Name: Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji naturalnych substratów dla lipaz i fosfolipaz bakteryjnych. Technika umożliwia niezależną optymalizację aktywności enzymatycznej oraz badanie specyficzności substratowej hydrolaz w różnych organizmach modelowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82614, 153998, 253549, and 178359 w Investigación Científica Básica oraz 118 w Investigación en Fronteras de la Ciencia) oraz z Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger%2C+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger, Principles of Biochemistry</a>. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).</li>
<li>Jaeger, K. E., Eggert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipases+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lipases for biotechnology.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).</li>
<li>Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowhan%2C+W+%22Biochemistry+of+Lipids%2C+Lipoproteins+and+Membranes%22">Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes</a>. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).</li>
<li>Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+membrane+phospholipid+diversity%3A+why+are+there+so+many+lipids%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids?</a> Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).</li>
<li>De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti+mutants+deficient+in+phospholipid+N-methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).</li>
<li>Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulator+gene+phoB+mediates+phosphate+stress-controlled+synthesis+of+the+membrane+lipid+diacylglyceryl-N%2CN%2CN-trimethylhomoserine+in+Rhizobium+%28Sinorhizobium%29+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti.</a> Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).</li>
<li>Klug, R. M., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+enzymes+of+diacylglyceryl-O-4%27-%28N%2CN%2CN%2C-trimethyl%29homoserine+biosynthesis+are+encoded+by+btaA+and+btaB+in+the+purple+bacterium+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).</li>
<li>Zavaleta-Pastor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinorhizobium+meliloti+phospholipase+C+required+for+lipid+remodeling+duringphosphorus+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).</li>
<li>Pech-Canul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FadD+is+required+for+utilization+of+endogenous+fatty+acids+released+from+membrane+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids.</a> J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).</li>
<li>Banerji, S., Flieger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patatin-like+proteins%3A+a+new+family+of+lipolytic+enzymes+present+in+bacteria%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria?</a> Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).</li>
<li>Sahonero-Canavesi, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-releasing+activities+in+Sinorhizobium+meliloti+include+unusual+diacylglycerol+lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase.</a> Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).</li>
<li>Fischer, M., Pleiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipase+Engineering+Database%3A+a+navigation+and+analysis+tool+for+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acid.+Res%22%5BJournal%5D)">The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families.</a> Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).</li>
<li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+continuing+developments+at+PROSITE%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+-+new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3 - new capabilities and interfaces.</a> Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22Experiments+in+Molecular+Genetics%22">Experiments in Molecular Genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Molecular Dynamics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphorimager+SI+User%C2%B4s+Guide%22">Phosphorimager SI User´s Guide</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf">http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf</a> (1994).</li>
<li>Dixon, M., Webb, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDixon%2C+M+%22Enzymes%3A+Third+Edition%22">Enzymes: Third Edition</a>. , Longman, USA. (1979).</li>
<li>Rudolph, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+characterization%2C+and+mutagenesis+of+the+Yersinia+pestis+murine+toxin%2C+a+phospholipase+D+superfamily+member%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member.</a> J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).</li>
<li>Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+a+novel+lipolytic+enzyme+YvdO+from+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).</li>
<li>Peppelenbosch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Kinome profiling.</a> Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).</li>
<li>Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+and+chromogenic+substrates+used+in+bacterial+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.</a> Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).</li>
<li>Kuznetsova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+genomics%3A+Application+of+general+enzymatic+screens+to+discover+new+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes.</a> FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).</li>
<li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScopes%2C+RK+%22Protein+Purification%2C+Principles+and+Practice%22">Protein Purification, Principles and Practice</a>. , Springer. New York. (2010).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatnich 20 lat zsekwencjonowano genomy wielu organizmów i chociaż wygenerowano wiele danych dotyczących sekwencji genomu, interpretacja funkcjonalna pozostaje w tyle, co utrudnia nasze zrozumienie funkcji genomu. Funkcje genów w genomach są często przypisywane na podstawie podobieństwa do genów o znanej funkcji lub występowania konserwatywnych motywów. Jednak dokładna funkcja danego genu często nie jest znana. W szczególności przewidywane geny strukturalne enzymów nie mogą być łatwo zbadane za pomocą technik om...

