Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Biofilmy bakteryjne są ważne dla zdrowia ludzkiego, chroniąc ich mieszkańców przed szkodliwym wpływem środowiska i środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Celem tej procedury było opracowanie modelowego systemu do oceny wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na tworzenie biofilmu. Metody te mogą pomóc w stworzeniu zestawu narzędzi niezbędnych w dziedzinie biofilmu do wyboru inhibitorów małych cząsteczek, które są specyficznie ukierunkowane na tworzenie biofilmu.

Główną zaletą tych metodologii jest to, że opierają się one na spójnych, solidnych ramach eksperymentalnych i dostarczają ilościowych i jakościowych informacji na temat mechanizmu działania inhibitorów specyficznych dla biofilmu. Chociaż metody te mogą zapewnić wgląd w biofilmy Bacillus subtilis, można je również zastosować do innych bakterii tworzących biofilm, takich jak Pseudomonas aeruginosa lub patogen roślinny Xanthomonas citri. Skaningowa mikroskopia elektronowa może być niezbędna do analizy wpływu małych cząsteczek na tworzenie biofilmu, ponieważ umożliwia obserwację macierzy zewnątrzkomórkowej i daje rozdzielczość pojedynczej komórki.

Aby rozpocząć, najpierw wybierz odpowiednią pojedynczą kolonię i przenieś ją do trzech mililitrów bulionu LB. Umieść tę kulturę starterową w inkubatorze do wytrząsania na cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji weź 1,5 mililitra kultury starterowej i wiruj przez cztery minuty.

Ostrożnie usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 1,5 mililitra pożywki MSgg. Aby wyhodować błonki, przygotuj 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, dodając trzy mililitry MSgg do każdej studzienki. Do niektórych z tych studzienek dodaj MSgg z inhibitorem małych cząsteczek w zakresie stężeń, rozprowadzając rozmieszczenie różnych stężeń wokół naczynia, aby uniknąć efektów krawędzi.

Zmierzyć gęstość optyczną ponownie zawieszonej kultury starterowej przy 600 nanometrach. Kultura powinna wynosić od 0,6 do jednego. Ma to kluczowe znaczenie dla niezawodności systemu.

Inokulować każdą studzienkę płytki hodowlanej 3 mikrolitrami ponownie zawieszonej kultury starterowej. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 23 stopni Celsjusza przez trzy dni w warunkach statycznych. Następnie wyjąć płytkę z inkubatora i obserwować błonki.

Aby wyhodować biofilmy, użyj szablonu i symetrycznie umieść cztery oddzielne krople po 1,5 mikrolitra niemytej kultury starterowej na 8,5-centymetrowej wysuszonej płytce 1,5% Agar MSgg. Pozwól, aby krople wchłonęły się w podłoże przed przesunięciem płytki. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Za pomocą lornetki z jednorodną ekspozycją oświetlenia sprawdź, czy kolonie biofilmu rozwinęły się i utworzyły trójwymiarową, pomarszczoną strukturę. Najpierw weź czystą żyletkę i pokrój kolonie biofilmu na dwie równe części za pomocą szablonu. Ostrożnie podnieś jedną połowę kolonii czystą szpatułką i przenieś ją do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 500 mikrolitrów PBS.

Weź drugą połowę kolonii i przenieś ją do probówki mikrowirówki zawierającej 500 mikrolitrów 50% etanolu. Zostaną one wykorzystane do oceny odporności na środki sterylizujące. Następnie w podobny sposób weź pierwszą połowę kolonii traktowanej D-lizyną i umieść ją w PBS.

Następnie weź drugą połowę tej kolonii i przenieś ją do etanolu. Inkubować wszystkie probówki zawierające połówki biofilmu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. A następnie odwiruj je przez pięć minut w temperaturze 18 000 g.

Za pomocą pipety ostrożnie usunąć supernatant. Dodaj 300 mikrolitrów PBS, a następnie poddaj komórki sonikacji na niskim poziomie za pomocą sonografu z mikrokońcówką. Dodaj dodatkowe 700 mikrolitrów PBS, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra.

Następnie wykonaj seryjne rozcieńczanie od 10 do ujemnych siedmiu w PBS. Weź 100 mikrolitrów jednego z rozcieńczeń i zainfekuj 1,5% płytkę Agar LB. Powtórzyć ten krok dla dwóch innych rozcieńczeń na próbkę.

Rozprowadź innoculum za pomocą szklanych kulek, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zbadaj płytki i policz jednostki tworzące kolonie lub CFU. Po obliczeniu wartości CFU na mililitr oblicz odsetek osób, które przeżyły w PBS w porównaniu z leczeniem etanolem.

