Name: Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych w tkankach roślinnych Coffea arabica. Technika ta oferuje minimalną preparację próbek, wysoką przepustowość i niskie koszty w porównaniu do spektrometrii mas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za finansowe wsparcie tego projektu przez firmę The J.M. Smucker.

<ol><li>Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+and+Regulation+of+the+Tricarboxylic+Acid+Cycle+in+Photosynthetic+and+Heterotrophic+Plant+Tissues%3A+TCA+Control+and+Regulation+in+Plant+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues.</a> Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).</li>
<li>Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+Analysis+of+the+Role+of+Carboxylic+Acids+in+Metabolite+Signaling+in+Arabidopsis+Leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves.</a> Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).</li>
<li>Doyle, M. P., Buchanan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoyle%2C+MP+%22Food+Microbiology%3A+Fundamentals+and+Frontiers%22">Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers</a>. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).</li>
<li>Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Spectrum+of+Low+Molecular+Mass+Organic+Acids+in+Urine+by+Capillary+Electrophoresis+with+Contactless+Conductivity+and+Ultraviolet+Photometric+Detection-An+Efficient+Tool+for+Monitoring+of+Inborn+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders.</a> Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).</li>
<li>López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+Acid+Metabolism+in+Plants%3A+From+Adaptive+Physiology+to+Transgenic+Varieties+for+Cultivation+in+Extreme+Soils%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils.</a> Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).</li>
<li>Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Joint+CZE+Determination+of+Sugars+and+Acids+in+Vegetables+and+Fruits%3A+CE+and+CEC%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC.</a> Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).</li>
<li>Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+the+Main+Organic+Acids+and+Carbohydrates+Involved+in+Tomato+Flavour+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sci+Food+Agr%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis.</a> J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).</li>
<li>Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Electrophoresis+in+Determination+of+Low+Molecular+Mass+Organic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Sci+Dev%22%5BJournal%5D)">Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids.</a> Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).</li>
<li>Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Electrophoresis+for+Short-Chain+Organic+Acids+and+Inorganic+Anions+in+Different+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples.</a> Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).</li>
<li>Klampfl, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Organic+Acids+by+CE+and+CEC+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods.</a> Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).</li>
<li>Kenney, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Organic+Acids+in+Food+Samples+by+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis.</a> J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).</li>
<li>Galli, V., Barbas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Electrophoresis+for+the+Analysis+of+Short-Chain+Organic+Acids+in+Coffee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee.</a> J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).</li>
<li>Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384(2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chromatographic+analysis+of+the+environment+3rd+ed%22">Chromatographic analysis of the environment 3rd ed</a>. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ElixerOA+Organic+Acids%2FAnions+Operating+and+Instruction+Manual%2C+MicroSolv+Technology+Corperation%22">ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation</a>. , Eatontown, NJ, USA. (2001).</li>
<li>Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+low+molecular+weight+organic+acids+in+water+with+capillary+zone+electrophoresis+employing+indirect+photometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fresenius+J.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).</li>
<li>Ibanez, A. B., Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+method+for+the+determination+of+organic+acids+in+dilute+acid+pretreated+biomass+hydrolysate+by+liquid+chromatography-time-of-flight+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+For+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy.</a> Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podobnie jak w przypadku każdej techniki analitycznej, istnieje kilka krytycznych czynników, które mogą znacząco wpłynąć na jakość i wiarygodność generowanych danych. Po pierwsze, ważne jest, aby przetwarzać próbki wydajnie, przy minimalnej liczbie cykli zamrażania/rozmrażania. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie może pogorszyć skład chemiczny próbki przed przetwarzaniem lub analizą. Po drugie, bardzo ważne jest, aby konsekwentnie i równomiernie stosować etapy tego protokołu do wszystkich próbek. Błędy techniczne wynika...

