Name: Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodologie badania biofilmów Bacillus subtilis jako modelu do oceny małocząsteczkowych inhibitorów. Techniki te dostarczają ilościowych i jakościowych informacji o mechanizmach działania inhibitorów biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obrazowanie mikroskopem elektronowym zostało przeprowadzone w Jednostce Mikroskopii Elektronowej Instytutu Naukowego Weizmanna, częściowo wspieranej przez Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Badania te były również wspierane przez grant ISF I-CORE 152/1, Pana i Panią Dan Kane, Panią Lois Rosen, przez grant badawczy Yeda-Sela, przez Larson Charitable Foundation, przez Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, przez grant Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research, przez grant Ministerstwa Zdrowia na alternatywne metody badawcze, oraz przez Francusko-Izraelski Program Współpracy - Majmonide-Izrael Badawczy. IKG jest laureatem Katedry Rozwoju Kariery Rowland and Sylvia.

1. Ocena wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na tworzenie kolonii błony pellikularnej i biofilmu
<ol>
	<li>Przygotuj 2-krotny roztwór zdefiniowanej pożywki MSgg indukującej tworzenie biofilmu25 bez chlorku wapnia i heksahydratu chlorku żelaza(III). Po sterylizacji przez filtr należy dodać chlorek wapnia. Pożywka jest gotowa do bezpośredniego użycia lub może być przechowywana w 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przygotuj 1-krotne rozcieńczenie MSgg w dniu przeprowadzenia eksperymentu.
	<ol>
		<li>Rozcień pożywkę 2x MSgg do stężenia 1x za pomocą sterylnej wody destylowanej (biofilmy) lub sterylnego 3% gorącego (80 °C) agar (biofilmy) i dodać sześciowodny chlorek żelaza(III) do stężenia końcowego wynoszącego 50 μM (błonie) lub 250 µM (biofilmy). Dodać antybiotyki lub inhibitory małocząsteczkowe do pożądanego stężenia i dokładnie wymieszać. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM D-leucyny w 30 ml w celu wytworzenia błon pellicle lub biofilmów, należy dodać 196.6 µl roztworu zapasowego D-leucyny o stężeniu 76,3 mM (10 mg/ml). 
		UWAGA: Końcowy skład pożywki 1x MSgg opisano w Tabela 1W porównaniu z oryginalną recepturą25, pożywka zawierała 50 µg/ml stężenie treoniny oraz żelaza niezbędne do wzrostu kolonii biofilmu na stałym podłożu MSgg zwiększono 2,5-krotnie, aby zoptymalizować pomarszczoną morfologię kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zestaleniu agaru wysuszyć stałe płytki MSgg w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 30–45 min przed inokulacją.</li>
	<li>Aby wybrać specyficzne inhibitory zakłócające mechanizmy tworzenia się pellikuli (Rycina 1), wykluczając wpływ zastosowanych stężeń na wzrost planktoniczny oraz statyczny.
	<ol>
		<li>Wyznaczyć wzrost planktoniczny (wzrost gęstości optycznej w czasie w hodowli płynnej) w prostej krzywej wzrostu, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm co godzinę aż do wystąpienia stacjonarnej fazy wzrostu.</li>
		<li>Aby potwierdzić, że zmierzona mętność hodowli odpowiada liczbie żywych komórek, należy oznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) komórek w fazie wzrostu planktonicznego z hodowli wytrząsanej w kilku punktach czasowych.</li>
		<li>Aby ocenić wpływ inhibitorów małocząsteczkowych na wzrost statycznej pelikuli, należy zebrać komórki po 3-dniowej inkubacji w 23 °C z dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, zaszczepionej w tych samych warunkach, które opisano w sekcjach 1.7-1.9, i wyznacz liczbę CFU. W przypadku tej kontroli należy użyć szczepu niezdolnego do tworzenia błony (pellicle), któremu brakuje operonów kodujących składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (t. j., B. subtilis ΔepsH, ΔtasA). 
		UWAGA: Szczep ten jest zdolny do wzrostu w warunkach statycznych, lecz w przeciwieństwie do dzikiego typu tworzącego błonę (pellicle), wykazuje niedobór zdolności do wypływania na granicę fazy ciecz-powietrze, gdzie wzrost jest sprzyjany ze względu na wyższy poziom tlenu.26Zatem ten szczep z deficytem macierzy zewnątrzkomórkowej i błony pellicle jest rekomendowanym szczepem referencyjnym do oceny wzrostu w warunkach statycznych. 
		UWAGA: W przypadku konkretnego przykładu niekanonicznego D-aminokwasu – D-leucyny opisanego poniżej – wykluczono wpływ na wzrost planktoniczny i stacjonarny przy stężeniach, które zakłócały tworzenie się pellikli12,17Metody określania wzrostu planktonicznego i statycznego zostały opisane szczegółowo.17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Ocena celu biofilmu; schemat blokowy oceny inhibicji i cytotoksyczności; analiza inhibitora." src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Koncepcyjny przegląd procesu identyfikacji optymalnego układu eksperymentalnego do oceny specyficznego hamowania tworzenia biofilmu. Kryteria wyboru inhibitorów małocząsteczkowych wskazujących na specyficzne zakłócanie tworzenia biofilmu bez wyraźnego wpływu na wzrost planktoniczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="5">
	<li>Wysiać B. subtilis z zapasu przechowywanego w -80 °C (kultura LB o stężeniu 109 komórek/ml zamrożona w 20% glicerolu) w celu wyizolowania pojedynczych kolonii na płytce z agarem LB-1,5% za pomocą sterylnej końcówki lub aplikatora.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>KROK KRYTYCZNY: Aby uzyskać silne hamowanie tworzenia błony (pellicle) przez niekanoniczne D-aminokwasy, takie jak D-leucyna, pojedynczą kolonię pobraną z płytki z agarem LB-1,5% hodować w 3 ml bulionu LB w temperaturze 37 °C przez 4 h w inkubatorze wytrząsowym (prędkość wytrząsania 20 rpm). Przed inokulacją zastąpić bulion LB indukującym biofilm medium MSgg poprzez odwirowanie 1,5 ml kultury startowej przez 4 min przy 6,00 x g, ostrożne usunięcie supernatantu i resuspensję osadu w 1,5 ml medium MSgg. Pozostałą część kultury można usunąć. 
	Ważne: Aby zapewnić powtarzalność systemu, gęstość optyczna przy 600 nm (OD60) wypłukanej kultury startowej powinna wynosić od 0,6 do 1.</li>
