Name: In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę badania interakcji śródbłonka z perycytami in vivo za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy. Ta technika pozwala identyfikować szlaki sygnałowe odpowiedzialne za angiogenezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. K. Yuan był wspierany przez American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) oraz Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr V. de Jesus Perez otrzymał nagrodę za rozwój kariery od Fundacji Roberta Wooda Johnsona, nagrodę NIH K08 HL105884-01, nagrodę Pulmonary Hypertension Association, nagrodę za badania biomedyczne od American Lung Association oraz nagrodę Translational Research and Applied Medicine nagroda Uniwersytetu Stanforda.

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Stanford University School of Medicine.
UWAGA: Zwierzęta są znieczulone 3% izofluranem parownika i 3% zapasem gazuO2. Stosowanie maści weterynaryjnej na oczy może pomóc w zapobieganiu wysuszeniu podczas znieczulenia.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hodować hodowle ludzkich komórek śródbłonka i perycytów na płytkach o średnicy 100 mm z 10 ml odpowiedniej pożywki. Wymieniaj 10 ml świeżej pożywki co 2-3 dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek śródbłonka (ECs) w kompletnych pożywkach z komórek śródbłonka (ECM) uzupełniona dostarczonymi przez firmę 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10% penicyliną/streptomycyną i 10% suplementem wzrostu komórek śródbłonka.</li>
		<li>Hodowla perycytów w kompletnych pożywkach perycytycznych (PM) uzupełniona dostarczonym przez firmę 2% FBS, 10% penicyliną/streptomycyną i 10% suplementem wzrostu perycytów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszaniny komórek
	<ol>
		<li>Oblicz wymaganą liczbę komórek dla grupy doświadczalnej i kontrolnej. 
		UWAGA: Każda wtyczka w grupie eksperymentalnej zawiera milion (1 x 106) ludzkich EC i dwieście tysięcy (2 x 105) perycytów. W grupie kontrolnej każda wtyczka zawiera tylko 1,2 miliona ludzkich EC. Grupa kontroli ujemnej ma tylko żel matrycowy. Każda grupa powinna zawierać co najmniej cztery zatyczki, co wymagałoby dwóch myszy, ponieważ zatyczki można wstrzyknąć z każdej strony dolnej części pleców myszy. Trzy zatyczki służyłyby jako potrójne zatyczki do eksperymentu, a czwarta mogłaby być użyta w przypadku, gdyby jedna z nich się nie powiedziała. Przygotuj 25% dodatkowych komórek, aby dopasować dodatkową objętość żelu.</li>
		<li>Zbierz i policz komórki z płytek hodowlanych.
		<ol>
			<li>Aby odłączyć komórki, usuń pożywkę i przemyj raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) o temperaturze pokojowej. Usunąć PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny/2,21 mM EDTA i inkubować przez 1 minutę. Zmyć komórki z płytki, dodając 2 ml pożywki i zebrać do probówki o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Policz komórkę za pomocą hemocytometru zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
			<li>Odwirować odpowiednią liczbę komórek w postaci osadu o masie 400 x g przez 5 minut. W przypadku grupy eksperymentalnej odwiruj zarówno EC, jak i perycyty razem w jednym osadzie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie żelu Matrix
<ol>
	<li>Całkowicie rozmrozić żel matrycowy w temperaturze 4 °C przez 4 godziny lub przez noc, aby uzyskać jednorodny roztwór. Nie jest wymagane mieszanie.</li>
	<li>Podwielokrotność żelu matrycowego w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sterylne probówki o pojemności 1,5 ml i strzykawki insulinowe 28 G 1 ml należy schłodzić w temperaturze 4 °C. Uwaga: Żel matrycowy należy zawsze przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Zmieszać zimny żel matrycowy z bFGF w stosunku objętościowym 1:100 (końcowe stężenie bFGF = 0,5 μg/ml; roztwór podstawowy bFGF = 50 μg/ml) Po wymieszaniu roztworu żelu matrycowego przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół, inkubować na lodzie przez 30 - 60 minut przed zmieszaniem z komórkami w kroku 3.1. 