Kwasy karboksylowe to związki organiczne zawierające jedną lub więcej końcowych karboksylowych grup funkcyjnych, z których każda jest przyłączona do grupy R zawierającej jeden lub więcej atomów węgla (R-C[O]OH). Krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe o niskiej masie cząsteczkowej (krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe, SCCA) zawierające od jednego do sześciu atomów węgla, są niezbędnymi składnikami oddychania komórkowego i funkcjonują w kilku szlakach biochemicznych niezbędnych do wzrostu i rozwoju komórek. SCCA odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym1, sygnalizacji komórkowej2 i reakcjach organizmu na środowisko (takich jak antybioza3). Z tego powodu SCCA mogą służyć jako użyteczne wskaźniki zakłóceń metabolizmu komórkowego, reakcji roślin na stres4,5 i jakości owoców6,7. Do tej pory SCCA były oznaczane ilościowo głównie za pomocą technik chromatograficznych, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) lub chromatografia gazowa ze spektroskopią mas (GC-MS). Chociaż metody te są w stanie osiągnąć bardzo niskie granice wykrywalności, mogą być kosztowne, wymagają derywatyzacji docelowych SCCA przy użyciu i/lub toksycznych odczynników i obejmują długie przebiegi separacji na GC lub HPLC. Z tego powodu stale rośnie zainteresowanie zastosowaniem wolnej, strefowej elektroforezy kapilarnej (CZE), która nie wymaga derywatyzacji próbki, do ilościowego oznaczania kwasów organicznych8.
Wolna strefowa elektroforeza kapilarna (CZE) to metodologia chromatograficznego rozdzielania, która, ze względu na dużą liczbę teoretycznych płytek, szybkość i względną łatwość użycia, coraz częściej zastępuje zarówno GC-MS, jak i wysokociśnieniową chromatografię cieczową jako metodę analityczną do oznaczania ilościowego (szczególnie dla celów kontroli jakości) anionów, kationów, aminokwasów, węglowodanów i krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych (SCCA)8,9,10. Separacja małych cząsteczek, w tym SCCA, oparta na CZE, opiera się na dwóch podstawowych zasadach: elektroforetycznym ruchu naładowanych jonów w polu elektrycznym utworzonym w poprzek buforu wypełniającego kapilarę; oraz ruch elektroosmotyczny całego układu buforowego z jednego końca kapilary na drugi, na ogół w kierunku elektrody ujemnej. W tym układzie małe cząsteczki poruszają się w kierunku elektrody ujemnej z różnymi prędkościami, przy czym prędkość każdej cząsteczki zależy od stosunku ładunku netto cząsteczki do masy cząsteczkowej. Ponieważ ruch każdej pojedynczej cząsteczki w tym układzie zależy od stanu naładowania cząsteczki i ogólnej szybkości przepływu elektroosmotycznego (która z kolei opiera się na zawartości jonów w buforze używanym do wypełnienia kapilary), pH buforu i skład jonowy mają duży wpływ na stopień, w jakim cząsteczki mogą być skutecznie oddzielone za pomocą CZE. Z tego powodu SCCA, ze względu na stosunkowo wysoki stosunek ładunku do masy, są idealnymi celami do separacji opartej na CZE. Metabolity wydzielone za pomocą CZE można wykrywać różnymi metodami, w tym absorbancją UV, absorbancją spektralną (która jest zwykle wykonywana przy użyciu matrycy fotodiodowej [PDA]) i/lub spektroskopii mas (CE-MS lub CE-MS/MS)8. Różnorodność metod separacji i detekcji oferowanych przez CZE sprawia, że jest to technika niezwykle elastyczna i adaptowalna. Z tego powodu CZE jest coraz częściej stosowane jako standardowa metoda analizy w obszarach bezpieczeństwa i jakości żywności11,12, badań farmaceutycznych13 i monitorowania środowiska13,14. 
Elektroforeza kapilarna jest używana do wykrywania i ilościowego oznaczania krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych od prawie dwóch dekad13. Zdolność rozdzielcza (szczególnie w przypadku małych, naładowanych cząsteczek), krótki czas trwania i niski koszt analiz CZE w przeliczeniu na próbkę sprawiają, że CZE jest idealną techniką do rozdzielania i oznaczania ilościowego SCCA13. Metoda ta przedstawia protokół wykorzystania CZE do pomiaru stężenia kwasów organicznych w tkankach roślinnych. Przykładowe dane zostały wygenerowane dzięki pomyślnemu wdrożeniu tego protokołu w celu zmierzenia zmian poziomu kwasów organicznych w nasionach kawy po wtórnej fermentacji. Protokół szczegółowo opisuje krytyczne etapy i typowe błędy związane z separacją SCCA na podstawie CZE oraz omawia środki, za pomocą których protokół ten może być z powodzeniem stosowany do ilościowego oznaczania SCCA w dodatkowych tkankach roślinnych.