	<li>Podczas wzrostu kultury startowej przygotować 12-dołkową wielodołkową płytkę do hodowli komórkowych zawierającą 3 ml medium MSgg bez inhibitora lub z zakresem stężeń inhibitora małocząsteczkowego (np. 0,3, 0,5, 1 mM D-leucyny17). Aby wykluczyć efekt brzeżny, rozmieścić różne stężenia w różnych miejscach płytki. Alternatywnie można użyć 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych zawierających 1,5 ml medium MSgg.</li>
	<li>Zaszczepić dołki 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowych 3 µl wypłukanej kultury startowej (rozcieńczenie 1:1 0). 
	UWAGA: Można zastosować niższe rozcieńczenie, tj. 1:50. Skraca to czas rozwoju błon.</li>
	<li>Hodować błony w temperaturze 23 °C w warunkach statycznych przez trzy dni. W tym czasie nie wolno przesuwać płytek, ponieważ może to wpłynąć na końcową morfologię powierzchni błony.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia przy użyciu binokulara i jednorodnej ekspozycji światła. Alternatywnie można sfotografować błony za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości. Aby uniknąć artefaktów spowodowanych niejednolitymi kątami oświetlenia i cieniami, wykonywać zdjęcia z góry, z kamerą zamocowaną na statywie, używając miękkiego i dużego źródła światła pod kątem 45° z obu stron. 
	UWAGA: Alternatywną metodą badania wielokomórkowości B. subtilis jest test kolonii biofilmu na stałym, indukującym biofilm medium MSgg. Podobnie jak w przypadku błon, test ten pozwala na badanie procesów spatiotemporalnych. Po ustaleniu czynnego zakresu inhibitorów małocząsteczkowych można badać ich wpływ na tworzenie kolonii biofilmu.</li>
	<li>Aby wyhodować kolonie biofilmu, symetrycznie nanosić 1,5 µl niewypłukanej prekultury (Krok 1.7) na wysuszoną płytkę z agarem MSgg 1,5% przy pomocy szablonu — 4 krople na płytkę Petriego o średnicy 8,5 cm. Pozostawić krople do czasu ich adsorpcji na płytce przed ich przesunięciem. 
	UWAGA: Szablon pomaga uzyskać równomierny rozkład kolonii biofilmu w obszarze wzrostu komórek. Aby przygotować szablon, narysować całkowity obszar wzrostu w oryginalnej skali, podzielić go na równe sektory i zaznaczyć środek. Dla okrągłej płytki Petriego o średnicy 8,5 cm przypisuje to 14 cm2 na jedną kolonię biofilmu.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy dni. W tym czasie rozwijają się kolonie biofilmu, tworząc trójwymiarową, pomarszczoną strukturę.</li>
	<li>Wykonać zdjęcia zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
</ol>
2. Test oporności na etanol
<ol>
	<li>Hodować biofilmy zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.7 oraz 1.12-1.14.</li>
	<li>Po 68 hr wzrostu w temperaturze 30 °C, przeciąć kolonie biofilmu na dwie równe części za pomocą żyletki i szablonu.</li>
</ol>
<img alt="Konfiguracja eksperymentu wzrostu biofilmu, kolonia bakteryjna na agarze, wirowanie, sonikacja, proces rozcieńczania." src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykład projektu eksperymentalnego służącego do oceny odporności komórek kolonii biofilmu na środki sterylizujące. (A) Szablon wykorzystywany do równomiernego rozmieszczenia kolonii biofilmu na szalce Petriego oraz do wycinania. (B) Zdjęcia z góry nieleczonego biofilmu typu dzikiego, hodowanego przez 68 h na stałej, zdefiniowanej pożywce MSgg indukującej tworzenie biofilmu w 30 °CPowiększenie pokazuje, w jaki sposób kolonię biofilmu można przeciąć na dwie równe połowy.CDwie równe połowy biofilmu są traktowane w ten sam sposób (kontrola, PBS) lub odpowiednio PBS lub środkiem sterylizującym, a następnie przetwarzane zgodnie z opisem. Skala: 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Ostrożnie podnieś każdą połowę kolonii biofilmu z płytki agarowej za pomocą małej szpatułki i przenieś ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 µl soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). W razie potrzeby zeskrob pozostałe komórki z płytki i również przenieś je do probówki do mikrowirówki. 
	UWAGA: Drugą połowę kolonii biofilmu traktuje się odmiennie, w zależności od tego, czy służy ona jako kontrola, czy do badania odporności na środki sterylizujące.</li>
	<li>W przypadku kontroli inkubuj drugą połowę kolonii biofilmu w 50 µl PBS, analogicznie jak w kroku 2.3. Aby ocenić odporność na środki sterylizujące, przenieś drugą połowę kolonii biofilmu do 50 µl 50% (v/v) etanolu. 
	UWAGA: Można zastosować alternatywne środki sterylizujące, takie jak podchloryn sodu. Dla wszystkich stosowanych środków sterylizujących należy określić stężenie czynne oraz czas inkubacji w eksperymencie wstępnym.</li>
	<li>Inkubuj kolonie biofilmu przez 10 min na blacie w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wiruj kolonie biofilmu przez 5 min przy 18 0 x g i ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety. Dodaj 30 µl PBS.</li>
	<li>Poddaj komórki łagodnej sonikacji (amplituda 10%, impuls 5 s) za pomocą mikrokońcówki sonikatora. 
	UWAGA: Energia sonikacji musi być wystarczająca do rozdzielenia agregatów biofilmu. Jednak zbyt intensywna sonikacja może doprowadzić do lizy komórek. Potwierdź wcześniej za pomocą mikroskopii świetlnej, że zastosowana energia sonikacji nie powoduje lizy komórek i że wszystkie agregaty zostały rozpuszczone.</li>
	<li>Dodaj 70 µl PBS do uzyskania końcowej objętości 1 ml. Wykonaj rozcieńczenia seryjne (do 10-7) w PBS i wysew 100 µl z trzech rozcieńczeń na płytkę z agarem LB-1,5%, używając sterylnych szklanych kulek. 
	UWAGA: Optymalne rozcieńczenia do wysewu należy określić w eksperymencie wstępnym, ponieważ zależy to od liczby komórek w badanej kolonii biofilmu oraz przeżywalności komórek w odpowiedzi na środek sterylizujący.</li>
	<li>Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 °C, przelicz CFU i wyznacz wartość CFU/ml. Na podstawie końcowego wyniku CFU/ml dla każdej z połówek kolonii biofilmu oblicz procent przeżywalności. 
	UWAGA: Przy przeprowadzeniu i analizie zgodnie z opisem, dwie połowy kontrolnej kolonii biofilmu oraz połowa nieleczona i połowa traktowana etanolem z nieleczonej kolonii biofilmu powinny wykazać różnice w liczbie żywych komórek poniżej 10%, co potwierdza odpowiednio symetrię lub odporność kolonii. Alternatywnie wyniki można przedstawić jako całkowitą liczbę CFU. Liczba komórek w kontrolnej i nieleczonej kolonii biofilmu powinna pozostać w tym samym rzędzie wielkości. W przeciwieństwie do tego, oczekuje się, że liczba komórek w połowie traktowanej etanolem z kolonii biofilmu leczonej cząsteczką o małej masie spadnie o co najmniej dwa rzędy wielkości, co pozwoli stwierdzić zwiększoną wrażliwość na środek sterylizujący.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek kolonii biofilmu do skaningowej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Hodować kolonie biofilmu zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.7 oraz 1.12-1.14.</li>
