Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Celem tej interwencji chirurgicznej jest wyjaśnienie mechanizmów indukcji kończyn u zarodka kurczaka poprzez zapobieganie dyfuzji cząsteczek sygnałowych z tkanek przyśrodkowych do komórek w mezodermie płytki bocznej oraz badanie wpływu tego procesu na ekspresję genów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak to, jakie sygnały indukcyjne kontrolują inicjację pączka kończyny. Zaletą tej techniki jest fakt, że zarodek kurczaka jest dostępny do manipulacji chirurgicznych i bardzo odporny; ponadto nieoperowany, przeciwległy pączek kończyny kontrolnej służy jako bardzo użyteczna kontrola wewnętrzna.

Susan Wilde zaprezentuje procedurę. Aby rozpocząć, wytnij kwadratowy kawałek folii aluminiowej o boku 1 cm i grubości 0,013 mm, a następnie wysterylizuj go, przecierając 70% etanolem. Następnie umieść kwadrat w sterylnym, plastikowym naczyniu Petri o średnicy 6 cm.

Aby zapobiec przywieraniu elektrostatycznemu, należy usunąć pokrywkę i wykonać nową do szalki z tej samej folii. Następnie szalkę Petriego należy umieścić na siatce przedmiotowej pod mikroskopem binokularnym ustawionym na powiększeniu 1,6x. Za pomocą małego skalpela z ostrzem nr 15 należy wyciąć z folii paski o szerokości 1,3 mm i długości 2 mm.

Rozdziel paski folii za pomocą dwóch par pęset zegarmistrzowskich nr 4. Następnie wykonaj w centrum bariery z folii zgięcie pod kątem prostym, tak aby przypominała zawias. Ustaw bariery w centrum szalki Petriego tak, aby jedna strona przylegała płasko do szalki, a druga była skierowana do góry, poza szalkę; przygotuj 20 lub więcej barier przed dniem operacji.

Przykryj naczynie pokrywką z folii i przechowuj bariery w miejscu, w którym nie będą one przeszkadzane. Trzymając jajko na boku, mocno chwyć pęsetę typu AA (strong forceps) i kontrolowanym ruchem przebij tępe koniec jajka, w którym znajduje się komora powietrzna, przytrzymując jajko wolną ręką. Upewnij się, że wewnętrzna błona skorupki została przerwana.

Następnie chwyć jajo obiema rękami i obróć je o 180 stopni wzdłuż osi poziomej. Potem weź kawałek przezroczystej taśmy o wymiarach około 5 cm x 5 cm i naklej go ściśle na górnej powierzchni jaja, aby zapobiec kruszeniu się skorupki na embrion podczas otwierania jaja. Używając zakrzywionych nożyczek, delikatnie przebij skorupkę oraz powiązane z nią wewnętrzne błony komórkowe w centrum górnej części jaja.

Za pomocą jednego ramienia nożyczek wykonaj bardzo mały otwór, aby powietrze mogło dostać się do jaja nad embrionem. Użyj nożyczek, aby powiększyć otwór w skorupce do koła o średnicy około 1 cm. Usuń ten fragment skorupki z jaja.

Zakryj otwór w jajku kawałkiem przezroczystej taśmy o wymiarach około 5 cm kwadratu. Przyciśnij taśmę tak, aby przykleiła się tylko do krawędzi otworu, pozostawiając resztę taśmy wolną. Wolną część taśmy można następnie chwycić, aby łatwo odbezpieczyć jajko.

Wyjmij zarodek w stadium 15 z inkubatora i umieść jajo na podstawce pod mikroskopem binokularowym ustawionym na powiększenie 3,2x lub większe. Następnie usuń górną warstwę przezroczystej taśmy. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witelinową i boczny mezoderm lakralny sąsiadujący z somitami 26-32 po prawej stronie zarodka.

Chwyć barierę za jeden koniec za pomocą mikropincety nr 5 i skręć ją, aby wprowadzić wolny koniec do nacięcia. Jak najszybciej zabezpiecz jajo przezroczystą taśmą i przenieś je z powrotem do inkubatora. Jeśli wraz z barierą ma zostać wprowadzony koralik, należy najpierw przygotować koraliki nasączone kwasem retinowym zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Następnie, za pomocą mikropincety nr 5, umieść kuleczkę w przekroju mezodermy płytki bocznej po stronie dystalnej nacięcia. Następnie wsuń barierę do nacięcia proksymalnie względem kuleczki. Zamknij jajko i niezwłocznie przenieś je z powrotem do inkubatora.

Jeśli koralik lub koraliki mają zostać wprowadzone bez bariery, nie należy wykonywać długiego nacięcia. Zamiast tego należy wykonać niewielkie nacięcie przez błonę żółtkową do mezodermy płytki bocznej w miejscu, w którym ma zostać umieszczony koralik. Następnie, używając mikropincety nr 5, należy chwycić koralik i wprowadzić go w otwór w mezodermie płytki bocznej.

Wcisnąć go nieco głębiej za pomocą zamkniętych końców pęsety. Wyjąć z inkubatora embrion dziesiątego stopnia rozwoju z oknem w skorupce i umieścić jajo na podstawce do jaj pod mikroskopem binokularnym ustawionym na powiększenie 3,2x lub wyższe, jeśli jest to preferowane. Następnie, używając stalowego mikronoża, wykonać nacięcie przez błonę witelinową i mezodermę płyty bocznej, bocznie od prążka pierwotnego wyrostka ogonowego embrionu w linii z somytami, na długości około sześciu somytów.

Następnie, za pomocą mikropincety nr 5, chwyć barierę w miejscu wystającym poza szalkę Petriego i przekręć dłonią, aby wprowadzić wolny koniec bariery do nacięcia. Jak najszybciej zabezpiecz jajo przezroczystą taśmą i przenieś je z powrotem do inkubatora. Jeśli koralik ma zostać wprowadzony bez bariery, wykonaj niewielkie nacięcie przez błonę witelinową do mezodermy płytki bocznej w miejscu, w którym koralik ma zostać umieszczony.

Następnie weź kuleczkę i mikro-pincetę nr 5 i wprowadź ją w otwór w mezodermie płyty bocznej. Na koniec dociśnij ją nieco głębiej za pomocą zamkniętych końcówek pincety. Przedstawione tutaj jest położenie bariery na poziomie zakładkowej kończyny w somitach 26-32 u embrionu w stadium 15.

Bariera ta prowadzi do braku ekspresji zarówno Fhf10, jak i Fhf8 w regionie pąka kończyny po stronie operowanej, przy jednoczesnym występowaniu ekspresji po nieoperowanej lewej stronie. Jednakże ekspresja Tbx4 jest obserwowana zarówno w stadium 19, jak i stadium 23 po stronie operowanej. Sugeruje to, że sama ekspresja Tbx4 nie jest wystarczająca do zainicjowania wzrostu kończyny tylnej z lpm.

Gdy koraliki nasączone kwasem retinowym zostaną umieszczone dystalnie względem bariery w stadium 15, Tbx4, Fgf10 i Fgf8 ulegają ekspresji po stronie operowanej, tak samo jak po lewej stronie kontrolnej. Zatem w normalnym rozwoju kwas retinowy pochodzący z somytów jest niezbędny do zainicjowania wzrostu pączka kończyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania nieprzepuszczalnych barier oraz koralików nasączonych czynnikami kandydackimi do badania wpływu sygnałów indukcyjnych na inicjację pączka kończyny w embrionie kurczaka.