<table><tbody><tr><td>Ceramiczny Moarter i tłuczek</td><td>Coorstek</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>System Beckman Coulter P / ACE MDQ CE Beckman</td><td>Coulter</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>szklane fiolki na próbki</td><td>Fisher Inc.</td><td>033917D</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml&nbsp;</td><td>Fisher Inc.</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy LC/MS</td><td>Fisher Inc.</td><td>W6-1</td><td>Mili-Q woda (18.2&nbsp; M&Omega; &#183; cm) jest również dopuszczalna</td></tr><tr><td>15 ml szklana rurka / nakrętka wyłożona teflonem&nbsp;</td><td>Fisher Inc.</td><td>14-93331A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Inc.</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania CElixirOA pH 5,4&nbsp;</td>Strzykawki <td>MicroSolv</td><td>06100-5.4</td><td></td></tr><tr><td>BD Safety-Lok</td><td>Fisher Inc.</td><td>14-829-32</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 17 mm, PTFE</td><td>Fisher Inc.</td><td></td><td></td>3377154</tr><tr><td>32 Karatów, V. 8.0 oprogramowanie sterujące</td><td>Beckman Coulter</td><td>285512</td><td></td></tr><tr><td>fiolki na próbki do elektroforezy kapilarnej (CE)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>144980</td><td></td></tr><tr><td>nakrętki do fiolek CE&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>144648</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ciekły azot jest dostępny w większości usług obiektowych</td></tr></tbody></table>

zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona coffea arabica

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Kwasy karboksylowe to kwasy organiczne zawierające jedną lub więcej końcowych karboksylowych grup funkcyjnych (COOH). Krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe (SCCA; kwasy karboksylowe zawierające od trzech do sześciu atomów węgla), takie jak jabłczan i cytrynian, mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania wielu systemów biologicznych, w których działają w oddychaniu komórkowym i mogą służyć jako wskaźniki zdrowia komórek. W żywności zawartość kwasów organicznych może mieć znaczący wpływ na smak, a zwiększony poziom SCCA skutkuje kwaśnym lub "kwaśnym" smakiem. Z tego powodu metody szybkiej analizy poziomów kwasów organicznych są szczególnie interesujące dla przemysłu spożywczego i napojów. Niestety, większość metod stosowanych do oznaczania ilościowego SCCA opiera się na czasochłonnych protokołach wymagających derywatyzacji próbek za pomocą niebezpiecznych odczynników, a następnie kosztownych analiz chromatograficznych i/lub spektrometrycznych mas. Niniejsza metoda szczegółowo opisuje alternatywną metodę wykrywania i oznaczania ilościowego kwasów organicznych z materiału roślinnego i próbek żywności przy użyciu swobodnej strefowej elektroforezy kapilarnej (CZE), czasami nazywanej po prostu elektroforezą kapilarną (CE). CZE zapewnia opłacalną metodę pomiaru SCCA o niskiej granicy wykrywalności (0,005 mg/ml). Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat ekstrakcji i oznaczania ilościowego SCCA z próbek roślin. Podczas gdy przedstawiona metoda koncentruje się na pomiarze SCCA z ziaren kawy, przedstawiona metoda może być stosowana do wielu roślinnych materiałów spożywczych.

Niniejszy protokół został z powodzeniem zastosowany do pomiaru wpływu zabiegów nasiennych na zawartość SCCA w ziarnach zielonej kawy. W tym eksperymencie zastosowano sześć wariantów: nasyconą zawiesinę mikrobiologiczną szczepu Leuconostoc pseudomesenteroides GCP674 w pożywce wzrostowej (1), wodną zawiesinę drobnoustrojów GCP674 w wodzie (2), wodny roztwór kwasu octowego i mlekowego (odpowiednio 0,15 i 0,4 mg/ml) (3), zużytą pożywkę wzrostową M1 (4), wodę dH2O (5) oraz ...

