Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie myszy wykazujących ekspresję interesującego genu w komórkach krwiotwórczych przy użyciu metody transdukcji i transplantacji. W krótkim czasie metoda ta pozwala odpowiedzieć na pytanie, czy badany gen indukuje nowotwór hematologiczny. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę nowotworów krwi, dzięki przyspieszonej produkcji modeli mysich, które mogą służyć do testowania potencjalnych leków.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat nowotworów hematologicznych, może być ona również wykorzystana do badania roli interesującego genu w prawidłowej hematopoezie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tym eksperymentem mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga on wielu etapów. Ponadto kluczowym warunkiem sukcesu tego eksperymentu jest uzyskanie wirusa o wysokim mianie.

Wizualna demonstracja tej procedury jest istotna, ponieważ praca z myszami może być trudna i wymaga praktyki. Po znieczuleniu myszy i sprawdzeniu głębokości znieczulenia zgodnie z protokołem tekstowym, ułóż mysz na boku i za pomocą kciuka oraz palca wskazującego unieruchom zwierzę tak, aby oko lekko wystawało z głowy. Aby wstrzyknąć 150 mg/kg 5-fluorouracylu, czyli 5-FU, drogą zaocznojemiołkową, wprowadź igłę 27G o długości 1/2 cala pod kątem 45 stopni, skierowaną ścięciem do góry w kierunku przyśrodkowym, i zatrzymaj się, gdy igła zostanie wprowadzona do połowy.

Powoli wstrzyknij roztwór, a następnie ostrożnie wyjmij igłę. Sprawdź, czy u myszy nie wystąpiły oznaki urazu, takie jak obrzęk lub krwawienie, i upewnij się, że zwierzę doszło do siebie i zaczęło chodzić. Pięć dni później, po uśmierceniu zwierzęcia zgodnie z protokołem tekstowym, wysterylizuj mysz, obficie spryskując ją 70% etanolem, aż futro stanie się mokre.

Za pomocą nożyczek sekcyjnych wykonaj nacięcie skóry, a następnie oddziel powięź od mięśni kończyny dolnej. Następnie oddziel nogę od myszy, przecinając kość udową w stawie biodrowym oraz kość piszczelową w stawie skokowym. Zegnij nogę w kształt litery L i użyj nożyczek sekcyjnych, aby rozdzielić poszczególne kości kończyny, przecinając je w stawie kolanowym.

Następnie delikatnie zeskrobcie mięsień w kierunku jednego z końców kości nogi, aż chrząstka zostanie oddzielona. Dalej, używając strzykawki z igłą 27G o długości pół cala, przepłuczcie każdą kość nogi w PBS z dodatkiem 2% FBS przez nylonową membranę o rozmiarze 100 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aż kość stanie się biała, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych komórek. Za pomocą tłoka strzykawki przeciśnijcie komórki przez membranę nylonową do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Powtórz czynność z drugą nogą myszy. Odwiruj zebrane komórki przy 400 ×g w temperaturze 4°C przez 10 minut, a następnie odlej nadsącz. Następnie dodaj 5 mL chlorku amonu i potasu, czyli ACK, aby ponownie zawiesić szpik kostny.

Inkubuj zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut, aby zlizować erytrocyty. Aby przerwać lizę, dopełnij probówkę buforem PBS. Następnie ponownie odwiruj komórki i usuń nadsącz.

Komórki resuspenduj w pięciu mililitrach PBS, a następnie określ ich liczbę za pomocą hemocytometru, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu. Następnie dodaj cocktail 2x pre-stem, aby resuspendować komórki w stężeniu 2×10⁶ komórek na mililitr. Na koniec nanieś dwa mililitry zawiesiny do studzienek płytek 6-dołkowych.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez noc. Po inkubacji dodaj do każdej studzienki dwa mililitry nadsączu wirusowego, a następnie osiem mikrogramów na mililitr polybrene. Wirować płytki z prędkością 1500 ×g w temperaturze 30 °C przez 90 minut.

Następnie należy zwrócić płytki do inkubatora na noc. Zawiesinę komórkową przenieść pipetą do probówek stożkowych i wirować przy 400 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Do resuspensji komórek użyć 2x pre-stem cocktail na każdą studzienkę, a następnie ponownie wysiać je w pierwotnych studzienkach.

Po przygotowaniu myszy biorczych do transplantacji zgodnie z protokołem tekstowym, pobierz przetransdukowane komórki dawcy z płytek sześciodołkowych, delikatnie przenosząc supernatant do probówek stożkowych za pomocą pipety. Użyj jednego mililitra PBS do przemycia każdego dołka i zbierz pozostałe komórki do probówek. Dodaj 0,5 mililitra 0,05% trypsyny do dołków i inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut.

Następnie dodaj jeden mililitr D-10 do otworów i odleć pozostałe komórki, delikatnie pipetując. Następnie przenieś komórki do odpowiednich probówek i odwiruj przy 400 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius przez 10 minut. Ponownie przemyj komórki za pomocą PBS.

Następnie, po wirowaniu, należy użyć pięciu mililitrów PBS do resuspensji komórek, a następnie policzyć je metodą wykluczania błękitu trypanowego przy użyciu komory countingowej (hemocytometru). Do iniekcji u myszy należy resuspender od 5 × 10⁵ do 2 × 10⁶ komórek w 50 do 100 µL PBS. Myszy należy ułożyć na boku i unieruchomić, trzymając ją kciukiem i palcem wskazującym w taki sposób, aby oko lekko wystawało poza obręb głowy.

Wprowadź igłę ściętym końcem do góry, bocznie w stosunku do kąta wewnętrznego oka pod kątem 45 stopni, a następnie wykonaj wtrysk. Po wstrzyknięciu sprawdź, czy u myszy nie występują oznaki urazu w miejscu wkłucia, takie jak obrzęk lub krwawienie, i zapoznaj się z protokołem tekstowym w celu uzyskania dalszych informacji na temat opieki po wtrysku. Na koniec przeanalizuj ekspresję GFP we krwi zgodnie z protokołem tekstowym.

Rysunek ten ilustruje sposób obliczania względnego miana wirusa, w którym procent GFP jest obliczany na podstawie zdarzeń zebranych z bramki żywych komórek. Przedstawiono tutaj miano z więcej niż jedną cząsteczką wirusa na komórkę, natomiast te próbki reprezentują miana z pojedynczymi cząsteczkami wirusa na komórkę. W idealnych warunkach, przy rozcieńczeniu supernatantu wirusowego od 1 do 30, wykryto by co najmniej 50% komórek dodatnich pod kątem GFP.

W tym eksperymencie przedstawiono udanego biorcę przeszczepu, w którym myszy CALRdel52 wykazują fenotyp MPN z nasiloną trombocytozą, zwiększoną liczbą megakariocytów w szpiku kostnym oraz włóknieniem szpiku kostnego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu ośmiu dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie każdego kroku protokołu.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom do analizy wpływu konkretnych genów na hematopoezę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak uzyskać myszy wykazujące ekspresję interesującego Cię genu w komórkach krwiotwórczych.