	<li>Przygotować świeżą partię 2% (v/v) glutaraldehydu oraz 3% (v/v) roztworu paraformaldehydu w buforze 10 mM kakodylanu sodu i 5 mM chlorku wapnia o pH 7,3. Przygotować 5 ml utrwalacza dla każdej szalki Petriego o średnicy 8,5 cm. 
	OSTROŻNIE: Glutaraldehyd i paraformaldehyd są substancjami niebezpiecznymi. Należy obchodzić się z nimi przy użyciu sprzętu ochronnego wewnątrz wyciągu chemicznego. Roztwory i zanieczyszczone materiały należy zutylizować jako odpady niebezpieczne.</li>
	<li>Ostrożnie dodać utrwalacz do kolonii biofilmu, nie dozując go bezpośrednio na powierzchnię biofilmu. 
	UWAGA: Ze względu na hydrofobowy charakter kolonii biofilmu, kolonie powoli odrywają się od agaru i zaczynają pływać.</li>
	<li>Szalki szczelnie zamknąć paskiem Parafilmu. Inkubować na wstrząsarku rotacyjnym przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść szalki do temperatury 4 °C na noc.</li>
	<li>Następnego dnia ostrożnie usunąć ciecz za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 10 ml buforu 10 mM kakodylanu sodu i 5 mM chlorku wapnia, aby wypłukać biofilm, i inkubować przez 5 min. Ostrożnie usunąć ciecz pipetą Pasteura z narożnika szalki, aby uniknąć uszkodzenia biofilmu, i dodać świeży roztwór płuczący, delikatnie pipetując. Powtórzyć ten krok raz.</li>
	<li>W celu odwodnienia kolonii biofilmu przeprowadzić następujące etapy: 2x 5 min w ddH2O; 2x 20 min w 30% etanolu; 2x 20 min w 50% etanolu; 2x 20 min w 70% etanolu; 2x 20 min w 96% etanolu; 2x 30 min w 10% etanolu.
	<ol>
		<li>W każdym kroku dodać 15 ml cieczy dla każdej szalki Petriego o średnicy 8,5 cm i ostrożnie usunąć ciecz po każdej inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosować jedną z dwóch różnych metod suszenia próbek z etanolu.
	<ol>
		<li>W przypadku suszenia powietrznego z etanolu:
		<ol>
			<li>Wyciąć papier filtracyjny celulozowy (średnica 9 cm) na ćwiartki. Krótko zanurzyć jedną ćwiartkę w 10% etanolu, a następnie ostrożnie przenieść na nią jedną pływającą kolonię biofilmu. Umieścić mokry papier filtracyjny w szalce Petriego wyłożonej papierem filtracyjnym. Przykryć szalkę Petriego i pozostawić kolonie biofilmu do wyschnięcia na noc w wyciągu chemicznym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku suszenia w punkcie krytycznym (CP) z wykorzystaniem dwutlenku węgla (CO2) jako płynu przejściowego:
		<ol>
			<li>Wypełnić 75% komory urządzenia do suszenia w punkcie krytycznym 10% etanolem. Przenieść próbki do uchwytu, każdą próbkę do oddzielnej komory. W razie potrzeby przeciąć biofilm nożyczkami na mniejsze kawałki. Próbki powinny pozostawać zanurzone w etanolu podczas wszystkich czynności. Następnie przenieść uchwyt do komory i szczelnie ją zamknąć.</li>
			<li>Schłodzić komorę do 7 °C i rozpocząć mieszanie. Wypełnić komorę całkowicie ciekłym CO2. Podczas 7-minutowego czasu inkubacji pozwolić etanolowi zmieszać się z CO2. Następnie usunąć 25% roztworu. 
			UWAGA: Nie opróżniać komory poniżej poziomu próbki.</li>
			<li>Powtórzyć krok 3.8.2.2 cztery razy.</li>
			<li>Powtórzyć krok 3.8.2.2 pięć razy, stosując czas inkubacji wynoszący tylko 5 min. Ostatecznie etanol powinien zostać całkowicie zastąpiony przez CO2.</li>
			<li>Podczas ostatniej serii opróżnić tylko 5% komory. Wyłączyć mieszanie i chłodzenie. Rozpocząć ogrzewanie komory do 42 °C. W temperaturze 31,1 °C i pod ciśnieniem 73,9 bar ciekły CO2 osiąga swój punkt krytyczny, czyli stan, w którym faza gazowa ma taką samą gęstość jak faza ciekła rozpuszczalnika27. Po osiągnięciu temperatury 42 °C inkubować przez 10 min. W temperaturze 42 °C CO2 w komorze występuje jako gaz nadkrytyczny. 
			UWAGA: Stale kontrolować ciśnienie w komorze. Ciśnienie nie powinno przekroczyć 120 bar w temperaturze 42 °C.</li>
			<li>Zacząć powoli uwalniać gaz przy ciągłym ogrzewaniu. Pozwala to utrzymać próbki w fazie gazowej CO2 i zapobiega deformacji morfologii próbki wskutek napięcia powierzchniowego cieczy. Ustawić przepływomierz na 5 L/h poprzez precyzyjną regulację zaworu dozującego sterującego przepływomierzem. Czekać, aż całe ciśnienie w komorze zostanie uwolnione. Teraz otworzyć komorę i ostrożnie wyjąć próbki z uchwytu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryć podkład do mikroskopii elektronowej taśmą węglową. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieść kolonie biofilmu na podkład. Połączyć każdą kolonię z podkładem, dodając cienki mostek z taśmy węglowej, co jest kluczowe dla eliminacji ładunków pod wiązką elektronów. Na tym etapie należy obchodzić się z koloniami biofilmu ostrożnie, ponieważ są one bardzo kruche. Przechowywać próbki w deskryka-torze przez co najmniej 24 h lub do czasu badania.</li>
	<li>W dniu badania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego napylić kolonie biofilmu przez 2 min pod kątem 60° w napylarce złoto-palladowej. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, obracając próbki o 120° pomiędzy cyklami. Na koniec napylić próbki raz przez 3 min od góry. Cienka warstwa złota i palladu o grubości 20 nm poprawia przewodność i zwiększa kontrast próbki podczas obrazowania w SEM.</li>
	<li>Przechowywać próbki w deskryka-torze, aby uniknąć rehydratacji próbki28 aż do momentu obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego29,30.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bacillus subtilis tworzy wytrzymałe i wysoce ustrukturyzowane biofilmy zarówno w cieczach (błonki), jak i na podłożu stałym (kolonie). W związku z tym służy jako idealny organizm modelowy do scharakteryzowania sposobu działania określonych inhibitorów biofilmu. Na pożywkach stałych komórki tworzą struktury wielokomórkowe o charakterystycznych cechach, które nie są widoczne w błonkach, takich jak zmarszczki promieniujące od środka do krawędzi. Tak więc błonki i kolonie są uzupełniającymi się systemami do badania ...