Lipidy na bazie glicerolu, takie jak triacyloglicerole i (glicero)fosfolipidy, stanowią ważne i prawdopodobnie najbardziej znane klasy lipidów1. Triacyloglicerole (TAG) to tłuszcze lub oleje, które zwykle pełnią funkcję lipidów magazynujących, a zatem jako potencjalne źródła energii i węgla. TAG mogą być rozkładane przez lipazy, które są często wydzielane przez organizm wytwarzający w celu trawienia zewnętrznych TAG i udostępniania ich jako źródeł węgla. Ponadto lipazy były szeroko badane na przestrzeni lat ze względu na ich ważne zastosowania biotechnologiczne2.
Ze względu na ich amfifilową naturę i prawie cylindryczny kształt, (glicero)fosfolipidy wykazują właściwości błonotwórcze i zazwyczaj stanowią główne składniki lipidowe dwuwarstwowej membrany3. W prostych mikroorganizmach, takich jak bakteria Escherichia coli, spotyka się tylko trzy główne warianty grupy głównej: fosfatydyloglicerol (PG), kardiolipinę (CL) i fosfatydyloetanoloaminę (PE), chociaż należy mieć świadomość, że każdy z nich może być zastąpiony znaczną liczbą różnych łańcuchów tłuszczowych acylowych w pozycji sn-1 lub sn-2, co daje początek dużej liczbie różnych gatunków molekularnych4. Inne bakterie mogą mieć inne fosfolipidy dodatkowo lub zamiast niego. Na przykład Sinorhizobium meliloti, bakteria glebowa, która jest w stanie tworzyć symbiozę brodawek korzeniowych wiążących azot z lucerną siewną (Medicago sativa), zawiera oprócz PE drugi zwitterionowy fosfolipid, fosfatydylocholinę (PC)5. Ponadto lipidy niezawierające fosforu lub glicerolu mogą być amfifilowe i stanowić część błony komórkowej. Na przykład, w warunkach wzrostu ograniczających fosfor, u S. meliloti, (glicero)fosfolipidy są w dużej mierze zastępowane lipidami błonowymi, które nie zawierają fosforu, tj. sulfolipidami, lipidami ornityny i trimetylohomoseryną diacyloglicerylu (DGTS)6. U bakterii DGTS jest tworzony z diacyloglicerolu (DAG) w dwuetapowym szlaku7, ale źródło wytwarzania DAG nie było jasne. Eksperymenty z impulsem sugerują, że PC może być prekursorem DGTS8 i korzystając z metodologii opisanej w tym manuskrypcie, możemy zidentyfikować fosfolipazę C (PlcP, SMc00171), która powstaje w warunkach ograniczających fosfor i która może przekształcić PC w DAG i fosfocholinę8.
W osobnym badaniu odkryliśmy, że mutant S. meliloti lub Escherichia coli z niedoborem syntetazy acyl-CoA (FadD) gromadził wolne kwasy tłuszczowe podczas wchodzenia w stacjonarną fazę wzrostu9. Chociaż te kwasy tłuszczowe wydawały się pochodzić z lipidów błonowych, dokładne źródło wolnych kwasów tłuszczowych lub enzym(ów) je uwalniających nie było znane. Ponownie, stosując strategię opisaną w tym manuskrypcie, przewidywano dwie patatynopodobne10 (fosfo)lipazy (SMc00930 i SMc01003), które przyczyniły się do powstania wolnych kwasów tłuszczowych w S. meliloti11. Co zaskakujące, SMc01003 użył DAG jako substratu, przekształcając go w monoacyloglicerol, a na końcu w glicerol i wolne kwasy tłuszczowe11. Dlatego SMc01003 jest lipazą DAG (DglA).
Chociaż istnieje wiele algorytmów do przewidywania potencjalnych (fosfo)lipaz12,13, ich dokładna funkcja i rola fizjologiczna zazwyczaj nie są znane. Tutaj przedstawiamy protokół klonowania i nadekspresji przewidywanych lub potencjalnych (fosfo)lipaz. Ten manuskrypt wyjaśnia, w jaki sposób można opracować i zoptymalizować testy enzymatyczne dla nadekspresji (fosfo)lipazy (fosfo)lipazy przy użyciu sztucznych substratów chromogennych. Podajemy przykłady, w jaki sposób za pomocą zoptymalizowanego testu enzymatycznego można napotkać prawdziwy substrat (fosfo)lipazy i jak te odkrycia mogą wzbogacić naszą wiedzę na temat fizjologii drobnoustrojów.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td>Analiza TLC i Ekstrakcja lipidów</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03</td><td>TLC analiza i Ekstrakcja lipidów</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>JT Baker</td><td>9507-05</td><td>Analiza TLC i Ekstrakcja</td></tr><tr><td>lipidów Heksany</td><td>JT Baker</td><td>9309-02</td><td>Analiza TLC i Ekstrakcja lipidów</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>woda bidestylowana</td><td>&nbsp; WZELAKI&</td><td>nbsp; NA</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Bulion LB</td><td>DOWOLNA</td><td>BRAK DANYCH</td><td>Wzrost bakterii, 10 g tryptonu + 5 g ekstraktu drożdżowego + 10 g NaCl per litr wody bidestylowanej</td></tr><tr><td>trypton</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td> wzrostu bakterii <td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Wzrost bakterii</td></tr><tr><td>TY bulion</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Wzrost bakterii, 8 g tryptonu + 3 g ekstraktu drożdżowego + 66 mg CaCl2&#183; 2H2O na litr wody destylowanej</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Baker</td><td>1332-01</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>izopropylo-&beta;-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Wzrost bakterii</td></tr><tr><td>Dietanoloamina</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Fosfolipaza A2 wąż venom</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Fosfolipaza C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Bis-p-nitrofenylowy fosforan</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>p-stearynian nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>p-dodekanian nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>p-dekanian nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>p-palmitynian nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>p-maślan nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>p-oktanian nitrofenylu</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Kwas octowy, sól sodowa [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td>Wzrost bakterii</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy Aluminium HPTLC 60 płytek. Płytki HPTLC z żelem krzemionkowym o wymiarach 20 x 20 cm, 25 arkuszy.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>Analiza TLC & Ekstrakcja lipidów</td></tr><tr><td>Spektrometr UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Dynamika molekularna</td><td>NA</td><td>Fotostymulowalny skaner luminescencyjny&nbsp;</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Kwantyfikacja radioaktywności</td></tr><tr><td>Francuska komórka ciśnieniowa</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Pękanie komórek</td></tr><tr><td>bibuła chromatograficzna 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>analiza TLC</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021nasze</td><td>odniesienie 11</td><td></td><td>badanych szczep</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Kompetentne komórki</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>szczep ekspresji białka</td></tr><tr><td>wektor pET9a</td><td>Wektor ekspresji białka</td> <td>Novagen</td><td>69431</td></tr><tr><td>pET17b wektor</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>wektor ekspresji białka</td></tr><tr><td>sterylna probówka okrągłodenna z polistyrenu polistyrenowego (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>znakowanie radioizotopowe kultur bakteryjnych</td></tr><tr><td>polipropylenowe probówki wirówkowe (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Testy enzymatyczne</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicerol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>wzorzec lipidowy</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydylocholina, dipalmitoilo</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>wzorzec lipidowy</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-monopalmityna</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>wzorzec lipidowy</td></tr><tr><td>kwas palmitynowy</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>wzorzec lipidowy</td></tr></tbody></table>

definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Mikroorganizmy wytwarzają szerokie spektrum (fosfo)lipaz, które są wydzielane w celu udostępnienia organizmowi zewnętrznych substratów. Alternatywnie, inne (fosfo)lipazy mogą być fizycznie związane z organizmem wytwarzającym, powodując obrót wewnętrznych lipidów i często powodując przebudowę błon komórkowych. Chociaż potencjalne (fosfo)lipazy można przewidzieć za pomocą wielu algorytmów, gdy dostępna jest sekwencja genu/białka, często nie uzyskano eksperymentalnego dowodu na aktywność enzymu, specyficzność substratu i potencjalne funkcje fizjologiczne. W artykule opisano optymalizację warunków oznaczania dla prospektywnych (fosfo)lipaz o nieznanej specyficzności substratowej oraz sposób wykorzystania tych zoptymalizowanych warunków w poszukiwaniu naturalnego substratu odpowiedniej (fosfo)lipazy. Stosowanie sztucznych substratów chromogennych, takich jak pochodne p-nitrofenylu, może pomóc w wykryciu niewielkiej aktywności enzymatycznej przewidywanej (fosfo)lipazy w standardowych warunkach. Po napotkaniu tak niewielkiej aktywności enzymatycznej można zmieniać różne parametry testu enzymatycznego w celu uzyskania bardziej wydajnej hydrolizy sztucznego substratu. Po ustaleniu warunków, w których enzym działa dobrze, należy oznaczyć różne potencjalne naturalne substraty pod kątem ich degradacji, procesu, który można śledzić przy użyciu różnych metod chromatograficznych. Określenie specyficzności substratowej dla nowych enzymów często dostarcza hipotez dotyczących potencjalnej fizjologicznej roli tych enzymów, które następnie można przetestować eksperymentalnie. Postępując zgodnie z tymi wytycznymi, byliśmy w stanie zidentyfikować fosfolipazę C (SMc00171), która rozkłada fosfatydylocholinę do fosfocholiny i diacyloglicerolu, co jest kluczowym krokiem dla przebudowy błon w bakterii Sinorhizobium meliloti w warunkach wzrostu ograniczających fosfor. Dla dwóch przewidywanych fosfolipaz podobnych do patatyny (SMc00930 i SMc01003) tego samego organizmu, możemy ponownie zdefiniować ich specyficzność substratową i wyjaśnić, że SMc01003 jest lipazą diacyloglicerolową.