	UWAGA: Rozmrozić bulion bFGF przed wymieszaniem. Oblicz liczbę zatyczek potrzebnych do wtrysku. Na przykład każda wtyczka wymaga 200 μl żelu matrycowego. Dlatego przygotuj 25% dodatkowego żelu.</li>
</ol>
3. Wymieszaj żel Matrix z komórkami
<ol>
	<li>Dla każdej grupy ponownie zawiesić osad komórkowy (zawierający odpowiednią liczbę komórek) z obliczoną objętością żelu matrycowego zawierającego bFGF. Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pienienia się i pozostaw w tubce o pojemności 15 ml na lodzie, aż myszy będą przygotowane do wstrzyknięcia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Znieczulij 1 myszy SCID przez 5 minut w 3% izofluranu plus 3%O2 w komorze indukcyjnej. Skoncentruj się na jednej grupie eksperymentalnej lub 2 myszach na raz.</li>
	<li>Wyjmij mysz z komory indukcyjnej, umieść ją na poduszce grzewczej brzuszną stroną do dołu i szybko przymocuj dyszę pyska do pyska myszy za pomocą systemu bez ponownego oddychania, aby zapewnić znieczulenie przez cały czas trwania procedury wstrzykiwania. Przełącz przepływ gazu z komory indukcyjnej na system bez ponownego oddychania i obniż ciśnienie gazu do 1,5% izofluranu i 1,5%O2.</li>
	<li>Usuń włosy z obu bocznych tylnych obszarów (około 1 cm średnicy) za pomocą golarki lub kremu do depilacji.</li>
	<li>Przetrzyj obszar skóry wacikiem nasączonym 70% alkoholem.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w komorze indukcyjnej i powtórz kroki 4.2 - 4.4 z drugą myszą.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie żelu Matrix
<ol>
	<li>Przygotować jedną mysz do wstrzyknięcia, podłączając ją do systemu bez oddychania i kładąc na poduszce grzewczej brzusznie do dołu.</li>
	<li>Załaduj żel matrycowy do wstępnie schłodzonej strzykawki insulinowej 28 G i pojemności 1 cm3, po jednej myszy na raz.
	<ol>
		<li>Do strzykawki załadować pełną objętość 500 μl żelu matrycowego na dwie zatyczki (200 μl na wtyczkę plus 25% dodatkowo) do strzykawki.</li>
		<li>Należy upewnić się, że wstrzyknąłeś żel macierzowy myszom w ciągu 3 minut od włożenia komórek do strzykawki, aby zapobiec osiadaniu komórek na boku strzykawki i zastygnięciu żelu matrycowego wewnątrz strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieś skórę pleców, aby zlokalizować przestrzeń podskórną, a następnie powoli i równomiernie wstrzyknij 200 μl żelu macierzowego w przestrzeń podskórną tylnej części klatki piersiowej.</li>
	<li>Powoli wyjmować igłę do wstrzykiwań, uważając, aby żel matrycowy nie wyciekł z miejsca wstrzyknięcia. W miejscu wstrzyknięcia utworzy się guzek. Przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Powtórz kroki wstrzykiwania 5,2 - 5,5 po drugiej stronie grzbietu myszy, a następnie pozostaw mysz na plecach na 1 minutę, aby umożliwić żelowanie żelu matrycowego na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Obrysuj oba guzki za pomocą trwałego markera, aby zidentyfikować guzek po 14 dniach. Po odrośnięciu niektórych włosów łatwiej będzie znaleźć guzek.</li>
</ol>
6. Izolacja zatyczki żelowej Matrix: 14 dni po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w sposób humanitarny, wystawiając zwierzęta na >5 minuty wdychania dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.</li>
	<li>Wyjmij zatyczkę żelową matrycy z tyłu myszy.
	<ol>
		<li>Delikatnie usunąć odrastające włosy wokół miejsca wstrzyknięcia, w którym znajduje się zatyczka, powtarzając krok 4.3. Linia znacznika wskazuje rozmiar oryginalnego guzka pod skórą.</li>
		<li>Wytnij zatyczkę wraz z otaczającą ją skórą i warstwami mięśni przyczepionymi odpowiednio na górnej i dolnej stronie zatyczki.
		<ol>
			<li>Za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie na zaznaczonej granicy zatyczki, która jest prostopadła do skóry i przeciąć mięsień pod zatyczką. Następnie ostrożnie przeciąć wokół obwodu wtyczki wzdłuż zaznaczonej granicy.</li>
			<li>Wyjmij zatyczkę, trzymając ją wciśniętą między warstwę skóry i mięśni. Natychmiast spłukać w małej zlewce z 1x PBS, aby zmyć nadmiar krwi. Wtyczka jest teraz gotowa do zamocowania (następny krok, 6.3).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamocuj korek w 4% paraformaldehydzie.
