In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy
19 grudnia 2016
Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.
Ogólnym celem tego testu żelowego in vivo macierzowego jest zbadanie interakcji komórek śródbłonka z pasożytami. Ten test matrigelowy ma na celu pomóc badaczom w badaniu głównych etapów androgenezy. Pozwoli to również na identyfikację szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za główne etapy tworzenia naczyń krwionośnych, a także genów, których dysfunkcja może prowadzić do zaburzeń naczyniowych i innych aberracji androgenezy.
Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam badać tworzenie się naczyń krwionośnych in vivo obejmujących zarówno komórki śródbłonka, jak i ich komórki podporowe, perycyty. Na początek hoduj ludzkie hodowle komórek śródbłonka i komórek pasożytów na 100-milimetrowych płytkach z 10 mililitrami odpowiedniej pożywki. Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
Aby przygotować roztwór żelu matrycowego do wymieszania z komórkami, należy rozmrozić zapas żelu matrycowego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 1,5 mililitra porcji do długoterminowego przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Każda eksperymentalna wtyczka będzie wymagała 200 mikrolitrów żelu matrycowego.
Tak więc jedna zamagazynowana tuba może dostarczyć sześć korków z 25% nadmiarem. Przygotuj każdą wymaganą porcję do użycia, dodając 15 mikrolitrów rozmrożonego 100-krotnego bulionu beta-FGF. Wymieszać beta-FGF z roztworem przez pipetowanie, a następnie inkubować na lodzie przez co najmniej 30 minut przed dodaniem komórek.
W tym momencie schłodź kilka strzykawek insulinowych o pojemności 1 cm3 o rozmiarze 28 do wstrzykiwań. Aby zebrać komórki z płytek hodowlanych, usuń pożywkę i przemyj komórki raz PBS. Po wyjęciu PBS dodać jeden mililitr roztworu trypsyny i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na jedną minutę.
Następnie odpipetować dwa mililitry pożywki hodowlanej na płytki, aby odłączyć komórki i zebrać pożywkę do probówki o pojemności 15 mililitrów. Teraz sprawdź stężenie kolekcji za pomocą hemocytometru. Następnie przygotuj porcje komórek w 15-mililitrowych probówkach.
W grupie eksperymentalnej zastosowano kombinację miliona komórek śródbłonka i 200 000 pasożytów. Następnie odwiruj porcje komórek w ilości 400 g przez pięć minut. Następnie dodaj obliczoną objętość żelu matrycowego do osadu komórkowego i wymieszaj z delikatnym pipetowaniem, aby nie powstała piana, ponieważ nie można wstrzyknąć pęcherzyków powietrza.
Teraz trzymaj preparaty na lodzie, aż myszy będą gotowe do wstrzyknięcia. Po znieczuleniu myszy izofluranem i potwierdzeniu stanu znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi, przymocuj mysz do systemu bez ponownego oddychania dostarczającego izofluran i umieść ją na poduszce grzewczej, brzuszną stroną do dołu. Teraz usuń około centymetra kwadratowego włosów z obu bocznych tylnych obszarów.
Następnie przetrzyj odsłoniętą skórę do czysta za pomocą 70% alkoholu. Następnie załaduj jeden mililitr przygotowanego roztworu komórkowego do schłodzonej strzykawki, co wystarcza na cztery zatyczki. Aby wykonać wstrzyknięcie, należy unieść skórę z tyłu, aby zlokalizować przestrzeń podskórną.
Następnie powoli wstrzyknij 200 mikrolitrów równomiernie w przestrzeń podskórną za klatką piersiową i powoli wyjmij igłę, aby zapobiec wyciekowi. Po wstrzyknięciu w miejscu tego miejsca utworzy się guz. Przetrzyj miejsce alkoholem, a następnie obrysuj guzek trwałym markerem, aby można go było później znaleźć.
Następnie powtórz procedurę wstrzykiwania po drugiej stronie myszy. Należy pamiętać, aby wstrzyknąć wszystkie komórki w ciągu trzech minut, w przeciwnym razie zaczną przyklejać się do strzykawki. Etap wstrzykiwania ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że korek żelowy z matrycą utworzy się między warstwami skóry i mięśni, tak aby czop zachował dobry kształt i nie uległ dyfuzji.
Przed przystąpieniem do wstrzykiwania następnej myszy, pozwól myszy, której wstrzyknięto pomoc, pozostać na poduszce grzewczej przez minutę, aby dać matrycy czas na żelowanie. Po eutanazji ustaw mysz na etapie operacyjnym. Po usunięciu odrastających włosów z miejsca wstrzyknięcia, należy odnaleźć linie znaczników, które identyfikują położenie zatyczki.
