Name: Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj technikę chirurgiczną z barierami nieprzepuszczalnymi i kulkami nasączonymi kwasem retinowym do badania mechanizmów indukcji kończyn w zarodku kurzego. Metoda pozwala analizować ekspresję genów Tbx4, Fgf10 i Fgf8.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez grant MRC MC.PC_13052.

<ol><li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li>
<li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li>
<li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li>
<li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li>
<li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos%3A+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li>
<li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li>
<li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li>
<li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li>
<li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li>
<li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li>
<li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt%2FFgf+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li>
<li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing%3A+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li>
<li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li>
<li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li>
<li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zone+of+polarizing+activity%3A+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li>
<li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Devel%22%5BJournal%5D)">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy zastosowanie nieprzepuszczalnych barier zapobiegających tworzeniu się zawiązków kończyn w zarodku pisklęcia. Ta technika składa się z kilku krytycznych kroków. Po wstępnych eksperymentach stwierdziliśmy, że bariery w kształcie zawiasów zastosowane w 9, 10 pozostają na swoim miejscu w zarodku znacznie lepiej niż bariery proste. Dystalna płaska strona bariery przylega do błony witelinowej i utrzymuje barierę na miejscu (rysunek 2C'). Staranne przygotowanie barier w kształcie zawiasów z folii aluminiowej, jak opisano w kroku 1.6 protokołu, ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia operacji. Drugim ważnym krokiem jest upewnienie się, że jaja nie są pozostawione poza inkubatorem zbyt długo po oknierzeniu i ocenie stopnia zaawansowania przed operacją na zarodku. Z naszego doświadczenia wynika, że zarodki lepiej przeżywają operację, jeśli w momencie przeprowadzania operacji znajdują się w temperaturze inkubacji lub w jej pobliżu. W związku z tym operacje powinny być przeprowadzane tak szybko, jak to możliwe, a jaja powinny być niezwłocznie ponownie zamykane, aby zapewnić dobre wskaźniki przeżycia. Wielu badaczy dodaje kroplę antybiotyków do zarodka po mikrooperacji przed powrotem jaj do inkubatora. Obecność cieczy uniemożliwiała dobre przyleganie barier na miejscu. Dodanie antybiotyku może również usunąć kulki po umieszczeniu. Dlatego zaleca się niestosowanie antybiotyków, szybkie operacje i dobrą czystość narzędzi, aby uniknąć infekcji. Wycieranie narzędzi 70% etanolem po każdym etapie operacji jest niezbędne, aby zapobiec lepkości narzędzi w kontakcie z membraną witelinową, co może powodować przyleganie zarówno barier, jak i kulek do kleszczy (patrz krok protokołu 3.1.2.2). Obie odmiany użytych koralików mogą wypaść na miejsce po operacji. Kiedy następnego dnia sprawdzono położenie bariery, nie było możliwe zajrzenie przez barierę, aby upewnić się, czy stopka pozostała na swoim miejscu, czy nie. W przypadkach, gdy koralik wypadł, wyrostek pąka skrzydłowego nie został uratowany (tab. 1). Unikanie przenoszenia płynu wraz ze stopką podczas ich implantacji oznacza, że koraliki łatwiej przyklejają się do przeciętej powierzchni LPM (patrz protokół 2.3.2.3). Wreszcie, zapewnienie, że zarodki zostaną utrwalone natychmiast po pobraniu, ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej późniejszej analizy ekspresji genów (patrz krok 4.2 protokołu).
Protokół ten modyfikuje wcześniej opublikowane eksperymenty, w których wykorzystywano bariery zapobiegające inicjacji pąków kończyn, określa określone optymalne szerokości barier i wprowadza łączenie umieszczania barier i koralików, a następnie analizę ekspresji genów. Odkryliśmy, że użycie konwencjonalnej folii aluminiowej, która jest tania i łatwo dostępna we wszystkich laboratoriach, daje wyniki równe tym, które wcześniej stosowano przy użyciu folii tantalowej. Folię można pozostawić w zarodku podczas przeprowadzania hybrydyzacji in situ (ryc. 2C'), ale zwykle usuwamy ją, jeśli przetwarzany jest więcej niż jeden zarodek, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków przez ostre krawędzie folii. Badania pilotażowe wykazały, że szczególnie ważna jest szerokość barier w obszarze nóg. Początkowo testowane bariery były zbyt krótkie, a wyrastanie pąków nóg nie zostało zapobieżone. 1,2-1,3 mm to optymalna szerokość, aby bariera całkowicie zablokowała wyrastanie pąków nóg. Najwęższe bariery na skrzydłach, które można dokładnie umieścić, aby zapobiec wyrastaniu pąków, zapewniają najlepsze wskaźniki przeżycia. Może to być nawet 0,5-0,7 mm. Jednak bariery, które są nieco szersze, z większym prawdopodobieństwem spowodują całkowite zablokowanie wyrastania pąków skrzydeł, ponieważ pozwalają na niewielką niedokładność umieszczenia (użyliśmy 0,7-1 mm). Unikanie naczyń krwionośnych podczas wykonywania nacięcia ma kluczowe znaczenie dla barier na poziomie pąków skrzydeł. Bariery półprzepuszczalne były wcześniej używane do przecinania pąka kończyn piskląt. MacCabe i Parker, 1976 i Summerbell, 1979 używali filtrów o wielkości porów 0,45 μm i 0,8 μm, odpowiednio 16, 17. Stwierdzili, że sygnały dyfuzyjne mogą przechodzić przez pory w filtrach i że wyniki uzyskane przy użyciu barier półprzepuszczalnych znajdowały się w połowie drogi między pąkiem kończyny bez bariery a pąkiem z nieprzepuszczalnej folii tantalowej. Protokół ten można dostosować do wykorzystania półprzepuszczalnych barier o różnej wielkości porów w celu różnicowania sygnałów kandydujących na podstawie rozmiaru lub modyfikowania dynamiki dyfuzji sygnału.
