Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Ogólnym celem tej procedury jest przyspieszenie wykrywania fizjologicznych substratów dla potencjalnych lipaz i fosfolipaz. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie entomologii, takie jak to, w jaki sposób fosfolipazy przyczyniają się do przebudowy lipidów w błonach biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że optymalizacja aktywności enzymatycznej i poszukiwanie naturalnego substratu dla enzymu mogą być wykonywane niezależnie.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat specyficzności substratowej lipaz bakteryjnych i fosfolipaz, może być również modyfikowana w celu badania hydrolaz innych organizmów modelowych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy szukaliśmy aktywności enzymu, która mogłaby degradować wewnętrzną błonę lipidową fosfatydylocholinę inorhizobium meliloti. Aby przygotować bezkomórkowe ekstrakty białkowe, rozmrozić zawiesiny komórek bakteryjnych i przechowywać je na lodzie.

Następnie przepuść zawiesiny komórek trzykrotnie przez zimną komórkę ciśnieniową o sile 20 000 funtów na cal kwadratowy. Usunąć komórki i resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 5 000 g przez 30 minut, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przygotować podwielokrotności 100 i 500 mikrolitrów z supernatantu do dalszej analizy.

Skonfiguruj wcześniej zoptymalizowany test enzymatyczny, korzystając ze schematów pipetowania podanych w tabeli w protokole tekstowym. Aby uzyskać wstępne pokrycie różnych aktywności enzymatycznych, należy użyć sztucznych substratów, które po hydrolizie dają kolorowy produkt, takich jak para-nitrofenol lub pochodne PNP. Postępuj zgodnie z biegiem czasu, aby zwiększyć absorbancję przy 405 nanometrach, ze względu na tworzenie się PNP w spektrofotometrze w temperaturze 30 stopni Celsjusza w ciągu pięciu minut.

Na koniec wykonaj obliczenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W celu znakowania radiowego lipidów należy przygotować przez noc wstępną hodowlę interesującego organizmu w pięciu mililitrach pożądanej pożywki hodowlanej i hodować w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Z kultury wstępnej zaszczepić 20 milimetrów świeżej pożywki w 100-milimetrowej kolbie hodowlanej, aby uzyskać początkową gęstość optyczną przy 620 nanometrach 0,3 dla kultury.

Następnie przenieś jednomililitrową porcję kultury do 14-mililitrowej sterylnej probówki z okrągłym dnem z polistyrenu w sterylnych warunkach. Dodaj jedną mikrokiurę octanu 114 c do kultury o pojemności jednego mililitra. Następnie inkubuj płynną kulturę pod mieszaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez okres 24 godzin.

Pod koniec okresu inkubacji przenieść kulturę do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i odwirować 12 000 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zawiesić granulat w 100 mikrolitrach wody. W tym momencie przechowuj zawiesinę komórkową w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast kontynuuj ekstrakcję polarnych lipidów.

Aby przeprowadzić ekstrakcję lipidów polarnych, dodaj 375 mikrolitrów metanolu dwa do jednego roztworu chloroformu do 100 mikrolitrów wodnej zawiesiny komórek. Wirować próbkę przez 30 sekund przed inkubacją przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wirować przez pięć minut w temperaturze 12 000 g w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie do supernatantu dodać 125 mikrolitrów chloroformu i 125 mikrolitrów wody. Po wirowaniu przez 30 sekund odwirować próbkę przez jedną minutę w temperaturze 12 000 g w temperaturze pokojowej.

Przenieś dolną fazę chloroformu do świeżej probówki. Następnie osusz roztwór strumieniem azotu gazowego. Wysuszone lipidy rozpuścić w 100 mikrolitrach chloroformu do roztworu metanolu.

W celu oddzielenia obojętnych lipidów polarnych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, należy nałożyć trzy mikrolitrowe porcje próbek lipidów na wysokowydajną blachę aluminiową z żelu krzemionkowego do chromatografii cienkowarstwowej, zaczynając dwa centymetry od krawędzi płytki. Jeżeli w chromatografii jednowymiarowej analizowanych jest wiele próbek, należy zachować odległość co najmniej 1,5 centymetra między różnymi miejscami aplikacji próbki. Przenieść fazę ruchomą do komory wywoływania TLC, wewnętrznie pokrytej bibułą chromatograficzną.

Przykryj szklaną płytą, aby komora nasyciła się przez 30 minut. Przenieś blachę aluminiową z żelu krzemionkowego HPTLC z wysuszonymi próbkami lipidów do komory. Pozwól płytce rozwinąć się przez 30 minut w zamkniętej komorze przed wyjęciem płytki.

Następnie pozwól rozpuszczalnikom wyschnąć w okapie przepływowym przez dwie godziny. Po wyschnięciu opracowanego arkusza TLC inkubuj go z fototymulacyjnym ekranem luminescencyjnym w zamkniętej kasecie przez trzy dni. Następnie wystaw inkubowany ekran na działanie skanera PSL i uzyskaj wirtualny obraz oddzielonych lipidów znakowanych radioaktywnie.

Aby określić aktywność lipazy diacyloglicerolu lub DAG, najpierw dodaj 5 000 CPM 14 DAG znakowanych C do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Dodaj również roztwór Triton X-100 do probówki i wymieszaj wirowo. Wysuszyć roztwór pod strumieniem azotu.

Aby uzyskać końcowy test o objętości 100 mikrolitrów, dodaj bufor Tris-HCl, roztwór chlorku sodu i wodę dwudestylowaną. Wiruj przez pięć sekund. Rozpocznij reakcję, dodając do roztworu pięć mikrolitrów enzymu.

Inkubuj roztwór w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Zatrzymaj reakcję przez dodanie 250 mikrolitrów metanolu i 125 mikrolitrów chloroformu przed ekstrakcją lipidów, jak opisano wcześniej w tym filmie. Przystąp do analizy neutralnych lipidów polarnych za pomocą 1DTLC, a następnie obrazowania PSL, jak poprzednio.

Chociaż przewidywana fosfolipaza SMc01003 wykazuje aktywność ze sztucznymi estrami acylowymi para-nitrofenolu, aktywność jest tylko dwukrotnie lub trzykrotnie większa niż aktywność tła obecna w bezkomórkowych ekstraktach Escherichia coli, w których nie stwierdzono ekspresji obcego genu. Oznacza to, że estry para-nitrofenyloacylowe nie wydają się być dobrymi substratami dla SMc01003. Podczas gdy bezkomórkowe ekstrakty E. Coli nie mogą rozkładać diacyloglicerolu, ekstrakty ze szczepów, w których stwierdzono ekspresję przewidywanej fosfolipazy SMc01003, spowodowały degradację diacyloglicerolu.

Chociaż przewidywano, że SMc01003 jest fosfolipazą, w rzeczywistości jest to lipaza diacyloglicerolu, która rozkłada diacyloglicerol do monoacyloglicerolu i jednego kwasu tłuszczowego. Następnie rozkłada monoacyloglicerol dalej do glicerolu i innego kwasu tłuszczowego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zoptymalizować aktywność enzymatyczną lipaz i fosfolipaz oraz jak kontynuować poszukiwanie ich fizjologicznych substratów. Istotną zaletą tej procedury jest to, że optymalizacja aktywności enzymu może być oddzielona od poszukiwania naturalnego substratu enzymu. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi lub substancjami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować wymagane środki ostrożności.