Test oparty na CFSE do badania migracji komórek dendrytycznych skóry myszy do drenujących węzłów chłonnych podczas zakażenia Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Ogólnym celem niniejszego testu opartego na fluorescencyjnym śledzeniu komórek jest monitorowanie i charakterystyka specyficznych, interesujących populacji komórek podczas ich migracji ze skóry do drenującego węzła chłonnego po zakażeniu poduszeczki stopy prątkami Bacille Calmette-Guerin, czyli BCG. Wykorzystaliśmy tę technikę do zidentyfikowania populacji komórek dendrytycznych, które migrują do drenującego węzła chłonnego po zakażeniu skóry BCG. Technika ta pozwoliła na zbadanie migracji komórek poprzez wstrzykiwanie guzów w określonym, 24-godzinnym oknie czasowym.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wstrzykiwania do poduszki stopy oraz izolacji węzłów chłonnych są trudne do opanowania wyłącznie na podstawie tekstu. W celu wstrzyknięcia microbacterium Bovus BCG, po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez ucisk palca, należy użyć strzykawki z igłą 29G o długości 1/2 cala, aby zaszczepić tylną poduszkę stopy myszy w wieku od 8 do 12 tygodni dawką 1×10⁶ jednostek tworzących kolonie bakterii w 30 µL PBS. Poduszki stóp kontrolnych należy wstrzyknąć samym PBS.

Następnie monitoruj zwierzęta, aż całkowicie odzyskają sprawność i będą w stanie przenieść ciężar ciała na wstrzykniętą poduszkę stopy. W przypadku iniekcji CFSE, w odpowiednim punkcie czasowym po iniekcji BCG, rozcieńcz dziesięciokrotnie w PBS fiolkę 5 mM CFSE w temperaturze pokojowej, dbając o dokładne resuspensowanie roztworu. Następnie nabierz rozcieńczony CFSE do strzykawki i podaj 20 µL do tej samej tylnej poduszki stopy, w którą wykonano pierwszą iniekcję.

24 godziny po wstrzyknięciu CFSE należy ostrożnie wykonać nacięcie pionowe w tylnej części uda i usunąć tłuszcz mięśniowy. Następnie za pomocą nożyczek i pęsety należy odsłonić i wyciąć węzeł chłonny podkolanowy, znajdujący się głęboko w worku tłuszczowym w dole podkolanowym. Węzeł chłonny należy przenieść do 0,5 ml sterylnego PBS w temperaturze 0°C i zhomogenizować go przez sitko komórkowe o rozmiarze 70 µm w jednym dołku płytki sześciodołkowej zawierającej 5 ml PBS, używając do tego końcówki strzykawki o pojemności 3 ml.

Przemyj sitko kolejnymi 5 mililitrami buforu, a następnie przelej zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie odwiruj komórki i resuspenduj osad w odpowiedniej objętości buforu. Aby znakować komórki do cytometrii przepływowej, odmierz od 1 do 10 × 10⁶ komórek do polistyrenowych probówek o zaokrąglonym dnie o pojemności 5 mililitrów i przemyj komórki świeżym buforem do FACS.

Resuspender osady w 50 do 100 µl odpowiedniego koktajlu przeciwciał zawierającego anty-mysie CD16 CD32 w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań zależnych od receptorów FC w buforze FACS, w lodzie, chroniąc próbki przed światłem. Po 30 do 45 minutach przemyć komórki buforem FACS i resuspender osady w 50 do 100 µl świeżego buforu FACS. Większość znakowania CFSE w węźle chłonnym podkolanowym obserwuje się w komórkach MHC-II high i CD11c positive low, co jest zgodne z charakterystyką dendrytycznych komórek skóry migrujących do drenujących skórę węzłów chłonnych.

Zarówno częstotliwość, jak i całkowita liczba tych znakowanych komórek wydają się być zwiększone w węzłach chłonnych podkolanowych myszy zakażonych BCG w porównaniu do kontroli wstrzykniętych PBS, co sugeruje, że BCG nasila relokację tych komórek do drenującego węzła chłonnego. Dendrytyczne komórki skóry nadal napływają do drenującego układu chłonnego do pięciu dni po zakażeniu, co wydłuża migrację komórek dendrytycznych w obecnym modelu znacznie poza ramy czasowe wstępnej aktywacji antygenowo swoistych limfocytów T CD4 dodatnich w węźle chłonnym podkolanowym. Ponadto migrujące dendrytyczne komórki skóry wykazują podwyższony poziom cząsteczek kostymulujących, co potwierdza tezę, że migrujące komórki dendrytyczne są aktywowane.

Co istotne, zarówno odporne na węzły chłonne komórki dendrytyczne monocytoidalne, jak i plazmocytoidalne, które przedostają się do zapalnych węzłów chłonnych poprzez wysokotrówne naczynia żylne, a nie naczynia limfatyczne doprowadzające, są negatywne pod kątem CFSE, co dodatkowo potwierdza, że znakowanie CFSE zachodzi głównie w poduszce stopy. Ponadto dodatkowa analiza cytometryczna przepływowa wykazuje, że subpopulacja komórek EpCAM low CD11b high stanowi główny migrujący podzbiór komórek dendrytycznych skóry, który drenuje do węzła chłonnego podkolanowego w odpowiedzi na zakażenie BCG. Po opanowaniu ta technika może być wykonana w pięć minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia.

Podczas wykonywania tego procesu należy zachować szczególną ostrożność w kwestii miejsca i objętości iniekcji; należy przede wszystkim uważać, aby nie uszkodzić drenującego węzła chłonnego podczas sekcji. Po przeprowadzeniu procedury można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa lub mikroskopia konfokalna, w celu dalszej analizy mikroekspresji komórek specyficznych dla danej subpopulacji. Technika ta umożliwiła badaczom śledzenie komórek przemieszczających się ze skóry do drenującego węzła chłonnego w ciągu 24 godzin w odpowiedzi na infekcję lub szczepienie.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wykonywać iniekcje w poduszkę stopy oraz jak lokalizować i izolować odprowadzające węzły chłonne w celu śledzenia i charakteryzacji interesujących populacji migrujących komórek dendrytycznych.