu mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą ostrego skalpela ręcznie wypreparuj mniejsze prostokątne bloki tkanki mózgowej dla każdego ustalonego obszaru mózgu. Postępuj zgodnie z proponowanym schematem zbierania regionów mózgowych opisanym w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Umieść każdy blok tkanki w oddzielnie oznaczonych histokassetach. 
		UWAGA: Każdy blok tkanki mózgowej musi zostać przycięty tak, aby pasował, w jak największym stopniu, do standardowej maksymalnej objętości histokassy (30 x 20 x 4 mm3).</li>
		<li>Oznacz histokassety za pomocą kodu deidentyfikującego dla każdego przypadku i używając specyficznych identyfikatorów neuroanatomicznych (nie używaj losowych liter lub cyfr dla różnych mózgów; raczej zawsze używaj tych samych regionalnych nazw anatomicznych lub odpowiadających im liczb, jak pokazano w Tabeli 1). Twórz kody deidentyfikujące, na przykład generując liczby losowe lub półlosowe dla każdego przypadku (np. BRC 130, gdzie B pozostaje dla Mózgu, R pozostaje dla Zasobu, C pozostaje dla Centrum, a 130 to postępujący akcesor lub AD160001, gdzie AD oznacza "badanie choroby Alzheimera", 16 to rok, w którym przeprowadzono autopsję (2016), i 0001 numer egzemplarza postępowego akcesji). 
		UWAGA: Ten krok jest bardzo pomocny dla przyszłych badaczy; zachowaj legendę i określ półkulę (L = lewa półkula, R = prawa półkula). Użyj dwóch różnych kolorów histokasset, ustalając określony kolor dla każdej półkuli.</li>
		<li>Wykonaj tyle zdjęć cyfrowych, ile jest konieczne w każdym konkretnym przypadku, aby udokumentować możliwe makroanomalie i uwzględnić możliwe względy kliniczno-neuroanatomiczne i po cięciu. Poproś asystenta naukowego o wykonanie zdjęć cyfrowych prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory mózgowej. Zwróć uwagę na każdą niezwykłą cechę mózgu w porównaniu z normalnym mózgiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrób cyfrowe zdjęcia (tyle, ile jest to konieczne lub pożądane) całego przeciętego mózgu i związanych z nim histokasset.</li>
	<li>Dziurkowanie (np. za pomocą Accu-punch) małych kawałków tkanki w celu ekstrakcji DNA i analiz genetycznych. Użyj stempla o średnicy 2 - 5 mm. 
	UWAGA: Ze względu na wysoką zawartość materiału genomowego móżdżek jest preferowanym wyborem; Jednak każdy inny region jest w porządku.</li>
	<li>Ponownie zanurz wszystkie histokassety zawierające bloki tkanki mózgowej w tym samym rodzaju roztworu utrwalającego (np. 10% neutralnie buforowanej formalinie), jaki był poprzednio stosowany, aż do następnego etapu przetwarzania tkanki.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami przetwarzania tkanek utrwalonych w ludzkim formalinie14.</li>
</ol>
3. Specjalne podejście: naprzemienne zamrożone i stałe symetryczne cięcie bihemsfery
UWAGA: Protokół symetrycznego dwupółkulowego cięcia mózgu opisany w sekcji 2 oferuje możliwość wycinania fragmentów tkanek z nieustalonych, świeżych mózgów (jeśli są dostępne) w ten sam systematyczny i symetryczny sposób.
<ol>
	<li>Umieść cały świeży mózg do góry nogami (najlepiej na półkulistej powierzchni z tworzywa sztucznego przypominającej miskę) na 8 - 10 minut w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby stwardnieć tkankę mózgową bez powodowania uszkodzeń biochemicznych i ułatwić ręczne cięcie.</li>
	<li>Za pomocą ostrego noża przeciąć obie półkule na przemian i po kolei, postępując zgodnie z protokołem cięcia mózgu opisanym w sekcji 2, ale zamrozić i przymocować co drugą płytę (z obu półkul i wzdłuż czołowo-potylicznego kierunku anatomicznego).
	<ol>
		<li>W tym momencie nie próbuj przecinać każdego obszaru mózgu, jak opisano w Tabeli 1. Wytnij określone świeże obszary mózgu tylko wtedy, gdy jest to wymagane do natychmiastowej ekstrakcji RNA lub białka (tj. do badań genomicznych lub proteomicznych)15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pokrojeniu natychmiast zamroź, oznacz i ponumeruj każdą świeżą tkankę. Rób cyfrowe zdjęcia całej serii płyt; zapakuj każdą płytę w jedną plastikową torbę; zebrać płyty do oddzielnego pojemnika tylko na jeden mózg; i przechowywać pojemnik w dedykowanej zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Zamrażarka powinna być dedykowana wyłącznie ludzkiej tkance mózgowej. Dopiero później pojedyncze zamrożone obszary mózgu zostaną wycięte, zgodnie z wymaganiami dla każdego konkretnego eksperymentu.</li>
	<li>Zanurzyć każdy inny fragment tkanki wybrany do utrwalenia (10% neutralnie buforowanej formaliny lub innego utrwalacza) w oddzielnych torebkach zawierających wystarczającą objętość utrwalacza (stosunek 3/1 objętości utrwalacza do bloku tkankowego). Oznacz każdą torbę, numerując je kolejno zgodnie z sekwencją czołowo-potyliczną. Zamknij każdą torbę, zrób zdjęcia cyfrowe i przechowuj je w plastikowym pojemniku.</li>
	<li>Otwórz worki zawierające utrwalacz po 2 tygodniach utrwalenia tkanki i przeciąć każdy obszar mózgu, jak opisano w Tabeli 1.</li>
</ol>
4. Histostain i immunohistochemia
UWAGA: Zestaw regionów mózgu wyciętych w oparciu o proponowany schemat (Tabela 1) jest wystarczający, aby spełnić większość, jeśli nie wszystkie, obecnie ustalonych, opartych na konsensusie kryteriów patologicznych dla AD16, PD17, otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB)18, otępienia czołowo-skroniowego (FTD/MND)19, postępującego porażenia nadgałkowego (PSP)20, zaniku wieloukładowego (MSA)21, przewlekłej encefalopatii pourazowej (CTE)22, itp.
<ol>
	<li>Dla każdego obszaru mózgu i dla obu półkul należy wykonać następujący minimalny zestaw barwień histowarowych: Hematoksylina i eozyna (H&E), fiolet krezylowy (CV; jeśli planowane są na przykład ilościowe badania morfometryczne) i barwienie srebrem (jeśli potrzebne są analizy "eksploracyjne").</li>
	<li>Dla każdego regionu mózgu i dla obu półkul wykonaj następujący minimalny zestaw protokołów immunohistochemicznych: β-amyloid (βA), fosforylowany Tau (pTau), fosforylowany α-synukleina (pα-syn) i fosforylowany-TDP43 (pTDP43), zgodnie z opisem14. 
	UWAGA: Całkowita liczba skrawków tkanek w celu oceny każdego mózgu zgodnie z tym protokołem wynosi 46 (jeśli dostępne są wszystkie obszary mózgu z obu półkul).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta metoda wycinania mózgu może być dostosowana do specyficznych potrzeb każdego laboratorium neuropatologicznego (na przykład poprzez zmniejszenie liczby regionów mózgu do oceny dla każdej półkuli), przy jednoczesnym zachowaniu procedury dwupółkulowego symetrycznego cięcia jako jednej z jej głównych cech. Ten proponowany protokół może być stosowany do rutynowych procedur (ośrodki neuropatologiczne zorientowane na badania) lub tylko wtedy, gdy jest to konieczne (specyficzne badania kliniczne). Może być selektywnie stosowa...