Protokół ten ma różne ograniczenia, związane głównie z samym organizmem modelowym. Takie techniki mogą być wykorzystane do zbadania dalszych pytań dotyczących rozwoju kończyn, a także innych kwestii związanych z embriogenezą kręgowców. Zastrzeżenie jest takie, że dany narząd/obszar powinien się rozwijać, gdy zarodek pisklęcia jest dostępny do interwencji. Obecność dużych naczyń krwionośnych w obszarze, w którym należy umieścić barierę, sprawia, że umieszczenie bariery później niż na etapie 13 lub 14 jest technicznie trudne. Jeśli duże naczynia krwionośne zostaną przecięte podczas umieszczania bariery, może to spowodować śmiertelność zarodków. Nasze badanie tego, kiedy czynniki transkrypcyjne Tbx5 i Tbx4 są po raz pierwszy indukowane w LPM, było ograniczone przez najwcześniejszy etap, na którym mogliśmy umieścić barierę, która później znalazłaby się naprzeciwko odpowiednio pąka skrzydła lub nogi. Pouczająca może być próba zablokowania indukcji genu Tbx na wcześniejszych etapach, bliżej gastrulacji. Najwcześniej udało się umieścić barierę w przypuszczalnym obszarze skrzydła w stadium 8, a w obszarze nóg w stadium 10. Protokół ten prawdopodobnie nie nadaje się do badania ekspresji genów poza stadiami zawiązków kończyn, ponieważ późniejszy szybki wzrost spowodowałby przemieszczenie bariery, a wyniki odnosiłyby się tylko do początkowej pozycji bariery.
Odnosząc się w tym kontekście do ograniczeń zarodka pisklęcia, można stwierdzić, że jego zalety w porównaniu z innymi modelowymi organizmami kręgowców są liczne. Zarodek pisklęcia jest bardzo odpowiednim modelem zwierzęcym do tego typu fizycznej interwencji w zarodku kręgowców. Zarodki są stosunkowo duże i łatwo dostępne przez skorupkę jaja. Można wrócić do zarodka w celu dalszych eksperymentów (np. usunięcia koralika 18 lub nawet bariery) lub sprawdzić postępy, po prostu usuwając okienko taśmy. Możliwy jest zakres obrazowania na żywo lub obrazowania poklatkowego. Opisujemy metodę okienkowania jaj kurzych, która jest szczególnie odpowiednia do operacji na zarodkach we wczesnym stadium. W przypadku badań kończyn bardzo ważne i pomocne jest, aby dla każdego eksperymentu istniała przeciwległa kończyna kontrolna, która służy jako idealna kontrola wewnętrzna dla każdej repliki biologicznej.
Połączenie stosowania nieprzepuszczalnych barier zapobiegających rozrastaniu się kończyn i koralików nasączonych cząsteczkami sygnałowymi nie zostało wcześniej zgłoszone. Nasza analiza ekspresji mRNA po takich interwencjach jest również nowatorska. Techniki te pozwoliły nam przeanalizować trudny problem, kiedy czynniki transkrypcyjne specyficzne dla kończyn Tbx5 i Tbx4 są indukowane w LPM, a także wykazać, że później, przed inicjacją zawiązków kończyn, obecność tych genów Tbx w LPM nie jest wystarczająca do aktywacji transkrypcji Fgf10 i rozpoczęcia wzrostu pąków kończyn. Rysunki 2G, 2D i 2E dobrze ilustrują te ustalenia. Brak ekspresji Tbx4 po wstawieniu bariery na etapie 10 na rysunku 2G jest w wyraźnym kontraście z jej obecnością w 2D i 2E po indukcji bariery na etapie 15, po indukcji Tbx4. Implantacja kulek nasączonych RZS ułatwiła uratowanie inicjacji zawiązków kończyn po wprowadzeniu bariery, a zatem wskazuje na to, że RZS z somitów jest niezbędne w LPM, zanim zacznie się wyrastanie pąków kończyn. Takie techniki mogą być wykorzystane do rozwiązania dalszych problemów związanych z rozwojem kończyn, ale także innych kwestii związanych z embriogenezą kręgowców. Obszary mózgu, oka i tułowia mogą być odpowiednie.

