Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku
17 listopada 2016
Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.
Celem tej interwencji chirurgicznej jest wyjaśnienie mechanizmów indukcji kończyn w zarodku pisklęcia poprzez zapobieganie dyfuzji cząsteczek sygnałowych z tkanek przyśrodkowych do komórek w mezodermie płytki bocznej i zbadanie jej wpływu na ekspresję genów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak, jakie są sygnały indukcyjne kontrolujące inicjację pąków kończyn. Zaletą tej techniki jest to, że zarodek pisklęcia jest dostępny do manipulacji chirurgicznej i bardzo wytrzymały, a ponadto nieobsługiwany zawiązek kończyny kontrolnej przeciwległej służy jako bardzo przydatna kontrola wewnętrzna.
Susan Wilde zademonstruje procedurę. Na początek wytnij kwadratowy kawałek folii aluminiowej o grubości 1,013 mm i wysterylizuj go, przecierając go 70% etanolem. Następnie umieść kwadrat na sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 6 cm.
Aby zapobiec przywieraniu ładunków elektrostatycznych, wyrzuć pokrywkę i zrób nową dla naczynia z tej samej folii. Następnie umieść szalkę Petriego na siatce stolika pod mikroskopem dwuokularowym ustawionym na powiększenie 1,6x. Użyj małego skalpela z ostrzem 15, aby przeciąć paski folii o szerokości 1,3 mm i długości 2 mm.
Oddziel paski folii za pomocą dwóch par kleszczyków zegarmistrzowskich numer cztery. Następnie wykonaj zagięcie pod kątem prostym na środku bariery foliowej, tak aby przypominała zawias. Ustaw bariery na środku szalki Petriego tak, aby jedna strona przylegała płasko do naczynia, a druga była skierowana do góry z naczynia, przygotuj 20 lub więcej barier przed dniem operacji.
Umieść foliową pokrywkę na naczyniu i przechowuj barierki w miejscu, w którym nie będą przeszkadzać. Gdy jajko leży na boku, chwyć mocno parę mocnych kleszczy typu AA i użyj kontrolowanego ruchu kłującego, aby przebić koniec jajka zawierającego worek powietrzny, trzymając jajko wolną ręką. Upewnij się, że membrana wewnętrznej powłoki została uszkodzona.
Następnie weź jajko w obie ręce i obróć je o 180 stopni wzdłuż osi poziomej. Następnie weź kawałek przezroczystej taśmy o boku około 5 cm kwadratowych i przyklej go ściśle do najwyższej powierzchni jaja, aby zapobiec rozpadaniu się skorupki jajka na zarodek po otwarciu jaja. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby delikatnie przebić się przez skorupkę i związane z nią wewnętrzne błony komórkowe w środku najwyższej części jaja.
Zrób bardzo mały otwór jednym ostrzem nożyczek, aby powietrze mogło dostać się do jaja nad zarodkiem. Za pomocą nożyczek powiększ otwór w skorupie do koła o średnicy około 1 cm. Usuń ten kawałek skorupki wielkości jajka z jajka.
Przykryj otwór w jajku kawałkiem przezroczystej taśmy o boku około 5 cm kwadratowych. Dociśnij taśmę, aby przykleić ją tylko na krawędzi otworu, pozostawiając pozostałą taśmę wolną. Wolną taśmę można następnie chwycić, aby łatwo rozpieczętować jajko.
Weź zarodek w stadium 15 z inkubatora i umieść jajo na podpórce pod mikroskop dwuokularowy ustawiony na powiększenie 3,2x lub większe. Następnie usuń górną warstwę przezroczystej taśmy. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witeliny i umieść boczną mezodermę przylegającą do somitów 26-32 po prawej stronie zarodka.