Neuropatolodzy mają przywilej naukowy, honor intelektualny i obowiązek diagnostyczny do oceny ludzkich mózgów. Przez wiele dziesięcioleci podejmowano szczegółowe opisy kliniczne chorób mózgu i podejmowano znaczne wysiłki w celu zindywidualizowania ich możliwych neurohistologicznych korelatów w ludzkich mózgach pośmiertnych. Historycznie rzecz biorąc, wysiłki te reprezentowały najbardziej produktywną metodę, dzięki której nauki medyczne, a w szczególności neurologia, rozwijały się w epoce nowożytnej. Dzięki wcześniejszym wybitnym neuropatologom i ich poświęceniu, determinacji, nauce i zadziwiającej zdolności do rozróżniania normalnych i nieprawidłowych tkanek mózgowych (często przy użyciu bardzo prymitywnych narzędzi), możemy teraz badać i celować w choroby takie jak choroba Alzheimera-Perusiniego (niesprawiedliwie nazywana tylko chorobą Alzheimera; APD/AD)1, choroba Parkinsona (PD)2, choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD)3, choroba Lou-Gehriga/stwardnienie zanikowe boczne (ALS)4 i choroba Guam5, by wymienić tylko kilka.
Zaawansowane techniki neuroobrazowania, takie jak tomografia komputerowa wysokiej rozdzielczości (np. wielosekcyjna spiralna tomografia komputerowa; Angiografia CT), funkcjonalne i morfologiczne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (tj. fMRI, rezonans magnetyczny dyfuzyjny, traktografia-rezonans magnetyczny itp.), pozytonowa tomografia emisyjna (PET), obrazowanie oparte na ultradźwiękach i inne, z pewnością zmieniły nasze ogólne podejście do diagnozowania i leczenia pacjentów neurologicznych i psychiatrycznych. Niemniej jednak, chociaż techniki neuroobrazowania są w stanie uwidocznić mózg osoby za życia, nie dają one w danym momencie możliwości bezpośredniej analizy wysoce skomplikowanych struktur komórkowych i subkomórkowych komórek, takich jak neurony; lub do wizualizacji, oznaczania i ilościowego określania określonych typów zmian wewnątrzkomórkowych; lub precyzyjnie wskazać ich lokalizację neuroanatomiczną lub subregionalną na obwodowych i podobwodowych poziomach anatomicznych. Na przykład techniki neuroobrazowania nie są w stanie zidentyfikować ani zlokalizować ciał Lewy'ego (LB) w pigmentowanych neuronach istoty czarnej (SN), powszechnej cechy patologicznej związanej z chorobą Parkinsona, lub splątków neurofibrylarnych (NFT) w korze śródwęchowej, klasycznej cechy choroby Alzheimera i innych patologii mózgu. Badania neuropatologiczne w połączeniu z zaawansowaną mikroskopią cyfrową są nadal niezastąpione w celu uzyskania szczegółowych korelacji kliniczno-patologicznych, a tym samym ostatecznej diagnozy.
Ze względu na szczególne anatomiczno-funkcjonalne właściwości ludzkiego mózgu, a zwłaszcza jego anatomiczną lokalizację (czyli wewnątrz czaszki, naturalny system ochronny, który nie pozwala na bezpośrednie zbadanie jego zawartości), wprowadzenie technik neuroobrazowania in vivo niezwykle pomogło klinicystom i badaczom znaleźć wstępne odpowiedzi na niektóre z tajemnic tej złożonej tkanki. Nie ma jednak metodologii klinicznej ani neuroobrazowania, która mogłaby zastąpić wyjątkową możliwość bezpośredniej analizy tkanki mózgowej podczas autopsji. Tylko zorganizowane gromadzenie, zachowanie i kategoryzacja ludzkich mózgów może pozwolić na bezpośrednie i systematyczne badania komórek neuronalnych i nieneuronalnych, ich subkomórkowych składników, wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych zmian patologicznych oraz wszelkiego rodzaju nieprawidłowości wewnątrz mózgu w celu potwierdzenia, modyfikacji lub