Name: Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę transdukcji-transplantacji do generowania mysich modeli nowotworów mieloproliferacyjnych. Technika ta umożliwia ekspresję genów w komórkach hematopoetycznych i badanie ich roli w patogenezie chorób krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez V Foundation Scholar (AGF) i MPN Research Foundation (AGF).

Badanie to zostało zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Wszystkie zabiegi wykonywano w znieczuleniu izofluranem i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.
1. Generacja retrowirusa ekotropowego
<ol>
	<li>Przygotuj wysokiej jakości plazmidy o stężeniu co najmniej 1 μg/μl za pomocą dostępnego w handlu zestawu maxi-prep lub oczyszczania chlorkiem cezu. 
	nuta: Należą do nich wektor szkieletowy MSCV kodujący interesujący nas gen (w tym przypadku CALR7,8) i marker z wyboru (GFP, Neo itp.), a także ekotropowy plazmid pakujący, kodujący gag-pol-env (określany tutaj jako plazmid).</li>
	<li>Rozmrozić i rozmnożyć komórki 293T o niskim pasażu w DMEM uzupełnione 10% FBS i L-glutaminą z penicyliną / streptomycyną (D10). Płytka 5 x 106 komórek w 10 cm naczyniu poddanym działaniu kultur tkankowych w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Rozwiń komórki 293T w hodowli. W dniu poprzedzającym transfekcję przemyć komórki, dodając 1 ml PBS i odessać supernatant do kolby próżniowej.</li>
	<li>Aby trypsynizować komórki, dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj naczynia w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 3 ml D10 do naczynia i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki przy 400 x g przez 10 min.</li>
	<li>Odessać supernatant do kolby próżniowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml D10.</li>
	<li>Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wysiewaj 2 x 106 komórek na szalkę do trzech 10-centymetrowych szalek poddanych kulturze tkankowej na każdego wytworzonego wirusa. 
	UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, nie należy dopuścić do przekroczenia przez komórki 30-50% konfluencji w czasie transfekcji, w przeciwnym razie można uzyskać słabą wydajność wirusa.</li>
	<li>Bezpośrednio przed transfekcją odessać pożywkę do kolby próżniowej i zastąpić 5 ml świeżej pożywki D10.</li>
	<li>Na każde 10 cm szalki Petriego, która ma być transfekowana, należy przygotować indywidualną sterylną probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odpipetować 760 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej probówki do mikrowirówki, a następnie ostrożnie dodać 40 μl odczynnika do transfekcji bezpośrednio do pożywki. Inkubować probówki w kapturze do hodowli tkankowej w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dodaj 30 μg wektora MSCV z interesującym genem (15 μg w przypadku stosowania pustego wektora), a także 5 μg plazmidu do każdej odpowiedniej probówki i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowych przez dodatkowe 15 minut. 
	nuta: Mniejsze wektory mają zwykle wyższą wydajność wirusa.</li>
	<li>Ostrożnie dodać całkowitą objętość każdej reakcji (około 800 μl) kroplami do odpowiedniej 10 cm szalki Petriego i delikatnie przechylić szalkę z boku na bok, aby wymieszać. Z powrotem komórki do nawilżonego inkubatora do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Po 8-godzinnej lub nocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli tkankowych odessać pożywkę do kolby próżniowej i delikatnie zastąpić 10 ml świeżej witaminy D10.</li>
	<li>Po 48 godzinach od transfekcji zebrać supernatant do strzykawki o pojemności 35 ml i przefiltrować przez membranę 0,45 μm w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Umieścić 10 ml świeżej witaminy D10 z powrotem na komórkach 293T, a dodatkowy wirus może zostać pobrany po 72 godzinach od transfekcji.</li>
	<li>Komórki 293T należy wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne, gdy nie zbiera się dodatkowego wirusa.</li>
	<li>Podwielokrotność supernatantu wirusa rozdzielić na objętości do jednorazowego użytku (na przykład 1 ml w przypadku miana wirusa lub 6,5 ml w przypadku zakażenia BM). Wirus błyskawicznego zamrożenia z użyciem ciekłego azotu i przechowywać wirusa w temperaturze -80 °C. 