Klasyczni embriolodzy tradycyjnie stosowali techniki fizyczne do badania mechanizmów kontrolujących rozwój embrionalny. W latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych XX wieku badacze opracowali techniki, które wykorzystywały nieprzepuszczalne bariery umieszczone między tkankami rozwijającego się zarodka, aby zademonstrować znaczenie sygnałów indukcyjnych podczas embriogenezy. Interesuje nas rozwój kończyn kręgowców, a w szczególności to, jakie wydarzenia poprzedzają wyrastanie pąków kończyn. Na przykład wprowadzenie bariery może zapobiec wyrastaniu pąków kończyn po jednej stronie zarodka pisklęcia, umożliwiając jednocześnie normalny przebieg po przeciwnej, nieoperowanej stronie. Materiały użyte do wykonania tych barier były różne; Na przykład płytki mikowe 1 i folia tantalowa 2. Bariery te skutecznie oddzielają mezodermę płytki bocznej (LPM), z której tworzy się pączek kończyny, od somitów powstałych z mezodermy przyosiowej. Techniki przeszczepu chirurgicznego pokazują, że ścisły związek z somitami jest niezbędny, jeśli inicjacja zawiązków kończyn ma nastąpić w LPM 34. W latach 80. i 90. biolodzy rozwojowi odkryli dyfuzyjne cząsteczki sygnałowe, które są niezbędne do kontrolowania procesów rozwojowych. Koraliki nasączone tymi cząsteczkami sygnałowymi mogą być zagnieżdżane w określonych obszarach zarodka i powodować zmiany w rozwoju embrionalnym. Na przykład kwas retinowy (RA) pobierany przez kulki jonowymienne jest uwalniany w ciągu 24 godzin po wszczepieniu do zarodka pisklęcia i może powodować lustrzane odbicie cyfr 5. Akrylowe kulki heparyny zawierające białko FGF mogą inicjować wyrastanie pąków kończyn z międzykończynowego LPM 6.
Ostatnio genetyka myszy i ryb przeniosła badania nad inicjacją kończyn kręgowców w nową erę (przejrzane w 7). Istnieją dobre dowody na to, że RZS obecne w somitach przed inicjacją pąków kończyn jest niezbędnym sygnałem dyfuzyjnym wymaganym przez LPM do zainicjowania pączkowania kończyn. Chcieliśmy wykorzystać dostępność i solidność eksperymentalną zarodka pisklęcia, aby przeanalizować wpływ implantacji bariery na ekspresję genów w LPM w czasie inicjacji zawiązków kończyn. Nowatorską adaptacją naszej metody jest połączenie bariery, która blokuje sygnały z tkanek osiowych, z umieszczeniem koralików bocznie do bariery, aby egzogennie dostarczyć kandydujące czynniki endogenne, które zostały zablokowane przez barierę. Poniższe protokoły są tymi, które zostały opracowane w celu poznania mechanizmów indukcji i inicjacji zawiązków kończyn.
Badanie inicjacji zawiązków kończyn oznacza wykorzystanie zarodków we wczesnym stadium. Wielu badaczy bada jaja kurze, usuwając najpierw część albuminy przez worek powietrzny za pomocą igły podskórnej. Zarodek, który leży na żółtku, będzie następnie leżał niżej w jaju. Jest to zaleta niektórych technik, takich jak elektroporacja, ale może być wadą, jeśli pożądana jest chirurgiczna manipulacja zarodkiem. Uważamy, że posiadanie zarodka jak najbliżej otworu w jaju jest zaletą.
Pozostają pytania dotyczące sygnałów, które kontrolują indukcję i inicjację zawiązków kończyn kręgowców, a następujące protokoły są odpowiednie, aby je rozwiązać. Jako pierwsi opracowaliśmy protokół wprowadzania barier zapobiegających wyrastaniu pąków kończyn piskląt na etapie wcześniejszym niż stadium 12 8. Zmodyfikowane wersje tych protokołów mogą być również wykorzystane do odpowiedzi na inne pytania dotyczące pochodzenia i czasu sygnałów indukcyjnych, w których dostępna tkanka indukująca leży w sąsiedztwie indukowanego zawiązka. Zakładając, że obszar zarodka jest dostępny na odpowiednim etapie rozwoju, można umieścić barierę między dwiema tkankami i w konsekwencji badać zmiany w rozwoju. Przykłady można znaleźć w rozwoju mózgu, rozszerzeniu osi i ewentualnie rozwoju narządów, takich jak indukcja wątroby lub nerek.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze zegarmistrzowskie Dumont nr 5, x2</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zegarmistrzowskie Dumont nr 4, x2</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze mocne Dumont, typ AA</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione z ostrzami o długości</td> <td>2,5 cmNarzędzia naukowe&nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione z tępo zakończonym końcem, końce ok. 0,5&nbsp; cm długości</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Stalowy trzpień o szerokości 0,2 mm</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Kamień do ostrzenia, kwadratowy</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Olej</td><td></td><td></td><td></td>mineralny</tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Fine Science Tools&nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Taśma przezroczysta, 50 mm x 66&nbsp; m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>Białko</td><td></td><td></td> FGF4 <td>Prezent od Cliffa Tabina.