Następnie za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie wzdłuż zaznaczonej granicy zatyczki, prostopadle do skóry i przez mięsień pod spodem. Ostrożnie wytnij na obwodzie zaznaczonej granicy. Następnie wyjmij zatyczkę, trzymając ją wciśniętą między warstwę skóry i mięśni.
Natychmiast spłucz zatyczkę w małej zlewce PBS, aby usunąć krew. Następnie umieść całą wtyczkę w 50-mililitrowej tubie z 25 mililitrami 4% paraformaldehydu. Pozwól mu utrwalić się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny bez mieszania.
Następnego dnia przenieś zatyczki do 25 mililitrów 70% etanolu na 24 godziny. Następnie przystąp do zatapiania parafiny. Skrawki czopów zawierających tylko komórki śródbłonka pokazują, że niektóre naczynia nie ulegają perfuzji z krwią gospodarza po 14 dniach in vivo.
Natomiast czopy zawierające zarówno komórki śródbłonka, jak i pasożyty, wykazują wiele perfundowanych naczyń po 14 dniach in vivo. Te czopy mają komórki, które są dodatnie dla barwienia aktyny mięśni gładkich, widoczne na czerwono, bezpośrednio przylegające do komórek śródbłonka CD31-dodatnich, widoczne na zielono. Dlatego pasożyty mogą odgrywać istotną rolę w powstających naczyniach krwionośnych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować tę potężną technikę in vivo do badania tworzenia naczyń krwionośnych w wielu typach komórek. Technika ta utoruje naukowcom drogę do zbadania różnych tematów biologii naczyniowej w modelach mysich. Zgodnie z tą procedurą można również uruchomić inne metody, takie jak ilościowy PCR i zachodnia immunoblotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiany w ekspresji genów i proteomika.
Ta potężna technika pozwoli badaczowi na badanie in vivo, w jaki sposób komórki śródbłonka i pasożyty oddziałują na siebie podczas tworzenia naczyń krwionośnych. Co jest kluczowym krokiem w androgenezie. Ta potężna technika pozwoli również badaczowi na badanie innych interakcji komórka-komórka, które są istotne dla zrozumienia chorób naczyniowych, takich jak między innymi nadciśnienie płucne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę badania oddziaływań między ludzkimi komórkami śródbłonka a perycytami in vivo z wykorzystaniem testu angiogenezy w zatyczkach z żelu matrycowego. Celem testu jest wyjaśnienie szlaków sygnalizacyjnych uczestniczących w tworzeniu naczyń krwionośnych oraz identyfikacja genów związanych z zaburzeniami naczyniowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Angiogeneza
- Interakcje komórkowe
- Biologia naczyniowa
Wstęp
- Interakcja między komórkami śródbłonka a perycytami jest kluczowa dla stabilności naczyń krwionośnych.
- Zrozumienie tych oddziaływań może dostarczyć cennych informacji na temat zaburzeń naczyniowych.
- Test z zatyczką z żelu matrycy umożliwia obserwację tych procesów in vivo.
- Poprzednie badania podkreśliły znaczenie szlaków sygnalizacyjnych w angiogenezie.
Cel badania
- Badanie oddziaływań między komórkami śródbłonka a perycytami.
- Identyfikacja szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w proces tworzenia naczyń krwionośnych.
- Analiza genów, których dysfunkcja może prowadzić do zaburzeń naczyniowych.
Zastosowane metody
- Analiza w żelu macierzy in vivo.
- Hodowla ludzkich komórek śródbłonka i perycytów.
- Obserwacja tworzenia naczyń krwionośnych.
- Analiza szlaków sygnalizacyjnych i ekspresji genów.
Główne wyniki
- Skuteczne ustanowienie oddziaływań między komórkami śródbłonka a perycytami in vivo.
- Identyfikacja kluczowych szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w angiogenezę.
- Wgląd w geny związane z zaburzeniami naczyniowymi.
- Wykazanie zalet testu z wykorzystaniem zatyczki z żelu macierzy (matrix gel plug assay).
Wnioski
- Analiza z użyciem zatyczek żelowych o strukturze macierzy jest skuteczną metodą badania oddziaływań między komórkami śródbłonka a perycytami.
- Uzyskane wyniki przyczyniają się do zrozumienia procesu tworzenia naczyń krwionośnych.