	nuta: Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania, ponieważ znacznie zmniejszają one miano wirusa.</li>
</ol>
2. Określ względne miano wirusa za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Rozmrozić komórki 3T3 i utrzymać w D10. Hodować komórki w 10-centymetrowym naczyniu poddanym działaniu hodowli tkankowej w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wykonać miano wirusa w trzech egzemplarzach. Aby przygotować komórki, należy je przemyć, dodając 1 ml PBS i odessać supernatant do kolby próżniowej.</li>
	<li>Aby trypsynizować komórki, dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj naczynia w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 3 ml D10 do naczynia i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki przy 400 x g przez 10 min.</li>
	<li>Odessać supernatant do kolby próżniowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml D10.</li>
	<li>Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Komórki 3T3 należy wysiać w gęstości 1 x 105 komórek na piętnaście 60-milimetrowych szalek poddanych kulturze tkankowej i inkubować przez noc.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia 1:3, 1:10, 1:30 i 1:100 rozmrożonego supernatantu wirusowego za pomocą D10 w sumie w 1 ml. Dołącz również kontrolę wolną od wirusów.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek 3T3 do kolby próżniowej i zastąpić 4 ml D10.</li>
	<li>Na komórki 3T3 nałożyć rozcieńczenia supernatantu wirusa i dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml do każdej płytki. Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Określ względne miano wirusa za pomocą cytometrii przepływowej:
	<ol>
		<li>Aby przepłukać komórki, należy zassać pożywkę do kolby próżniowej i dodać 5 ml PBS.</li>
		<li>Zassać PBS do kolby próżniowej. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut, aby oderwać komórki od naczynia.</li>
		<li>Dodać 3 ml D10 i pipetować w górę i w dół, aby odłączyć pozostałe komórki od płytki. Przenieść komórki do probówki FACS i odwirować przy 400 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i przepłukać komórki 3 ml PBS. Odwirować przy 400 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant. Zawiesić w 200 μl PBS.</li>
		<li>Uruchom komórki na cytometrze przepływowym9. Zbierz od 20 000 do 30 000 zdarzeń w bramce aktywnej komórki (określonej przez FSC w porównaniu z SSC) i oblicz procent komórek GFP+ i GFP-. 
		nuta: Miano wirusa uważa się za dopuszczalne, gdy rozcieńczenie supernatantu wirusa w stosunku 1:30 daje co najmniej 50% komórek GFP+ 3T3. Jeśli w wyniku tego rozcieńczenia uzyskasz mniej niż 50% komórek GFP+, można uzyskać nieoptymalne wyniki transdukcji. Obliczenia mające na celu określenie miana wirusa zostały zaadaptowane z Limon et al., Blood (1997)9.</li>
		<li>Aby określić względne miano wirusa, należy użyć równania: miano wirusa = jednostki tworzące cząstki (PFU)/ml = [(Liczba komórek 3T3 × częstość komórek GFP+) / Objętość supernatantu (ml)] × Współczynnik rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transdukcja komórek szpiku kostnego dawcy
<ol>
	<li>Aby przygotować myszy dawcy do pobrania szpiku kostnego (BM), najpierw znieczulij myszy za pomocą parownika izofluranu z natężeniem przepływu 5% połączonego dodatkowego tlenu o stężeniu 1 l/min. Stopa szczyptająca, aby ocenić reakcję. 
	nuta: Myszy dawcy (w wieku poniżej 8 tygodni) powinny być przygotowane na 5 dni przed pobraniem szpiku kostnego (8 dni przed przeszczepem). Jedna mysz dawca dostarczy wystarczającą ilość komórek dla co najmniej 2 biorców.</li>
	<li>Wstrzyknąć 150 mg/kg 5-fluorouracylu (5-FU) przez wstrzyknięcie zaoczodołowe znieczulonym myszom za pomocą igły 27 G × 1/2". 
	ostrożność! 5-FU przeciwnowotworowy środek chemioterapeutyczny. Z 5-FU należy zawsze obchodzić się w certyfikowanym okapie oparowym lub kanałowej szafie bezpieczeństwa biologicznego. Skonsultuj się z laboratorium instytucji i komitetem ds. bezpieczeństwa zwierząt, aby określić odpowiednie oznakowanie myszy leczonych 5-FU.