Podnieś barierę za pomocą mikrokleszczyków numer 5 na jednym końcu i przekręć barierę, aby włożyć wolny koniec do nacięcia. Tak szybko, jak to możliwe, zaklej jajo przezroczystą taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora. Jeśli koralik ma być wstawiony w połączeniu z barierą, najpierw przygotuj kulki nasączone kwasem retinowym zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Następnie weź koralik i parę mikrokleszczyków numer 5 i włóż je w przeciętą powierzchnię mezodermy w bocznym miejscu po dystalnej stronie nacięcia. Następnie włóż barierę do nacięcia proksymalnie do stopki. Zamknij jajo i niezwłocznie włóż je z powrotem do inkubatora.
Jeśli koralik lub koraliki mają być włożone bez bariery, nie należy wykonywać długiego nacięcia. Zamiast tego wykonaj małe nacięcie przez błonę witeliny i w mezodermie płytki bocznej w miejscu, w którym ma być umieszczony koralik. Następnie weź koralik i mikrokleszczyki numer 5 i włóż je do otworu w mezodermie płytki bocznej.
Wepchnij go trochę dalej za pomocą zamkniętych końców kleszczy. Weź z inkubatora zarodek w wieku dziesiątym i umieść komórkę jajową na podpórce pod mikroskopem dwuokularowym ustawionym na powiększenie 3,2x lub większe, jeśli wolisz. Następnie, za pomocą stalowego mikronoża, wykonaj nacięcie przez błonę witelinową i mezodermę płytki bocznej, boczną do pierwotnej smugi na ogonowym końcu zarodka w linii z somitami, o długości około sześciu długości somitów.
Następnie podnieś barierę za pomocą pary mikrokleszczyków numer 5, na końcu wystającym z szalki Petriego i przekręć rękę, aby włożyć wolny koniec bariery w nacięcie. Tak szybko, jak to możliwe, zaklej jajo przezroczystą taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora. Jeśli koralik ma być włożony bez bariery, należy wykonać małe nacięcie przez błonę witeliny i mezodermę płytki bocznej w miejscu, w którym koralik ma być umieszczony.
Następnie weź koralik i parę mikrokleszczyków numer 5 i włóż je do otworu w mezodermie płytki bocznej. Na koniec wepchnij go nieco dalej za pomocą zamkniętych końców kleszczy. Pokazano tutaj pozycję bariery na przypuszczalnym poziomie nóg somitów 26-32 w zarodku w stadium 15.
Ta bariera prowadzi do tego, że ekspresja Fhf10 i Fhf8 jest nieobecna w okolicy pąka nogi po stronie operowanej i obecna po nieoperowanej lewej stronie. Jednak ekspresję Tbx4 obserwuje się zarówno w stadium 19, jak i 23 po stronie operowanej. Oznacza to, że sama ekspresja Tbx4 nie jest wystarczająca do zainicjowania wyrastania kończyn tylnych z lpm.
Gdy kulki nasączone kwasem retynowym są umieszczane dystalnie do bariery na etapie 15, Tbx4, Fgf10 i Fgf8 są wyrażane po stronie operowanej, tak jak po lewej stronie kontrolnej. Tak więc, w normalnym rozwoju, kwas retinowy z somitów jest niezbędny przed zainicjowaniem wzrostu pąków kończyn. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać nieprzepuszczalnych barier i kandydatów nasączonych koralikami fakultatywnymi, aby zbadać, w jaki sposób sygnały indukcyjne regulują inicjację zawiązków kończyn w zarodku pisklęcia.
Przegląd
Ten artykuł opisuje interwencję chirurgiczną w celu zbadania mechanizmów indukcji kończyn u zarodków kurcząt poprzez blokowanie dyfuzji cząsteczek sygnałowych. Szczegółowo opisano zastosowanie nieprzepuszczalnych barier i sygnałów indukcyjnych za pomocą koralików, wraz z analizą ekspresji genów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia rozwoju
- Embriologia
- Transdukcja sygnału
Tło
- Rozumienie formowania kończyn jest kluczowe w biologii rozwoju.