Wielokomórkowe społeczności bakteryjne odgrywają znaczącą rolę w naturalnym i antropogenicznym środowisku i mogą być korzystne lub wysoce szkodliwe. Te wielokomórkowe kolonie są znane jako biofilmy, w których poszczególne komórki są osadzone w samodzielnie wytwarzanej zewnątrzkomórkowej matrycy substancji polimerowych (EPS). EPS silnie przylega komórki do powierzchni, którą kolonizują. Służą jako tarcza przed siłami mechanicznymi i chemicznymi oraz tworzą bliski kontakt między sąsiednimi komórkami, ułatwiając komunikację komórkową1. Biofilm może być postrzegany jako zróżnicowana społeczność, w której komórki wykorzystują wysoce regulowane, zaaranżowane procesy do koordynowania swoich działań w społeczności, a także między gatunkami2-5. Przejście od planktonicznego, wolno żyjącego trybu wzrostu do stanu biofilmu jest często związane z procesami rozwojowymi. Dobrym przykładem jest Gram-dodatnia bakteria glebowa Bacillus subtilis, dlatego nieudomowiony szczep służy jako solidny organizm modelowy do badania etapów rozwojowych prowadzących do tworzenia biofilmu. W tej bakterii ruchliwe komórki organizują się w wyraźne struktury wielokomórkowe, które wykonują wyspecjalizowane zadania4. Jedna grupa komórek, producenci macierzy, wydzielają egzopolisacharydy6, białko amyloidowe TasA7,8 i białko hydrofobowości powierzchniowej BslA9,10; wszystkie z nich uczestniczą w montażu EPS11-13.
Biorąc pod uwagę obfitość biofilmów w naturalnych i antropogenicznych niszach oraz przypuszczalne śmiertelne szkody, jakie mogą spowodować, istnieje pilna potrzeba znalezienia sposobów na zapobieganie ich powstawaniu. Inhibitory małocząsteczkowe mogą pomóc w odkryciu nowych szlaków regulacyjnych, enzymów i białek strukturalnych zaangażowanych w tworzenie biofilmu, a tym samym przyczynić się do uzyskania wglądu w złożone procesy tworzenia społeczności wielokomórkowych. Ponieważ B. subtilis jest dobrze zbadanym modelem tworzenia biofilmu14,15, może być wykorzystany do oceny działania różnych inhibitorów biofilmu. W badaniu przeanalizowano cztery podstawowe metody, które są kluczowe dla oceny odpowiedzi biofilmów na inhibitory małocząsteczkowe. Po pierwsze, aby zapewnić, że inhibitory te mają cel specyficzny dla biofilmu, kluczowe znaczenie ma oddzielenie wpływu na wzrost planktonu od wpływu na tworzenie biofilmu. Większość środków przeciwbakteryjnych celuje w komórki w fazie wzrostu planktonu, ale cząsteczki, które celują w biofilm, są rzadkie. Dodatkowo, ponieważ cząsteczki, które nie wpływają na wzrost planktonu, nie są toksyczne, mogą zmniejszać presję selekcyjną faworyzującą mutanty oporne na antybiotyki16. Na przykład, gdy biofilmy są traktowane D-aminokwasami lub niektórymi innymi cząsteczkami zakłócającymi ścianę komórkową, są one albo zaburzone, albo rozłożone, ale inhibitory te tylko nieznacznie wpływają na wzrost planktonu12,17. W przeciwieństwie do tego, wiele antybiotyków dramatycznie upośledza wzrost planktonu, z niewielkim lub żadnym wpływem na tworzenie biofilmu17.
Po drugie, kluczowe jest ustanowienie spójnych i solidnych ram eksperymentalnych do badania wpływu małych cząsteczek. Zaobserwowaliśmy, że aktywny zakres stężeń inhibitorów małocząsteczkowych był wrażliwy na warunki przed hodowlą i na konfigurację eksperymentalną stosowaną do badania wpływu tych małocząsteczkowych inhibitorów. Różne doniesienia, szczególnie te dotyczące B. subtilis, ujawniły różnice w zakresie stężeń, w których D-aminokwasy hamują tworzenie błonek – pływających biofilmów bakteryjnych12,17-19. Przedstawione wyniki sugerują, że za różnice w zakresie stężeń aktywnych odpowiadają następujące czynniki: warunki przed hodowlą (logarytmicznafaza wzrostu 12,17 w porównaniu z późno stacjonarnąfazą wzrostu 20), pożywka stosowana w warunkach przed hodowlą (bogata, nieokreślona [Luria Broth, LB] w porównaniu z zdefiniowaną [glutaminian sodu-glicerol, MSgg]), współczynnik inokulacji, a zwłaszcza usunięcie pożywki przed hodowlą przed inokulacją. Temperatura statycznego wzrostu błonki wykazała mniej istotną rolę w zakresie aktywności małocząsteczkowego inhibitora D-leucyny, reprezentatywnego D-aminokwasu użytego w tym badaniu.
Na koniec, gdy biofilmy zostaną potraktowane specyficznymi inhibitorami biofilmu, potrzebne są solidne i pouczające metody do scharakteryzowania wpływu tych inhibitorów na dostosowanie biofilmu. W tym miejscu szczegółowo opisano dwie metody niezależnego charakteryzowania działania inhibitorów drobnocząsteczkowych: (1) Wpływ na pojedyncze komórki w kolonii biofilmu i ich oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Komórki w biofilmach są zazwyczaj bardziej odporne na antybiotyki w porównaniu z bakteriami wolno żyjącymi21-23. Chociaż zjawisko to jest wieloczynnikowe, zdolność EPS do zmniejszania penetracji antybiotyków była często uważana za atrakcyjne wyjaśnienie24. Metoda ta ocenia przeżywalność wcześniej utworzonych komórek biofilmu po ekspozycji na substancje przeciwbakteryjne. (2) Wpływ na architekturę kolonii biofilmu, od dużej do małej skali. Kolonie biofilmu charakteryzują się trójwymiarową strukturą i obecnością EPS. Wykorzystując skaningową mikroskopię elektronową, można wizualizować zmiany w morfologii komórki, strukturze kolonii biofilmu oraz architekturę i obfitość EPS od dużej (mm) do małej skali (μm).