Ten artykuł przedstawia metodę wykrywania i kwantyfikacji kwasów organicznych z materiału roślinnego za pomocą swobodnej strefowej elektroforezy kapilarnej. Podano przykład potencjalnego zastosowania tej metody, określającej wpływ wtórnej fermentacji na poziom kwasów organicznych w nasionach kawy.

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie poziomu kwasów organicznych obecnych w tkankach roślinnych. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania z zakresu biochemii i fizjologii roślin, takie jak wpływ bodźców środowiskowych na wzrost korzeni, rozwój upraw oraz jakość żywności lub napojów. Głównymi zaletami tej metody są minimalny nakład pracy przy przygotowaniu próbek, wysoka przepustowość oraz fakt, że elektroforeza kapilarna jest bardziej ekonomiczna niż spektrometria mas.Choć metoda ta jest wykorzystywana do wyjaśniania fizjologicznych odpowiedzi roślin, może ona zostać zastosowana również w nauce o żywności i kontroli jej jakości, gdzie kwasy organiczne mają kluczowy wpływ na smak, bezpieczeństwo i stabilność. Na początek należy przygotować próbki do ekstrakcji krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych (SCCA). Przygotowuj po jednym gramie ziaren kawy na raz, aby upewnić się, że po przetworzeniu pozostanie wystarczająca ilość próbki.Aby uzyskać jednolity rozmiar cząstek dla maksymalnej wydajności ekstrakcji SCCA, należy najpierw schłodzić moździerz i tłuczek ciekłym azotem. Do moździerza z niewielką objętością ciekłego azotu należy dodać próbkę. Za pomocą chochli należy dolać do moździerza tyle ciekłego azotu, aby całkowicie zanurzyć próbkę.Dodaj próbki trudne do rozcierania, takie jak surowe ziarna kawy, do ciekłego azotu. Pozostaw je do zamrożenia na 10 do 30 sekund przed rozcieraniem. Rozdrobnij tkankę na mniejsze fragmenty, wykonując pionowe ruchy miażdżące.Następnie należy zakończyć rozcieranie tkanki, wykonując koliste ruchy. Kroki mrożenia i rozcierania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie, tak aby próbki zostały rozcierane łącznie trzy razy. Zazwyczaj trzy kolejne serie rozcierania zredukują próbki do postaci proszku o konsystencji mąki.Przenieś proszek do szklanych fiolek lub probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Rozpocznij dalsze etapy przetwarzania natychmiast po mieleniu lub przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia ekstrakcji. Przygotuj autentyczne wzorce dla interesujących SCCAs, aby stworzyć zewnętrzne i wewnętrzne roztwory standardowe do wyznaczania stężeń SCCA.W przypadku próbek kawy jako kwasy analizowane należy uwzględnić kwas cytrynowy, jabłkowy, octowy i mlekowy, a jako standard wewnętrzny kwas adypinowy. Przygotuj roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 mg standardu do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Uzupełnij kolbę miarową do kreski 10 ml wodą ultraczystą, aby rozpuścić kwas.Przenieś każdą z roztworów zapasowych do czystej szklanej probówki o pojemności 15 mililitrów z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem i szczelnie zamknij folią parafinową. Roztwory zapasowe można przechowywać w szczelnych probówkach w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden tydzień. Przygotuj 50 mililitrów roztworu do ekstrakcji SCCA poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego standardu wewnętrznego do stężenia 0,05 miligramów na mililitr w wodzie ultraczystej.Należy to zrobić, dodając 250 µL roztworu zapasowego standardu wewnętrznego do 49,75 mL wody. Następnie należy przygotować próbki do krzywej wzorcowej dla analizowanych SCCA. Należy użyć co najmniej pięciu punktów o stężeniach w zakresie liniowej odpowiedzi, które obejmują oczekiwane stężenia SCCA w próbkach.Rozcień każdy SCCA do wyznaczonego stężenia w nowych probówkach do mikrocentryfugi, używając ultra czystej wody, do objętości jednego mililitra. Upewnij się, że każdy punkt stężenia zawiera wszystkie cztery wzorce kwasów oraz standard wewnętrzny w odpowiednim stężeniu. Wyjmij próbki przeznaczone do ekstrakcji z przechowywania i umieść je na lodzie.Odważ 100 mg próbki do ekstrakcji