Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie poziomu kwasów organicznych obecnych w tkankach roślinnych. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania z zakresu biochemii i fizjologii roślin, takie jak wpływ bodźców środowiskowych na wzrost korzeni, rozwój upraw oraz jakość żywności lub napojów. Głównymi zaletami tej metody są minimalny nakład pracy przy przygotowaniu próbek, wysoka przepustowość oraz fakt, że elektroforeza kapilarna jest bardziej ekonomiczna niż spektrometria mas.

Choć metoda ta jest wykorzystywana do wyjaśniania fizjologicznych odpowiedzi roślin, może ona zostać zastosowana również w nauce o żywności i kontroli jej jakości, gdzie kwasy organiczne mają kluczowy wpływ na smak, bezpieczeństwo i stabilność. Na początek należy przygotować próbki do ekstrakcji krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych (SCCA). Przygotowuj po jednym gramie ziaren kawy na raz, aby upewnić się, że po przetworzeniu pozostanie wystarczająca ilość próbki.

Aby uzyskać jednolity rozmiar cząstek dla maksymalnej wydajności ekstrakcji SCCA, należy najpierw schłodzić moździerz i tłuczek ciekłym azotem. Do moździerza z niewielką objętością ciekłego azotu należy dodać próbkę. Za pomocą chochli należy dolać do moździerza tyle ciekłego azotu, aby całkowicie zanurzyć próbkę.

Dodaj próbki trudne do rozcierania, takie jak surowe ziarna kawy, do ciekłego azotu. Pozostaw je do zamrożenia na 10 do 30 sekund przed rozcieraniem. Rozdrobnij tkankę na mniejsze fragmenty, wykonując pionowe ruchy miażdżące.

Następnie należy zakończyć rozcieranie tkanki, wykonując koliste ruchy. Kroki mrożenia i rozcierania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie, tak aby próbki zostały rozcierane łącznie trzy razy. Zazwyczaj trzy kolejne serie rozcierania zredukują próbki do postaci proszku o konsystencji mąki.

Przenieś proszek do szklanych fiolek lub probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Rozpocznij dalsze etapy przetwarzania natychmiast po mieleniu lub przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu rozpoczęcia ekstrakcji. Przygotuj autentyczne wzorce dla interesujących SCCAs, aby stworzyć zewnętrzne i wewnętrzne roztwory standardowe do wyznaczania stężeń SCCA.

W przypadku próbek kawy jako kwasy analizowane należy uwzględnić kwas cytrynowy, jabłkowy, octowy i mlekowy, a jako standard wewnętrzny kwas adypinowy. Przygotuj roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 mg standardu do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Uzupełnij kolbę miarową do kreski 10 ml wodą ultraczystą, aby rozpuścić kwas.

Przenieś każdą z roztworów zapasowych do czystej szklanej probówki o pojemności 15 mililitrów z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem i szczelnie zamknij folią parafinową. Roztwory zapasowe można przechowywać w szczelnych probówkach w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jeden tydzień. Przygotuj 50 mililitrów roztworu do ekstrakcji SCCA poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego standardu wewnętrznego do stężenia 0,05 miligramów na mililitr w wodzie ultraczystej.

Należy to zrobić, dodając 250 µL roztworu zapasowego standardu wewnętrznego do 49,75 mL wody. Następnie należy przygotować próbki do krzywej wzorcowej dla analizowanych SCCA. Należy użyć co najmniej pięciu punktów o stężeniach w zakresie liniowej odpowiedzi, które obejmują oczekiwane stężenia SCCA w próbkach.

Rozcień każdy SCCA do wyznaczonego stężenia w nowych probówkach do mikrocentryfugi, używając ultra czystej wody, do objętości jednego mililitra. Upewnij się, że każdy punkt stężenia zawiera wszystkie cztery wzorce kwasów oraz standard wewnętrzny w odpowiednim stężeniu. Wyjmij próbki przeznaczone do ekstrakcji z przechowywania i umieść je na lodzie.

Odważ 100 mg próbki do ekstrakcji SCCA. Odmierz ilość próbki jak najbliższą docelowej masie, aby zminimalizować zmienność. Po odważeniu każdej próbki przenieś tkankę do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.