Aby rozpocząć utrwalanie próbki, najpierw przygotuj wystarczającą ilość świeżego roztworu utrwalającego dla pożądanej liczby kolonii biofilmu. Ostrożnie dodaj pięć mililitrów utrwalacza do każdej szalki Petriego i unikaj pipetowania bezpośrednio na kolonie. Kolonie zaczną odłączać się od Agaru i unosić się na wodzie.

Ostrożnie uszczelnij płytki parafilmem i inkubuj na wytrząsarce obrotowej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przenieś płytki do przechowywania w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Delikatnie usunąć płyn utrwalający za pomocą pipety Pasteura, podłączonej do próżni.

Dodaj 10 mililitrów 100 nanomolowego kakodylanu sodu, pięciomilimolowy bufor chlorku wapnia do przepłukania biofilmu i inkubuj przez pięć minut. Ostrożnie odłączyć środek kolonii biofilmu od płytki agarowej za pomocą pipety Pasteura. Aby wysuszyć kolonie na powietrzu, pokrój celulozową bibułę filtracyjną na ćwiartki, a następnie zanurz jedną sekcję w 100% etanolu.

Ostrożnie przenieś jedną pływającą kolonię biofilmu na papier. Umieść papier na szalce Petriego wyłożonej suchą bibułą filtracyjną. Następnie przykryj naczynie i pozostaw je na noc w okapie chemicznym do wyschnięcia.

Aby zachować morfologię kolonii biofilmu, ważne jest, aby całkowicie pokryć unoszący się biofilm papierem celulozowym. Po umieszczeniu na papierze biofilmu nie można go ponownie wyregulować. Pokryj kikut mikroskopii elektronowej taśmą węglową, a następnie użyj pęsety, aby ostrożnie przenieść kolonie biofilmu na kikut.

Po połączeniu każdej kolonii z króćcem, dodając cienki mostek z taśmy węglowej, przechowuj kikuty w eksykatorze przez 24 godziny lub do momentu, gdy będą potrzebne. Ten krok wymaga pewnej i precyzyjnej ręki, ponieważ na tym etapie biofilmy są bardzo kruche i łatwo pękają. Wyzwaniem jest zamontowanie znacznej części biofilmu bez pęknięć.

W dniu badania umieść kolonie w napylarce złoto-palladowej. Pokrywaj próbki przez dwie minuty pod kątem 60 stopni. Powtórz ten krok dwukrotnie, obracając próbki o 120 stopni pomiędzy nimi.

Na koniec pokryj próbki raz przez trzy minuty od góry. Próbki są teraz gotowe do obrazowania w SEM. Obrazy te pokazują pellikalne tworzenie B.subtilis wyhodowanego w pożywce MSgg indukującej biofilm.

Dzięki dodatkowi małocząsteczkowego inhibitora D-lizyny zmniejsza się rozwój błonki. A wraz ze wzrostem stężenia inhibitora, tworzenie się błonki wykazuje skorelowany spadek. Ten wykres pokazuje wpływ ekspozycji na etanol na przeżycie komórek w koloniach biofilmu, traktowanych inhibitorem D-lizyny lub pozostawionych nieleczonych.

Kolonie traktowane D-lizyną i wystawione na działanie 50% etanolu przez 10 minut wykazały dramatyczne zmniejszenie przeżywalności w porównaniu z frakcją nieleczoną. Obrazy lornetkowe z góry na dół pokazują, że kolonie wyhodowane w obecności D-lizyny były ogólnie mniejsze i tworzyły mniej wyraźne zmarszczki niż te, które nie były leczone. Obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego wysuszonych kolonii biofilmu w punkcie krytycznym ujawniają jeszcze bardziej zmieniony rozwój biofilmu.

Zewnątrzkomórkowa matryca substancji polimerowych (EPS) wyglądała bardziej jak pajęczyna w próbkach niepoddanych działaniu substancji, przy czym próbki poddane działaniu substancji wykazywały mniejszą organizację. Wreszcie, badanie rozdzielczości pojedynczych komórek bakteryjnych pokazuje, że leczone komórki mają wydłużony wygląd, są mniej pokryte EPS i nie są tak ściśle połączone ze swoimi sąsiadami jak komórki nieleczone. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ustalenie spójnych ram do badania inhibitorów biofilmu jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników.

Po opanowaniu, badanie przesiewowe małych cząsteczek pod kątem hamowania biofilmu można przeprowadzić w mniej niż tydzień, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak badanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach biofilmu, w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat celu inhibitora drobnocząsteczkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować ogólny wpływ określonych inhibitorów biofilmu na rozwój biofilmu i oporność na antybiotyki.