Aktywność specyficznej dla PC fosfolipazy C SMc00171 z bis-p-nitrofenylofosforanem
Ekstrakty bezkomórkowe otrzymane z E. coli BL21(DE3) x pLysS, który posiadał smc0171 wykazano ekspresję, a następnie zbadano ich zdolność do hydrolizy bis-pestry p-nitrofenylofosforanowe, przy użyciu spektrofotometrycznego testu enzymatycznego, mierząc p</em...

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przyspieszenie detekcji substratów fizjologicznych dla potencjalnych lipaz i fosfolipaz. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie entomologii, takie jak wpływ fosfolipaz na przebudowę lipidów w błonach biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość niezależnego przeprowadzenia optymalizacji aktywności enzymatycznej oraz poszukiwania naturalnego substratu dla enzymu.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat swoistości substratowej lipaz i fosfolipaz bakteryjnych, można ją również zmodyfikować w celu badania hydrolaz innych organizmów modelowych. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy poszukiwaliśmy aktywności enzymatycznej zdolnej do degradacji wewnątrzkomórkowego lipidu błonowego – fosfatydylocholiny – u Rhizobium meliloti. Aby przygotować bezkomórkowe ekstrakty białkowe, rozmrozić zawiesiny komórek bakteryjnych i przechowywać je na lodzie.Następnie przepuść zawiesiny komórkowe trzykrotnie przez zimną komorę wysokociśnieniową przy ciśnieniu 20 000 psi. Usuń nienaruszone komórki oraz szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 5 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu przygotuj z supernatantu aliquoty o objętości 100 i 500 µL do dalszej analizy.Przygotuj wcześniej zoptymalizowany test enzymatyczny, korzystając ze schematów pipetowania przedstawionych w tabelach protokołu tekstowego. Aby uzyskać wstępny zakres różnych aktywności enzymatycznych, należy zastosować substraty sztuczne, które w wyniku hydrolizy tworzą kolorowy produkt, takie jak para-nitrofenol lub pochodne PNP. Monitoruj przebieg czasowy wzrostu absorbancji przy 405 nanometrach, wynikającego z powstawania PNP, w spektrofotometrze w temperaturze 30 stopni Celsiusia przez okres pięciu minut.Na koniec należy przeprowadzić obliczenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku znakowania lipidów izotopami promieniotwórczymi, należy przygotować nocną prekulturę badanego organizmu w 5 ml odpowiedniej pożywki i inkubować w temperaturze 30 °C. Z prekultury należy wykonać inokulację do 20 ml świeżej pożywki w kolbie hodowlanej o pojemności 100 ml, aby uzyskać początkową gęstość optyczną hodowli na poziomie 0,3 przy 620 nm.Następnie, w warunkach sterylnych, przenieś jedną mililitrową alikvotę hodowli do sterylnej polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml. Dodaj jedną mikrokuri 114 c acetate do jednej mililitrowej hodowli. Następnie inkubuj hodowlę płynną z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez okres 24 godzin.Po zakończeniu okresu inkubacji przenieść hodowlę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odwirować z prędkością 12 000 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Osad zawiesić w 100 µl wody. Na tym etapie przechowywać zawiesinę komórkową w temperaturze -20 °C lub bezzwłocznie przystąpić do ekstrakcji lipidów polarnych.Aby przeprowadzić ekstrakcję lipidów polarnych, dodaj 375 µL roztworu metanolu i chloroformu w stosunku dwa do jednego do 100 µL wodnej zawiesiny komórkowej. Mieszaj próbkę w wortexie przez 30 sekund, a następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wiruj przez pięć minut przy 12 000 ×g w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Do nadsączu dodaj 125 µl chloroformu i 125 µl wody. Po mieszaniu w wortexie przez 30 sekund, odwiruj