	<ol>
		<li>Umieść całą zatyczkę, łącznie ze skórą i warstwami mięśniowymi, w probówce o pojemności 50 ml z 25 ml 4% paraformaldehydu na 24 godziny w temperaturze pokojowej bez kołysania. Następnego dnia przenieś zatyczkę do 25 ml 70% etanolu na kolejne 24 godziny przed zatopieniem w parafinie. 
		UWAGA: Z paraformaldehydem należy obchodzić się ostrożnie. Nosić rękawice.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Proces parafinowy w zatyczce żelowej Matrix
<ol>
	<li>Przygotuj zatyczkę do zatapiania parafiny.
	<ol>
		<li>Ustaw zatyczkę tak, jak pokazano na rysunku 1a; umieść zatyczkę w kasecie na chusteczki tak, aby strona zatyczki była skierowana do góry, a zarówno warstwa skóry, jak i mięśni były widoczne na powierzchni bloku tkanki, który zostanie przecięty jako pierwszy podczas cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parafina zatapia korek zgodnie ze standardowymi protokołami zatapiania parafiny13.</li>
	<li>Wyciąć skrawki o grubości 8 - 10 μm z bloku tkanki i zamontować na szkiełkach mikroskopowych zgodnie ze standardowymi protokołami cięcia parafiny13.</li>
	<li>Przechowuj szkiełka w chłodnym, suchym miejscu w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do barwienia.</li>
</ol>
8. Plamy z barwnikiem Hematoxylin i Eozyny (H&E)13
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki tkanki, przepuszczając szkiełka przez 100% ksylenu dwukrotnie, 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i na koniec 1x PBS, każdy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Pozostaw slajdy w 1x PBS do następnego kroku.</li>
	<li>Pobrać pipetą 100 μl roztworu H&E na wycinek i inkubować przez 1 - 5 minut lub do momentu, gdy pojawi się wyraźny kontrast między niebieskimi jądrami a różową cytoplazmą w komórce, oglądany pod pionowym mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu. Uważaj, aby żadne rozwiązanie BHP nie dotknęło obiektywu.</li>
	<li>Zmyć roztwór H&E ze szkiełka, zanurzając szkiełko w dużej zlewce z wodą z kranu, a następnie umieścić szkiełko w stojaku w zlewce i spłukiwać pod bieżącą wodą przez 2 minuty.</li>
	<li>Przejdź do kroku 9.8, aby zamontować prowadnice.</li>
</ol>
9. Barwienie innych preparatów do ludzkich naczyń włosowatych i perycytów
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki tkanki, przepuszczając szkiełka przez 100% ksylenu dwukrotnie, 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i na koniec 1x PBS, każdy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Pozostaw slajdy w 1x PBS do następnego kroku.</li>
	<li>Zagotuj skrawki w roztworze do pobierania antygenu.
	<ol>
		<li>W zlewce o pojemności 2 l przygotować wrzący roztwór do pobierania antygenu, używając 1x buforu cytrynianowego (pH 7,0) w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym.</li>
		<li>Po ugotowaniu umieść szkiełka w metalowym stojaku i zanurz je we wrzącym roztworze antygenu na 20 minut.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij zlewkę z bloku grzewczego z szkiełkami nadal zanurzonymi i pozwól, aby roztwór powoli powrócił do temperatury pokojowej przez około 30 minut.</li>
		<li>Umieść szkiełka w 1x PBS do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokuj sekcje w buforze blokującym (1x PBS, 5% Kozia Surowica, 0,3% Triton X-100).
	<ol>
		<li>Narysuj hydrofobowy okrąg wokół krawędzi każdej sekcji za pomocą pisaka PAP.</li>
		<li>Umieść szkiełka w tacce na wilgoć z wodą destylowaną na dnie tacy.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl buforu blokującego na skrawki, upewniając się, że cała tkanka jest pokryta płynem (może wymagać więcej niż 100 μl).</li>
		<li>Inkubować sekcje z buforem blokującym przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować skrawki z przeciwciałem pierwotnym.