Należy zapisywać masę każdej zważonej próbki, ponieważ wykryte ilości SCCAs zostaną znormalizowane względem masy próbki. Po zważeniu wszystkich próbek, do każdej probówki z materiałem należy dodać jeden mililitr roztworu do ekstrakcji. Należy zachować taki sam stosunek ilości roztworu do ekstrakcji do masy tkanki we wszystkich przeprowadzanych ekstrakcjach.

Wymieszaj dokładnie, wstrząsając na wortexie przez 10 sekund. Pozostaw próbki w temperaturze pokojowej na jedną godzinę. W tym czasie mieszaj każdą probówkę co 15 minut, wstrząsając na wortexie przez 10 sekund.

Po godzinie ekstrakcji wymieszaj próbki po raz ostatni i przenieś probówki do mikrocentrifugi. Wirowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przy 10 000 ×g przez 10 minut, aby wytrącić materiał stały. W celu przefiltrowania próbek przygotuj filtry dyskowe montowane na strzykawkach, upewniając się, że każdy filtr jest prawidłowo przymocowany do strzykawki.

Przygotuj jedną strzykawkę z filtrem dyskowym dla każdej próbki przeznaczonej do analizy, w tym dla próbek do krzywej wzorcowej. Przefiltruj nadsącz bezpośrednio do czystej probówki do mikrocentryfugi. Po filtracji zamknij probówkę zawierającą filtrat i zutylizuj zestaw do filtrowania ze strzykawką.

Przenieś jeden mililitr próbki do każdej fiolki do elektroforezy kapilarnej (CE), uważając, aby nie rozpryskać próbki na szyjkę fiolki. Po przeniesieniu próbki załóż na każdą fiolkę zakrętkę do CE. Przeprowadź analizę detekcji SCCA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Wgrać do wlotowego podajnika próbek fiolki zawierające punkty krzywej wzorcowej oraz fiolki z próbkami do analizy, zgodnie z instrukcją producenta. Odnotować pozycję każdej fiolki w celu zaprogramowania autosamplera. Po przeprowadzeniu kondycjonowania opisanego w protokole tekstowym, rozpocząć rozdzielanie próbek, otwierając menu Control w oprogramowaniu i wybierając opcję Run Sequence.

Monitoruj detektor matrycy fotodiod, czyli tacki PDA, aby zapewnić odpowiednią separację. Obserwuj pierwszy ślad i upewnij się, że posiada on płaską linię bazową oraz wyraźnie rozdzielone poszczególne piki kwasów. Aby zintegrować piki próbek, otwórz pierwszy plik i ustaw kroki automatycznej integracji tak, aby wykluczyć pierwsze trzy minuty analizy.

W tym samym menu ustaw kryteria wyboru piku na minimalną szerokość piku wynoszącą 50 jednostek oraz pole powierzchni piku wynoszące 100 jednostek, aby zapewnić umiarkowanie wysoki poziom selektywności, oddzielając piki kwasów od szumu tła w śladzie. Przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj porównanie śladów PDA, z wyróżnieniem przeładowanej próbki.

Wraz ze wzrostem stężenia analitycznego geometria poszczególnych pikov może stać się asymetryczna. Przy stężeniu 0,05 mg/ml kwas octowy wykazuje dobrze zdefiniowany, obustronnie symetryczny pik. Gdy stężenie kwasu octowego wzrasta do 0,07 lub 0,10 mg/ml, pik staje się asymetryczny i pojawia się tzw. ogon piku.

Takie ściąganie piku jest wyraźnym sygnałem, że próbka jest przeładowana. Przedstawione tutaj przykładowe ślady PDA pokazują kwasy organiczne w próbkach zielonej kawy. Próbki zielonej kawy rozcieńczono 1:10 przed wprowadzeniem do fiolek CE.

Kwasy będące przedmiotem analizy obejmują kwas octowy, kwas cytrynowy, kwas mlekowy, kwas jabłkowy oraz standard wewnętrzny – kwas adypinowy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozcieraniu próbek do uzyskania jednolitej konsystencji oraz o ostrożnym pipetowaniu próbek, aby zmaksymalizować powtarzalność i zminimalizować błąd eksperymentalny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat ilościowego oznaczania kwasów organicznych z próbek roślinnych za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE). Powinieneś potrafić rozetrzeć próbki roślinne, wyekstrahować kwasy organiczne oraz przygotować ekstrakty roślinne do dalszej analizy metodą CE.