	<ol>
		<li>Ustaw znieczuloną mysz na boku i utrzymuj się zarówno kciukiem, jak i palcem wskazującym tak, aby oko lekko wystawało z głowy.</li>
		<li>Zaczynając od igły bocznie do kości przyśrodkowej i ze skosem skierowanym do góry, wbić igłę pod kątem 45° w kierunku przyśrodkowym i zatrzymać, gdy igła zostanie włożona do połowy. Powoli wstrzyknąć komórki i ostrożnie wyjąć igłę. 
		nuta: Jeśli ta technika jest wykonywana prawidłowo, oko powinno się lekko cofnąć i nie powinien być odczuwalny żaden opór po wprowadzeniu igły.</li>
		<li>Zbadaj mysz pod kątem oznak obrażeń, takich jak obrzęk lub krwawienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szpik kostny należy pobrać 5 dni po leczeniu 5-FU (3 dni przed przeszczepem).
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy za pomocą parownika izofluranu z natężeniem przepływu 5% połączonego dodatkowego tlenu o stężeniu 1 l/min. Uszczypnij stopę, aby ocenić reakcję.</li>
		<li>Ofiaruj mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Wysterylizuj mysz, spryskując obficie 70% EtOH, aż futro stanie się mokre.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj nacięcie w skórze i odetnij powięź od mięśni nóg. Następnie odetnij nogę od myszy, odcinając kość udową w biodrze i kość piszczelową w kostce.</li>
		<li>Zegnij nogę w kształt litery "L" i oddziel każdą kość nogi, przecinając staw kolanowy nożyczkami preparacyjnymi.</li>
		<li>Aby usunąć chrząstkę na dystalnych końcach każdej kości nogi, użyj nożyczek preparujących, aby delikatnie zeskrobać mięsień w kierunku jednego końca kości nogi, aż chrząstka zostanie odłączona.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki z igłą o wymiarach 27 G x 1/2 cala przepłukać każdą kość nogi PBS uzupełnionym 2% FBS przez nylonową membranę 100 μM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Płucz kość, aż kość zmieni kolor na biały, aby zmaksymalizować liczbę zebranych komórek.</li>
		<li>Za pomocą tłoka strzykawki rozgnieść komórki przez membranę nylonową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Powtórz z drugą nogą myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić BM w 5 ml buforu chlorku amonu i potasu (ACK) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować komórki na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Napełnij probówkę PBS, aby zatrzymać lizę komórek. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant. Powtórz etap lizy, jeśli osad BM ma czerwony kolor.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 5 ml PBS i policzyć komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zawieś komórki przy 2 x 106 komórkach na m za pomocą 2x koktajlu pre-stim, który zawiera DMEM uzupełniony o 20% FBS, L-glutaminę, penicylinę/streptomycynę, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / ml) i SCF (112 ng / ml). Płytka 2 ml na studzienkę w płytkach 6-dołkowych.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 2 ml supernatantu wirusa do każdej studzienki zawierającej komórki BM i dodać polibren (8 μg/ml). Obracać płytki w temperaturze 30 °C przez 90 minut w temperaturze 1 500 x g, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze kultur tkankowych na noc.</li>
	<li>Zawiesinę komórek pipetować do stożkowych probówek i wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g, nie wyrzucać płytki. Zawieś komórki w 2 ml świeżego koktajlu 2x pre-stim na dołek i wróć do oryginalnych dołków.</li>
	<li>Wykonaj drugą spinokulację, powtarzając kroki 3.7-3.9.</li>
</ol>
4. Przeszczepianie komórek dawcy myszom biorcom
<ol>
	<li>Przygotować syngeniczne myszy biorcze do przeszczepu za pomocą napromieniania całego ciała dawką śmiertelną < 24 godziny przed wstrzyknięciem komórek BM. 