	<ol>
		<li>Przygotuj jeden roztwór z dwoma przeciwciałami pierwszorzędowymi, aby zbadać każdą sekcję pod kątem CD31 (EC) i aktyny mięśni gładkich (perycyty) rozcieńczonych w buforze rozcieńczającym (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100). 
		UWAGA: Tutaj stężenie anty-CD31 wynosi 1:50, a stężenie aktyny przeciwko mięśniom gładkim wynosi 1:300.</li>
		<li>Inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C ze 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych na tacy nawilżającej zawierającej wodę destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBST (1x PBS + 0,1% Tween20) przez 5 minut każde mycie.</li>
	<li>Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór z sprzężonym z fluoroforem kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi w celu rozpoznania przeciwciała królika anty-CD31 rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym.
		<ol>
			<li>UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe aktyny mięśni gładkich jest już sprzężone z fluoroforem CY3, więc nie jest potrzebne barwienie przeciwciałami wtórnymi. Stężenie przeciwciał drugorzędowych przeciwko królikowi wynosi 1:250.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować skrawki przez 1 godzinę ze 100 μl przeciwciała drugorzędowego na tacy nawilżającej zawierającej wodę destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBST przez 5 minut każde mycie.</li>
	<li>Zamontuj zjeżdżalnie.
	<ol>
		<li>Odpipetować 2 - 3 krople (~ 40 - 60 μl) roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu z barwieniem jądrowym DAPI na każdą sekcję.</li>
		<li>Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe nr 1.5 na sekcjach i roztworze montażowym, pozwalając płynowi rozprowadzić się po sekcjach i na krawędziach szkiełka nakrywkowego. Delikatnie palcem wyciśnij pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się nad sekcją.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Ilościowe określenie gęstości i struktury kapilar14
<ol>
	<li>Policz liczbę naczyń włosowatych w skrawkach wybarwionych H&E, wyrażoną jako #/mm2.
	<ol>
		<li>Zrób zdjęcia czterech różnych pól na pionowym mikroskopie świetlnym pod 40-krotnym powiększeniem. 
		UWAGA: Naczynia włosowate są identyfikowane jako probówki wypełnione czerwonymi krwinkami.</li>
		<li>Alternatywnie, zamiast ręcznie liczyć naczynia włosowate, należy użyć oprogramowania do analizy obrazu (np. Wimasis Image Analysis) do ilościowego określenia różnych parametrów angiogenezy, takich jak liczba naczyń krwionośnych, średnia długość i średnica naczynia oraz punkty rozgałęzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza struktury kapilarnej w skrawkach barwionych immunofluorescencyjnie.
	<ol>
		<li>Uzyskaj zdjęcia czterech różnych pól na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z FITC i kostką filtra TxRed.
		<ol>
			<li>Użyj kostki FITC do obrazowania EC przez wzbudzenie przy długości fali 488 nm i użyj kostki TxRed do obrazowania perycytów przez wzbudzenie przy długości fali 594 nm.
			<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
			</style>
			<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {odstępy między literami: -0.1px}
			</style>
			<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {odstępy między literami: -0.1px}
			</style>
			<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {odstępy między literami: -0.1px}
			</style>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in angiogenesis.</a> Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).</li>
<li>Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-specific+activation+of+Src+and+Rho+initiates+capillary+morphogenesis+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells.</a> FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).</li>
<li>Grant, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelial+cells+with+a+laminin+A+chain+peptide+%28SIKVAV%29+in+vitro+and+induction+of+angiogenic+behavior+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo.</a> J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).</li>
<li>Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modulation+of+endothelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta+depends+upon+the+composition+and+organization+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix.</a> J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).</li>
<li>Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+10-day-old+chick+embryo+model+for+studying+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).</li>
<li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+pathway+is+required+for+pericyte+recruitment+during+pulmonary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis.</a> Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).</li>
<li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).</li>
<li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).</li>
<li>Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+vessels%2C+endothelial+cells%2C+and+vascular+pericytes+in+insulin+secretion+and+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action.</a> Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).</li>
<li>Ricard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pericyte+coverage+mediated+by+endothelial-derived+fibroblast+growth+factor-2+and+interleukin-6+is+a+source+of+smooth+muscle-like+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).</li>
<li>Buchwalow, I. B., Bocker, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchwalow%2C+IB+%22Immunohistochemistry%3A+Basics+and+Methods%22">Immunohistochemistry: Basics and Methods</a>. , 1-153 (2010).</li>
<li>Tata, D. A., Anderson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+investigation+of+capillary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the investigation of capillary structure.</a> J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).</li>
</ol>

Brak sprzecznych interesów finansowych.