<table><tbody><tr><td>Rosół Luria, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy&nbsp;</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosforan potasu dwuzasadowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy</td><td>Fisher Scientific, 209,27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>sześciowodny chlorek magnezu&nbsp;</td><td>Merck, 203,30 g/mol&nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia bezwodny</td><td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>czterowodny chlorek manganu(II)</td><td>Sigma, 197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>chlorek żelaza(III) sześciowodny&nbsp;</td><td>Sigma, 270.30 g/mies.)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>chlorek bezwodny&nbsp;</td><td>Acros Organics, 136,29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek tiaminy</td><td>Sigma, 337,27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Fisher Scientific, 204,1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>Sigma, 165,19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma, 119,12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glicerol bezwodny</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>Sole monosodowe kwasu L-glutaminowego (hydrat&nbsp)</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucyna</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr> etanol <tr><td>bezwodny</td><td>Żyletka Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr> Bibuła filtracyjna z <tr><td>okrągłej celulozy</td><td>Eddison NA</td><td></td> Whatman, 90 mm 1001-090 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> aldehyd glutarowy EMS (nauka o mikokopii elektronowej), 25% w wodzie <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd&nbsp;</td><td>EMS, 16% w wodzie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>kakodylan sodu</td><td>Merck, 214,05 g/mol&nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>2-hydrat chlorku wapnia</td><td>Merck, 147,02 g/mol&nbsp;</td><td></td><td></td>1172113</tr><tr><td>aluminiowy uchwyt</td><td>aluminiowy EMS, głowica szczelinowa</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>taśma klejąca węglowa</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka 37 & deg; C</td><td>Wirówka New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka stołowa Eppendorf 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy sonifier, model 250, używany z dwustopniowym</td> inkubatorem <td>Microtip Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>30 &deg; C</td><td>Inkubator</td><td>Binder NA</td><td></td></tr><tr><td>23 &deg; C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>System filtracyjny, 500 ml, polistyren</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Napylarka rozpryskowa&nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Suszarka do punktów krytycznych</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologie badania biofilmów b. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Ta praca ocenia różne metodologie badania wpływu małocząsteczkowych inhibitorów biofilmu, takich jak D-aminokwasy, na rozwój i odporność biofilmów Bacillus subtilis. Po pierwsze, przedstawiono metody, które selekcjonują inhibitory małocząsteczkowe z celami specyficznymi dla biofilmu w celu oddzielenia wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na wzrost planktonu od ich wpływu na tworzenie biofilmu. Następnie skupiamy się na tym, jak warunki inokulacji wpływają na wrażliwość wielokomórkowych, pływających kultur B. subtilis na inhibitory małocząsteczkowe. Wyniki sugerują, że rozbieżności w zgłaszanym działaniu takich inhibitorów, jak D-aminokwasy, wynikają z niespójnych warunków przed hodowlą. Ponadto opisano niedawno opracowany protokół służący do oceny wpływu leczenia małymi cząsteczkami na oporność biofilmu na substancje przeciwbakteryjne. Na koniec przedstawiono techniki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu analizy trójwymiarowego układu przestrzennego komórek i otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej w biofilmie B. subtilis. SEM ułatwia wgląd w trójwymiarową architekturę biofilmu i teksturę matrycy. Połączenie opisanych tutaj metod może znacznie pomóc w badaniach nad rozwojem biofilmu w obecności i bez inhibitorów biofilmu oraz rzucić światło na mechanizm działania tych inhibitorów.