przedefiniowania diagnoz klinicznych i odkrycia nowych korelacji kliniczno-patologicznych. Jednym z oczywistych ograniczeń dotyczących oceny mózgu podczas sekcji zwłok jest fakt, że procedura ta jest metodologią przekrojową. Zawsze będzie istniało opóźnienie między trwającym procesem neuropatologicznym (objawiającym się klinicznie lub nie) a szansą, jeśli taka istnieje, na zdefiniowanie go na poziomie neurohistologicznym. Wynika to głównie z niezdolności ludzkiego mózgu do samoregeneracji. Obecnie nie jest możliwe uzyskanie tkanki mózgowej in vivo bez spowodowania trwałego uszkodzenia. W związku z tym nie jest możliwa długotrwała i neuropatologiczna ocena tego samego mózgu/osoby. Jednak ustandaryzowane procedury bankowania mózgu i zwiększona świadomość na temat dawstwa mózgu wśród ogółu społeczeństwa mogą znacznie przyczynić się do rozwiązania problemów związanych z czasem autopsji mózgu poprzez konsekwentne zwiększanie liczby przypadków do zebrania i analizy. W ten sposób można uzyskać bardziej odpowiednią liczbę mózgów pośmiertnych, aby zdefiniować stałe wzorce patologicznego pochodzenia i progresji dla każdego konkretnego rodzaju uszkodzenia mózgu związanego z każdą chorobą mózgu człowieka. Wymagałoby to dawstwa i pobrania jak największej liczby mózgów od pacjentów dotkniętych jakimkolwiek zaburzeniem neuropsychiatrycznym, a także od zdrowych osób z grupy kontrolnej w każdym wieku. Jedną z możliwych metod może być pobranie jak największej liczby mózgów pośmiertnych z ogólnych i specjalistycznych ośrodków medycznych jako standardowa rutyna. Potrzeba dawstwa mózgu została niedawno wyrażona przez tych, którzy badają demencję i normalne starzeniesię6. Ta sama konieczność powinna być wyrażona przez całą dziedzinę neuropsychiatrii.
Z wyżej wymienionych i innych powodów, konieczna jest aktualizacja trwających procedur cięcia mózgu. Co więcej, procedury wycinania mózgu powinny być powszechnie ustandaryzowane w różnych ośrodkach badawczych neuropatomorfologii na całym świecie, biorąc również pod uwagę możliwość zastosowania obecnych i przyszłych technik biotechnologicznych w celu lepszego zbadania i, miejmy nadzieję, ostatecznego zrozumienia przyczyn i mechanizmów chorób mózgu u ludzi.
Tutaj, głównie w celach badawczych, opisujemy symetryczną metodologię pośmiertnego cięcia mózgu u ludzi. Ta procedura polega na pobraniu większej liczby obszarów mózgu niż zwykle i zarówno z półkuli mózgowej, jak i móżdżku. Symetryczna procedura dwupółkulowego cięcia mózgu będzie znacznie lepiej pasować do naszej obecnej wiedzy na temat ludzkiej neuroanatomii, neurochemii i neurofizjologii. Metoda ta daje również możliwość neuropatologicznej analizy unikalnych cech ludzkiego mózgu, takich jak specjalizacja półkulowa i lateralizacja, które są związane z wyższymi funkcjami poznawczymi i niepoznawczymi typowymi lub wyłącznie występującymi u naszego gatunku. Obecnie nie wiadomo, czy istnieją specyficzne związki patogenetyczne między specjalizacją/lateralizacją półkuli a określonymi typami uszkodzeń mózgu, czy też szczególne neuropsychiatryczne zdarzenie patogenetyczne jest początkowo, powszechnie lub wyłącznie związane z określoną półkulą i funkcją. Opisując tę symetryczną procedurę cięcia mózgu, staramy się zaproponować zaktualizowaną metodę sekcji ludzkiego mózgu, która może pomóc w lepszym zrozumieniu normalnych i patologicznych warunków w wysoce wyspecjalizowanej tkance, jaką jest mózg. Metoda ta uwzględnia również te aspekty półkuli morfofunkcjonalnej, które występują tylko u ludzi.