</td></tr><tr><td>kwas all-trans-retinowy</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Pamiętaj o ochronie przed światłem.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>nr kat. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, żel do chromatografii powinowactwa</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Koraliki do dostarczania białka.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Żywica jonowymienna</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Koraliki do dostarczania RA lub BMS 493.</td></tr><tr><td>Inkubator do jaj</td><td>Memmert</td><td>www.hce-uk.com LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Szkodliwy, drażniący,.&nbsp; Z proszkiem należy obchodzić się w oparach w pełnym ubraniu ochronnym.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop dwuokularowy&nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>zastąpiony przez M60</td></tr><tr><td>Jaja kurze</td><td>Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brązowe jaja</td></tr></tbody></table>

zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Zarodek pisklęcia stanowi doskonały model kręgowca, który może być wykorzystany do bezpośredniego analizowania zagadnień rozwojowych. Jego dostępność i wytrzymałość po interwencji chirurgicznej to kluczowe atuty eksperymentalne. Płytki mikowe były pierwszymi barierami stosowanymi w celu zapobiegania inicjacji pąków kończyn piskląt1. Opisano protokoły, które wykorzystują folię aluminiową jako nieprzepuszczalną barierę dla indukcji i/lub inicjacji zawiązków skrzydeł lub nóg. Łączymy tę technikę z umieszczaniem koralików bocznie do bariery, aby egzogennie dostarczyć kandydujące czynniki endogenne, które zostały zablokowane przez barierę. Wyniki są analizowane przy użyciu hybrydyzacji in situ późniejszej ekspresji genów. Koncentrujemy się głównie na roli sygnalizacji kwasu retinowego w indukcji, a następnie inicjacji zarodka pisklęcia kończyny przedniej i tylnej. Używamy namoczonych kulek BMS 493 (odwrotny agonista receptorów kwasu retinowego (RAR)) wszczepionych w mezodermę płytki bocznej (LPM), aby naśladować efekt bariery umieszczonej między somitami (źródło kwasu retinowego (RA)) a LPM, z którego wyrastają pąki kończyn. Zmodyfikowane wersje tych protokołów mogą być również wykorzystane do odpowiedzi na inne pytania dotyczące pochodzenia i czasu sygnałów indukcyjnych. Zakładając, że obszar zarodka pisklęcia jest dostępny na odpowiednim etapie rozwoju, można umieścić barierę między dwiema tkankami i w konsekwencji badać zmiany w rozwoju. Przykłady można znaleźć w rozwijającym się mózgu, wydłużeniu osi oraz w rozwoju narządów, takich jak indukcja wątroby lub nerek.

Powyższy protokół szczegółowo opisuje metody zastosowane przez Nishimoto i wsp., 2015. Artykuł analizuje indukcję i inicjację pączków kończyn przednich i tylnych zarodka kurca. Wyniki uzyskane po wprowadzeniu nieprzepuszczalnych barier w celu zapobieżenia wzrostowi pączka kończyny przedniej zostały opublikowane wcześniej 1, 2, 9 istnieje jednak tylko jedna praca opisująca bariery zapobiegające inicjacji pączka kończyny 1Dane dotyczące kończyn tylnych od Nishimoto i wsp., 2015 przedstawiono tutaj jako reprezentatywne wyniki badania ekspresji mRNA po wszczepieniu bariery.
Ekspresja Tbx4 w LPM nie jest wystarczająca do zainicjowania wzrostu kończyny tylnej: 
Ryciny 2B i C (Tabela 2) pokazują, że wprowadzenie bariery w stadium 15 (Rycina 2A) (patrz protokół 3.2) prowadzi do braku ekspresji zarówno Fgf10, jak i Fgf8 w obszarze pączka kończyny (oznaczonym nawiasem) po operowanej prawej stronie. Porównaj z nieoperowaną lewą stroną. Jednakże ekspresja Tbx4 jest obserwowana zarówno w stadium 19, jak i w stadium 23 po stronie operowanej (Rycina 2D i E). Wnioskujemy, że sama ekspresja Tbx4 nie jest wystarczająca do zainicjowania wzrostu kończyny tylnej z LPM. Inne badania na kurczętach sugerowały, że ekspresja genów Tbx jest wystarczająca do zainicjowania formowania pączka kończyny przedniej 12, 13.
Rysunek 2C' został dołączony, aby zilustrować wygląd bariery osadzonej w obszarze kończyny embrionu po utrwaleniu. W większości przypadków bariery usunięto przed hybrydyzacją in situ (protokół 4.3).