Test zatyczek żelowych Matrix okazał się wygodną i skuteczną metodą oceny regulacji genów w angiogenezie, związkach angiogennych i antyangiogennych in vivo oraz w celu uzupełnienia testów in vitro . W tym miejscu szczegółowo opisujemy nowatorski test czopa żelowego macierzy ludzkiej angiogenezy, który bada interakcję między komórkami śródbłonka a perycytami podczas tworzenia naczyń.
W tym protokole jest kilka nowatorskich i krytycznych kroków. Preferowane są komórki o niskim ...

Angiogeneza to proces, w którym nowe naczynia krwionośne są formowane z wcześniej istniejącej sieci naczyniowej1 i jest przedmiotem ciągłych badań w wielu obszarach, od normalnego rozwoju po chorobę. Ten dynamiczny proces obejmuje proliferację i migrację komórek śródbłonka (EC) oraz rekrutację perycytów w celu skonstruowania cewy naczyniowej, która jest skierowana w stronę miejsca, które potrzebuje dostarczania tlenu i składników odżywczych2. Zbadanie tego procesu wymaga równie dynamicznego testu, a przede wszystkim takiego, który może podsumować trójwymiarową naturę powstawania rurek. Testy matrycowe 3D in vitro zostały opracowane w celu zaspokojenia tej potrzeby i sprawdziły się, umożliwiając naukowcom zdefiniowanie dyskretnych etapów w przestrzeni i czasie, w których zachodzi angiogeneza 3,4,5,6. Jednak te modele matrycowe 3D in vitro są ograniczone do badania nieperfundowanych naczyń krwionośnych i dlatego brakuje im krytycznych składników związanych z procesem angiogenezy (np. krążących czynników wzrostu i hamujących, nienaturalnych napięć/sił w łożysku naczyniowym) i nie symulują złożonego środowiska obecnego w żywej tkance. Aby rozwiązać to ograniczenie, opracowano kilka testów angiogenezy in vivo 7, w tym test czopa żelowego Matrix, który będzie przedmiotem naszego raportu 8,9.
Test zatyczek żelowych w macierzy jest dobrze znanym testem angiogenezy in vivo, który przemawia do badaczy, ponieważ stanowi solidną platformę do testowania ról różnych komórek i substancji w angiogenezie. Żel Matrix jest dostępnym na rynku roztworem błony podstawnej, który jest wydzielany przez linię komórkową mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), która krzepnie w żel w temperaturze 37 °C. Żel macierzowy można mieszać z komórkami i/lub substancjami, takimi jak czynniki wzrostu, i wstrzykiwać podskórnie myszy. EC gospodarza zaatakują czop w ciągu 14 dni, utworzą sieć naczyniową i ulegną perfuzji z krwią gospodarza. Do tej pory testy czopów żelowych macierzy koncentrowały się wyłącznie na badaniu zachowania komórek śródbłonka podczas angiogenezy, jednak zgodnie z naszą najlepszą wiedzą nie podjęto jeszcze żadnych wysiłków, aby ustalić, czy test ten można wykorzystać do wspólnej hodowli komórek śródbłonka i perycytów w celu zbadania, jak te dwa typy komórek oddziałują podczas angiogenezy. W szczególności zrozumienie związku między EC a perycytami jest cenne dla badania chorób, w których utrata naczyń krwionośnych jest patologiczna, w tym niedokrwienia mikronaczyniowego i choroby naczyń obwodowych 10,11,12.
Tutaj opisujemy protokół, który wprowadza perycyty pochodzące z człowieka do mieszaniny żelu macierzowego wraz z ludzkimi EC i czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF). Mieszanina ta może być następnie wstrzykiwana podskórnie w grzbiet myszy z SCID, aby umożliwić utworzenie w pełni funkcjonalnych, pokrytych perycytami, naczyń hybrydowych. Nasz protokół opisuje, jak przygotować wtyczki żelowe zawierające ludzkie EC z ludzkimi perycytami lub bez, umieszczać je u myszy SCID i jak analizować skrawki histologiczne pod kątem krytycznych punktów końcowych angiogenezy.