	UWAGA: Dawka śmiertelna promieniowania dla myszy BALB/c wynosi zwykle 800-900 cGy i 1,000-1,200 cGy dla C57B/610. Dawkę dzieli się zazwyczaj na dwie sesje napromieniania w odstępach co najmniej 3-4 godzin.</li>
	<li>Kontynuując od kroku 3.11, należy pobrać transdukowane komórki dawcy z 6 płytek dołkowych, delikatnie pipetując supernatant do stożkowych probówek. Przemyć każdą studzienkę 1 ml PBS w celu zebrania pozostałych komórek i dodać do 50 ml stożkowych probówek.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 0,05% trypsyny do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml D10 do studzienek i odłączyć pozostałe komórki za pomocą delikatnego pipetowania. Dodać komórki do odpowiednich probówek z kroku 4.2 i osadzać przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g.</li>
	<li>Przemyć komórki PBS i odwirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 400 x g. Zawiesić ponownie w 5 ml PBS i zliczyć komórki za pomocą hemocytometru przez wykluczenie błękitu trypanowego. 
	UWAGA: Jeśli wektor ma znacznik GFP, określ ilościowo procent komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Zawiesić 5 x 105 - 2 x 106 komórek w 50 - 100 μl PBS do wstrzyknięcia myszom.</li>
	<li>Wstrzyknij komórki za pomocą wstrzyknięcia zaorbitalnego znieczulonym myszom za pomocą sterylnej igły 27 G x 1/2". 
	nuta: Inne techniki iniekcji obejmują żyłę ogonową, śledzionę lub kość udową.
	<ol>
		<li>Znieczulij mysz za pomocą izofluranu i uszczypnij stopę, aby ocenić reakcję.</li>
		<li>Ustaw mysz na boku i unieruchamiaj się zarówno kciukiem, jak i palcem wskazującym tak, aby oko lekko wystawało z głowy.</li>
		<li>Ze skosem skierowanym do góry, włóż igłę bocznie do kantu przyśrodkowego pod kątem 45°. 
		nuta: Jeśli ta technika jest wykonywana prawidłowo, oko powinno się lekko cofnąć i nie powinien być odczuwalny żaden opór po wprowadzeniu igły.</li>
		<li>Zbadaj mysz pod kątem oznak obrażeń, takich jak obrzęk lub krwawienie. 
		nuta: Po przeszczepie myszy będą miały niską morfologię krwi przez kilka tygodni, a więc są podatne na infekcje. Można zastosować profilaktykę antybiotykami lub stosowanie zakwaszonej wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miesiąc po przeszczepieniu należy zmierzyć % GFP we krwi obwodowej jako wskaźnik dla przeszczepionych komórek dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. 
	nuta: Sama GFP nie może decydować o powodzeniu wszczepienia komórek. Transdukcja wirusa mogła się nie powieść, ale mogło dojść do wszczepienia. W tym przypadku nie wykryto by komórek GFP+, ale wszczepienie przeszczepionych komórek zakończyło się sukcesem.
	<ol>
		<li>Weź 10 μl krwi obwodowej, nakłuwając żyłę odpiszczelową nogi strzykawką 21 G x 1 1/2" i dodaj ją do 100 mM EDTA w PBS, aby zapobiec krzepnięciu.</li>
		<li>Dodać 1 ml ACK do krwi i lizować na lodzie przez 10 min. Komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.</li>
		<li>Odessać supernatant do kolby próżniowej i dodać 1 ml PBS uzupełnionego 2% FBS w celu zatrzymania lizy. Komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.</li>
		<li>Odessać supernatant do kolby próżniowej i zawiesić osad w 100 μl PBS uzupełnionym 2% FBS.</li>
		<li>Uruchom próbki na cytometrze przepływowym i zbierz 300 000 zdarzeń w bramce żywej komórki (określone przez FSC w porównaniu z SSC) i oblicz procent komórek GFP+ i GFP- 9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodatkowo po 1 miesiącu od przeszczepu wykonaj pełną morfologię krwi (CBC) za pomocą automatycznego analizatora hematologicznegoweterynaryjnego 18 w celu monitorowania postępu choroby. 