Test tworzenia błony (pellicle assay) jest jedną z metod badania ściśle regulowanych i dynamicznych procesów wielokomórkowości B. subtilis. Ponadto test ten nadaje się do badania szeregu warunków przedstartowych lub stężeń małych cząsteczek w pojedynczej wielooddzielczej płytce do hodowli komórkowej w ramach jednego eksperymentu. Jednak tworzenie błony przez B. subtilis jest wrażliwe na warunki prekultury (np. pożywkę wzrostową prekultury i jej fazę wzrostu), stosunek szczepienia oraz usunięcie...

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Bakteryjne biofilmy są istotne dla zdrowia ludzi, chroniąc zamieszkujące je bakterie przed szkodliwymi czynnikami środowiskowymi oraz środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Celem niniejszej procedury było opracowanie modelu systemu do oceny wpływu małocząsteczkowych inhibitorów na tworzenie biofilmu. Metody te mogą pomóc w stworzeniu zestawu narzędzi niezbędnych w badaniach nad biofilmami do wyboru małocząsteczkowych inhibitorów specyficznie ukierunkowanych na hamowanie tworzenia biofilmu.Główną zaletą tych metodologii jest to, że opierają się one na spójnych i solidnych ramach eksperymentalnych oraz dostarczają ilościowych i jakościowych informacji na temat mechanizmu działania inhibitorów specyficznych dla biofilmu. Choć metody te pozwalają na analizę biofilmów Bacillus subtilis, mogą być one również zastosowane do innych bakterii tworzących biofilmy, takich jak Pseudomonas aeruginosa lub patogen roślin Xanthomonas citri. Skaningowa mikroskopia elektronowa może być niezbędna do analizy wpływu małych cząsteczek na tworzenie biofilmu, ponieważ umożliwia obserwację macierzy zewnątrzkomórkowej i zapewnia rozdzielczość na poziomie pojedynczej komórki.W celu rozpoczęcia należy najpierw wybrać odpowiednią pojedynczą kolonię i przenieść ją do 3 mL bulionu LB. Kulturę startową należy umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem na cztery godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji należy pobrać 1,5 mL kultury startowej i wirować przez cztery minuty.Ostrożnie usuń nadsącz, a następnie zawieś osad w 1,5 ml pożywki MSgg. Aby wyhodować błony biologiczne (pellicles), przygotuj 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, dodając trzy ml MSgg do każdego dołka. Do niektórych z tych dołków dodaj MSgg z inhibitorem małocząsteczkowym w określonym zakresie stężeń, rozmieszczając różne stężenia w różnych miejscach płytki, aby uniknąć efektu brzegowego.Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach resuspendTime starterowej kultury. Wartość dla kultury powinna mieścić się w przedziale od 0,6 do 1. Jest to kluczowe dla stabilności systemu.Każdy dołek płytki hodowlanej zaszczepić 3 µL zawiesiny kultury startowej. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 23 °C przez trzy dni w warunkach statycznych. Po tym czasie wyjąć płytkę z inkubatora i zaobserwować powstałe błony bakteryjne.Aby wyhodować biofilmy, należy użyć szablonu i symetrycznie nanieść cztery oddzielne krople po 1.5 µL niepłukanej kultury startowej na wysuszoną płytkę z 1.5%Agar MSgg o średnicy 8.5 cm. Należy odczekać, aż krople wchłoną się w podłoże, przed przesunięciem płytki. Płytki należy inkubować w temperaturze 30 °C przez trzy dni.Używając stereomikroskopu z jednorodnym oświetleniem, należy sprawdzić, czy kolonie biofilmu rozwinęły się i utworzyły trójwymiarową, pomarszczoną strukturę. Następnie, za pomocą czystej żyletki i szablonu, należy przeciąć kolonie biofilmu na dwie równe części. Jedną połowę kolonii należy ostrożnie podnieść czystą szpatułką i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, zawierającej 500 µl PBS.Pobrać drugą połowę kolonii i przenieść ją do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 500 µL 50% etanolu. Próbki te zostaną wykorzystane do oceny odporności na środki sterylizujące. Następnie, w podobny sposób pobrać pierwszą połowę kolonii traktowanej D-lizyną i umieścić ją w PBS.Następnie drugą połowę tej kolonii przenieś do etanolu. Inkubuj wszystkie probówki zawierające połowy biofilmu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj je przez pięć minut przy 18 000 ×g.Za pomocą pipety ostrożnie usuń nadsącz. Dodaj 300 µL PBS, a następnie poddaj komórki sonikacji przy niskim ustawieniu, używając sonikatora z mikrokońcówką. Dodaj kolejne 700 µL PBS, aby uzyskać końcową objętość 1 mL.Następnie wykonaj rozcieńczenia seryjne do stężenia 10⁻⁷ w PBS. Pobierz 100 µL jednego z rozcieńczeń i zaszczep płytkę z agarową LB 1,5%. Powtórz ten krok dla dwóch kolejnych rozcieńczeń dla każdej próbki.Rozprowadź inokulum