<table><tbody><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyny/0,53 mM EDTA</td><td>Zestaw</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywek dla komórek śródbłonka (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>zawiera pożywkę, suplement wzrostu EC oraz penicylinę/streptomycynę, z których każdy jest dostarczany w odpowiedniej objętości dla łatwego mieszania</td></tr><tr><td>Zestaw pożywki perycytowej (PM)</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>obejmuje pożywkę, suplement wzrostu Pericyte oraz penicylinę/streptomycynę, z których każdy jest dostarczany w odpowiedniej objętości w celu łatwego mieszania</td></tr><tr><td>pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc</td><td>Przełomowa inicjatywa</td><td></td> na rzecz nadciśnienia płucnego <td>ten typ komórek jest również dostępny na rynku. Komórki używane w pasażu 1-4</td></tr><tr><td>pierwotne ludzkie perycyty płucne</td><td>Przełomowa inicjatywa</td><td></td> nadciśnienia płucnego <td>ten typ komórek nie jest dostępny na rynku, ale paricyty mózgu są.&nbsp; Komórki używane przy pasażowaniu 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>roztwór podstawowy wynosi 50 &mu; g/ml w 0,1% BSA w PBS, podwielokrotności przy 50 &mu; l i przechowywane w temperaturze -20 stopni</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Ciężki Złożony Niedobór Odporności) myszy</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD. Szczep SCID IL2R gamma knockout jest najlepszym szczepem; 4-6 tygodni życia</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek, sterylne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml zakręcane probówki, sterylne</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>Hemocytometr Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji Nair</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie przeciwciało pierwotne CD31</td> Roztwór roboczy <td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>to 1:50</td></tr><tr><td>anty-ludzkie przeciwciało fluorescencyjne aktyny mięśni gładkich CY3 roztwór</td> roboczy <td>Sigma</td><td>C6198</td><td>to 1:300</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi; 488/zielony</td> Roztwór roboczy <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>to 1:250</td></tr><tr><td>Roztwór DAPI Prolong Gold</td><td>Komórka Szkiełka mikroskopowe sygnalizacyjne</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nr 1.5 szkiełka nakrywkowe</td> Bufor cytrynianowy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr> 10x <tr><td>bardzo cienkie nożyczki chirurgiczne</td><td></td> Millipore 21545 <td></td> Fine Science Tools 14084-08 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Formalina (paraformaldehyd)Thermo Fisher Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Kasety na tkanki</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>surowica kozia</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu matrix gel plug u myszy

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogeneza to proces, w którym nowe naczynia krwionośne są formowane z istniejących naczyń. Wzrost nowych naczyń wymaga skoordynowanej proliferacji, migracji i wyrównania komórek śródbłonka w celu utworzenia struktur rurkowych, a następnie rekrutacji perycytów w celu zapewnienia wsparcia ściennego i ułatwienia dojrzewania naczyń. Obecne metody hodowli komórkowych in vitro nie są w stanie w pełni odtworzyć złożonego środowiska biologicznego, w którym komórki śródbłonka i perycyty oddziałują na siebie, tworząc funkcjonalne naczynia. Przedstawiamy nowatorskie zastosowanie testu in vivo z zatyczką żelową macierzy do badania interakcji śródbłonka-perycytów i tworzenia funkcjonalnych naczyń krwionośnych przy użyciu myszy z ciężką złożoną mutacją niedoboru odporności (SCID). Krótko mówiąc, żel matrycowy miesza się z roztworem zawierającym komórki śródbłonka z perycytami lub bez, a następnie wstrzykuje się w plecy znieczulonych myszy SCID. Po 14 dniach zatyczki żelowe matrycy są usuwane, mocowane i cięte na sekcje do analizy histologicznej. Długość, liczba, wielkość i zakres pokrycia perycytami dojrzałych naczyń krwionośnych (zdefiniowany przez obecność czerwonych krwinek w świetle) można określić ilościowo i porównać między grupami eksperymentalnymi za pomocą komercyjnych platform statystycznych. Oprócz zastosowania jako test angiogenezy, ten test wkładu żelowego Matrix może być używany do prowadzenia badań genetycznych i jako platforma do odkrywania leków. Podsumowując, protokół ten pozwoli naukowcom uzupełnić dostępne testy in vitro do badania interakcji śródbłonka-perycytów i ich znaczenia dla angiogenezy układowej lub płucnej.