	nuta: Kontynuuj monitorowanie choroby za pomocą % GFP we krwi obwodowej i morfologii krwi co miesiąc.</li>
	<li>Aby zakończyć eksperyment, znieczul mysz za pomocą izofluranu i uszczypnij stopę, aby ocenić reakcję. Ofiaruj mysz przez zwichnięcie szyjki macicy i pobierz śledzionę i szpik kostny do histopatologii. 
	nuta: Czas trwania eksperymentu jest subiektywny, a datę zakończenia należy ocenić na podstawie oczekiwanego fenotypu choroby.</li>
</ol>

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaley%2C+GQ+%22Science%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science(New York, N.Y.)</a>. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Jak2V617F+causes+a+polycythemia+vera-like+disease+with+associated+myelofibrosis+in+a+murine+bone+marrow+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model.</a> Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).</li>
<li>Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+expression+in+murine+hematopoietic+cells+leads+to+MPD+mimicking+human+PV+with+secondary+myelofibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis.</a> Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).</li>
<li>Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+therapy+of+polycythemia+induced+in+mice+by+JAK2+V617F%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F.</a> PloS One. 1, e18(2006).</li>
<li>Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+murine+JAK2V617F-positive+myeloproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease.</a> Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).</li>
<li>Marty, C., Pecquet, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+C+%22Calreticulin+mutants+in+mice+induce+an+MPL-dependent+thrombocytosis+with+frequent+progression+to+myelofibrosis%22">Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis</a>. , Blood. (2015).</li>
<li>Klampfl, T., Gisslinger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> N. Engl. J. Med. 369 (25), 2379-2390 (2013).</li>
<li>Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAraki%2C+M+%22Blood%22">Blood</a>. , (2016).</li>
<li>Limón, A., Briones, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Titer+Retroviral+Vectors+Containing+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Gene+for+Efficient+Expression+in+Hematopoietic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells.</a> Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Replication-Defective+Retrovirus+by+Transient+Transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Hematopoietic+Stem+Cell+Identification+And+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis.</a> Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).</li>
<li>Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio.+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse side population cells.</a> Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).</li>
<li>Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150-+side+population+cells+represent+a+functionally+distinct+population+of+long-term+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+myeloproliferative+neoplasms%3A+JAK+of+all+grades%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades.</a> Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).</li>
<li>Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloproliferative+neoplasm+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.+Oncol.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Myeloproliferative neoplasm animal models.</a> Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26 (5), 1065-1081 (2012).</li>
<li>Scil animal care company GmbH. , Source: 
 <a target="_blank" href="http://www.scilvet.us/company-downloads">http://www.scilvet.us/company-downloads</a> (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zawiera szczegółowy opis sposobu wykonywania przeszczepów szpiku kostnego u myszy w celu podsumowania podstawowej choroby podobnej do małopłytkowości z progresją do zwłóknienia szpiku z mutacją CALRdel52 jako czynnikiem powodującym chorobę. Pomyślne przeszczepienie komórek wykazujących ekspresję CALRdel52 powoduje zwiększenie liczby płytek krwi, ekspansję megakariocytów i zwłóknienie szpiku kostnego. Ponieważ przeszczep szpiku kostnego jest procesem wieloetapowym, ważne jest, aby zwrócić uwagę na etapy, w kt...

Transdukcja-transplantacja jest użyteczną metodą modelowania nowotworów hematologicznych u myszy. Technika ta była szczególnie cenna w badaniu nowotworów złośliwych szpiku od czasu pierwszego wykazania, że ektopowa ekspresja BCR-ABL1 może wiernie odtworzyć przewlekłą białaczkę szpikową u myszy1. Technika ta ułatwiła następnie szeroko zakrojone badania zmutowanego nowotworu mieloproliferacyjnego (MPN) JAK2V617F i MPLW515K/L.