<table><tbody><tr><td>Kopia podpisanej świadomej zgody na autopsję i oddanie mózgu do celów badawczych.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczegółowy wywiad kliniczny pacjenta, który powinien zawierać szczegółowy opis wszelkich objawów i oznak neurologicznych i psychiatrycznych.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medyczne lub niemedyczne nagrania wideo, jeśli są dostępne (szczególnie przydatne w dziedzinie zaburzeń ruchowych). Najbliżsi krewni Wymagana jest zgoda.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skale neuroobrazowania, neurofizjologii, neuropsychiatrii i oceny lub kliniczno-kliniczne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dane genetyczne i dane dotyczące historii rodziny. Przegląd raportów genetycznych, jeśli zdiagnozowano choroby neurogenetyczne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik histologiczny</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI</td><td>64233-24</td><td></td></tr><tr><td>Kasety histologiczne</td><td>VWR</td><td>18000-142 (pomarańczowe)</td><td></td></tr><tr><td>Kasety histologiczne</td><td>VWR</td><td>18000-132 (granatowe)</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeści noży i ostrza jednorazowe</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>62560-04</td><td></td></tr><tr><td>Długie ostrza</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>62561-20</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeści noży z jednorazowym ostrzem</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>72040-08</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>72049-22</td><td></td></tr><tr><td>Accu-Punch 2 mm</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>69038-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki styropianowe &ndash; Sterylna</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>64240-12</td><td></td></tr><tr><td>Deska sekcyjna</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES</td><td>63307-30</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, obojętnie buforowany, 10%</td> <td>Roztwór hematoksyliny Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>HT501128</tr>, <tr><td>Gill nr 2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS280&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y roztwór wodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT1102128&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>anty-beta-amyloid</td><td>Covance, Princeton, NJ</td><td>SIG-39220</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anty-tau</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MN1020</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anty-alfa-synukleina</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anty-fosfo-TDP43</td><td>Cosmo Bio Co.</td><td>TIP-PTD-P02</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>głowica Zgrzewarka impulsowa&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>5ZZ35</td><td></td></tr></tbody></table>