próbkę przez jedną minutę przy 12 000 ×g w temperaturze pokojowej.Przenieś dolną fazę chloroformową do nowej probówki. Następnie wysusz roztwór strumieniem azotu. Rozpuść wysuszone lipidy w 100 µL roztworu chloroformu z metanolem.W celu rozdzielenia neutralnych lipidów polarnych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, nanieś trzy mikrolitrowe alikwoty próbek lipidów na wysokowydajną płytkę aluminiową z żelem krzemionkowym do chromatografii cienkowarstwowej, zaczynając dwa centymetry od krawędzi płytki. W przypadku analizy wielu próbek w chromatografii jednowymiarowej, zachowaj odległość co najmniej 1,5 centymetra pomiędzy poszczególnymi punktami naniesienia próbek. Przenieś fazę ruchomą do komory rozwijania TLC, wyłożonej od wewnątrz papierem chromatograficznym.Przykryć płytą szklaną, aby komora nasyciła się przez 30 minut. Przenieść aluminiową płytkę HPTLC Silica Gel z wysuszonymi próbkami lipidów do komory. Pozostawić płytkę do rozwinięcia na 30 minut w zamkniętej komorze przed jej wyjęciem.Następnie pozostaw rozpuszczalniki do odparowania w dygestorium z przepływem laminarnym przez dwie godziny. Po wyschnięciu rozwiniętej płytki TLC inkubuj ją z ekranem luminescencyjnym stymulowanym światłem w zamkniętej kasecie przez trzy dni. Następnie poddaj inkubowany ekran skanowaniu w skanerze PSL i uzyskaj obraz wirtualny rozdzielonych lipidów znakowanych radioaktywnie.Aby oznaczyć aktywność lipazy diacylogliceryolu (DAG), najpierw należy dodać 5 000 CPM znakowanego 14C DAG do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Do probówki należy również dodać roztwór Tritonu X-100 i wymieszać go za pomocą wortexa. Roztwór należy wysuszyć w strumieniu azotu.W celu przygotowania końcowego testu o objętości 100 µL, dodać bufor Tris-HCl, roztwór chlorku sodu oraz wodę bidestylowaną. Mieszać w vorteksie przez pięć sekund. Rozpocząć reakcję, dodając do roztworu pięć µL enzymu.Inkubuj roztwór w temperaturze 30 °C przez cztery godziny. Zatrzymaj reakcję poprzez dodanie 250 µL metanolu i 125 µL chloroformu, a następnie przeprowadź ekstrakcję lipidów zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej w tym filmie. Przejdź do analizy neutralnych lipidów polarnych za pomocą 1DTLC i następującego po niej obrazowania PSL, jak zrobiono to wcześniej.Chociaż przewidywana fosfolipaza SMc01003 wykazuje aktywność wobec sztucznych esterów acylowych para-nitrofenolu, aktywność ta jest jedynie dwu- lub trzykrotnie wyższa od aktywności tła występującej w ekstraktach bezkomórkowych Escherichia coli, w których nie wyeksponowano żadnego obcego genu. Wskazuje to, że estry acylowe para-nitrofenylu nie wydają się być dobrymi substratami dla SMc01003. Podczas gdy ekstrakty bezkomórkowe E. coli nie potrafią degradować diacylogliceryolu, ekstrakty ze szczepów, w których wyeksponowano przewidywaną fosfolipazę SMc01003, wywołały degradację diacylogliceryolu.Choć przewidywano, że SMc01003 jest fosfolipazą, w rzeczywistości jest to lipaza diacyloglicerolowa, która rozkłada diacyloglicerol do monoacyloglicerolu i jednego kwasu tłuszczowego. Następnie rozkłada ona monoacyloglicerol dalej do glicerolu i drugiego kwasu tłuszczowego. Po opanowaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu kilku tygodni, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat optymalizacji aktywności enzymatycznej lipaz i fosfolipaz oraz sposobu kontynuowania poszukiwań ich fizjologicznych substratów. Kluczową zaletą tej procedury jest możliwość oddzielenia optymalizacji aktywności enzymu od poszukiwania jego naturalnego substratu. Pamiętaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi lub substancjami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować wymagane środki ostrożności.