MPN to grupa nowotworów hematologicznych charakteryzujących się nadprodukcją dojrzałych komórek szpikowych i zwłóknieniem szpiku kostnego. Choroby te na ogół powstają w wyniku klonalnej ekspansji hematopoetycznej komórki macierzystej, która nabyła mutację somatyczną w Jak2, MPL lub CALR. Modele transdukcyjno-transplantacyjne JAK2V617F i MPLW515K/L wykazują cechy kliniczne czerwienicy prawdziwej i zwłóknienia szpiku 2-5. Ostatnio wygenerowano również mysi model MPN z mutacją kalretykuliny za pomocą metody transdukcji-przeszczepu6. U tych myszy rozwija się choroba podobna do małopłytkowości ze zwiększoną liczbą płytek krwi, zwiększoną liczbą megakariocytów i zwłóknieniem szpiku kostnego. Łącznie modele te dały nie tylko możliwość uzyskania wglądu w molekularną patogenezę MPN, ale także możliwość opracowywania i badania środków terapeutycznych w warunkach przedklinicznych.
Ten manuskrypt zawiera szczegółowy opis metodologii transdukcji-transplantacji, ze szczególnym uwzględnieniem mutacji CALRdel52. Technika ta polega na przeszczepieniu transdukowanych retrowirusowo komórek szpiku kostnego wykazujących ekspresję zmutowanego konstruktu do napromieniowanych myszy syngenicznych biorców.

<table><tbody><tr><td>Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak, znany również jako pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>Retrowirusowe linie komórkowe, takie jak EcoPack 2-293, mogą być stosowane zamiast plazmidu EcoPak i standardowych komórek 293T. Dodatkowe plazmidy &gamma;-retrowirusowe i plazmidy opakowaniowe są dostępne w Addgene i innych.</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td><td>addgene</td><td>20672</td><td>Dodatkowe plazmidy do transferu &gamma;-retrowirusowego są dostępne w Addgene i innych.</td></tr><tr><td><mocne>Materiały eksploatacyjne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 Igły G x 1/2"</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna/L-glutamina</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>Może być domowej roboty</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia 10 cm</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia 60 mm</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &#181; m sitka komórkowe</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>probówki FACS</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtry strzykawkowe</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Może być domowej roboty</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki wirówkowe</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>BD <tr><td>Promiennik</td><td></td><td></td><td></td> rentgenowski</tr> <tr><td>Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transdukcja-transplantacja to szybki i skuteczny sposób modelowania ludzkich nowotworów hematologicznych u myszy. Technika ta powoduje ekspresję interesującego genu w komórkach krwiotwórczych i może być wykorzystana do badania roli genu w prawidłowej i/lub złośliwej hematopoezie. Protokół ten zawiera szczegółowy opis sposobu wykonywania transdukcji-przeszczepu przy użyciu mutacji kalretykuliny (CALR) niedawno zidentyfikowanych w nowotworze mieloproliferacyjnym (MPN) jako przykładzie. W tym protokole całe komórki szpiku kostnego od myszy dawców leczonych 5-flurouracylem (5-FU) są transdukowane zmutowanym CALR kodującym retrowirusa i przeszczepiane do śmiertelnie napromieniowanych gospodarzy syngenicznych. Komórki dawcy wykazujące ekspresję zmutowanego CALR są oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Przeszczepione myszy rozwijają fenotyp MPN, w tym podwyższone płytki krwi obwodowej, ekspansję megakariocytów w szpiku kostnym i zwłóknienie szpiku kostnego. Przedstawiamy krok po kroku, jak wygenerować retrowirusa, obliczyć miano wirusa, transdukować całe komórki szpiku kostnego i przeszczepić napromieniowanym myszom biorcy.

Technika transdukcji i transplantacji prowadzi do rekonstytucji krwiotwórczej myszy biorcy komórkami wykazującymi ekspresję interesującego genu. Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat modelu mysiego transdukcji i transplantacji w przypadku MPN z mutacją kalretikuliny. W skrócie, retrowirus wykazujący ekspresję CALRwt lub CALRdel52 jest wykorzystywany do zakażenia komórek szpiku kostnego (BM) od myszy dawcy szczepu C57B/6. Przetransdukowane komórki są przeszczepiane do napro...