symetryczne pośmiertne cięcie mózgu w bihemferze w celu zbadania zdrowych i patologicznych stanów mózgu u ludzi

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropatolodzy czasami czują się onieśmieleni ilością wiedzy potrzebnej do wygenerowania ostatecznych diagnoz dla złożonych zjawisk neuropsychiatrycznych opisywanych u tych pacjentów, dla których poproszono o autopsję mózgu. Chociaż postęp nauk biomedycznych i neuroobrazowania zrewolucjonizował dziedzinę neuropsychiatrii, wygenerował również mylącą ideę, że autopsje mózgu mają jedynie wartość potwierdzającą. Ta fałszywa idea doprowadziła do drastycznego zmniejszenia liczby autopsji, a w konsekwencji do zmniejszenia możliwości przeprowadzenia bardziej szczegółowych i rozległych badań neuropatologicznych, które są niezbędne do zrozumienia wielu normalnych i patologicznych aspektów ludzkiego mózgu, które są jeszcze nieznane. Tradycyjna metoda wnioskowania o korelacji między obserwowanymi zjawiskami neuropsychiatrycznymi i odpowiadająca im lokalizacja/charakterystyka ich możliwych korelatów neurohistologicznych nadal ma niezaprzeczalną wartość. W kontekście chorób neuropsychiatrycznych tradycyjna metoda kliniczno-patologiczna jest nadal najlepszą możliwą metodologią (i często jedyną dostępną) do łączenia unikalnych cech neuropsychiatrycznych z odpowiadającymi im substratami neuropatologicznymi, ponieważ opiera się ona w szczególności na bezpośredniej ocenie fizycznej tkanek mózgowych. Ocena pośmiertnych mózgów opiera się na procedurach wycinania mózgu, które różnią się w różnych ośrodkach neuropatologicznych. Wycinanie mózgu jest wykonywane w stosunkowo obszerny i systematyczny sposób w oparciu o różne kliniczne i akademickie sytuacje występujące w każdej instytucji. Bardziej anatomicznie inkluzywna i symetryczna metodologia dwupółkulowego cięcia mózgu powinna być przynajmniej stosowana do celów badawczych w ludzkiej neuropatologii w celu spójnego dogłębnego zbadania normalnych i patologicznych stanów ze specyfiką ludzkiego mózgu (tj. specjalizacją półkulową i lateralizacją dla określonych funkcji). Taka metoda zapewniłaby bardziej wszechstronny zbiór neuropatologicznie dobrze scharakteryzowanych mózgów, dostępnych dla obecnych i przyszłych technik biotechnologicznych i neuroobrazowania. Opisujemy symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu do badania różnic półkulowych w patologiach ludzkiego mózgu oraz do stosowania z obecnymi, a także przyszłymi technikami biomolekularnego / neuroobrazowania.

Długość protokołu
Szacowany czas trwania pojedynczej procedury symetrycznego dwupółkulowego cięcia utrwalonego mózgu wynosi 1 h (z wyłączeniem czasu poświęconego na przygotowanie stołu sekcyjnego, narzędzi i powierzchni do cięcia, etykietowanie itp.). Szacuje się, że pojedyncza procedura symetrycznego dwupółkulowego naprzemiennego cięcia mózgu mrożonego i utrwalonego zajmuje 2 h. Uzyskanie ostatecznych diagnoz histologiczn...