- Potencjalne implikacje dla strategii terapeutycznych ukierunkowanych na zaburzenia naczyniowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test z wykorzystaniem zatyczki z żelu macierzyowego in vivo wypełnia istotną lukę w badaniach nad angiogenezą, umożliwiając analizę interakcji między ludzkimi komórkami śródbłonka a perycytami w fizjologicznym mikrośrodowisku, co jest niezbędne do zmniejszenia ryzyka podczas walidacji celów naczyniowych oraz zwiększenia pewności prognostycznej w modelach przedklinicznych. Test ten wspiera badania mechanistyczne nad dojrzewaniem naczyń krwionośnych i rekrutacją perycytów, zapewniając znaczenie translacyjne dla schorzeń naczyniowych płuc oraz układowych. Uzupełnia on istniejące systemy in vitro, dostarczając funkcjonalnych odczytów, takich jak tworzenie perfundowanych naczyń i stopień pokrycia perycytami, które mają bezpośrednie zastosowanie w procesach walidacji celów i identyfikacji związków wiodących w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących sygnalizacji między komórkami śródbłonka a perycytami w procesie dojrzewania naczyń.
- Wartość operacyjna: Zapewnia model istotny z punktu widzenia jednostki chorobowej do oceny związania z celem oraz modulacji szlaków in vivo.
- Wartość naukowa: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie funkcjonalnej roli perycytów w stabilności i perfuzji naczyń.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki oparte na histologii, w tym długość, liczbę i rozmiar naczyń oraz stopień pokrycia perycytami, do analizy porównawczej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ustandaryzowane, powtarzalne odczyty naczyniowe, odpowiednie do walidacji testów i kaskad przesiewowych związków chemicznych.
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszej oceny kandydatów o działaniu angiogennym lub antyangiogennym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje model istotny dla schorzeń, pozwalający na badanie zaburzeń naczyniowych, takich jak nadciśnienie płucne, poprzez wszczepienie ludzkich komórek myszom z niedoborem odporności.
- Wartość operacyjna: Ułatwia dostosowanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie stopnia pokrycia perycytami i dojrzewania naczyń z wynikami funkcjonalnymi.
- Wartość naukowa: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych, umożliwiając ocenę interwencji genetycznych lub farmakologicznych w procesie tworzenia sieci naczyniowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – w szczególności w programach biologii naczyniowej wymagających funkcjonalnej walidacji mechanizmów angiogennych lub stabilizujących naczynia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie obserwacji interakcji między komórkami śródbłonka a perycytami w żywym mikrośrodowisku.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanemu tworzeniu zatyczek, fiksacji i sekcjonowaniu w celu ilościowej analizy histologicznej.
- Analityka: Dostarcza wyników morfometrycznych i perfuzyjnych (rozmiar i liczba naczyń, stopień pokrycia perycytami, światła naczyń zawierające RBC), które umożliwiają porównawczą ocenę warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie ludzkich interakcji naczyniowych in vivo, istotnych dla angiogenezy płucnej i systemowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Służy jako platforma wielokrotnego użytku w badaniach genetycznych, analizie szlaków oraz kampaniach poszukiwania leków ukierunkowanych na cele naczyniowe.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w walidacji celów naczyniowych dzięki bezpośredniej obserwacji dojrzewania naczyń zależnego od perycytów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym proporcjom komórek, przygotowaniu żelu macierzy oraz protokołom ilościowej analizy histologicznej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie funkcjonalnych danych o dojrzewaniu naczyń na wcześniejszym etapie procesu odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów naczyniowych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o rekrutację perycytów i funkcjonalność naczyń in vivo.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie pierwotnych hodowli ludzkich komórek, sterylnych technik chirurgicznych oraz obróbki histologicznej.
- Zależny od modeli myszy z niedoborami odporności (np. SCID) oraz dostępu do żelu macierzy (matrix gel), markerów perfuzji i odczynników immunohistochemicznych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania komórek, powtarzalności iniekcji oraz ślepej analizy histologicznej.
- Kwestie adaptacyjne obejmują gatunkowo specyficzne źródła komórek, typy perycytów oraz testowanie związków angiogennych w porównaniu z antyangiogennymi.
- Ograniczenia praktyczne obejmują 14-dniowy czas trwania testu, zmienność w odzyskiwaniu zatyczek (plugs) oraz poleganie na końcowej analizie histologicznej zamiast obrazowania w czasie rzeczywistym.