za pomocą szklanych kulek, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 °C. Obejrzyj płytki i policz jednostki tworzące kolonie, czyli CFU. Po obliczeniu wartości CFU na mililitr, oblicz procent przeżywalności w grupie traktowanej PBS w porównaniu z grupą traktowaną etanolem.Aby rozpocząć utrwalanie próbek, należy najpierw przygotować odpowiednią ilość świeżego roztworu utrwalającego dla pożądanej liczby kolonii biofilmu. Ostrożnie dodać 5 mL utrwalacza do każdej szalki Petriego, unikając pipetowania bezpośrednio na kolonie. Kolonie zaczną odrywać się od agaru i unosić.Kolejno szczelnie zamknąć płytki za pomocą parafilmu i inkubować na wytrząsarku rotacyjnej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść płytki do przechowywania w temperaturze 4°C przez noc. Ostrożnie usunąć ciecz utrwalającą za pomocą pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej.Dodaj 10 ml buforu zawierającego 100 nM kacylowanu sodu i 5 mM chlorku wapnia, aby przemyć biofilm, a następnie inkubuj przez pięć minut. Ostrożnie oddziel centrum kolonii biofilmu od płytki z agarem za pomocą pipety Pasteura. Aby wysuszyć kolonie na powietrzu, potnij papier filtracyjny z celulozy na ćwiartki, a następnie zanurz jedną sekcję w 100% etanolu.Ostrożnie przenieś jedną pływającą kolonię biofilmu na papier. Umieść papier w szalce Petri wyłożonej suchym papierem filtrowym. Następnie przykryj szalkę i pozostaw ją w dygestorium do wyschnięcia na noc.Aby zachować morfologię kolonii biofilmu, ważne jest, aby całkowicie podłożyć pod pływający biofilm papier celulozowy. Po przeniesieniu na papier biofilmu nie można już ponownie ustawić. Pokryj stub do mikroskopii elektronowej taśmą węglową, a następnie za pomocą pęsety ostrożnie przenieś kolonie biofilmu na stub.Po przymocowaniu każdej kolonii do stubu za pomocą cienkiego mostka z taśmy węglowej, należy przechowywać stuby w eksykatorem przez 24 godziny lub do momentu ich użycia. Krok ten wymaga pewnej i precyzyjnej ręki, ponieważ na tym etapie biofilmy są bardzo kruche i łatwo ulegają pękaniu. Wyzwaniem jest zamocowanie znacznej części biofilmu bez powstania pęknięć.W dniu badania umieść kolonie w napylaczu złoto-palladowym. Napylaj próbki przez dwie minuty pod kątem 60 stopni. Powtórz ten krok dwukrotnie, obracając próbki o 120 stopni pomiędzy kolejnymi etapami.Na koniec napylcie próbki jednorazowo przez trzy minuty od góry. Próbki są teraz gotowe do obrazowania za pomocą SEM. Przedstawione obrazy ukazują tworzenie się błony przez B.subtilis hodowaną w indukującym tworzenie biofilmu medium MSgg.Po dodaniu małocząsteczkowego inhibitora D-lizyny rozwój pellikli ulega ograniczeniu. Wraz ze wzrostem stężenia inhibitora obserwuje się korelacyjny spadek tworzenia pellikli. Wykres ten przedstawia wpływ ekspozycji na etanol na przeżywalność komórek w koloniach biofilmu, traktowanych inhibitorem D-lizyny lub pozostawionych bez obróbki.Kolonie traktowane D-lizyną i eksponowane na 50% etanol przez 10 minut wykazały gwałtowny spadek przeżywalności w porównaniu z frakcją nietraktowaną. Zdjęcia binokularne z góry pokazują, że kolonie hodowane w obecności D-lizyny były ogólnie mniejsze i tworzyły mniej wyraźne zmarszczki niż te pozostawione bez traktowania. Obrazy z rozpylającego mikroskopu elektronowego kolonii biofilmu utrwalonych metodą punktu krytycznego jeszcze bardziej ujawniają zmieniony rozwój biofilmu.Macierz zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, czyli EPS, w próbkach niepoddanych działaniu preparatu przypominała pajęczynę, natomiast w próbkach traktowanych wykazywała mniejszy stopień organizacji. Wreszcie, badanie w rozdzielczości pojedynczych komórek bakteryjnych pokazuje, że komórki traktowane mają wydłużony kształt, są w mniejszym stopniu pokryte EPS i nie są tak ściśle połączone z sąsiednimi komórkami jak komórki niepoddane działaniu preparatu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że ustalenie spójnych ram badania inhibitorów biofilmu jest niezbędne dla uzyskania powtarzalnych wyników.Po opanowaniu tej metody, prawidłowo przeprowadzony skrining inhibitorów biofilmu wśród małych cząsteczek może zostać zrealizowany w czasie krótszym niż tydzień. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne analizy, takie jak badanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach biofilmu, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat celu działania inhibitora z grupy małych cząsteczek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak analizować ogólny wpływ specyficznych inhibitorów biofilmu na rozwój biofilmu oraz oporność na antybiotyki.