Zorganizowane procedury cięcia mózgu są konieczne, aby skorelować określone zjawiska neuropsychiatryczne z ostatecznymi diagnozami neuropatologicznymi. Cięcia mózgu są wykonywane w różny sposób w zależności od różnych kliniczno-akademickich okoliczności. Protokół ten opisuje symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu w celu zbadania różnic półkulowych w patologiach ludzkiego mózgu oraz maksymalizacji obecnych i przyszłych technik biomolekularnych/neuroobrazowania.

Symetryczne pośmiertne cięcie mózgu w bihemferze w celu zbadania zdrowych i patologicznych stanów mózgu u ludzi

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Ogólnym celem tej procedury jest systematyczne pobieranie i analiza stałej serii obszarów mózgu, wyciętych symetrycznie z obu półkul mózgu człowieka, w celu oceny stopnia nasilenia, kliniczno-patologicznego stadium oraz rozkładu półkulowego różnych chorób mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuropatologii, dostarczając systematycznie zorganizowanego zbioru jakościowych i ilościowych danych neuropatologicznych do szczegółowych korelacji kliniczno-patologicznych i obrazowo-patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest uzyskanie istotnych danych dotyczących samych procesów patologicznych, a także histofunkcjonalnych aspektów specjalizacji każdej z półkul mózgu.Po utrwaleniu tkanki ludzkiego mózgu pobranej po śmierci zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić mózg na płaskiej powierzchni tak, aby bieguny czołowe były skierowane w stronę przeciwną do badacza. Ustawić mózg w sposób umożliwiający pełną i wyraźną wizualizację wszystkich zakrętów i bruzd kory całego mózgowia. Zbadać tkankę pod kątem anomalii opon mózgowych, makroskopowych asymetrii półkul, makroskopowych przylegania tkanek, wad wrodzonych, nieprawidłowości naczyń lub wszelkich innych anomalii bądź nietypowych obrazów powierzchni kory mózgu.Ustawiając bieguny czołowe przodem od badacza, a powierzchowne części półkul w stronę badacza, wykonaj tyle zdjęć cyfrowych, ile jest koniecznych do udokumentowania ewentualnych anomalii makroskopowych oraz uwzględnienia możliwych uwarunkowań klinicznych, neurologicznych, anatomicznych i pozakcięciowych. Wykonaj zdjęcia cyfrowe prostopadle do mózgu, aby uchwycić całą powierzchnię kory. Następnie, używając tuszu lub kolorowych igieł, zaznacz zakręty przedśrodkowy i pośrodkowy kory.Następnie, wciąż z biegunami czołowymi skierowanymi w przeciwną stronę, obróć mózg o 180 stopni, a następnie dokładnie obejrzy podstawę mózgu, zwracając szczególną uwagę na układ naczyniowy oraz nerwy czaszkowe na poziomach wyjścia i wejścia do pnia mózgu. Postępuj z cebulkami i pasmami węchowymi z wyjątkową ostrożnością, aby uniknąć rozdarcia tkanek ze względu na ich niezwykłą delikatność. Wykonaj cyfrowe fotografie prostopadle do mózgu, aby uchwycić całe powierzchnie kory oraz pnia mózgu.Ustawiając się naprzeciw podstawy mózgu, należy za pomocą skalpela przeciąć pień mózgu w poprzek w górnej części mostu, jak najbliżej podstawy mózgowia. Należy dokładnie sprawdzić istotę czarną pod kątem bladości oraz ocenić inne sąsiadujące struktury. Przy użyciu urządzenia do rejestracji dźwięku należy odnotować wszelkie nietypowe cechy wyglądu mózgu w porównaniu do mózgu prawidłowego.W tym kroku przeprowadzana jest dyssekcja cebulek i traktów węchowych najpierw w półkuli lewej, a następnie prawej. Obrócić mózg z powrotem i za pomocą ostrego noża, prowadząc go w kierunku czołowo-potylicznym, oddzielić obie półkule poprzez przecięcie ciała modzelowatego centralnie wzdłuż szczeliny podłużnej środkowej. Obejrzeć każdą stronę obu półkul w celu wykrycia ewentualnych anomalii.Po wykonaniu niezbędnej liczby zdjęć, w tym zdjęć prostopadłych do mózgu w celu uchwycenia całej powierzchni kory, należy położyć obie półkule płasko stroną przyśrodkową do dołu, tak aby płaty czołowe były skierowane z dala od badacza, a ich środki stykały się. Używając ostrego noża, należy