Indukowanie całkowitej regeneracji polipów z pęcherza brzusznego ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis

Ogólnym celem tej procedury jest zilustrowanie przewidywalnej serii zmian morfologicznych, które zaszły podczas regeneracji całego polipa z niewielkiego fragmentu tkanki usuniętego z wierzchołka przewodu pokarmowego nematostella vectensis Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii regeneracji, takie jak to, w jaki sposób komórki w miejscu rany reorganizują się i wdrażają, aby odtworzyć brakujące struktury. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, ponieważ chciałem zobaczyć, jak stosunkowo złożony polip może się ponownie złożyć, zaczynając od najmniejszej ilości informacji morfologicznej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ postęp etapu po początkowym zranieniu jest czasami zasłonięty przez błonę śluzową.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie znają tej metody, będą miały trudności z uzyskaniem całkowitego oddzielenia tkanki w miejscu rany, ze względu na miękką, lepką, galaretowatą naturę polipa. Procedurę tę należy rozpocząć od kondycjonowania nematostella vectensis zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Szczególnie ważne przy stosowaniu tej techniki jest, aby wybrane zwierzęta były tej samej wielkości i miały tę samą historię hodowli, taką jak identyczne karmienie i inne parametry kondycyjne.

Wyjmij naczynie z wybranymi zwierzętami z inkubatora na światło w pomieszczeniu co najmniej godzinę przed amputacją. Użyj plastikowej pipety o szerokim otworze, aby przenieść pięć zwierząt z basenu, który ma zostać amputowany, na dno sterylnego naczynia do cięcia szkła o średnicy 100 milimetrów, zawierającego sztuczną wodę morską o zasoleniu 12 części na tysiąc. Umieść czaszę na stoliku mikroskopu stereoskopowego o zmiennym powiększeniu od 10 do 40x.

Wybierz pasujące do wielkości polipy o mniej więcej tej samej długości i umieść je w misce oddzielonej od kolonii na trzy dni przed amputacją. Za pomocą sterylnego skalpela amputuj pęcherzyk brzuszny z każdego polipa, aby uzyskać odcinek physa o długości mniej więcej tak długiej, jak szeroka i nie zawierająca krezki. Aby to osiągnąć, umieść ostrze skalpela w kontakcie ze zwierzęciem w żądanym miejscu amputacji.

Zrób to samodzielnie lub delikatnie chwytając ciało zwierzęcia kleszczami numer pięć. Przetnij tkankę, wykorzystując zakrzywione ostrze skalpela w kołyszącym ruchu po ciele. Usuń każdy amputowany polip dawcy z naczynia i umieść go z powrotem w osobnej misce oznaczonej jako osoby po amputacji.

Po datowaniu miski przywróć ją do kultury magazynowej. Wycięte physa, które pozostały w naczyniu do krojenia, opłukać w sztucznej wodzie morskiej o zasoleniu 12 części na 1 000. Następnie przenieś każdą physa do oddzielnej sterylnej studzienki na wielodołkowej płytce do hodowli komórkowej, która zawiera 10 mililitrów sztucznej wody morskiej o zasoleniu 12 części na 1 000 w każdym dołku.

Powtórz te kroki, aby zebrać co najmniej pięć physa w każdym dołku, które mają być zarezerwowane dla każdego zabiegu eksperymentalnego. Umieścić płytkę zawierającą physa w inkubatorze o regulowanej temperaturze w stałej temperaturze określonej przez pożądaną szybkość regeneracji. Oceń fizję za pomocą stereoskopowego mikroskopu złożonego o zmiennym powiększeniu.

Oceń świeżo ściętą nematostella physa jako etap zerowy i kontynuuj punktację o tej samej porze każdego dnia po amputacji lub DPA, korzystając z NRSS. Oceń physa jako etap zerowy, jeśli świeżo ścięta physa pojawia się jako masa w kształcie miseczki przypominająca zwiotczały balon z otwartym miejscem rany, które prawdopodobnie jest widoczne. Oceń physa jako etap pierwszy, jeśli rana po amputacji wydaje się zamknięta.

Oceń physa jako etap drugi, jeśli powierzchnia bieguna słuchowego wydaje się napompowana, odsłaniając osiem wypukłych łuków ułożonych w promieniowo symetryczny wzór i oddzielonych rowkami. Na drugim etapie obserwuj małe półkuliste pęcherzki na wierzchołku łuków, które są mniej więcej tak wysokie, jak szerokie, prawdopodobnie przejściowe i początkowo składające się z pojedynczej warstwy komórek ektodermalnych. Wraz z wiekiem physa może zostać pokryta śluzem, który należy ostrożnie usunąć kleszczami.

Oceń physa jako etap trzeci, jeśli pąki macek zawierających warstwy tkanki endodermalnej i ektodermalnej są stabilnie uformowane na słuchowym końcu co najmniej niektórych łuków promieniowych. Oceń physa jako etap czwarty, jeśli physa zawiera osiem różnych widocznych krezek, które rozciągają się w celenteronie od przyczepów w ścianie ciała o dźwiękowych długościach aboralnych, które są ponad dwukrotnie większe niż ich szerokość promieniowa, mierzona od miejsca, w którym wydają się łączyć z gardłem na jego brzusznym końcu lub enterostomem. Na koniec oceń physa jako etap piąty, jeśli physa ma więcej niż cztery krezki z plisowaniem, a plisowanie jest bardziej pełne i faliste niż w etapie czwartym.

W piątym etapie zwierzę ma prawie normalny wygląd dorosłego osobnika, ale nie ma widocznych komórek gonadalnych. Ta grupa kontrolna nematostella physa leczona 0,1 procent DMSO całkowicie się zregenerowała do piątego etapu. Physa leczona chlorochiną nie zdołała jednak całkowicie uformować kompletnych krezek.

Zbliżenie pokazuje zarówno obecność, jak i brak plisowania w krezkach w physie, która była inkubowana w chlorochinie. Powyższy wykres ilustruje zagregowane wyniki leczenia chlorochiną. Każde leczenie od 10 do 50 mikromolowców powodowało podobne wady, głównie brak całkowitej odbudowy krezki w tym sensie, że krezka nie miała pofałdowania.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż godzinę dla każdej sześciodołkowej płytki zawierającej 30 naciętych physa. Punktacja jest szybka, być może wymaga pół godziny na każdą powtórzoną płytkę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak amputować physa, aby uwidocznić zmiany morfologiczne, które zachodzą podczas regeneracji całego polipa z niewielkiego fragmentu tkanki brzusznej.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona etapy morfologiczne, w których można określić zdarzenia molekularne leżące u podstaw regeneracji całego polipa z miseczki wizualnie jednolitej tkanki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wstępnym kondycjonowaniu zwierząt pod względem historii żywieniowej, przecięciu na pół w celu wykluczenia krezki u dorosłych osób oraz ujednoliceniu wielkości regenerującej się physa w celu zmniejszenia zmienności w ramach leczenia. Po tej procedurze można na przykład ocenić skutki mutacji genetycznych lub zaburzeń szlaku sygnałowego w przypadku małych cząsteczek.

Lub zmiany morfogenetyczne mogą być skorelowane z analizą mikroskopową samoproliferacji, śledzeniem linii lub ekspresją genów w miejscu drugim. Technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się biologią regeneracji do zbadania biologii komórki, szlaków sygnałowych i procesów morfogenetycznych, które leżą u podstaw niezwykłej zdolności regeneracyjnej tego modelowego organizmu.