Reprezentatywne barwienia H&amp;E oraz immunofluorescencyjne przekrojów wtyczek z żelu macierzyowego przedstawiono na Rysunku 2. Przekroje wtyczek zawierających wyłącznie EC wykazują obecność niektórych naczyń, które w większości nie są ukrwione (Rysunek 2, góra po lewej, czarne strzałki), natomiast wtyczki zawierające zarówno EC, jak i pericyty wykazują kilka ukrwionych naczyń o większych średnicach i pełnym pokryciu pericytami, o czym świadczy pozytywne...

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Ogólnym celem tego testu z użyciem żelu macierzy in-vivo jest zbadanie oddziaływania komórek śródbłonka z pasożytami. Niniejszy test z matrigelem został opracowany, aby pomóc badaczom w analizie głównych etapów angiogenezy. Pozwoli on również na identyfikację szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za kluczowe etapy tworzenia naczyń krwionośnych, a także genów, których dysfunkcja może prowadzić do zaburzeń naczyniowych i innych aberracji angiogenezy.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie tworzenia naczyń krwionośnych in-vivo z udziałem zarówno komórek śródbłonka, jak i ich komórek wspierających – perycytów. Aby rozpocząć, należy hodować ludzkie kultury komórek śródbłonka i komórek perycytów na płytkach 100-milimetrowych w 10 mililitrach odpowiednich pożywek. Wymieniaj pożywki co dwa do trzech dni, aż komórki osiągną 80% konfluencji.Aby przygotować roztwór żelu macierzy do zmieszania z komórkami, rozmrozić zapas żelu macierzy przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotować alikwoty po 1,5 mililitra do długoterminowego przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie dwa tygodnie. Każdy wkład eksperymentalny będzie wymagał 200 mikrolitrów żelu macierzy.Zatem jedna probówka z zapasem może zapewnić sześć wkładek z 25% nadwyżką. Przygotuj każdą wymaganą alikwot do użycia, dodając 15 µL rozmrożonego 100x zapasu beta-FGF. Wymieszaj beta-FGF w roztworze za pomocą pipetowania, a następnie inkubuj w lodzie przez co najmniej 30 minut przed dodaniem komórek.Na tym etapie należy schłodzić kilka strzykawek insulinowych 1cc o rozmiarze igły 28G, które posłużą do iniekcji. Aby zebrać komórki z płytek hodowlanych, należy usunąć pożywkę i jednokrotnie przemyć komórki roztworem PBS. Po usunięciu PBS należy dodać jeden mililitr roztworu trypsyny i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na jedną minutę.Następnie pipetujemy 2 ml pożywki hodowlanej na płytki, aby odlepić komórki, a następnie zbieramy pożywkę do probówki o pojemności 15 ml. Teraz sprawdzamy stężenie zebranego materiału za pomocą hemocytometru. Następnie przygotowujemy alikwoty komórek w probówkach o pojemności 15 ml.W przypadku grupy eksperymentalnej zastosowano kombinację jednego miliona komórek śródbłonka i 200 000 pasożytów. Następnie odwiruj alikwoty komórek przy 400g przez pięć minut. Po tym dodaj obliczoną objętość żelu macierzy do osadu komórkowego i wymieszaj delikatnie pipetując, aby nie wytworzyła się piana, ponieważ pęcherzyków powietrza nie można wstrzyknąć.Przygotowane zawiesiny należy przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia myszom. Po znieczuleniu myszy izofluranem i potwierdzeniu stanu znieczulenia poprzez uciśnięcie palca u stopy, należy podłączyć mysz do systemu nieoddechowego podającego izofluran i umieścić ją na podgrzewaczu stroną brzuszną do dołu. Następnie należy usunąć ok. jednego centymetra kwadratowego sierści z obu bocznych obszarów tylnych.Następnie przemyj odsłoniętą skórę 70% alkoholem. Potem pobierz jeden mililitr przygotowanego roztworu komórek do schłodzonej strzykawki, co wystarczy na cztery wkłucia. Aby wykonać iniekcję, unieś skórę na grzbiecie, aby zlokalizować przestrzeń podskórną.Następnie powoli i równomiernie wstrzyknij 200 µL w przestrzeń podskórną za klatką piersiową i powoli wyjmij igłę, aby zapobiec wyciekowi. Po wstrzyknięciu w miejscu podania utworzy się wybrzuszenie. Przetrzyj to miejsce alkoholem, a następnie obrysuj wybrzuszenie markerem permanentnym, aby można było je później