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Źródło: Tay, S. B., et.al. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje proces hamowania tworzenia biofilmu poprzez wprowadzenie enzymu zakłócającego sygnalizację komórkową bakterii. Enzym ten zapobiega produkcji przez bakterie pozakomórkowych substancji polimerowych, co ogranicza rozwój biofilmu na mikromisce o szklanym dnie. Na koniec struktura biofilmu jest wizualizowana za pomocą...

Mikroskopowa ocena hamowania powstawania biofilmu przez enzymy

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test tworzenia pelikuli z użyciem Bacillus subtilis do oceny inhibitorów małych cząsteczek zakłócających syntezę matrycy i rozwój biofilmu, dostarczając modelu do przesiewania związków selektywnie hamujących wzrost związany z powierzchnią, nie wpływając na swobodnie unoszące się komórki.

Ocena wpływu inhibitorów na tworzenie pelikuli u Bacillus subtilis

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016).Ten film pokazuje, jak integralność matrycy biofilmu wpływa na odporność bakterii na etanol, porównując jednostki tworzące kolonie w biofilmach nieleczonych i zaburzonych przez inhibitory. Zmniejszone CFU w próbkach objętych inhibitorami pokazują, że macierz zewnątrzkomórkowa jest niezbędna do ochrony komórek osadzonych w biofilmie przed...

Test odporności na etanol w celu oceny integralności matrycy biofilmu

Źródło: Bucher, T. i in., Metodologie badań biofilmów B. subtilis jako modelu do charakteryzacji inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp.(2016)Ten film pokazuje przygotowanie dojrzałych kolonii biofilmu bakteryjnego do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obejmuje etapy utrwalania, odwodnienia, montażu oraz nakładania powłok metalowych, aby zachować i zobrazować morfologię biofilmu.

Przygotowanie kolonii biofilmu bakteryjnego do analizy morfologicznej

Film prezentuje test dyspersji biofilmu przy użyciu płytki wielodołkowej. Leczenie buforem i glukozą demontuje biofilm, uwalniając bakterie, podczas gdy sole żółciowe wywołują stres, zatrzymując bakterie w ochronnej zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej. Wyższa dyspersja z buforem i glukozą potwierdza udany demontaż biofilmu, oszacowany na podstawie pomiaru jednostek tworzących kolonie.

Wykrywanie demontażu biofilmu za pomocą testu dyspersyjnego

Większość infekcji bakteryjnych wytwarza biofilm. Ze względu na środowisko, w którym działają, bakterie związane z biofilmem są często fenotypowo odporne na leki. Nowe cząsteczki przeciwbakteryjne, które zabijają bakterie w biofilmach, mają zatem wysoki priorytet. Opracowujemy test do szybkiego badania przesiewowego pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych, które są skuteczne w zwalczaniu biofilmów.

Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Produkty naturalne stanowią obiecujące punkty wyjścia dla rozwoju nowych leków i środków terapeutycznych. Jednak ze względu na dużą różnorodność chemiczną znalezienie nowych związków terapeutycznych z roślin jest trudnym i czasochłonnym zadaniem. Opisujemy uproszczone podejście do identyfikacji cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i antybiofilmu z ekstraktów i frakcji roślinnych.

Systematyczne podejście do identyfikacji nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i przeciwbiofilmowych z ekstraktów i frakcji roślinnych w celu zapobiegania próchnicy zębów

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Ten protokół opisuje podejście łączące metody statyczne i dynamiczne do oceny skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmów w przemyśle mleczarskim. Podejście to może być również wykorzystane do testowania skuteczności nowych preparatów biologicznych lub chemicznych w zwalczaniu biofilmów.

Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne

Poznaj metodologie badania biofilmów Bacillus subtilis jako modelu do oceny małocząsteczkowych inhibitorów. Techniki te dostarczają ilościowych i jakościowych informacji o mechanizmach działania inhibitorów biofilmu.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Przeglądaj więcej filmów