- Zarodki kurcząt są dostępne do manipulacji chirurgicznej.
- Sygnały indukcyjne odgrywają kluczową rolę w inicjacji pączka kończyn.
- Analiza ekspresji genów pomaga wyjaśnić procesy rozwojowe.
Cel badania
- Zbadać rolę cząsteczek sygnałowych w indukcji kończyn.
- Ocenić wpływ barier na ekspresję genów w zarodkach kurcząt.
- Zidentyfikować sygnały indukcyjne niezbędne do formacji pączka kończyn.
Zastosowane metody
- Przygotowanie barier z folii aluminiowej do interwencji chirurgicznej.
- Wstawienie koralików nasączonych kwasem retinowym do badania ekspresji genów.
- Rozcięcia w błonie żółtkowej i bocznej płytce mezodermy.
- Analiza ekspresji genów Tbx4, Fgf10 i Fgf8 w operowanych zarodkach.
Główne wyniki
- Bariery zapobiegają ekspresji Fgf10 i Fgf8 w operowanym pączku kończyn.
- Ekspresja Tbx4 jest obecna zarówno w operowanych, jak i nieoperowanych stronach.
- Kwas retinowy jest niezbędny do inicjacji wzrostu pączka kończyn.
- Metoda pozwala na kontrolowane badania rozwoju kończyn.
Wnioski
- Technika chirurgiczna skutecznie izoluje ścieżki sygnałowe w indukcji kończyn.
- Wyniki analizy ekspresji genów podkreślają znaczenie kwasu retinowego.
- To podejście zapewnia wgląd w mechanizmy rozwojowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dissecting inductive signaling in vertebrate development is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The impermeable barrier and candidate factor bead approach in chick embryos enables precise isolation of signaling pathways, supporting predictive confidence in pathway assignment. This method informs portfolio decisions by clarifying the causal role of candidate signals in tissue induction and organogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of candidate signaling pathways in a manipulable vertebrate model.
- Supports functional validation of pathway involvement in tissue induction and organogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the effects of specific factors such as retinoic acid.
- Provides internal controls via contralateral unoperated tissue for robust comparative analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream gene expression analysis.
- Enables reproducible manipulation of signaling environments for quantitative readouts.
- Supports assay standardization by controlling for spatial and temporal delivery of candidate factors.
- Prepares the system for reliable evaluation of pathway modulators or inhibitors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental pathway interrogation with disease-relevant tissue induction models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of signaling targets.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying pathway necessity and sufficiency in organogenesis.
- Supports translational biomarker identification through gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and target validation stage, bridging hypothesis testing and preclinical model development for tissue induction pathways.
- Discovery Biology: Isolates and tests the necessity of candidate signals in tissue induction, supporting pathway clarification.
- Screening: Provides a reproducible system for quantitative gene expression analysis following pathway manipulation.
- Analytics: Enables direct measurement of gene expression changes (e.g., Tbx4, Fgf10, Fgf8) in response to pathway perturbation.
- Translational Research: Connects developmental pathway findings to organogenesis and potential disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for interrogating diverse inductive cues across multiple tissues and developmental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathway assignment and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable manipulation of signaling environments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic requirements for tissue induction.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of signaling targets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological microsurgery and gene expression analysis.
- Needs access to stereomicroscopy, microdissection tools, and in situ hybridization infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for barrier placement and bead delivery.
- Adaptable to other accessible embryonic tissues and developmental stages.
- Limited to systems where spatial separation of tissues is feasible and gene expression can be robustly measured.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Create Barriers from Aluminum Foil
2:08
'Window' the Incubated Chicken Eggs
3:35
Barrier to Prevent Leg Bud Initiation and Bead Operations at Stage 15
5:20
Barrier to Prevent Leg Bud Induction and Initiation at Stage 10
6:34
Results: Retinoic Acid from the Somites Is Essential for Limb Bud Outgrowth
7:36
Conclusion