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie myszy wykazujących ekspresję interesującego genu w komórkach krwiotwórczych przy użyciu metody transdukcji i transplantacji. W krótkim czasie metoda ta pozwala odpowiedzieć na pytanie, czy badany gen indukuje nowotwór hematologiczny. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę nowotworów krwi, dzięki przyspieszonej produkcji modeli mysich, które mogą służyć do testowania potencjalnych leków.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat nowotworów hematologicznych, może być ona również wykorzystana do badania roli interesującego genu w prawidłowej hematopoezie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tym eksperymentem mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga on wielu etapów. Ponadto kluczowym warunkiem sukcesu tego eksperymentu jest uzyskanie wirusa o wysokim mianie.Wizualna demonstracja tej procedury jest istotna, ponieważ praca z myszami może być trudna i wymaga praktyki. Po znieczuleniu myszy i sprawdzeniu głębokości znieczulenia zgodnie z protokołem tekstowym, ułóż mysz na boku i za pomocą kciuka oraz palca wskazującego unieruchom zwierzę tak, aby oko lekko wystawało z głowy. Aby wstrzyknąć 150 mg/kg 5-fluorouracylu, czyli 5-FU, drogą zaocznojemiołkową, wprowadź igłę 27G o długości 1/2 cala pod kątem 45 stopni, skierowaną ścięciem do góry w kierunku przyśrodkowym, i zatrzymaj się, gdy igła zostanie wprowadzona do połowy.Powoli wstrzyknij roztwór, a następnie ostrożnie wyjmij igłę. Sprawdź, czy u myszy nie wystąpiły oznaki urazu, takie jak obrzęk lub krwawienie, i upewnij się, że zwierzę doszło do siebie i zaczęło chodzić. Pięć dni później, po uśmierceniu zwierzęcia zgodnie z protokołem tekstowym, wysterylizuj mysz, obficie spryskując ją 70% etanolem, aż futro stanie się mokre.Za pomocą nożyczek sekcyjnych wykonaj nacięcie skóry, a następnie oddziel powięź od mięśni kończyny dolnej. Następnie oddziel nogę od myszy, przecinając kość udową w stawie biodrowym oraz kość piszczelową w stawie skokowym. Zegnij nogę w kształt litery L i użyj nożyczek sekcyjnych, aby rozdzielić poszczególne kości kończyny, przecinając je w stawie kolanowym.Następnie delikatnie zeskrobcie mięsień w kierunku jednego z końców kości nogi, aż chrząstka zostanie oddzielona. Dalej, używając strzykawki z igłą 27G o długości pół cala, przepłuczcie każdą kość nogi w PBS z dodatkiem 2% FBS przez nylonową membranę o rozmiarze 100 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aż kość stanie się biała, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych komórek. Za pomocą tłoka strzykawki przeciśnijcie komórki przez membranę nylonową do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Powtórz czynność z drugą nogą myszy. Odwiruj zebrane komórki przy 400 ×g w temperaturze 4°C przez 10 minut, a następnie odlej nadsącz. Następnie dodaj 5 mL chlorku amonu i potasu, czyli ACK, aby ponownie zawiesić szpik kostny.Inkubuj zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut, aby zlizować erytrocyty. Aby przerwać lizę, dopełnij probówkę buforem PBS. Następnie ponownie odwiruj komórki i usuń nadsącz.Komórki resuspenduj w pięciu mililitrach PBS, a następnie określ ich liczbę za pomocą hemocytometru, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu. Następnie dodaj cocktail 2x pre-stem, aby resuspendować komórki w stężeniu 2×10⁶ komórek na mililitr. Na koniec nanieś dwa mililitry zawiesiny do studzienek płytek 6-dołkowych.