RA z somytów jest niezbędny w LPM przed indukcją wzrostu pączka kończyn przez Fgf10: 
Rycina 3A przedstawia schemat dodania koralika nasączonego RA dystalnie względem bariery wprowadzonej w stadium 15 (protokół 3.2.1.3). Po tym zabiegu wzrost pączka kończyny (oznaczony gwiazdką) jest obserwowany po zoperowanej prawej stronie, a Tbx4, Fgf10 i Fgf8 wykazują ekspresję w pączku, podobnie jak po kontrolnej lewej stronie (Rycina 3B, C i D, Tabela 2). Zatem dodanie RA do LPM znosi efekt bariery i następuje inicjacja pączka kończyny. Wyciągamy wniosek, że w normalnym rozwoju RA z somytów jest niezbędny w LPM przed możliwością zainicjowania wzrostu pączka kończyny. Powstałe pączki kończyn tylnych są zazwyczaj mniejsze niż te po stronie kontrolnej. Może to wynikać z faktu, że dawka RA w LPM nie jest równoważna sytuacji w typie dzikim. Jeśli dawka RA jest zbyt wysoka, grzebień ektodermalny apikalny (AER) może ulec skróceniu, co prowadzi do powstania mniejszych pączków 14, 15.
Aby potwierdzić, że RA (pochodzące z somitymów) w LPM jest niezbędne do prawidłowej inicjacji pączka kończyny, zastosowano BMS 493, będący odwrotnym agonistą RAR. Kuleczki implantuje się do LPM w obszarze kończyny dolnej w stadium 15 (patrz protokół 3.2.1.4) (Rysunek 3E). Ekspresja Fgf10 jest obniżona po zastosowaniu kuleczek z BMS 493 w LPM, co skutkuje powstaniem mniejszych pączków kończyn tylnych w porównaniu ze stroną kontrolną (Rysunek 3F; Tabela 3). Kontrolne kuleczki z DMSO nie wywołują tych wad (Rysunki 3G oraz 3H; Tabela 3). Wady zaobserwowane po zastosowaniu BMS 493 są łagodniejsze niż te wywołane operacją bariery; t.j. Fgf10 jest nadal ekspresowany, a pączki kończyn powstają. Prawdobnie wynika to z faktu, że działanie BMS 493 jest ograniczone lokalnie do obszaru wokół kuleczek i może nie być w stanie zneutralizować całego RA produkowanego przez tkanki osiowe.
Wczesne sygnały osiowe specyfikują komórki LPM, które później wykazują ekspresję Tbx4: 
Zbadaliśmy, kiedy LPM nabywa zdolności do ekspresji Tbx4 w przyszłym regionie formowania kończyn dolnych. Najwcześniejszym etapem, na którym można wprowadzić barierę blokującą późniejszy wzrost pączka kończyny, jest etap 10. Jako pierwsi opracowaliśmy protokół wprowadzania barier na etapach wcześniejszych niż etap 12. Bariery wprowadzone między mezodermą paraksjalną a domniemanym LPM kończyny dolnej na etapie 10 (patrz protokół 3.4) blokują formowanie pączka kończyny oraz ekspresję Tbx4 w LPM formującej kończynę (Ryciny 2F i 2G, Tabela 2), co sugeruje, że sygnał z tkanek osiowych na etapie 10 jest niezbędny do późniejszej ekspresji Tbx4 w LPM kończyny tylnej. Wynik ten należy porównać z Rycynami 2D i E, gdzie późniejsze wprowadzenie bariery pozwala na ustanowienie ekspresji Tbx4. Ponadto zbadaliśmy, czy sygnałem osiowym tym może być RA, obserwując, czy odwrotny agonista RAR redukuje ekspresję Tbx4. Koralik BMS 493 umieszczony w LPM kończyny tylnej na etapie 10 (patrz protokół 3.4.1.3) obniża poziom ekspresji Tbx4 (Ryciny 2H i 2I), podczas gdy koraliki kontrolne namoczone w DMSO nie wpływają na ekspresję Tbx4 (Ryciny 2J i 2K). Razem wyniki te wspierają model, w którym sygnał RA z tkanek osiowych reguluje indukcję kończyn poprzez pozytywną regulację Tbx4 w LPM kończyny tylnej 7.
Zgony pooperacyjne: 
Tabele 1, 2 i 3 zawierają szczegóły dotyczące wyników eksperymentów, w tym liczbę zarodków kurzych, które zginęły po operacji i przed pobraniem próbek. Pewna liczba zgonów jest spodziewana po mikrochirurgii tego rodzaju. Liczbę zgonów można zminimalizować, dbając o to, aby narzędzia były czyste, otwór w jajku miał minimalną wymaganą wielkość, zarodki pozostawały bez ochrony taśmy klejącej przez jak najkrótszy czas, a w powiązaniu z tym ostatnim punktem, aby operacja była przeprowadzona jak najszybciej. Żadna z tych operacji nie jest czasochłonna, jednak zabiegi z użyciem kulek i barier wymagają nieco więcej czasu. Mimo tych środków, operacje przeprowadzane na najwcześniejszych etapach oraz w obszarze skrzydła częściej kończą się śmiercią. W okolicach regionów formujących kończyny znajdują się duże naczynia krwionośne, a ich przypadkowe przerwanie może prowadzić do śmierci z powodu utraty krwi. Zauważono, że jajka otwarte w stadium 8 lub 9, których zarodki nie zostały poddane operacji, często giną do następnego dnia. W związku z tym jedynym rozwiązaniem tych problemów jest przeprowadzenie dużej liczby eksperymentów.