SCCA. Odmierz ilość próbki jak najbliższą docelowej masie, aby zminimalizować zmienność. Po odważeniu każdej próbki przenieś tkankę do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Należy zapisywać masę każdej zważonej próbki, ponieważ wykryte ilości SCCAs zostaną znormalizowane względem masy próbki. Po zważeniu wszystkich próbek, do każdej probówki z materiałem należy dodać jeden mililitr roztworu do ekstrakcji. Należy zachować taki sam stosunek ilości roztworu do ekstrakcji do masy tkanki we wszystkich przeprowadzanych ekstrakcjach.Wymieszaj dokładnie, wstrząsając na wortexie przez 10 sekund. Pozostaw próbki w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. W tym czasie mieszaj każdą probówkę co 15 minut, wstrząsając na wortexie przez 10 sekund.Po godzinie ekstrakcji wymieszaj próbki po raz ostatni i przenieś probówki do mikrocentrifugi. Wirowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przy 10 000 ×g przez 10 minut, aby wytrącić materiał stały. W celu przefiltrowania próbek przygotuj filtry dyskowe montowane na strzykawkach, upewniając się, że każdy filtr jest prawidłowo przymocowany do strzykawki.Przygotuj jedną strzykawkę z filtrem dyskowym dla każdej próbki przeznaczonej do analizy, w tym dla próbek do krzywej wzorcowej. Przefiltruj nadsącz bezpośrednio do czystej probówki do mikrocentryfugi. Po filtracji zamknij probówkę zawierającą filtrat i zutylizuj zestaw do filtrowania ze strzykawką.Przenieś jeden mililitr próbki do każdej fiolki do elektroforezy kapilarnej (CE), uważając, aby nie rozpryskać próbki na szyjkę fiolki. Po przeniesieniu próbki załóż na każdą fiolkę zakrętkę do CE. Przeprowadź analizę detekcji SCCA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Wgrać do wlotowego podajnika próbek fiolki zawierające punkty krzywej wzorcowej oraz fiolki z próbkami do analizy, zgodnie z instrukcją producenta. Odnotować pozycję każdej fiolki w celu zaprogramowania autosamplera. Po przeprowadzeniu kondycjonowania opisanego w protokole tekstowym, rozpocząć rozdzielanie próbek, otwierając menu Control w oprogramowaniu i wybierając opcję Run Sequence.Monitoruj detektor matrycy fotodiod, czyli tacki PDA, aby zapewnić odpowiednią separację. Obserwuj pierwszy ślad i upewnij się, że posiada on płaską linię bazową oraz wyraźnie rozdzielone poszczególne piki kwasów. Aby zintegrować piki próbek, otwórz pierwszy plik i ustaw kroki automatycznej integracji tak, aby wykluczyć pierwsze trzy minuty analizy.W tym samym menu ustaw kryteria wyboru piku na minimalną szerokość piku wynoszącą 50 jednostek oraz pole powierzchni piku wynoszące 100 jednostek, aby zapewnić umiarkowanie wysoki poziom selektywności, oddzielając piki kwasów od szumu tła w śladzie. Przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj porównanie śladów PDA, z wyróżnieniem przeładowanej próbki.Wraz ze wzrostem stężenia analitycznego geometria poszczególnych pikov może stać się asymetryczna. Przy stężeniu 0,05 mg/ml kwas octowy wykazuje dobrze zdefiniowany, obustronnie symetryczny pik. Gdy stężenie kwasu octowego wzrasta do 0,07 lub 0,10 mg/ml, pik staje się asymetryczny i pojawia się tzw. ogon piku.Takie ściąganie piku jest wyraźnym sygnałem, że próbka jest przeładowana. Przedstawione tutaj przykładowe ślady PDA pokazują kwasy organiczne w próbkach zielonej kawy. Próbki zielonej kawy rozcieńczono 1:10 przed wprowadzeniem do fiolek CE.Kwasy będące przedmiotem analizy obejmują kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas mlekowy, kwas jabłkowy oraz standard wewnętrzny – kwas adypinowy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozcieraniu próbek do uzyskania jednolitej konsystencji oraz o ostrożnym pipetowaniu próbek, aby zmaksymalizować powtarzalność i zminimalizować błąd eksperymentalny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat ilościowego oznaczania kwasów organicznych z próbek roślinnych za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE). Powinieneś potrafić rozetrzeć próbki roślinne, wyekstrahować kwasy organiczne oraz przygotować ekstrakty roślinne do dalszej analizy metodą CE.