ręcznie przeciąć obie półkule mózgowia, zaczynając od biegunów czołowych i przesuwając się w kierunku biegunów potylicznych przez całą długość półkul, aby uzyskać dwie serie plastrów tkanki mózgowej o grubości 1 cm. Plastry mózgu należy ułożyć w anatomicznie uporządkowanej i symetrycznej sekwencji na płaskiej białej powierzchni z nadrukowaną linijką w celu wykonania dokumentacji fotograficznej.Należy upewnić się, że powierzchnie czołowe bloku są widoczne w celu bezpośredniej inspekcji wzrokowej oraz dokumentacji fotograficznej. Do lokalizacji struktur mózgu, określania ich rozmiarów oraz ewentualnych nieprawidłowości w sposób bardziej precyzyjny należy stosować powierzchnie do cięcia z nadrukowaną siatką milimetrową po obu stronach. Przy widocznych powierzchniach czołowych należy wykonać cyfrowe fotografie prostopadle, aby uchwycić całą powierzchnię kory.Odnotuj wszelkie nietypowe cechy mózgu w porównaniu z mózgiem prawidłowym. Następnie, używając ostrego skalpela, ręcznie wycięte małe prostokątne bloki tkanki mózgowej dla każdego z określonych obszarów mózgowia. Postępuj zgodnie z proponowanym schematem pobierania obszarów mózgowia opisanym w poniższej tabeli.Utwórz kody identyfikacyjne do oznakowania kasetek histologicznych, generując liczby losowe lub półlosowe dla każdego przypadku, gdzie AD oznacza badanie nad chorobą Alzheimera (Alzheimer's Disease Study), 16 oznacza rok przeprowadzenia autopsji, a 0001 jest progresywnym numerem próbki w rejestrze. Umieść każdy blok tkanki w osobnej kasetce histologicznej. Wykonaj tyle zdjęć cyfrowych całego przekroju mózgu i powiązanych z nim kasetek histologicznych, ile opisano wcześniej.Po wykonaniu pełnego zestawu zdjęć, należy wyciąć fragmenty tkanki o rozmiarach od dwóch do pięciu milimetrów do ekstrakcji DNA i analizy genetycznej. Na koniec wszystkie kasety histologiczne zawierające bloki tkanki mózgowej należy zanurzyć w tym samym rodzaju roztworu utrwalającego, który był stosowany wcześniej, a następnie przetworzyć tkankę zgodnie z protokołem tekstowym. Niniejsza tabela przedstawia wstępne dane półilościowe z zastosowaniem symetrycznej procedury cięcia obydwu półkul mózgowia, przeprowadzonej na serii ludzkich mózgów pobranych z banku tkanek mózgowych.Wstępne dane wskazują, że większość mózgów z grupy kontrolnej starszych osób była w rzeczywistości dodatnia pod kątem blaszek neurytowych beta-A oraz splotów neurofibrylarnych tau, a poziomy nierozpuszczalnych blaszek neurytowych beta-A były wyższe w lewej korze entorynalnej i hipokampie w porównaniu do tych samych obszarów mózgu po stronie prawej. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu godziny w przypadku mózgów utrwalonych i w ciągu dwóch godzin w przypadku mózgów świeżych, o ile zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przestrzeganie zaproponowanego schematu cięcia oraz pobieranie każdego obszaru mózgu z obu półkul w oparciu o precyzyjną wiedzę z zakresu anatomii człowieka.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ekstrakcja DNA, RNA lub białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące poziomów aktywacji konkretnego genu w określonym obszarze mózgu, w konkretnej półkuli, w przebiegu danej choroby mózgu. Wraz z upowszechnieniem, technika ta utoruje drogę badaczom w dziedzinie neuropatologii, patologii klinicznej oraz korelacji patologii z obrazowaniem do badania aspektów patologicznych różnych chorób neuropsychiatrycznych w odniesieniu do półkul mózgowie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak pobierać konkretne obszary anatomiczne z obu półkul ludzkiego mózgu w celu oceny stopnia nasilenia choroby, stadium patologicznego choroby oraz rozkładu różnych procesów neuropatologicznych w obu półkulach.Należy pamiętać, że praca z ludzkim mózgiem to praca z historią osoby o złożonych obwodach neuroanatomicznych i potencjalnie z różnymi jednostkami chorobowymi, a ostrzami, skalpelami i formaliną należy posługiwać się z najwyższą ostrożnością.