<img alt="Analiza rozwoju embrionalnego; etapy ekspresji Fgf10, Shh/Fgf8, Tbx4; schemat, obrazy mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/54618/54618fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zmiany w ekspresji genów markerowych po wstawieniu bariery lub koralika na poziomie domniemanej kończyny dolnej. (A) Schemat przedstawiający położenie bariery (zielona linia) na poziomie domniemanej kończyny dolnej (somity 26-32) w embrionie w stadium 15. (B-E oraz G) Analiza WISH przeprowadzona na operowanych embrionach. Region kończyny jest obrysomowany (nawiasy). (B) Ekspresja Fgf10 nie występuje w operowanym LPM, natomiast silna ekspresja jest wykrywana w lewym pączku. (C) Ekspresja Fgf8 nie występuje po stronie operowanej, co sugeruje brak AER. (C') Ten sam embrion przed usunięciem bariery. (D) Tbx4 jest wyrażany w LPM na tym samym poziomie rostro-kaudalnym co w pączku kontrolnym. (E) Ekspresja Tbx4 jest utrzymana w prawym regionie kończyny mimo braku wzrostu kończyny. (F) Schemat embrionu kurczaka w stadium 10 przedstawiający położenie bariery (zielona linia) na poziomie domniemanej kończyny dolnej. (G) Ekspresja Tbx4 nie występuje w operowanym prawym LPM (nawias). (H) Schemat embrionu kurczaka w stadium 10 przedstawiający położenie koralika z BMS 493 (fioletowe koło) na poziomie domniemanej kończyny dolnej. (I) Ekspresja Tbx4 jest obniżona po operowanej prawej stronie po zastosowaniu BMS 493. (J) Schemat embrionu kurczaka w stadium 10 przedstawiający położenie kontrolnego koralika z DMSO (szare koło). (K) Tbx4 jest wyrażany po operowanej prawej stronie na poziomie zbliżonym do poziomu kontrolnej lewej strony po zastosowaniu samego DMSO. Rycina została zmodyfikowana na podstawie 7. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ekspresja genów w zarodku kurczaka; schemat z Tbx4, Fgf10; umiejscowienie kuleczek w st19, st23; biologia molekularna." src="/files/ftp_upload/54618/54618fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3. RA przywraca wzrost pączka kończyny po wstawieniu bariery i jest niezbędne w LPM przed wzrostem pączka kończyny dolnej. (A) Schematyczna ilustracja wskazująca pozycję bariery (zielona linia) na poziomie domniemanej kończyny dolnej (somity 26-32) oraz kuleczkę nasączoną RA (czerwone koło). (B-D) RA przywraca wzrost pączka kończyny dolnej (oznaczony gwiazdką). (B) Ekspresja Tbx4 występuje w odtworzonym pączku kończyny, podobnie jak po stronie nieoperowanej. (C) Fgf10 wykazuje ekspresję w odtworzonym pączku kończyny, podobnie jak po stronie nieoperowanej. (D) Fgf8 wykazuje ekspresję w AER odtworzonego prawego pączka kończyny. (E) Schemat wskazujący miejsce umieszczenia kuleczek z BMS 493 (fioletowe koła) w LPM domniemanej kończyny dolnej zarodków w stadium 15. (F) Ekspresja Fgf10 jest obniżona po operowanej stronie prawej, a pączek kończyny jest mały po zastosowaniu BMS 493. Kuleczki są oznaczone gwiazdkami. (G) Schemat analogiczny do (E), wskazujący pozycję kontrolnych kuleczek DMSO (szare koła). (H) Kuleczki DMSO (oznaczone gwiazdkami) nie wpłynęły na ekspresję Fgf10 ani na wielkość pączka kończyny. Figura została zmodyfikowana na podstawie 7. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Umieszczono barierę stolika (+ koralik) *</td>
			<td>Liczba poddanych operacji</td>
			<td>Brak skrzydła</td>
			<td>Skrzydło obecne</td>
			<td>Liczba martwych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stadium 12-14  </td>
			<td>40</td>
			<td>24</td>
			<td>1</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etap 8/9</td>
			<td>65</td>
			<td>23</td>
			<td>0</td>
			<td>42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stadium 12-13 (kulką FGF4)</td>
			<td>41</td>
			<td>7 (brak koralika)</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stadium 12-13 (koralik z RA)</td>
			<td>75</td>
			<td>9 (brak kuleczki)</td>
			<td>32</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etap 13 (koralik kontrolny)</td>
			<td>5</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* Bariery z folii o grubości 0,7–1 mm umieszczone między somytami 15–20 a mezodermą płytki bocznej. Kuleczka z FGF4 o stężeniu 0,35 mg/ml. Kuleczka z RA o stężeniu 0,05–0,1 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Koralik kontrolny DMSO.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">** Zarodki kurczaka utrwalone w stadiach 21-23</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wyniki eksperymentu z barierą na poziomie skrzydła i koralikiem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Umieszczona bariera przedmiotowa (+ kuleczka) *</td>
			<td>Liczba operowanych</td>
			<td>Brak nogi</td>
			<td>Noga obecna **</td>
			<td>Liczba martwych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etap 12-15</td>
			<td>43</td>
			<td>39</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etap 10/11</td>
			<td>23</td>
			<td>16</td>
			<td>0</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stadium 15 (koralik FGF4)</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td>5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stadium 15 (koralik z RA)</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* Bariery z folii o grubości 0,7–1,3 mm umieszczone między somytami 26–32 a mezodermą płytki bocznej. Koralik z FGF4 o stężeniu 0,35 mg/ml. Koralik z RA o stężeniu 0,05–0,1 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">** Zarodki kurczęt utrwalone w stadiach 18-24</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Wyniki eksperymentu z barierą na poziomie nóg i koralikami.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liczba zoperowanych</td>
			<td>Mały pączek kończyny</td>
			<td>Zalążek nogi nieco za mały</td>
			<td>Normalny rozmiar pryzmatu nogi</td>
			<td>Liczba martwych osób</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuleczki BMS 493</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>12</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>9</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* 2–3 kuleczki namoczone w 5 mg/ml BMS 493 umieszczone w prawym zarodku LPM w stadium 14–15 na poziomie kończyny.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">** 2-3 kuleczki namoczone w samym DMSO umieszczone w prawej larwie LPM w stadium 15 na poziomie kończyny.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Zarfiksowane zarodki kurczęta w stadiach 17-19.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Wyniki eksperymentu z koralikami BMS 493 w zależności od poziomu nogi.

Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Celem tej interwencji chirurgicznej jest wyjaśnienie mechanizmów indukcji kończyn u zarodka kurczaka poprzez zapobieganie dyfuzji cząsteczek sygnałowych z tkanek przyśrodkowych do komórek w mezodermie płytki bocznej oraz badanie wpływu tego procesu na ekspresję genów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak to, jakie sygnały indukcyjne kontrolują inicjację pączka kończyny. Zaletą tej techniki jest fakt, że zarodek kurczaka jest dostępny do manipulacji chirurgicznych i bardzo odporny; ponadto nieoperowany, przeciwległy pączek kończyny kontrolnej służy jako bardzo użyteczna kontrola wewnętrzna.Susan Wilde zaprezentuje procedurę. Aby rozpocząć, wytnij kwadratowy kawałek folii aluminiowej o boku 1 cm i grubości 0,013 mm, a następnie wysterylizuj go, przecierając 70% etanolem. Następnie umieść kwadrat w sterylnym, plastikowym naczyniu Petri o średnicy 6 cm.Aby zapobiec przywieraniu elektrostatycznemu, należy usunąć pokrywkę i wykonać nową do szalki z tej samej folii. Następnie szalkę Petriego należy umieścić na siatce przedmiotowej pod mikroskopem binokularnym ustawionym na powiększeniu 1,6x. Za pomocą małego skalpela z ostrzem nr 15 należy wyciąć z folii paski o szerokości 1,3 mm i długości 2 mm.Rozdziel paski folii za pomocą dwóch par pęset zegarmistrzowskich nr 4. Następnie wykonaj w centrum bariery z folii zgięcie pod kątem prostym, tak aby przypominała zawias. Ustaw bariery w centrum szalki Petriego tak, aby jedna strona przylegała płasko do szalki, a druga była skierowana do góry, poza szalkę; przygotuj 20 lub więcej barier przed dniem operacji.Przykryj naczynie pokrywką z folii i przechowuj bariery w miejscu, w którym nie będą one przeszkadzane. Trzymając jajko na boku, mocno chwyć pęsetę typu AA (strong forceps) i kontrolowanym ruchem przebij tępe koniec jajka, w którym znajduje się komora powietrzna, przytrzymując jajko wolną ręką. Upewnij się, że wewnętrzna błona skorupki została przerwana.Następnie chwyć jajo obiema rękami i obróć je o 180 stopni wzdłuż osi poziomej. Potem weź kawałek przezroczystej taśmy o wymiarach około 5 cm x 5 cm i naklej go ściśle na górnej powierzchni jaja, aby zapobiec kruszeniu się skorupki na embrion podczas otwierania jaja. Używając zakrzywionych nożyczek, delikatnie przebij skorupkę oraz powiązane z nią wewnętrzne błony komórkowe w centrum górnej części jaja.Za pomocą jednego ramienia nożyczek wykonaj bardzo mały otwór, aby powietrze mogło dostać się do jaja nad embrionem. Użyj nożyczek, aby powiększyć otwór w skorupce do koła o średnicy około 1 cm. Usuń ten fragment skorupki z jaja.Zakryj otwór w jajku kawałkiem przezroczystej taśmy o wymiarach około 5 cm kwadratu. Przyciśnij taśmę tak, aby przykleiła się tylko do krawędzi otworu, pozostawiając resztę taśmy wolną. Wolną część taśmy można następnie chwycić, aby łatwo odbezpieczyć jajko.Wyjmij zarodek w stadium 15 z inkubatora i umieść jajo na podstawce pod mikroskopem binokularowym ustawionym na powiększenie 3,2x lub większe. Następnie usuń górną warstwę przezroczystej taśmy. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witelinową i boczny mezoderm lakralny sąsiadujący z somitami 26-32 po prawej stronie zarodka.Chwyć barierę za jeden koniec za pomocą mikropincety nr 5 i skręć ją, aby wprowadzić wolny koniec do nacięcia. Jak najszybciej zabezpiecz jajo przezroczystą taśmą i przenieś je z powrotem do inkubatora. Jeśli wraz z barierą ma zostać wprowadzony koralik, należy najpierw przygotować koraliki nasączone kwasem retinowym zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Następnie, za pomocą mikropincety nr 5, umieść kuleczkę w przekroju mezodermy płytki bocznej po stronie dystalnej nacięcia. Następnie wsuń barierę do nacięcia proksymalnie względem kuleczki. Zamknij