zlokalizować.Następnie powtórz procedurę iniekcji po drugiej stronie myszy. Należy upewnić się, że wszystkie komórki zostaną wstrzyknięte w ciągu trzech minut, w przeciwnym razie zaczną przyklejać się do strzykawki. Prawidłowe wykonanie etapu iniekcji jest kluczowe, aby zapewnić utworzenie się zatyczki z żelu macierzy pomiędzy warstwami skóry i mięśni, co pozwoli zatyczce zachować odpowiedni kształt i zapobiegnie jej rozproszeniu.Przed przejściem do wstrzyknięcia kolejnej myszy, pozwól wstrzykniętej myszy pozostać na podgrzewaczu przez minutę, aby matryca miała czas na zżelowanie. Po eutanazji umieść mysz na stole operacyjnym. Po usunięciu odrastających włosów z miejsca wstrzyknięcia, odnajdź linie znacznikowe wskazujące lokalizację wtyczki.Następnie, używając precyzyjnych nożyczek chirurgicznych, wykonaj nacięcie wzdłuż zaznaczonej krawędzi zatyczki, prostopadle do skóry i aż do mięśnia znajdującego się poniżej. Ostrożnie wytnij obszar wokół obwodu zaznaczonej krawędzi. Następnie usuń zatyczkę, utrzymując ją pomiędzy warstwami skóry i mięśni.Natychmiast opłucz czop w małym zlewce z PBS, aby usunąć krew. Następnie umieść cały czop w probówce o pojemności 50 milliliter z 25 milliliters 4% paraformaldehydu. Pozostaw do utrwalenia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, bez mieszania.Następnego dnia przenieś zatyczki do 25 mililitrów 70% etanolu na 24 godziny. Następnie przystąp do zatapiania w parafinie. Przekroje zatyczek zawierające wyłącznie komórki śródbłonka wykazują, że niektóre naczynia nie są ukrwione krwią gospodarza po 14 dniach in-vivo.W przeciwieństwie do nich, zatyczki zawierające zarówno komórki śródbłonka, jak i pasożyty, wykazują liczne ukrwione naczynia po 14 dniach in-vivo. Zatyczki te zawierają komórki wykazujące pozytywną reakcję na barwienie aktyną mięśni gładkich (kolor czerwony), znajdujące się bezpośrednio obok komórek śródbłonka pozytywnych pod kątem CD31 (kolor zielony). Zatem pasożyty mogą odgrywać istotną rolę w procesie tworzenia się nowych naczyń krwionośnych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować tę potężną technikę in-vivo do badania tworzenia naczyń krwionośnych w różnych typach komórek. Technika ta utoruje drogę badaczom do eksploracji różnorodnych zagadnień biologii naczyniowej w modelach mysich. Po przeprowadzeniu tej procedury można również zastosować inne metody, takie jak ilościowa PCR oraz immunoblotting metodą Western, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące zmian w ekspresji genów i proteomiki.Ta potężna technika pozwoli badaczowi na analizę in-vivo interakcji między komórkami śródbłonka a pasożytami podczas tworzenia naczyń krwionośnych, co stanowi kluczowy etap angiogenezy. Metoda ta umożliwi również badanie innych interakcji międzykomórkowych istotnych dla zrozumienia chorób naczyniowych, takich jak między innymi nadciśnienie płucne.

in-vivo-study-human-endothelial-pericyte-interaction-using-matrix-gel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

W tym filmie demonstrujemy wizualizację interakcji krwinek i śródbłonka w żyłach krezkowych w modelu myszy, któremu wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd.

Mikroskopia przyżyciowa do analizy interakcji komórka-śródbłonek krwi w mysim modelu zapalenia

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Ten protokół przedstawia nowatorski test kulkowy in vitro, który bardziej odpowiednio modeluje proces angiogenezy kiełkowania in vivo poprzez włączenie perycytów. Ta modyfikacja umożliwia testowi kulkowemu dokładniejsze odwzorowanie heterotypowych interakcji komórkowych między komórkami śródbłonka a komórkami ściennymi, które mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy.

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Poznaj metodę badania interakcji śródbłonka z perycytami in vivo za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy. Ta technika pozwala identyfikować szlaki sygnałowe odpowiedzialne za angiogenezę.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Przeglądaj więcej filmów