symmetric-bihemispheric-postmortem-brain-cutting-to-study-healthy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę przygotowywania swobodnie pływających kultur warstwowych z mózgu dorosłego człowieka. Cienkie plasterki są generowane z części mózgu za pomocą wibratomu. Wycinki te są następnie zawieszane w pożywce hodowlanej uzupełnionej czynnikami wzrostu w celu utrzymania żywotności tkanek.

Przygotowanie swobodnie unoszących się kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu

Film przedstawia krok po kroku procedurę symetrycznego preparowania ustalonego pośmiertnego ludzkiego mózgu, przygotowując mniejsze bloki tkanek do dalszej analizy.

Symetryczne przecięcie bihemferyczne ludzkiego mózgu pośmiertnego

Pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronów hipokampa są przydatne do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych ze śmiercią neuronów. Określenie płci zarodków przed izolacją i dysocjacją hipokampa pozwala na przygotowanie oddzielnych kultur męskich i żeńskich, co umożliwia badaczowi zidentyfikowanie i zbadanie sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci.

Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych

Korzystając z rezonansu magnetycznego (człowieka), oprogramowania do obrazowania 3D i analizy immunohistologicznej, dokumentujemy zmiany w bocznych komorach mózgu. Podłużne mapowanie 3D zmian objętości komór bocznych i charakterystyka okołokomorowych zmian komórkowych, które zachodzą w ludzkim mózgu z powodu starzenia się lub choroby, są następnie modelowane u myszy.

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

Tutaj prezentujemy protokół do określenia minimalnej liczby obrazów, które musiały zostać zarejestrowane i uśrednione, aby rozwiązać struktury podkorowe i sprawdzić, czy poszczególne warstwy LGN mogą być rozwiązane przy braku szumu fizjologicznego.

Obrazowanie strukturalnego rezonansu magnetycznego człowieka w wysokiej rozdzielczości in vivo i post mortem

Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.

Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym

Ten artykuł demonstruje skuteczne wykorzystanie metody preparacji włókien do ujawnienia powierzchownych dróg istoty białej i struktur okołokomorowych ludzkiego mózgu, w przestrzeni trójwymiarowej, aby pomóc studentom zrozumieć morfologię komór.

Eksploracja głębokiego kosmosu - odkrywanie anatomii struktur okołokomorowych w celu ujawnienia bocznych komór ludzkiego mózgu

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię uzyskiwania spłaszczonych przekrojów stycznych z kory mózgowej ssaków i wizualizacji modułów korowych za pomocą metod histochemicznych i immunohistochemicznych.

Wizualizacja modułów korowych w spłaszczonych korach ssaków

Stwardnienie rozsiane jest zapalną chorobą demielinizacyjną, na którą nie ma lekarstwa. Analiza tkanki mózgowej dostarcza ważnych wskazówek do zrozumienia patogenezy choroby. W tym miejscu omawiamy metodologię i dalszą analizę tkanki mózgowej stwardnienia rozsianego pobranej za pomocą unikalnego programu szybkiej autopsji działającego w Cleveland Clinic.

Kompleksowy program autopsji dla osób ze stwardnieniem rozsianym

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Poznaj symetryczne cięcie pośmiertne mózgu w bihemferze w celu badania patologii neuropatologicznych. Ta metoda umożliwia systematyczną analizę regionów mózgu i korelację kliniczną.

Symetryczne pośmiertne cięcie mózgu w bihemferze w celu zbadania zdrowych i patologicznych stanów mózgu u ludzi

Przeglądaj więcej filmów