jajko i niezwłocznie przenieś je z powrotem do inkubatora.Jeśli koralik lub koraliki mają zostać wprowadzone bez bariery, nie należy wykonywać długiego nacięcia. Zamiast tego należy wykonać niewielkie nacięcie przez błonę żółtkową do mezodermy płytki bocznej w miejscu, w którym ma zostać umieszczony koralik. Następnie, używając mikropincety nr 5, należy chwycić koralik i wprowadzić go w otwór w mezodermie płytki bocznej.Wcisnąć go nieco głębiej za pomocą zamkniętych końców pęsety. Wyjąć z inkubatora embrion dziesiątego stopnia rozwoju z oknem w skorupce i umieścić jajo na podstawce do jaj pod mikroskopem binokularnym ustawionym na powiększenie 3,2x lub wyższe, jeśli jest to preferowane. Następnie, używając stalowego mikronoża, wykonać nacięcie przez błonę witelinową i mezodermę płyty bocznej, bocznie od prążka pierwotnego wyrostka ogonowego embrionu w linii z somytami, na długości około sześciu somytów.Następnie, za pomocą mikropincety nr 5, chwyć barierę w miejscu wystającym poza szalkę Petriego i przekręć dłonią, aby wprowadzić wolny koniec bariery do nacięcia. Jak najszybciej zabezpiecz jajo przezroczystą taśmą i przenieś je z powrotem do inkubatora. Jeśli koralik ma zostać wprowadzony bez bariery, wykonaj niewielkie nacięcie przez błonę witelinową do mezodermy płytki bocznej w miejscu, w którym koralik ma zostać umieszczony.Następnie weź kuleczkę i mikro-pincetę nr 5 i wprowadź ją w otwór w mezodermie płyty bocznej. Na koniec dociśnij ją nieco głębiej za pomocą zamkniętych końcówek pincety. Przedstawione tutaj jest położenie bariery na poziomie zakładkowej kończyny w somitach 26-32 u embrionu w stadium 15.Bariera ta prowadzi do braku ekspresji zarówno Fhf10, jak i Fhf8 w regionie pąka kończyny po stronie operowanej, przy jednoczesnym występowaniu ekspresji po nieoperowanej lewej stronie. Jednakże ekspresja Tbx4 jest obserwowana zarówno w stadium 19, jak i stadium 23 po stronie operowanej. Sugeruje to, że sama ekspresja Tbx4 nie jest wystarczająca do zainicjowania wzrostu kończyny tylnej z lpm.Gdy koraliki nasączone kwasem retinowym zostaną umieszczone dystalnie względem bariery w stadium 15, Tbx4, Fgf10 i Fgf8 ulegają ekspresji po stronie operowanej, tak samo jak po lewej stronie kontrolnej. Zatem w normalnym rozwoju kwas retinowy pochodzący z somytów jest niezbędny do zainicjowania wzrostu pączka kończyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania nieprzepuszczalnych barier oraz koralików nasączonych czynnikami kandydackimi do badania wpływu sygnałów indukcyjnych na inicjację pączka kończyny w embrionie kurczaka.

application-impermeable-barriers-combined-with-candidate-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Różnorodne czynniki wzrostu i białka oddziałują na siebie, indukując komórki do przyjmowania różnych przeznaczeń komórkowych podczas rozwoju. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie preparacji in ovo w celu zbadania możliwych oddziaływań między różnymi białkami w rozwoju, poprzez umieszczanie kulek w embrionach kurzych w stadium E2.5.

Umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

Indukcja neuralna jest pierwszym etapem formowania się mózgu. Jest to mechanizm, dzięki któremu węzeł Hensen’a (organizator) instruuje sąsiednie tkanki do przyjęcia losu neuralnego, tzn. do przekształcenia się w układ nerwowy. Niniejszy film prezentuje test indukcji neuralnej w embrionie kurczaka.

Analiza indukcji neuralnej w embrionie kurczaka

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj technikę chirurgiczną z barierami nieprzepuszczalnymi i kulkami nasączonymi kwasem retinowym do badania mechanizmów indukcji kończyn w zarodku kurzego. Metoda pozwala analizować ekspresję genów Tbx4, Fgf10 i Fgf8.

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Przeglądaj więcej filmów