using-capillary-electrophoresis-to-quantify-organic-acids-from-plant

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Połączenie genomiki, analizy koekspresji genów oraz identyfikacji związków docelowych poprzez metabolizm umożliwia funkcjonalną adnotację genów.

Adnotacja funkcji genów roślin poprzez zintegrowaną genomikę, metabolomikę i informatykę

Ten film opisuje metodę ilościowego oznaczania strawnych węglowodanów obecnych w tkankach roślinnych. Pomaga to zbierać dane z różnych tkanek roślinnych w celu badania ekologii żywieniowej, interakcji między roślinami a roślinożercami oraz dynamiki sieci pokarmowej.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego węglowodanów niestrukturalnych w tkankach roślinnych

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Biomasa roślinna stanowi źródło odnawialne dla wielu produktów, w tym paliwa, paszy, żywności i różnych materiałów. W artykule badamy właściwości drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) i topoli jako odpowiednich źródeł dla rurociągu biorafineryjnego.

Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Opisane tutaj protokoły zapewniają jasną i przystępną metodologię pomiaru zawartości rozpuszczalnych białek i strawnych (niestrukturalnych) węglowodanów w tkankach roślinnych. Możliwość ilościowego określenia tych dwóch makroskładników odżywczych roślin ma znaczące implikacje dla postępu w dziedzinie fizjologii roślin, ekologii żywieniowej, interakcji roślinożerców i ekologii sieci pokarmowej.

Kwantyfikacja zawartości białka rozpuszczalnego w roślinach i strawnych węglowodanów na przykładzie kukurydzy (Zea mays)

Ten protokół opisuje efektywną metodologię ekstrakcji i kwantyfikacji kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L. oraz eksperymentalny proces oceny aktywności enzymatycznej syntazy kofeiny z poziomem ekspresji genu kodującego ten enzym.

Ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych

Produkty naturalne stanowią obiecujące punkty wyjścia dla rozwoju nowych leków i środków terapeutycznych. Jednak ze względu na dużą różnorodność chemiczną znalezienie nowych związków terapeutycznych z roślin jest trudnym i czasochłonnym zadaniem. Opisujemy uproszczone podejście do identyfikacji cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i antybiofilmu z ekstraktów i frakcji roślinnych.

Systematyczne podejście do identyfikacji nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i przeciwbiofilmowych z ekstraktów i frakcji roślinnych w celu zapobiegania próchnicy zębów

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

Kwasy fenolowe są ważnymi substancjami fitochemicznymi, które są obecne w pełnych ziarnach. Posiadają właściwości bioaktywne, takie jak przeciwutleniające funkcje ochronne. Prace te miały na celu przedstawienie informacji na temat uogólnionej metody identyfikacji HPLC, szacowania całkowitej zawartości fenoli oraz oznaczania zdolności przeciwutleniającej kwasów fenolowych w zbożach i roślinach strączkowych.

Uogólniona metoda oznaczania składu swobodnie rozpuszczalnych kwasów fenolowych i zdolności przeciwutleniających zbóż i roślin strączkowych

Demonstrujemy średnioprzepustową metodę ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych przy użyciu ultra wydajnej chromatografii cieczowej. Metoda ta została opracowana specjalnie do analiz dzikich gatunków pajęczaków zagrożonych przez aflatoksynogenne gatunki Aspergillus.

Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Poznaj metodę elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych w tkankach roślinnych Coffea arabica. Technika ta oferuje minimalną preparację próbek, wysoką przepustowość i niskie koszty w porównaniu do spektrometrii mas.

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

Przeglądaj więcej filmów