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez noc. Po inkubacji dodaj do każdej studzienki dwa mililitry nadsączu wirusowego, a następnie osiem mikrogramów na mililitr polybrene. Wirować płytki z prędkością 1500 ×g w temperaturze 30 °C przez 90 minut.Następnie należy zwrócić płytki do inkubatora na noc. Zawiesinę komórkową przenieść pipetą do probówek stożkowych i wirować przy 400 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Do resuspensji komórek użyć 2x pre-stem cocktail na każdą studzienkę, a następnie ponownie wysiać je w pierwotnych studzienkach.Po przygotowaniu myszy biorczych do transplantacji zgodnie z protokołem tekstowym, pobierz przetransdukowane komórki dawcy z płytek sześciodołkowych, delikatnie przenosząc supernatant do probówek stożkowych za pomocą pipety. Użyj jednego mililitra PBS do przemycia każdego dołka i zbierz pozostałe komórki do probówek. Dodaj 0,5 mililitra 0,05% trypsyny do dołków i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut.Następnie dodaj jeden mililitr D-10 do otworów i odleć pozostałe komórki, delikatnie pipetując. Następnie przenieś komórki do odpowiednich probówek i odwiruj przy 400 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius przez 10 minut. Ponownie przemyj komórki za pomocą PBS.Następnie, po wirowaniu, należy użyć pięciu mililitrów PBS do resuspensji komórek, a następnie policzyć je metodą wykluczania błękitu trypanowego przy użyciu komory countingowej (hemocytometru). Do iniekcji u myszy należy resuspender od 5 × 10⁵ do 2 × 10⁶ komórek w 50 do 100 µL PBS. Myszy należy ułożyć na boku i unieruchomić, trzymając ją kciukiem i palcem wskazującym w taki sposób, aby oko lekko wystawało poza obręb głowy.Wprowadź igłę ściętym końcem do góry, bocznie w stosunku do kąta wewnętrznego oka pod kątem 45 stopni, a następnie wykonaj wtrysk. Po wstrzyknięciu sprawdź, czy u myszy nie występują oznaki urazu w miejscu wkłucia, takie jak obrzęk lub krwawienie, i zapoznaj się z protokołem tekstowym w celu uzyskania dalszych informacji na temat opieki po wtrysku. Na koniec przeanalizuj ekspresję GFP we krwi zgodnie z protokołem tekstowym.Rysunek ten ilustruje sposób obliczania względnego miana wirusa, w którym procent GFP jest obliczany na podstawie zdarzeń zebranych z bramki żywych komórek. Przedstawiono tutaj miano z więcej niż jedną cząsteczką wirusa na komórkę, natomiast te próbki reprezentują miana z pojedynczymi cząsteczkami wirusa na komórkę. W idealnych warunkach, przy rozcieńczeniu supernatantu wirusowego od 1 do 30, wykryto by co najmniej 50% komórek dodatnich pod kątem GFP.W tym eksperymencie przedstawiono udanego biorcę przeszczepu, w którym myszy CALRdel52 wykazują fenotyp MPN z nasiloną trombocytozą, zwiększoną liczbą megakariocytów w szpiku kostnym oraz włóknieniem szpiku kostnego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu ośmiu dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie każdego kroku protokołu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom do analizy wpływu konkretnych genów na hematopoezę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak uzyskać myszy wykazujące ekspresję interesującego Cię genu w komórkach krwiotwórczych.

transduction-transplantation-mouse-model-myeloproliferative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

Obecny protokół opisuje rozwój powtarzalnego mysiego modelu glejaka rdzenia kręgowego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych do przestrzeni międzykręgowej, oferując bardziej efektywne i mniej inwazyjne podejście do badań i rozwoju terapeutycznego.

Chirurgiczny przeszczep komórek nowotworowych do rdzenia kręgowego myszy

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Poznaj metodę transdukcji-transplantacji do generowania mysich modeli nowotworów mieloproliferacyjnych. Technika ta umożliwia ekspresję genów w komórkach hematopoetycznych i badanie ich roli w patogenezie chorób krwi.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Przeglądaj więcej filmów