defining-substrate-specificities-for-lipase-phospholipase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Tutaj prezentujemy protokół do określania specyficzności proteazy w surowych ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii MALDI-TOF.

Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół wykorzystuje pęcznienie agarozy jako potężną i dającą się uogólnić technikę włączania integralnych białek błonowych (IMP) do gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków lipidowych (GUV), jak opisano tutaj dla rekonstytucji ludzkiego białka receptora serotoninowego 1A (5-HT1AR), jednej z klas farmakologicznie ważnych receptorów sprzężonych z białkiem G.

Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

Balans folii wisiorek z kroplą powierzchni, zaimplementowany z wymianą wielofazową, nazywaną OCTOPUS, pozwala na naśladowanie warunków trawiennych poprzez sekwencyjną wymianę podfaz oryginalnego roztworu masowego z symulowanymi płynami żołądkowo-jelitowymi. Symulowane trawienie in vitro jest monitorowane poprzez rejestrowanie in situ napięcia międzyfazowego strawionej warstwy międzyfazowej.

Metody in vitro Trawienie emulsji w pojedynczej kropli poprzez wielofazową wymianę symulowanych płynów żołądkowo-jelitowych

Ta metoda opisuje test sedymentacji in vitro oparty na lektynie, który pozwala określić ilościowo powinowactwo wiązania fosfatazy glukanowej i amylopektyny. Ten test kosedymentacji jest niezawodny w pomiarze wiązania substratu fosfatazy glukanowej i może być stosowany do różnych rozpuszczonych substratów glukanu.

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj metodę identyfikacji naturalnych substratów dla lipaz i fosfolipaz bakteryjnych. Technika umożliwia niezależną optymalizację aktywności enzymatycznej oraz badanie specyficzności substratowej hydrolaz w różnych organizmach modelowych.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Przeglądaj więcej filmów